專(zhuān)利名稱(chēng)：在外科或治療性治療哺乳動(dòng)物的方法中或在診斷方法中使用的、特別是用作血漿容量擴(kuò) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高支化支鏈淀粉的用途。
具體而言，本發(fā)明涉及具有特定支化度和特定分子量Mw的高支化支鏈淀粉的新用途。
在血漿容量擴(kuò)充劑的發(fā)展歷程中，獲得血清中具有膠體滲透壓的天然載體即白蛋白的球形結(jié)構(gòu)一直是所追求的目標(biāo)之一。同樣作為天然保有物多糖存在于人體器官中的糖原與所述球形結(jié)構(gòu)最為類(lèi)似。糖原因其非常高的支化度而具有球形結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)的角度而言，糖原是一種多聚葡萄糖，其直鏈部分具有α-1，4糖苷鍵，其上鍥合有α-1，6糖苷鍵的支化位點(diǎn)。由于糖原本身不能作為便宜的天然物質(zhì)來(lái)源，Wiedersheim于1957年建議使用分支較少的支鏈淀粉作為起始物質(zhì)以制備血漿擴(kuò)充劑羥乙基淀粉(HES)。同時(shí)，幾種不同類(lèi)型的羥乙基淀粉正被廣泛用作血漿擴(kuò)充劑。這一發(fā)展已產(chǎn)生了新型羥乙基淀粉類(lèi)型(HES型)，其具有最佳容積學(xué)效果但副作用(如例如影響凝血或組織間殘留)最小。
市售的各種類(lèi)型的HES在分子量、平均取代度及取代模式方面各不相同。
盡管通過(guò)這些改進(jìn)已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但即使是對(duì)于近幾年來(lái)最佳的HES而言也仍然存在一些缺點(diǎn)，尤其是不能被完全代謝。
但是眾所周知從化學(xué)角度而言，羥乙基醚基團(tuán)的代謝穩(wěn)定性極高，以至于帶有羥乙基醚基團(tuán)的羥乙基淀粉中的那些失水葡萄糖(anhydroglucose)單元實(shí)際上不可能被代謝。此外，已知在羥乙基淀粉分子中，只有那些由未取代的葡萄糖單體形成的α-1，4-糖苷鍵可被血清α-淀粉酶裂解。因此，已發(fā)現(xiàn)即使是最佳類(lèi)型的HES，在至少一定的時(shí)間內(nèi)也可確定存在雖然最低但仍顯著的組織殘留。
HES的另一個(gè)缺點(diǎn)是已發(fā)現(xiàn)其不具備白蛋白的理想球形結(jié)構(gòu)，因此其特性粘度也顯著高于白蛋白。對(duì)于血漿容量擴(kuò)充劑而言，需要具有較低的粘度，在將其應(yīng)用于循環(huán)中后，血液的總粘度將受到影響而降低。
因此，目前的任務(wù)是基于支鏈淀粉開(kāi)發(fā)新的改進(jìn)的血漿擴(kuò)充劑，所述擴(kuò)充劑不具有支鏈淀粉衍生物，即羥乙基淀粉的代謝不完全的缺點(diǎn)。同時(shí)新的血漿擴(kuò)充劑應(yīng)具有更接近球形的結(jié)構(gòu)，從而能夠形成粘度較低的溶液。
開(kāi)辟某些支鏈淀粉的其它應(yīng)用領(lǐng)域也可認(rèn)為是本發(fā)明的任務(wù)之一。
這些任務(wù)以及其它任務(wù)可由權(quán)利要求1的主題實(shí)現(xiàn)，所述其它任務(wù)雖然在此未詳細(xì)列出，但可方便且容易地從前言介紹歸納得到。優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方案為返引權(quán)利要求1的權(quán)利要求的主題。
通過(guò)在外科或治療性治療人或動(dòng)物體(包括哺乳動(dòng)物)的方法中或在診斷方法中使用摩爾平均支化度為大于10％至25％且平均分子量Mw為40,000至800,000道爾頓的高支化支鏈淀粉及必要時(shí)使用其衍生物，一方面有可能以不可直接預(yù)見(jiàn)的方式開(kāi)辟出高支化支鏈淀粉在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一些新的、有趣的應(yīng)用，另一方面，具體地在有關(guān)“血漿容量擴(kuò)充”領(lǐng)域，可提供近乎理想的目前仍普遍使用的基于淀粉的HES產(chǎn)品的替代品，使危險(xiǎn)的副作用大大減少。
