專(zhuān)利名稱(chēng)：在可生物降解的微球體中含有抗原、基因載體和佐劑的免疫組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)藥物組合物的方法，在免疫接種了抗原或編碼目的抗原的基因載體的宿主體內(nèi)，該藥物組合物能夠刺激特異性細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。這種組合物包含基于得自聚酯的共聚物的可生物降解的微球體，該微球體能夠?qū)乖?、基因載體和刺激免疫應(yīng)答遞質(zhì)的佐劑進(jìn)行包封和控釋。
已知包括6-單酯和6，6雙酯α，α-D-海藻糖(其中含30至90個(gè)碳原子的酯基被稱(chēng)作海藻糖單霉菌酸酯和海藻糖雙霉菌酸酯)在內(nèi)的一類(lèi)化合物能夠刺激抗原呈遞細(xì)胞的募集和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)產(chǎn)生，因而成為疫苗和免疫療法中的潛在候選對(duì)象。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指不與目的抗原本身共有免疫表位，卻能刺激針對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答。
專(zhuān)利US4340588記載了海藻糖雙霉菌酸酯在含有流產(chǎn)布魯氏菌(BA，45/20株)抗原的疫苗組合物中作為佐劑的用途。在該組合物中，海藻糖雙霉菌酸酯的天然混合物得自于幾個(gè)來(lái)源并且被命名為“索狀因子”。利用色譜技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)純化后，這些因子通常含有90％的雙霉菌酸酯和10％的單霉菌酸酯以及含有95-90％海藻糖雙霉菌酸酯的少量外源物質(zhì)與僅僅基于BA45/20株的可溶性抗原的組合物相比，施用含有抗原和海藻糖雙霉菌酸酯的水包油乳劑形式的疫苗后明顯減少了感染。在該研究中，將提取物與作為乳劑的油混合。盡管已知油相的存在提高了幾種不希望在用藥位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)的幾率而且可能導(dǎo)致肉芽瘤的產(chǎn)生，但是該油相的內(nèi)含物可根據(jù)其作為提取物載體的重要程度來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)從而刺激適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，其中所述提取物得自分枝桿菌的細(xì)胞壁。
在克服具有免疫原活性的制劑中由于有油的存在而導(dǎo)致問(wèn)題出現(xiàn)的嘗試中，提出了使用含分枝桿菌細(xì)胞壁的不溶性成分的含水懸浮液的建議(US5759554)。含水懸浮液通過(guò)以下步驟來(lái)制備(i)裂解細(xì)菌以及隨后進(jìn)行離心；(ii)采用蛋白水解酶從胞壁基的成分中去除蛋白(得自離心步驟的細(xì)胞碎片)；(iii)用去污劑進(jìn)行處理并沖洗得自步驟(ii)的級(jí)分；(iv)凍干和(v)將凍干的級(jí)分懸浮在水溶液如鹽水溶液中。在該發(fā)明中，采用基于分枝桿菌成分的懸浮液對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行刺激從而激發(fā)了人體或動(dòng)物體對(duì)傳染病原體的中和作用并且延緩了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，該方法不能實(shí)現(xiàn)佐劑的可控釋放，而可控釋放可以使免疫應(yīng)答最佳化。
針對(duì)抗原、基因載體和/或佐劑的方法也被記載在如US5643605專(zhuān)利文獻(xiàn)中。在該發(fā)明中，佐劑和/或微囊包封抗原的用途被記載用于治療或預(yù)防目的。
專(zhuān)利US5643605提供的組合物含有平均直徑為20至100μm的包封了這種免疫佐劑的PLGA(D-L-丙交酯-共-乙交酯)微球體。所使用的佐劑是皂甙(QS21)或胞壁酰二肽(MDP)，該佐劑能夠刺激以下條件的免疫應(yīng)答(i)結(jié)合到聚合物中的含水佐劑的體積相對(duì)3克的聚合物為1mL或小于1mL；(ii)乳酸和乙醇酸單體間的摩爾比范圍為100∶0至0∶100；(iii)PLGA聚合物的固有粘度范圍為0.1至1.2dL/g；(iv)微球體的直徑范圍為20至100μm，和(v)所述佐劑按照三階段模式從微球體中釋放出來(lái)，其中在第一階段中，一天內(nèi)釋放出少于30％的佐劑；在第二階段中，約30至200天內(nèi)，其在一天后釋放出少于10％的佐劑；以及其中在第三階段中，釋放出前兩階段所剩余的佐劑。
然而，重要地是應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明提供的微球體的直徑范圍是20至100μm，當(dāng)以用藥途徑如經(jīng)口或經(jīng)肺途徑進(jìn)行使用時(shí)阻止免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。用于這些途徑的理想直徑應(yīng)當(dāng)是在1至10μm的范圍內(nèi)，據(jù)文獻(xiàn)記載，該直徑范圍也是皮下施用免疫原性組合物的理想直徑范圍。在該發(fā)明中，將皂甙溶解在乙醇溶液中并加入到聚合物相中，并且在另一種制劑中，將MDP溶解在含水相中后再加入到聚合物相中。在兩種制劑中，含有佐劑的相相當(dāng)于制備方法的內(nèi)部含水相。然而，該方法不允許加入可溶于非極性溶劑的佐劑。
幾種疫苗制劑采用了目的在于當(dāng)主要以亞單位疫苗的形式施用抗原時(shí)能夠優(yōu)化免疫應(yīng)答的佐劑。最近十年來(lái)，在疫苗研制中取得的進(jìn)展使得引進(jìn)用于獲得和生產(chǎn)抗原的新策略以及施用并將這些抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的新途徑成為可能。這些策略實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)，尤其是在研制安全、有效和通用疫苗的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)。在本文中，DNA疫苗，尤其是在需要細(xì)胞免疫應(yīng)答的時(shí)候，作為引發(fā)保護(hù)反應(yīng)所需的有吸引力的替代物。
