專利名稱：一種大型藻類的微球體形態(tài)及其構(gòu)建培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藻類細(xì)胞培養(yǎng)和生物技術(shù)，具體的說是一種大型藻類的微球體形態(tài)構(gòu) 建及培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
利用光生物反應(yīng)器進(jìn)行藻類大規(guī)模、高密度、高效率培養(yǎng)，是現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的 發(fā)展趨勢(shì)。作為一種發(fā)展中的科學(xué)技術(shù)，國(guó)內(nèi)外都在大力進(jìn)行研究。大型藻類形態(tài)結(jié)構(gòu)分為單細(xì)胞多核體、絲狀體、假膜體和葉狀體等幾種類型，其細(xì) 胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使之不能像微藻那樣均勻地分布在培養(yǎng)液當(dāng)中；而且其培養(yǎng)過程中的細(xì)胞分化 也會(huì)造成培養(yǎng)效率的降低。而且不同藻類的生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)習(xí)性各異，培養(yǎng)中出現(xiàn)的諸如 藻體纏繞、附著、漂浮、聚集或沉降，影響光能、物質(zhì)的傳輸，導(dǎo)致了光生物反應(yīng)器難以實(shí)現(xiàn) 其高密度培養(yǎng)的設(shè)計(jì)要求。要實(shí)現(xiàn)大型藻類細(xì)胞在光生物反應(yīng)器條件下的培養(yǎng)，需要構(gòu)建適宜的藻體形態(tài)。 這是反應(yīng)器技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于構(gòu)建一種大型藻類的微球體形態(tài)及其構(gòu)建培養(yǎng)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案大型藻類的微球體形態(tài)大型藻類為具有較強(qiáng)細(xì)胞全能性的無性系，構(gòu)建成直徑 小于等于1cm的呈圓球狀的藻落形態(tài)，即為微球體(microsphere)，構(gòu)建成的微球體狀態(tài)使 藻類細(xì)胞停滯在構(gòu)建時(shí)的某一生長(zhǎng)階段不再繼續(xù)分化，進(jìn)而通過光生物反應(yīng)器進(jìn)行大量擴(kuò) 繁。所述微球體根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)劃分，其不同的表達(dá)形式由不同藻類的細(xì)胞結(jié)構(gòu)決定，分為 3種類型絨球狀，由單列細(xì)胞絲狀體構(gòu)成，藻絲呈輻射狀向外生長(zhǎng)；第二種是網(wǎng)狀，由多列 細(xì)胞組成的假膜體(線狀)分支交織而成；第三種是簇生，由幼葉狀體簇生而成，同時(shí)有的 夾雜后發(fā)生的單列細(xì)胞絲狀幼體。所述微球體的構(gòu)建過程如下對(duì)將要構(gòu)建微球體的大型藻，取其無性系，將其分 散、打碎，在藻類生物反應(yīng)器中進(jìn)行通氣懸浮培養(yǎng)，利用微重力和向光性的雙重作用，使藻 類細(xì)胞向四周全方位生長(zhǎng)，5-10天即可獲得形態(tài)穩(wěn)定均勻的球狀微球體。將分散、打碎的無性系藻類細(xì)胞置于質(zhì)量比1.5-3%的褐藻酸鈉溶液中，充分混 合使之分散均勻，而后將褐藻酸鈉藻段溶液全部滴入o. l-o. 2M的CaCl2溶液中進(jìn)行固化 10-30分鐘，其中液滴大小即為所得微球體的大小，可根據(jù)需要選擇、控制，即可獲得包埋著 藻體細(xì)胞的褐藻膠球；將包埋著藻體的小球于培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)7-14天，即可獲得較為穩(wěn) 定的微球體。所述分散、打碎的無性系藻類細(xì)胞是將大型藻用物理方式切段獲得大小均一的藻 段，藻段在0. 5-5mm。所述通氣懸浮培養(yǎng)是相反應(yīng)器去通氣使培養(yǎng)液體表面平穩(wěn)翻動(dòng)、無大 量氣泡破碎的狀態(tài)；同時(shí)在光照強(qiáng)度為30-90 u Em^s-1下培養(yǎng)。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明構(gòu)建的微球狀藻體為直徑< 1cm的圓球狀，可以有 效解決大型藻類在反應(yīng)器培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)的纏繞、貼壁和藻體成團(tuán)漂浮或下沉等問題，從 而使光生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)大型藻高密度培養(yǎng)。因此，利用細(xì)胞工程技術(shù)，誘導(dǎo)藻類外植體的 細(xì)胞全能性表達(dá)，獲得具有強(qiáng)擴(kuò)繁能力的藻類微型無性系——絲狀體。