關(guān)于血漿容量擴(kuò)充，經(jīng)過(guò)廣泛的研究和調(diào)查，本發(fā)明實(shí)際已發(fā)現(xiàn)在施用血漿擴(kuò)充劑的數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天后，血流和尿液中羥乙基淀粉殘留部分與最初輸注的羥乙基淀粉(HES產(chǎn)品)相比在支化度方面明顯增加。因此，以帶有支化點(diǎn)的無(wú)水葡萄糖的摩爾百分比表示的支化度在施用后2小時(shí)自約5％增至高于7％且于施用7小時(shí)后達(dá)到8％。與此同時(shí)，輸注后42至48小時(shí)的全尿樣本中，可觀察到9％或10％這樣更高的摩爾支化度。研究發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與所施用羥乙基淀粉的分子量、取代程度或取代模式無(wú)關(guān)。這意味著這些成分在裂解時(shí)逐漸獲得類(lèi)似于糖原的結(jié)構(gòu)和/或支化程度，按照文獻(xiàn)記載，糖原的支化水平高達(dá)約10％的摩爾百分比。
足以令人驚訝的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以利用支鏈淀粉及其衍生物中α-(1，6)分支的相對(duì)穩(wěn)定性以使支鏈淀粉的裂解與占支配地位的α-淀粉酶裂解相比減少到一定程度，在此裂解程度下可生成能夠完全裂解的多糖，但在藥代動(dòng)力學(xué)和/或容積效應(yīng)方面仍然具有理想血漿容量擴(kuò)充劑的特性。
因而，本發(fā)明包括高支化支鏈淀粉以及這種高支化支鏈淀粉的衍生物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的用途。
術(shù)語(yǔ)“支鏈淀粉”一般首先應(yīng)理解為在葡萄糖分子間具有α-(1，4)和α-(1，6)鍵的所有支鏈的淀粉或淀粉產(chǎn)品。鏈的分支由α-(1，6)鍵形成。對(duì)于天然存在的支鏈淀粉，鏈的分支呈不規(guī)則方式，約每15至30個(gè)葡萄糖片段分支一次。天然存在的支鏈淀粉的分子量非常大，即107至2×108道爾頓。據(jù)認(rèn)為支鏈淀粉在某些條件下也可形成螺旋。
可以對(duì)支鏈淀粉的支化度進(jìn)行定義。攜帶支化點(diǎn)(α-(1，6)鍵)的失水葡萄糖分子數(shù)在支鏈淀粉的失水葡萄糖分子總數(shù)中所占的比例是支化度的量度，該比例以摩爾比形式表示。天然存在的支鏈淀粉的摩爾支化度為約4％。但已知當(dāng)對(duì)個(gè)體進(jìn)行考察時(shí)，支鏈淀粉簇和分子片段的支化度略高于天然平均支化度。
本發(fā)明意義上的高支化支鏈淀粉是那些支化度顯著高于已知的天然支鏈淀粉的支化度的支鏈淀粉。在任何情況下，支化度均為平均值(平均支化度)，因?yàn)橹ф湹矸凼嵌喾稚⑿晕镔|(zhì)。
這種高支化支鏈淀粉與未改變的支鏈淀粉或羥乙基淀粉相比，具有顯著較高的支化度，所述支化度以分支無(wú)水葡萄糖的摩爾百分比表示，因而在結(jié)構(gòu)方面與糖原更為接近。
對(duì)于本發(fā)明的應(yīng)用，必需的高支化支鏈淀粉的摩爾平均支化度在大于10％至25％的范圍內(nèi)。這意味著本發(fā)明意義上可使用的支鏈淀粉中，平均約每10至14個(gè)葡萄糖單元具有一個(gè)α-(1，6)鍵，從而具有一個(gè)支化位點(diǎn)。如果摩爾支化度低于10％，則延緩分支支鏈淀粉裂解的作用將不夠充分(例如在作為血漿容量擴(kuò)充劑的情況下)。如果摩爾支化度高于25％，則裂解被過(guò)度延緩，以使其作為血漿容量擴(kuò)充劑的用途例如被排除。