專(zhuān)利US6048551記載了一種制備微球體的方法，該微球體含有被用于腫瘤治療的基因載體。在本發(fā)明中，采用了多種乳化方法。將基因載體溶解在含水相中并進(jìn)行包封，選擇性地與也被溶解在含水相中的抗病毒藥物進(jìn)行結(jié)合。所述顆粒的直徑范圍是1至200μm。
專(zhuān)利US6309569要求保護(hù)將DNA包封在聚合物微粒當(dāng)中的方法，其中通過(guò)將(油包水)水包乳濁液加到含水相來(lái)萃取過(guò)量的有機(jī)溶劑，從而在含水溶液中形成粒徑達(dá)到10μm的含DNA的聚合物微粒。
迄今為止，將抗原或基因載體和免疫佐劑包封在得自PLGA的可生物降解的微球體的同一制劑中的方法還有待于得到描述。因此，盡管在提供含有或不含共-佐劑分子的可控遞送制劑方面已經(jīng)做出了努力，其中所述制劑能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答，但是所述技術(shù)狀況仍然缺少基于微球體的被動(dòng)吞噬細(xì)胞定向系統(tǒng)，所述微球體具有適當(dāng)?shù)牧揭蚨軌蛲ㄟ^(guò)不同的途徑來(lái)進(jìn)行施用并且仍然能夠定向于特定的細(xì)胞群。
研制這種系統(tǒng)的一個(gè)重要原因是由于需要抗肺結(jié)核的有效疫苗。
本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，該組合物包含至少一種佐劑和/或蛋白質(zhì)；和/或含有蛋白-表達(dá)基因的質(zhì)粒，該質(zhì)粒被包埋在平均直徑小于20μm，優(yōu)選地在1至10μm之間的高分子微球體中。因此，除了佐劑，所述組合物還含有一種抗原或編碼該抗原的基因載體(優(yōu)選來(lái)源于寄生蟲(chóng)和病原體)，所述抗原包括胞外和胞內(nèi)細(xì)菌、真核生物如真菌和原生動(dòng)物等的抗原。所述佐劑優(yōu)選地是那些刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生的佐劑。理想地是，攜帶分枝桿菌蛋白基因，例如hsp65基因(源自麻風(fēng)分枝桿菌的65kDa的熱休克蛋白)的質(zhì)粒，或者甚至是純化的或重組的蛋白可以被包封在得自乳酸和乳酸與乙醇酸的共聚物(單體比例變化范圍是100∶0至0∶100)的聚合物微球體中。而且，海藻糖雙霉菌酸酯可以被包封在PLGA的微球體中。當(dāng)人或動(dòng)物宿主已經(jīng)患上了肺結(jié)核病時(shí)，包含海藻糖雙霉菌酸酯和/或含有hsp65蛋白基因的質(zhì)粒，或者甚至是所述蛋白本身的系統(tǒng)也可以被用于預(yù)防和治療肺結(jié)核。
本發(fā)明的基因載體、抗原和/或佐劑的微囊包封可以通過(guò)以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)方法A(i)將由乳酸和乙醇酸產(chǎn)生的聚合物(以重量百分比表示的比例范圍是100∶0至0∶100)以0.2至10％的濃度溶解在有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等中，所述有機(jī)溶劑與水不相溶或部分相溶；(ii)將親脂抗原和/或佐劑溶解在含有所述聚合物的溶液(i)中；(iii)將在步驟(ii)中得到的溶液加到多元醇，例如聚乙烯醇(1至10％)中，從而形成水包油乳濁液；(iv)以適當(dāng)?shù)乃俾?200至1000rpm)攪拌該乳濁液，以便得到平均直徑小于10μm，優(yōu)選地在1至5μm之間的微球體，以及(v)在攪拌條件下，通過(guò)利用共溶劑、通過(guò)真空蒸發(fā)或其它去除溶劑的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)溶劑的去除而不破壞系統(tǒng)的穩(wěn)定性?；蛘呖梢酝ㄟ^(guò)離心或過(guò)濾、用含水溶劑沖洗、然后凍干來(lái)收集所獲得的微球體懸浮體。
方法B(i)將由乳酸和乙醇酸(以重量百分比表示的比例范圍是100∶0至0∶100)產(chǎn)生的聚合物以0.2至10％的濃度溶解在有機(jī)溶劑，例如二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿等中，所述有機(jī)溶劑含有或不含親脂佐劑如海藻糖雙霉菌酸酯；(ii)將親脂性的基因載體、抗原和/或佐劑溶解在0.1至1mL的水相當(dāng)中；(iii)將在步驟(ii)中得到的溶液加到在步驟(i)中獲得的聚合物溶液中，然后在500至15000rpm的速度下進(jìn)行攪拌，結(jié)果形成油包水乳濁液(或分散體)；(iv)充分?jǐn)嚢枰欢螘r(shí)間(1至10分鐘)后，將該初級(jí)乳濁液(或分散體)加到通常含有多元醇溶液，例如聚乙烯醇(1至10％)的乳化水相中，以便形成水包油-油包水的乳濁液；(v)在適當(dāng)?shù)乃俣?100至1000rpm)下攪拌在步驟(iv)中獲得的多相乳濁液以便除去有機(jī)溶劑，結(jié)果產(chǎn)生平均直徑小于10μm，優(yōu)選地1至5μm的微球體，所述微球體可以通過(guò)過(guò)濾或離心、用含水溶劑沖洗并且最終凍干來(lái)進(jìn)行收集。
值得提及的是本技術(shù)領(lǐng)域的其它已知方法可以被用來(lái)獲得載有抗原和/或佐劑的微球體。這就是本發(fā)明的目標(biāo)，其不受本文所提供的技術(shù)的限制。