以各種藻類的無性 系為起始材料，通過培養(yǎng)條件的控制，將原本無序生長(zhǎng)的絲狀體，構(gòu)建成一定大小的球狀藻 落，得到適合反應(yīng)器培養(yǎng)的微球體(microsphere)，并能夠大量培養(yǎng)、擴(kuò)繁。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建所得絨球狀微球體(蜈蚣藻)。圖2為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建所得網(wǎng)團(tuán)狀微球體(多管藻)。圖3為本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建所得簇生狀微球體。(孔石莼)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1大型海藻選擇蜈蚣藻(Grateloupia filicina)絲狀體，用物理方式即手術(shù)剪切段 或用磁力攪拌器打碎成2mm左右的藻團(tuán)。將藻團(tuán)于藻類光生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。藻類生物反應(yīng)器表面光照強(qiáng)度為 45-70 iiEn^s—1，光暗周期為12h 12h。反應(yīng)器中連續(xù)通入無菌空氣，將進(jìn)氣量控制在培養(yǎng) 液體表面平穩(wěn)翻動(dòng)、無大量氣泡破碎的狀態(tài)；常溫下培養(yǎng)5天左右，原無性系藻絲呈輻射狀 向外生長(zhǎng)，形成均勻的球狀藻落，即得到絨球狀微球體(參見圖1)。另外紫菜(Porphyra yezoensis)絲狀體，海帶(Laminaria japonica)禾口裙帶菜(Undaria pinnatifida)的配子 體也可構(gòu)建成絨球狀微球體?；蛘邔⒋蛩榈慕z狀體藻團(tuán)混合到一定量的質(zhì)量比濃度為2%的褐藻酸鈉溶液中， 使之分散均勻，用滴管或注射器滴于0. 15M的CaCl2溶液中固化。20分鐘后從溶液中取出 包埋著藻體的褐藻膠小球，用消毒海水清洗，于培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)。12天后，即可獲得呈球 形生長(zhǎng)的絨球狀微球體，可用于光生物反應(yīng)器培養(yǎng)。大型海藻在形成微球體后，將停滯在這一生長(zhǎng)階段而不會(huì)發(fā)育分化；而且由于藻 體細(xì)胞都具有再生能力，利用這一特性可以將這些微球體不斷剪碎培養(yǎng)，大量擴(kuò)增為新的 微球體。所述藻段培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)液為PES培養(yǎng)基配方或其它常規(guī)藻類培養(yǎng)液。實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于大型海藻選擇多管藻(Polysiphonia urceolata)絲狀體無性系，將藻體用物理方 式即手術(shù)剪刀剪碎，獲得l_3mm左右的絲狀體藻段。所述藻段置于2% (質(zhì)量比)褐藻酸鈉溶液中使之分散均勻，而后用細(xì)滴管將混 合有藻絲的褐藻酸鈉溶液滴于0. 1M的CaCl2溶液中進(jìn)行固化，15-30分鐘后獲得包埋著藻 體的藻膠球，消毒海水清洗后，于培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)液采用PES海水加富型培養(yǎng)基配 方，溫度控制在20°C左右，光強(qiáng)eOiiEn^s—1左右，光暗周期為12h 12h。每5天更換一次培 養(yǎng)液。2周左右原包埋的絲狀藻體即可在藻膠球中呈球狀生長(zhǎng)，，即得到網(wǎng)狀微球體(參見
4圖2)，是由多列細(xì)胞組成的假膜體(線狀)分支交織而成。類似能形成網(wǎng)狀微球體結(jié)構(gòu)的 海藻還有細(xì)基江蘺(Gracilaria tenuistipitata)、剛毛藻等(Cladophora sericioides)?；蛘咧苯訉⑽锢矸绞角懈詈蟮脑褰z，于藻類生物反應(yīng)器中連續(xù)通氣培養(yǎng)，在微重 力和向光性的雙重作用下，藻絲向四周全方位生長(zhǎng)，形成球狀藻落，即得到網(wǎng)狀微球體。實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于大型海藻選擇孔石莼(Ulva pertusa)，將藻體用物理方式即用手術(shù)刀切碎成1mm 左右的片段。將切碎的藻體片段于藻類光生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。反應(yīng)器表面入射光強(qiáng)約 為gSyEnT、-1，光暗周期為12h 12h;向生物反應(yīng)器中連續(xù)通入無菌空氣，通氣量為 0. lSm^tr1，室溫(20°C左右)下培養(yǎng)7天左右，藻體以各藻體片段為中心向四周輻射生長(zhǎng) 形成球狀藻落，即得到簇生微球體(參見圖3)，是由幼葉狀體簇生而成，同時(shí)有的夾雜后發(fā) 生的單列細(xì)胞絲狀幼體。