可優(yōu)選用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種類(lèi)型的支鏈淀粉的特征在于摩爾支化度為11％至16％。
其它優(yōu)選的高支化支鏈淀粉的摩爾支化度為13％至16％。
另外，高支化支鏈淀粉的分子量Mw也很重要。所述分子量Mw指的是重均分子量，其可用相關(guān)提供該平均值的方法測(cè)得。這些方法包括水性凝膠滲透色譜法(GPC)、高效液相色譜法(HPLC)、光散射法等。
根據(jù)本發(fā)明適用的高支化支鏈淀粉顯示的重均分子量數(shù)值通常為40,000至800,000道爾頓。分子量范圍的下限數(shù)值Mw是在優(yōu)選應(yīng)用的情況下、基本上根據(jù)所謂的“腎閾值”而確定，其對(duì)于高分支化合物而言必須設(shè)定為約40,000。如果Mw小于40,000道爾頓，分子經(jīng)腎的濾除將過(guò)快。而Mw高于800,000道爾頓時(shí)，即便對(duì)于球形結(jié)構(gòu)而言極限粘度不再取決于分子量，也不能獲得額外的值得提及的效用。
對(duì)于作為血漿容量擴(kuò)充劑的用途而言，Mw平均值優(yōu)選為90,000至300,000道爾頓，尤其適合的是120,000至250,000道爾頓的分子量Mw。
本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案包括高支化支鏈淀粉，其平均摩爾支化度為11％至16％，分子量為90,000至300,000道爾頓。其它適合的本發(fā)明的實(shí)施方案包括高支化支鏈淀粉，其平均摩爾支化度為13％至16％，分子量Mw為120,000至250,000道爾頓。
上述參數(shù)，即支化度和分子量，使靶向作用得以發(fā)揮，從而可設(shè)定所需的藥代動(dòng)力學(xué)，尤其是可獲得所需的α-淀粉酶裂解作用。在這方面，支鏈淀粉的支化度發(fā)揮關(guān)鍵性作用。然而分子量也影響相關(guān)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。此外，通過(guò)改變支化位點(diǎn)的分布也可能影響支鏈淀粉的裂解動(dòng)力學(xué)，以使其向所需的方向進(jìn)行。
對(duì)于支鏈淀粉的α-淀粉酶裂解以及因此對(duì)于血漿容量擴(kuò)充劑的應(yīng)用而言，支化度尤其重要。由于高度支化，α-淀粉酶的進(jìn)攻被極大的延遲，并且在分子中支化位點(diǎn)密度大的區(qū)域，α-淀粉酶的進(jìn)攻被完全消除，因?yàn)棣?淀粉酶不可能靠近所述區(qū)域。不過(guò)這種化合物能夠被其它酶降解為寡糖并最終裂解為葡萄糖。
如果需要，本發(fā)明中使用的高支化支鏈淀粉也可以為其衍生物形式。這種衍生物包括支鏈淀粉的化學(xué)衍生物，如例如通過(guò)化學(xué)或生物技術(shù)轉(zhuǎn)化可得到的那些衍生物。
優(yōu)選的高支化支鏈淀粉衍生物是羥乙基支鏈淀粉、羥丙基支鏈淀粉和乙?；ф湹矸邸６渲惺褂昧u乙基支鏈淀粉尤其有利。因此，支鏈淀粉裂解的動(dòng)力學(xué)也受到衍生化的影響。然而在這些情況下，顯著較低的衍生化程度、例如羥乙基化程度是有利的，以便獲得與由正常支化支鏈淀粉制備的羥乙基淀粉(HES)相當(dāng)?shù)娜莘e效應(yīng)或相似的藥代動(dòng)力學(xué)。