本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例而得到詳細(xì)描述實(shí)施例1-海藻糖雙霉菌酸酯的制備在氯仿-甲醇混合物(1∶1體積/體積)中將100克的肺結(jié)核分枝桿菌H37Rv株勻化幾次。按照以前記載的純化海藻糖雙霉菌酸酯的方法對(duì)被提取的物質(zhì)(18g)進(jìn)行分級(jí)分離(Silva，C.L.，S.M.Ekizlerian，和R.A.Fazioli.1985.Role of cord factor in the modulation of infectioncaused by Mycobacteria.Am.J.Pathol.118238-247)。經(jīng)純化的糖脂(0.530g)在進(jìn)行薄層層析的過(guò)程中通過(guò)遷移而形成一條單帶，與商品(SIGMA，St.Louis，USA)類(lèi)似。
實(shí)施例2-含有海藻糖雙霉菌酸酯的微球體的制備和定性微球體按照乳濁液和溶劑蒸發(fā)技術(shù)來(lái)制備(Lewis，D.H.1990.Controlled release of bioactive agents from lactide/glicolide polymers.In Chasin M & Langer R.Biodegradable polymers as drug deliverysystems.Marcel Dekker，New York，1-43)。用30mL的二氯甲烷稀釋5mg的海藻糖雙霉菌酸酯(SIGMA)和125mg的可生物降解的PLGA(50∶50)(Resomer RG 505，MW 78,000，Boehringer Ingelheim，Germany)。將該有機(jī)相與100mL的含3％的聚乙烯醇(Mowiol40-88，SIGMA Aldrich Chemicals)表面活性劑的含水相混合，以便形成水包油的穩(wěn)定乳濁液。為了使有機(jī)溶劑蒸發(fā)，在室溫下進(jìn)行6個(gè)小時(shí)的機(jī)械攪拌(800rpm)。通過(guò)在10.000xg下進(jìn)行離心來(lái)收集微球體，用蒸餾水或鹽水沖洗3遍，凍干并貯存在4℃下。將微粒溶解在二氯甲烷中后通過(guò)薄層層析測(cè)定微球體中的海藻糖雙霉菌酸酯含量。通過(guò)CILAS 1064液相設(shè)備(Cilas，F(xiàn)rance)中的激光衍射測(cè)定微粒直徑，結(jié)果表明平均直徑范圍是1至5μm。結(jié)果被表示為直徑測(cè)定值下的累積值的百分比。不含PLGA的微球體或含海藻糖雙霉菌酸酯的微球體(Sigma，St.Louis，USA)或作為非相關(guān)對(duì)照的對(duì)照脂類(lèi)(一種甘油酯混合物，Sigma，St.Louis，USA)通過(guò)相同方法進(jìn)行制備并被作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
實(shí)施例3-質(zhì)粒的制備將被基因載體pCDNA3或被修飾的pCDNA3(pCDNA3m)和含hsp65基因的質(zhì)粒(PCDNA3-hsp65或pCDNA3修飾的-hsp65)轉(zhuǎn)化的E.coli，DH5α菌株在含100g/mL的氨芐青霉素(SIGMA)的LB肉湯基培養(yǎng)基(GIBCO BRL，Scotland)中進(jìn)行培養(yǎng)。構(gòu)建體pCDNA3修飾的-hsp65得自預(yù)先被Bam HI和Not I(Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA)消化的pCDNA3載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，然后將對(duì)應(yīng)于麻風(fēng)分枝桿菌hsp65基因的3.3kb片段和CMV內(nèi)含子A(citomegalovirus)插到所述載體中。將不含hsp65基因的載體用作對(duì)照。通過(guò)陰離子交換樹(shù)酯純化質(zhì)粒(Concert High Purity MaxiprepSystem，GIBCO BRL)。利用Gene Quant II儀器(Pharmacia Biotech)通過(guò)λ＝260和280nm的分光光度測(cè)定法對(duì)質(zhì)粒濃度進(jìn)行評(píng)估。
實(shí)施例4-重組蛋白的制備于37℃下、在振蕩速率為200rpm的振蕩培養(yǎng)箱中，采用含100μg/mL氨芐青霉素(SIGMA)和0.1M IPTG(異丙硫-β-D-半乳糖苷，GIBCO BRL)的500mL的LB肉湯基液體培養(yǎng)基(GIBCO BRL，Scotland)將經(jīng)含麻風(fēng)分枝桿菌hsp65基因的pIL-161質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli，BL21菌株培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)采用J2HS離心機(jī)(Beckman，rotor JS-7.5)以7500rpm離心15分鐘來(lái)收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞重懸浮在10mL的CE緩沖液中(30mM檸檬酸鈉，10mM EDTA，pH6.1)并利用Vibra CellTM超聲波探頭(Sonics & Materials，USA)在冰浴條件下進(jìn)行3次脈沖沖擊，每次脈沖沖擊持續(xù)1分鐘并且強(qiáng)度為100W從而將細(xì)胞裂解。以16500rpm離心20分鐘后，棄去上清液并將沉淀重懸浮在30mL的UPE緩沖液中(6M尿素，20mM EDTA，50mM磷酸二氫鉀，pH7.0)并渦旋3分鐘。在室溫下通過(guò)輕輕攪拌將懸浮液保持15分鐘并以16500rpm離心20分鐘。將硫酸銨加到上清液中直至終濃度達(dá)到1M并在冰浴中溫育30分鐘。以16500rpm離心20分鐘后，將沉淀重懸在3mL的PBS中并對(duì)著PBS徹底透析。