另外滸苔(Enteromorpha prolifera)，海帶、裙帶菜幼孢子體也將 構(gòu)建成簇生微球體?；蛘邔⑶兴榈脑弩w于濃度為2% (質(zhì)量比)的褐藻酸鈉溶液中分散均勻，用滴管滴 于0. 1M的CaCl2溶液中進(jìn)行固化，15分鐘后可獲得包埋著藻體的小球，將包埋著藻體的藻 膠球于培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)10天左右，可獲得在藻膠球內(nèi)呈球生長(zhǎng)的微球體。上述構(gòu)建所得微球體大小可控制在5mm-15mm，從而能夠利用光生物反應(yīng)器進(jìn)行高 密度培養(yǎng)(培養(yǎng)密度可達(dá)30g Fff/L以上)，具有較高的光能利用效率而不會(huì)出現(xiàn)附壁、纏 繞、細(xì)胞分化等不利于藻體擴(kuò)繁的情況。此外，淡水大型藻類亦可上述辦法，通過人工調(diào)控將之構(gòu)建成微球體 (microsphere)0上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種大型藻類的微球體形態(tài)，其特征在于大型藻類為具有較強(qiáng)細(xì)胞全能性的無性系，構(gòu)建成直徑小于等于1cm的呈圓球狀的藻落形態(tài)，即為微球體(microsphere)，構(gòu)建成的微球體狀態(tài)使藻類細(xì)胞停滯在構(gòu)建時(shí)的某一生長(zhǎng)階段不再繼續(xù)分化，進(jìn)而通過光生物反應(yīng)器進(jìn)行大量擴(kuò)繁。
2.按權(quán)利要求1所述的大型藻類的微球體形態(tài)，其主要特征在于所述微球體根據(jù)其 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)劃分，其不同的表達(dá)形式由不同藻類的細(xì)胞結(jié)構(gòu)決定，分為3種類型絨球狀，由 單列細(xì)胞絲狀體構(gòu)成，藻絲呈輻射狀向外生長(zhǎng)；第二種是網(wǎng)狀，由多列細(xì)胞組成的假膜體 (線狀)分支交織而成；第三種是簇生，由幼葉狀體簇生而成，同時(shí)有的夾雜后發(fā)生的單列 細(xì)胞絲狀幼體。
3.按權(quán)利要求1所述的大型藻類的微球體形態(tài)的構(gòu)建培養(yǎng)方法，其特征在于所述微 球體的構(gòu)建過程如下對(duì)將要構(gòu)建微球體的大型藻，取其無性系，將其分散、打碎，在藻類生 物反應(yīng)器中進(jìn)行通氣懸浮培養(yǎng)，利用微重力和向光性的雙重作用，使藻類細(xì)胞向四周全方 位生長(zhǎng)，5-10天即可獲得形態(tài)穩(wěn)定均勻的球狀微球體。
4.按權(quán)利要求3所述的大型藻類的微球體形態(tài)的構(gòu)建培養(yǎng)方法，其特征在于，將分散、 打碎的無性系藻類細(xì)胞置于1. 5-3%的褐藻酸鈉溶液中，充分混合使之分散均勻，而后將褐 藻酸鈉藻段溶液全部滴入0. 1-0. 2M的CaCl2溶液中進(jìn)行固化10-30分鐘，即可獲得包埋著 藻體細(xì)胞的褐藻膠球；將包埋著藻體的小球于培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)7-14天，即可獲得較為穩(wěn) 定的微球體。
5.按權(quán)利要求3或4所述的大型藻類的微球體形態(tài)的構(gòu)建培養(yǎng)方法，其特征在于所 述分散、打碎的無性系藻類細(xì)胞是將大型藻用物理方式切段獲得大小均一的藻段，藻段在 0. 5_5mm0
6.按權(quán)利要求3所述的大型藻類的微球體形態(tài)的構(gòu)建培養(yǎng)方法，其特征在于所述通 氣懸浮培養(yǎng)是相反應(yīng)器去通氣使培養(yǎng)液體表面平穩(wěn)翻動(dòng)、無大量氣泡破碎的狀態(tài)；同時(shí)在 光照強(qiáng)度為30-90 μ EnT2s-1下培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及藻類細(xì)胞培養(yǎng)和生物技術(shù)，具體的說是一種具有較強(qiáng)細(xì)胞全能性、處于未分化狀態(tài)的大型藻類無性系形態(tài)構(gòu)建。所述構(gòu)建形態(tài)為球狀藻落，即微球體(microsphere)。本發(fā)明構(gòu)建的微球狀藻體為直徑小于1cm的圓球狀。本發(fā)明能夠有效解決大型藻培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的貼壁、藻體成團(tuán)漂浮或下沉以及與反應(yīng)器部件纏繞等問題，便于光生物反應(yīng)器進(jìn)行高密度培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N11/10GK101864409SQ20101018026
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者周百成, 王金霞, 董逸 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所