本發(fā)明意義上適合的選擇之一且優(yōu)選用作血漿容量擴(kuò)充劑的高支化支鏈淀粉的制備以這樣一種已知的方式進(jìn)行用所謂的支化酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所述支化酶可催化α-1，4糖苷鍵水解并將其轉(zhuǎn)化為α-1，6糖苷化合物。這類(lèi)所謂的轉(zhuǎn)移酶可用已知方法、例如根據(jù)PCT WO 0018893從海藻中提取。但是，由US 4454161和EP 0418945可知，也可相應(yīng)地使用其它糖原支化酶。酶法轉(zhuǎn)糖基作用的實(shí)施按照已知的方式進(jìn)行，如例如將蠟質(zhì)玉米淀粉與相應(yīng)的酶在pH約7.5、溫度約30℃的溫和條件下于水溶液中溫育。隨后再以已知的方式對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行處理，首先使酶失活或通過(guò)改變pH或過(guò)濾步驟將酶除去。
在隨后優(yōu)選使用鹽酸進(jìn)行的水解步驟中，可對(duì)所需的產(chǎn)品分子量進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過(guò)使用截留分子量約3,000道爾頓的膜進(jìn)行滲濾，可從產(chǎn)物中除去低分子量化合物和在酸性水解產(chǎn)物的中和過(guò)程中所形成的鹽。所得產(chǎn)物用例如噴霧干燥進(jìn)行分離。
除了被用作血漿容量擴(kuò)充劑外，高支化支鏈淀粉通常還可用于其它醫(yī)藥領(lǐng)域。因此，高支化支鏈淀粉在可使用基于標(biāo)準(zhǔn)支化型淀粉的標(biāo)準(zhǔn)HES產(chǎn)品的治療學(xué)和外科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的所有應(yīng)用中均可使用。
除了作為血漿容量擴(kuò)充劑的用途外，本發(fā)明還優(yōu)選涉及高支化支鏈淀粉改進(jìn)微循環(huán)的用途、作為與白細(xì)胞采集有關(guān)的細(xì)胞分離中的助沉淀劑的用途，或用于血成分如紅細(xì)胞或粒細(xì)胞的低溫保存的用途。
模型實(shí)施例1支化方式不同的α-1，4/α-1，6葡萄糖化合物的對(duì)比裂解試驗(yàn)在70℃、pH6.0、含30％DMSO的DMSO/水混合物中，用得自NOVOZYMES的BAN 480L型α-淀粉酶對(duì)得自SIGMA的牡蠣糖原進(jìn)行裂解。通過(guò)用凝膠色譜法測(cè)定分子量的變化監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，在約2小時(shí)后通過(guò)加入苛性鈉溶液使酶失活從而終止反應(yīng)。中和后，使用標(biāo)定截留分子量為1,000D和25,000D的醋酸纖維素超濾器進(jìn)行超濾，將產(chǎn)物分級(jí)，以除去低分子量級(jí)分，保留高分子量級(jí)分。隨后用離子交換劑Amberlite IR200C和活性炭處理產(chǎn)物、用乙醇沉淀并于80℃下干燥。
用1H NMR光譜測(cè)定的支化度(對(duì)端基質(zhì)子信號(hào)進(jìn)行積分)為摩爾支化度15％。平均分子量Mw為7,000道爾頓。
按照與上述同樣的方法處理沸騰的稀蠟質(zhì)玉米淀粉(支鏈淀粉≥95％)(Cerestar)。所分離的支化簇的高支化部分的摩爾支化度為11％，平均分子量Mw為8,000道爾頓。
隨后，使用豬胰α-淀粉酶(Roche)對(duì)支鏈淀粉的高度分支簇級(jí)分和糖原進(jìn)行裂解實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)于37℃、pH7.2磷酸緩沖液、1％的溶液中進(jìn)行，酶濃度為0.5IU/ml。通過(guò)凝膠色譜法測(cè)定分子量的變化監(jiān)測(cè)裂解動(dòng)力學(xué)。同時(shí)用市售的血漿容量擴(kuò)充劑羥乙基淀粉(Voluven，F(xiàn)resenius Kabi)進(jìn)行對(duì)比裂解試驗(yàn)。在裂解動(dòng)力學(xué)方面發(fā)現(xiàn)了明顯的差異對(duì)支化度為15％的級(jí)分，分子量的半衰期(起始物質(zhì)的平均分子量Mw降至初始值一半的時(shí)間)為60分鐘，因此達(dá)到在同樣實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定的Voluven血漿容量擴(kuò)充劑的半衰期。