實(shí)施例5-質(zhì)?；蜉d有重組蛋白的微球體的制備進(jìn)行多級(jí)乳化后通過(guò)以下溶劑蒸發(fā)法來(lái)獲得微球體利用Ultraturrax T50均化器(IKA-Labortechnik，德國(guó))，在30mL含400mg PLGA 50∶50(來(lái)源于Boehringer Ingelheim的Resomer RG 505)的二氯甲烷中通過(guò)強(qiáng)烈攪拌(8000rpm)來(lái)乳化僅含不編碼hsp65蛋白的質(zhì)粒載體(pCDNA3或PcDNA3修飾的)；或含有編碼hsp65蛋白(pCDNA3-hsp65，pCDNA3修飾的-hsp65)的基因的載體；或僅僅是重組sp65蛋白的含水相(0.3mL)，以便得到油包水的初級(jí)乳化液。為了制備含質(zhì)粒的微球體，將4mg的質(zhì)粒溶解在0.3mL的含水相中，針對(duì)重組hsp65，將1mg的蛋白溶解在0.3mL的含水相中。將該乳濁液加到含3％聚乙烯醇(Mowiol40-88，Aldrich Chemicals)表面活性劑的外部含水相(100mL)中，并進(jìn)行均化從而形成多級(jí)水包油-油包水乳濁液。通過(guò)在室溫下利用Eurostar均化器(IKA-Labortechnik，德國(guó))攪拌(300至800rpm)6小時(shí)至10小時(shí)進(jìn)行蒸發(fā)來(lái)去除有機(jī)溶劑。利用Himac CR21離心機(jī)(Hitachi，轉(zhuǎn)頭R20A2)以10000xg的條件進(jìn)行離心來(lái)收集微球體，用無(wú)菌水沖洗三次，凍干后貯存在4℃下。利用CILAS 1064流體設(shè)備(Cilas，法國(guó))通過(guò)激光衍射學(xué)測(cè)定粒徑。平均粒徑應(yīng)當(dāng)在1至5μm之間。
實(shí)施例6-載有二霉菌酸酯和質(zhì)粒或二霉菌酸酯和蛋白的微球體的制備通過(guò)多級(jí)乳化和溶劑蒸發(fā)法獲得微球體利用Ultraturrax T50均化器(IKA-Labortechnik，德國(guó))，在30mL含0.5mg海藻糖雙霉菌酸酯和400mg PLGA 50∶50(Resomer RG 505 da Boehringer Ingelheim)的二氯甲烷中通過(guò)強(qiáng)烈攪拌(8000rpm)來(lái)乳化含pCDNA3，PcDNA3修飾的、pCDNA3-hsp65、PcDNA3修飾的-hsp65或重組hsp65(對(duì)于質(zhì)粒來(lái)說(shuō)需要4mg，對(duì)于蛋白來(lái)說(shuō)需要1mg)的含水相(0.3mL)，以便得到油包水的初級(jí)乳化液。將該乳濁液加到含3％聚乙烯醇(Mowiol40-88，Aldrich Chemicals)表面活性劑的外部含水相(100mL)中，并進(jìn)行均化從而形成多級(jí)水包油-油包水乳濁液。通過(guò)在室溫下利用Eurostar均化器(IKA-Labortechnik，德國(guó))攪拌(300至800rpm)6小時(shí)進(jìn)行蒸發(fā)來(lái)去除有機(jī)溶劑。利用Himac CR21離心機(jī)(Hitachi，轉(zhuǎn)頭R20A2)以10000xg的條件進(jìn)行離心來(lái)收集微球體，用無(wú)菌水沖洗三次，凍干后貯存在4℃下。利用CILAS 1064流體設(shè)備(Cilas，法國(guó))通過(guò)激光衍射學(xué)測(cè)定粒徑。平均粒徑應(yīng)當(dāng)在1至5μm之間。
實(shí)施例7-在被載有質(zhì)粒的微球體轉(zhuǎn)染化的真核細(xì)胞中對(duì)hsp65的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估于37℃下，在5％CO2的環(huán)境中，在添加了2％熱滅活的胎牛血清的1640 RPMI培養(yǎng)基(SIGMA)中培養(yǎng)J774細(xì)胞(來(lái)源于BALB/c小鼠的腫瘤譜系細(xì)胞)和J774-hsp65(經(jīng)攜帶麻風(fēng)麻風(fēng)分枝桿菌的hsp65基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[pZIPNeoSV(x)]轉(zhuǎn)染的J774細(xì)胞)。將100μL的細(xì)胞懸液(5×105個(gè)細(xì)胞)放置在24孔平板中的無(wú)菌蓋玻片上并溫育3小時(shí)從而使細(xì)胞粘著。溫育后，將1mL的RPMI培養(yǎng)基加到每個(gè)樣品中并按照下述方法進(jìn)行處理A)J774細(xì)胞接受1mL的RPMI培養(yǎng)基并被用作hsp65表達(dá)的陰性對(duì)照；B)J774-hsp65細(xì)胞加上1mL的RPMI培養(yǎng)基并被用作hsp65表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照；C)J774細(xì)胞接受1mL含載有pCDNA3修飾的-hsp65的微球體(10個(gè)微球體/細(xì)胞)的RPMI培養(yǎng)基。將微粒重懸在培養(yǎng)基中并將該懸液的濃度調(diào)節(jié)到5×106個(gè)微粒/mL，在Neubauer小室中對(duì)微粒進(jìn)行計(jì)數(shù)；D)J774細(xì)胞加上1mL含有結(jié)合了Lipofectin(GIBCO BRL)的pCDNA3修飾的-hsp65的RPMI培養(yǎng)基。
培養(yǎng)24小時(shí)后，除去培養(yǎng)上清液并重新加入1mL的RPMI培養(yǎng)基。每48小時(shí)更換一次培養(yǎng)基。試驗(yàn)開(kāi)始后的第10天和第20天進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。
為了進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)估，用含1％牛血清白蛋白(BSA)(SIGMA)的PBS溶液將細(xì)胞沖洗3遍。在室溫下用4％的低聚甲醛將細(xì)胞固定30分鐘后再次進(jìn)行沖洗。所有沖洗都進(jìn)行3次沖洗。然后，通過(guò)在室溫下利用含3％H2O2的PBS進(jìn)行溫育來(lái)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。沖洗后，在室溫下用封閉緩沖液(3％的兔血清，1％of BSA和0.01％的Triton X 100)將細(xì)胞溫育1小時(shí)，以便阻斷非特異性結(jié)合。然后，加入抗-hsp65抗體并在潮濕的4℃室內(nèi)將細(xì)胞溫育過(guò)夜。用封閉緩沖液稀釋單克隆抗體(1∶100)，溫育并沖洗后，在室溫下，將樣品與生物素化的抗-小鼠IgG抗體(B-7022，Sigma)一起溫育，然后用封閉緩沖液稀釋(1∶200)1小時(shí)。沖洗后，在室溫下將樣品與鏈霉抗生物素生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(鏈霉抗生物素蛋白-Dako Corporation，CA-USA)再溫育30分鐘。然后進(jìn)行沖洗并用3-3′二氨基聯(lián)苯胺底物(SIGMA)(10ml的PBS中含5mg)來(lái)顯色，同時(shí)加入180μL的H2O2(20個(gè)體積)。用蒸餾水終止反應(yīng)并在室溫下用Mayer蘇木精將細(xì)胞染色5至10分鐘。用蒸餾水沖洗后，用0.5％的氫氧化銨溶液對(duì)其進(jìn)行處理。然后再次進(jìn)行沖洗，室溫干燥并放置在涂有加拿大香脂的載玻片上。通過(guò)將初次抗體替換成PBS或同型非相關(guān)抗體來(lái)獲得陰性對(duì)照。觀測(cè)細(xì)胞并利用配置了MC80DX攝像系統(tǒng)的Aristoplan顯微鏡(Leitz)拍攝照片。結(jié)果表明包封加工過(guò)程不影響DNA的功能，這是因?yàn)榻?jīng)歷了上述過(guò)程的巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)hsp65蛋白。
實(shí)施例8-免疫和攻擊感染從 Paulo大學(xué)的 Preto醫(yī)科學(xué)校的動(dòng)物機(jī)構(gòu)獲得6至8周齡的BALB/c小鼠并在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。所有過(guò)程都是按照倫理委員會(huì)的建議進(jìn)行的。
通過(guò)肌內(nèi)或氣管內(nèi)途徑施用不同的微球體制劑來(lái)免疫小鼠。
微球體的用量范圍是100至500mg/kg并且方案是氣管內(nèi)途徑單次施用而肌內(nèi)途徑施用1或3次。施用微球體后的第30天或第60天，攻擊或殺死小鼠，以便對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行評(píng)估。
當(dāng)進(jìn)行攻擊感染時(shí)，在用200μl 2.5％三溴甲醇(Sigma)的PBS溶液進(jìn)行麻醉的情況下，通過(guò)氣管內(nèi)途徑給小鼠施用105個(gè)菌落形成單位(CFU)的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株。將被感染的動(dòng)物保存在適當(dāng)?shù)纳锇踩珬l件下。在不同的時(shí)間間隔殺死被感染的動(dòng)物以便對(duì)肺部的炎癥反應(yīng)進(jìn)行定性和對(duì)防護(hù)能力進(jìn)行評(píng)估。
實(shí)施例9-細(xì)胞因子的測(cè)定通過(guò)ELISA測(cè)定由經(jīng)微球體免疫的小鼠的肺和脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的濃度。在4℃下，利用Ultraturrax T 25 IKA(Labortechnik，德國(guó))將整個(gè)肺部組織均化5分鐘。以10000xg將被均化的組織離心15分鐘并通過(guò)0.22μm的膜濾出上清液，然后將該上清液用來(lái)測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)量。在37℃下，于5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)脾細(xì)胞并利用作為非特異性刺激物的伴刀豆凝集素A或利用作為特異性刺激物的重組hsp65對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行體外刺激。
48小時(shí)后，收集用于進(jìn)行細(xì)胞因子分析的培養(yǎng)上清液。特異于TNF-α(MP6-XT22，MP6 XT3)，IL-10(JES5-2A5，JES5-16E3)，IL-6(MP5-20F3，MP532cll)，IL-4(BVD4-1D11，BVD6-24G2)，IFN-γ(R4-6A2，XMG1.2)和IL-12(C15.6，C17.8)的捕獲物和生物素化單克隆抗體以及重組細(xì)胞因子可以購(gòu)自Pharmingen(San Diego，CA)。利用上述ELISA技術(shù)(Haagmans，B.L.，A.J.van den Eertwegh，E.Claassen，M.C.Horzinek，和V.E.Schijns.1994.Tumor necrosisfactor-alpha production during cytomegalovirus infection inimmunosuppressed rats.J.Gen.Virol.75779-787)并按照廠(chǎng)商提供的說(shuō)明書(shū)(Pharmingen，San Diego，CA)測(cè)定上清液中的TNF-α，IL-10，IL-6，IL-4，IFN-y和IL-12濃度。每次測(cè)定試驗(yàn)都繪制一條重組小鼠rTNF-α，rIL-10，rIL-6，rIL-4，rIFN-γ或rIL-12的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。所有評(píng)估的細(xì)胞因子的測(cè)定極限都是15pg/Ml。