另一方面，平均摩爾支化度為11％的組分，半衰期顯著縮短，只有25分鐘。
模型實(shí)施例2按照實(shí)施例1中給出的條件，使用豬胰α-淀粉酶對(duì)經(jīng)NMR測(cè)定摩爾平均支化度為4％的沸騰的稀蠟質(zhì)玉米淀粉(Cerestar)進(jìn)行裂解試驗(yàn)。為此，將1％的溶液在pH7.2的磷酸鹽緩沖液中短時(shí)加熱至約90℃進(jìn)行膠化，冷卻后向產(chǎn)物中加入一定量的酶，使其濃度為0.5IU/ml。
試驗(yàn)溫度為37℃。
通過(guò)凝膠色譜法測(cè)定分子量的變化從而監(jiān)測(cè)裂解動(dòng)力學(xué)。在與實(shí)施例1相同的條件下，10分鐘內(nèi)起始物質(zhì)的分子量即降低一半。
與實(shí)施例1的高支化α-1，4/α-1，6葡萄糖化合物相比，平均支化度相對(duì)低的稀沸騰蠟質(zhì)玉米淀粉被α-淀粉酶裂解的速度如此之快，致使其不能用作血漿容量擴(kuò)充劑。
這樣，兩個(gè)模型實(shí)施例1和2證明即使分子量低，但較高的支化度可延緩α-淀粉酶的裂解作用，且該效應(yīng)可用于制備血漿容量擴(kuò)充劑。
權(quán)利要求
1.高支化支鏈淀粉及其衍生物，其平均摩爾支化度為大于10至25％，平均分子量Mw為40,000至800,000道爾頓，用于人或動(dòng)物體的外科或治療性治療方法或診斷方法。
2.權(quán)利要求1的高支化支鏈淀粉，其用作血漿容量擴(kuò)充劑。
3.權(quán)利要求1的高支化支鏈淀粉，其用于改善微循環(huán)。
4.權(quán)利要求1的高支化支鏈淀粉，其在與白細(xì)胞采集相關(guān)的細(xì)胞分離中用作助沉淀劑。
5.權(quán)利要求1的高支化支鏈淀粉，其用于血成分如紅細(xì)胞或粒細(xì)胞的低溫保存。
6.上述權(quán)利要求之一的高支化支鏈淀粉，其平均摩爾支化度為11％至16％且分子量為90,000至300,000道爾頓。
7.上述權(quán)利要求1至5之一的高支化支鏈淀粉，其平均摩爾支化度為13％至16％且分子量為120,000和250,000道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明涉及高支化支鏈淀粉及其衍生物在外科或治療性治療人或動(dòng)物體的方法中或在診斷方法中的用途，優(yōu)選作為血漿容量擴(kuò)充劑的用途，所述高支化支鏈淀粉的平均摩爾支化度為大于10％至25％，分子量(Mw)為40,000至800,000道爾頓?；诹u乙基化支鏈淀粉的血漿容量擴(kuò)充劑由于羥乙基化作用已顯示出不完全代謝以及因此導(dǎo)致的與副作用有關(guān)的短時(shí)組織殘留的缺點(diǎn)。本發(fā)明提供了新的基于多糖的血漿容量擴(kuò)充劑，其不顯示與前者類(lèi)似的缺點(diǎn)。改進(jìn)的完全代謝的血漿容量擴(kuò)充劑基于高支化支鏈淀粉，高支化支鏈淀粉可通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用改變天然植物支鏈淀粉而獲得，以使其獲得可調(diào)節(jié)且較高的支化度，所述支化度可控制血清－α－淀粉酶的裂解作用，從而無(wú)需或僅需極其少量的羥乙基化程度。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1545522SQ02816354
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2002年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月22日
發(fā)明者K·佐默邁爾, K 佐默邁爾 申請(qǐng)人:超分子非腸道膠體有限公司