實(shí)施例10-氧化氮的測(cè)定在含10％胎牛血清(GIBCO-BRL，Grand Island，NY)、10mMHepes、20mM碳酸氫鈉、100μg/ml(GIBCO-BRL)青霉素和鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)從注射了含海藻糖雙霉菌酸酯的微球體的小鼠體內(nèi)支氣管肺泡灌洗液中回收細(xì)胞。通過(guò)采用Greiss方法(Stuehr，D.J.和C.F.Nathan.1989.Nitric oxide.A macrophage productresponsible for cystostasis and respiratory inhibition in tumor targetcells.J.Exp.Med.1691543-1555)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的亞硝酸鹽(NO2-)產(chǎn)量來(lái)評(píng)估氧化氮的產(chǎn)量。通過(guò)將200μM亞硝酸鈉溶液稀釋成系列稀釋度來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。檢測(cè)極限是3μM/105個(gè)細(xì)胞。
實(shí)施例11-對(duì)抵抗攻擊感染的防護(hù)作用的評(píng)估為了評(píng)估各種制劑所賦予的抵抗結(jié)核分枝桿菌H37Rv株進(jìn)行攻擊感染的保護(hù)作用，殺死預(yù)先經(jīng)過(guò)免疫和攻擊(如實(shí)施例8中所記載的)的動(dòng)物。取出這些動(dòng)物的肺，稱(chēng)重并進(jìn)行均化。將系列稀釋度的勻漿平鋪在7H11培養(yǎng)基上。在37℃下培養(yǎng)21天后對(duì)每只平板上的CFU數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在所有實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的制劑具有適當(dāng)?shù)奶匦裕T如平均直徑小于10μm(更精確地是在1至5μm之間)，因而容易被吞噬細(xì)胞攝取，使得囊化物質(zhì)進(jìn)行被動(dòng)定向。囊化過(guò)程不影響DNA功能，這是由于經(jīng)載有pCDNA3修飾的-hsp65的微球體處理的巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)蛋白。
本發(fā)明通過(guò)附加的表格得到進(jìn)一步的說(shuō)明。表I和表II表示氣管內(nèi)施用載有重組hsp65的微球體能夠引發(fā)局部和全身水平的特異性免疫應(yīng)答。該應(yīng)答通過(guò)測(cè)定得自被免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的γ干擾素(表I)和肺勻漿中的IL-12水平(表II)來(lái)進(jìn)行評(píng)估。利用重組hsp65進(jìn)行體外刺激后，經(jīng)載有重組hsp65的微球體免疫的小鼠體內(nèi)的γ干擾素(IFN-γ)水平很高。經(jīng)重組hsp65(r-hsp65)的PBS或空載微球體免疫的小鼠不產(chǎn)生高水平的IFN-γ。將經(jīng)伴刀豆凝集素A(ConA)體外刺激后產(chǎn)生的IFN-γ濃度用作陽(yáng)性對(duì)照。施用了r-hsp65的PBS或載有r-hsp65的微球體的小鼠體內(nèi)的白介素12(IL-12)水平很高。該結(jié)果證實(shí)了通過(guò)非腸道途徑以外的其它途徑施用本發(fā)明提供的制劑的可能性。
表I免疫后第30天的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ產(chǎn)量(pg/mL)

表II免疫第30天的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IL-12產(chǎn)量(pg/g)

然而，經(jīng)胃腸外施用后，本發(fā)明的制劑還能引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。每只BALB/c小鼠通過(guò)肌內(nèi)注射單次劑量為5mg的含質(zhì)粒微球體來(lái)進(jìn)行免疫。免疫60天后，在脾細(xì)胞的培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了IFN-γ、IL-12和IL-6，由此表明產(chǎn)生了特異性免疫應(yīng)答。如表III，IV和V所示，通過(guò)采用低于傳統(tǒng)疫苗接種方案的劑量的質(zhì)粒就能產(chǎn)生該應(yīng)答，其中如同發(fā)明專(zhuān)利WO95/31216和Silva及其同事(Lowrie等，Nature 400269-271，1999)的研究論文中所記載的那樣，DNA以溶液的形式分三次進(jìn)行施用。單次劑量為5mg的微球體(含30g的質(zhì)粒)能夠引發(fā)與肌內(nèi)注射三次劑量為100μg的裸質(zhì)粒相類(lèi)似的免疫應(yīng)答。該結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的進(jìn)步性在于降低了產(chǎn)生明顯免疫應(yīng)答所需的DNA用量，因而減少了需要注射的次數(shù)表III通過(guò)肌內(nèi)注射質(zhì)?；虮话庠谖⑶蝮w中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60后天，其脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ產(chǎn)量(ng/mL)

表IV通過(guò)肌內(nèi)注射質(zhì)粒和被包封在微球體中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60天后，其脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-12產(chǎn)量(pg/g)

表V通過(guò)肌內(nèi)注射質(zhì)粒和被包封在微球體中的r-hsp65而被免疫的BALB/c小鼠在免疫60天后，其脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-6產(chǎn)量(pg/g)

關(guān)于載有TDM的微球體的免疫刺激特性，表VI和VII表明，本發(fā)明獲得的制劑通過(guò)氣管內(nèi)用藥后能夠引起肺細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)種細(xì)胞因子以及激活肺泡巨噬細(xì)胞，所述肺泡巨噬細(xì)胞的激活通過(guò)一氧化氮的產(chǎn)生來(lái)確定。表VI顯示了由注射了含TDM的微球體的小鼠和注射了對(duì)照物(PBS，對(duì)照脂質(zhì)CtLip和海藻糖雙霉菌酸酯DBT)的小鼠的肺細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的結(jié)果。所述動(dòng)物通過(guò)氣管內(nèi)途徑進(jìn)行注射。60天后，將肺取出并進(jìn)行勻漿以便利用ELISA測(cè)定上清中的細(xì)胞因子。數(shù)據(jù)代表一次實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。
表VI通過(guò)氣管內(nèi)途徑處理的BALB/c小鼠在注射后第60天，其肺勻漿中的細(xì)胞因子的產(chǎn)量

表VII顯示了由注射了含TDM的微球體的小鼠和注射了對(duì)照物(PBS，對(duì)照脂質(zhì)和海藻糖雙霉菌酸酯)的小鼠的支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)獲得了約105個(gè)支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞并于37℃下，在5％CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)。接著，收集培養(yǎng)上清液并通過(guò)Greiss法測(cè)定亞硝酸鹽濃度。通過(guò)多重比較Dunnett’s檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明與注射了PBS的小鼠相比，采用TDM(*p＜0.01)和采用DBT(*p＜0.01)進(jìn)行的處理之間存在著顯著差異。
表VII經(jīng)氣管內(nèi)途徑處理的BALB/c小鼠的支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞培養(yǎng)上清中的一氧化氮的評(píng)估

表VIII闡述了在得自被含有質(zhì)粒和TDM的微球體和對(duì)照免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生IFN-γ的水平。
表VIII在免疫30天后的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ產(chǎn)量(pg/ml)

表IX闡述了在得自被含有質(zhì)粒和TDM的微球體和對(duì)照免疫的BALB/c小鼠在免疫30天后，其血清液中產(chǎn)生抗體的水平。
表IX通過(guò)肌內(nèi)注射含有質(zhì)粒和TDM微球體而被免疫的BALB/c小鼠在免疫30天后，其血清中抗體產(chǎn)量的評(píng)估。

表X，XI和XII闡述了在得自注射了含有質(zhì)粒和TDM的微球體和對(duì)照后又經(jīng)肺結(jié)核分枝桿菌H37Rv株攻擊后的BALB/c小鼠的肺勻漿中產(chǎn)生細(xì)胞因子的水平。
表X得自被免疫并受肺結(jié)核分枝桿菌攻擊的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IL-10產(chǎn)量(pg/mL)

表XI得自被免疫并受肺結(jié)核分枝桿菌攻擊的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IL-12產(chǎn)量(pg/mL)


表XII得自被免疫并受肺結(jié)核分枝桿菌攻擊的BALB/c小鼠的肺勻漿中的IFN-γ產(chǎn)量(pg/mL)

表XIII闡述了含有DNA或蛋白與TDM的不同微球體賦予BALB/c小鼠以抵抗肺結(jié)核分枝桿菌毒株攻擊的防御功能的能力

如表XIII所示，只有含有載入了pCDNA3m-hsp65與TDM的微球體的制劑能夠保護(hù)小鼠免受感染。重要的是需要單獨(dú)施用劑量低于10倍的質(zhì)粒就能誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)似于由裸DNA方法獲得的保護(hù)作用。蛋白的最佳包封率達(dá)到了95％；而質(zhì)粒的包封率為60至70％。佐劑/聚合物的最佳比例是6μg的佐劑∶1mg的聚合物。
權(quán)利要求
1.一種獲得免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物含有被共同包埋在可生物降解的微球體中的抗原或基因載體和免疫佐劑從而在被單次或多次施用后能夠引發(fā)包括細(xì)胞和體液應(yīng)答在內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答。
2.一種如權(quán)利要求1所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，其能通過(guò)上呼吸道(氣管內(nèi)、肺部和鼻腔)、口腔和腸胃外途徑來(lái)進(jìn)行施用。
3.一種如權(quán)利要求1和2所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，包含得自乳酸的聚合物和得自乳酸與乙醇酸的共聚物。
4.一種如權(quán)利要求1和2所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，其被包埋到平均粒徑為1至20μm的微球體當(dāng)中。
5.一種如權(quán)利要求1和2所述的含有抗原或基因載體與免疫佐劑的藥物組合物，其中生產(chǎn)方法以及施加在其中的有機(jī)溶劑不會(huì)引起被包封的抗原、質(zhì)?；蛎庖咦魟┕δ艿膯适А?br> 6.一種如權(quán)利要求1和2所述的藥物組合物，其中所述免疫佐劑增強(qiáng)了針對(duì)抗原或基因載體的免疫應(yīng)答，從而降低了誘發(fā)免疫應(yīng)答所需抗原或基因的劑量。
7.一種如權(quán)利要求1和2所述的藥物組合物，其中所述免疫佐劑增強(qiáng)了針對(duì)抗原或基因載體的免疫應(yīng)答，從而在單劑量施用后能夠引發(fā)細(xì)胞和體液特異性免疫應(yīng)答。
8.一種獲得如權(quán)利要求1和2所述組合物的方法，其中在所述方法的第一個(gè)步驟中，所述抗原或基因載體被加到初級(jí)乳濁液的含水相中而免疫佐劑被加到相同乳濁液的有機(jī)相(其含有所述的聚合物)中，從而形成油包水的含有抗原或基因載體與佐劑的乳濁液。
9.一種獲得如權(quán)利要求1和2所述組合物的方法，其中在權(quán)利要求8中獲得的油包水乳濁液被再次乳化到含有適當(dāng)表面活性劑的含水相中從而獲得水包油-油包水的乳濁液。
10.一種如權(quán)利要求1和2所述藥物組合物，其中所述抗原是被重組或純化的源自麻風(fēng)分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白。
11.一種如權(quán)利要求1和2所述藥物組合物，其中所述基因載體是含有編碼源自麻風(fēng)分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白的基因的質(zhì)粒。
12.一種如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物，其中所述佐劑是海藻糖雙霉菌酸酯。
13.一種如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物，其中所述抗原是源自麻風(fēng)分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白以及佐劑是海藻糖雙霉菌酸酯。
14.一種如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物，其中所述基因載體是含有編碼源自麻風(fēng)分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白的基因的質(zhì)粒以及佐劑是海藻糖雙霉菌酸酯。
15.一種如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物，該組合物經(jīng)肺施用后能夠引發(fā)免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答的特征在于-刺激細(xì)胞因子如IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IFN-γ和TNFα的產(chǎn)生；-IgG1和IgG2a同種型抗體的產(chǎn)生；-由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮增多；-刺激局部和全身的免疫應(yīng)答。
16.一種如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物，該組合物經(jīng)腸胃外施用后能夠引發(fā)免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答的特征在于-刺激細(xì)胞因子如IL-6，IL-10，IL-12和IFN-γ的產(chǎn)生；-特異于所述抗原的Th1型血清免疫球蛋白的產(chǎn)生；-IgG1和IgG2a同種型，尤其是IgG2a同種型抗體的產(chǎn)生。
17.如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物用于預(yù)防傳染病的用途，其在人和動(dòng)物宿主體內(nèi)需要一種特征如權(quán)利要求15和16中所述的特異性免疫應(yīng)答。
18.如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物作為治療劑用于治療傳染病、哮喘、自身免疫疾病和癌癥的用途，其在人和動(dòng)物宿主體內(nèi)需要一種特征如權(quán)利要求15和16中所述的特異性免疫應(yīng)答。
19.如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物用于預(yù)防人類(lèi)和動(dòng)物肺結(jié)核的用途。
20.如權(quán)利要求1，2和7所述藥物組合物用于治療人類(lèi)和動(dòng)物肺結(jié)核的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠在接種了目的抗原或編碼該目的抗原的基因載體的宿主體內(nèi)刺激免疫應(yīng)答的組合物。該組合物包含基于得自乳酸和乙醇酸的共聚體的微球體，該微球體包封了具有得自分枝桿菌成分的免疫刺激特性的抗原、基因載體和/或佐劑。本發(fā)明的具體應(yīng)用在于被包封在粒徑小于10μm的微球體內(nèi)的與熱休克蛋白結(jié)合的或與含有編碼所述熱休克蛋白基因的質(zhì)粒結(jié)合的海藻糖雙霉菌酸酯在被單次或多次施用后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及能夠誘導(dǎo)分泌與預(yù)防傳染病和癌癥相關(guān)的細(xì)胞因子的用途。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1549728SQ02817186
公開(kāi)日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2002年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月17日
發(fā)明者約瑟·馬奇爾·小羅德里格斯, 切利奧·洛佩斯·席爾瓦, 洛佩斯 席爾瓦, 約瑟 馬奇爾 小羅德里格斯 申請(qǐng)人:米納斯吉拉斯聯(lián)合大學(xué), 切利奧·洛佩斯·席爾瓦