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神經(jīng)胚活素的多聚體偶聯(lián)物及其應(yīng)用方法

文檔序號:825385閱讀:476來源:國知局
專利名稱:神經(jīng)胚活素的多聚體偶聯(lián)物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明通常涉及多肽尤其是修飾的神經(jīng)營養(yǎng)性多肽以及這些修飾性多肽的使用方法。
背景技術(shù)
神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotropic factor)是可促進神經(jīng)元細胞和組織生存,維持表型分化,防止退化以及增強其活性的天然蛋白。神經(jīng)營養(yǎng)因子是從神經(jīng)組織和由神經(jīng)系統(tǒng)支配的非神經(jīng)組織分離得來的,已根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)分成了相關(guān)的數(shù)個組,也稱為家族,超家族或亞家族。在這些神經(jīng)營養(yǎng)因子超家族中有成纖維細胞生長因子,神經(jīng)營養(yǎng)蛋白以及轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族。每種神經(jīng)營養(yǎng)因子在生理結(jié)構(gòu),與其相關(guān)受體之間的作用和對各種類型神經(jīng)細胞的作用方面都有所不同。神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的配體歸類為TGF-β超家族,所述配體包括GDNF,persephin(PSP)以及neurturin(NTN)。
GDNF超家族的配體都能通過RET受體酪氨酸激酶誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)。GDNF超家族的這三種配體在它們對神經(jīng)營養(yǎng)性受體,GFRα受體家族的相對親和性方面不同。
近來提及的神經(jīng)營養(yǎng)因子是“神經(jīng)胚活素(neublastin)”或稱“NBN”。神經(jīng)胚活素因其與其它GDNF配體有同源區(qū),能結(jié)合并活化RET,因此被歸類于GDNF超家族。與其它GDNF配體不同,神經(jīng)胚活素對GFRα3-REF受體復(fù)合物有高度的選擇性。另外,NBN在其氨基酸序列中包含獨特的亞區(qū)。
遺憾的是,神經(jīng)胚活素可被身體迅速清除。這種快速清除作用影響了神經(jīng)胚活素在治療方面的應(yīng)用。因此,有必要尋找到生物利用率提高的神經(jīng)胚活素變體。
發(fā)明簡述本發(fā)明是部分基于新形式神經(jīng)胚活素的發(fā)現(xiàn),該神經(jīng)胚活素顯示體內(nèi)藥物動力學(xué)特性和生物利用率特性提高。這些新形式包括與多聚體分子偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多肽變體。
一方面,本發(fā)明的特征是神經(jīng)胚活素多肽變體,或神經(jīng)胚活素多肽突變蛋白,其包括在成熟神經(jīng)胚活素二聚體暴露于溶劑的位置有一個或多個氨基酸取代的氨基酸序列。本發(fā)明的取代導(dǎo)入到天然神經(jīng)胚活素多肽的一個或多個位點,在這些位點一些物質(zhì),如天然或合成的多聚體可與所述多肽偶聯(lián)以提高其溶解性,并因此提高其體內(nèi)的生物利用率。優(yōu)選,本發(fā)明的多肽變體包括與SEQ ID NO1的氨基酸8-113至少70%相同的氨基酸序列。這種神經(jīng)胚活素多肽變體包括一個或多個氨基酸取代,依照SEQ ID NO1的多肽序列對氨基酸的位置進行編號時,在多肽變體的氨基酸序列的第14位一個氨基酸取代了精氨酸,在多肽變體氨基酸序列的第39位,一個氨基酸取代了精氨酸,在多肽變體的第68位一氨基酸取代了精氨酸或在多肽變體的第95位一氨基酸取代了天冬酰胺。
本發(fā)明所用“野生型神經(jīng)胚活素”或“wt-NBN”是指天然存在的或天然的神經(jīng)胚活素多肽序列,如大鼠、小鼠或人的神經(jīng)胚活素的天然序列(參見,例如SEQ ID NO2,3或4)。具體的神經(jīng)胚活素多肽變體在本發(fā)明中是指“NBN-X1N1X2或X1N1X2-NBN”,其中X1是指野生型神經(jīng)胚活素多肽的氨基酸,N1是指X1氨基酸在序列中的編號位置,該編號是根據(jù)SEQ ID NO1進行的。X2是指在序列的指定編號位置上取代野生型氨基酸的氨基酸。例如,NBN-N95K就是指在95位上天冬酰胺被賴氨酸取代的神經(jīng)胚活素多肽變體。
神經(jīng)胚活素多肽變體可以作為多聚體多肽提供。例如其可以作為其中至少包括一個神經(jīng)胚活素多肽變體的二聚體提供。在優(yōu)選實施方案中,所述二聚體是神經(jīng)胚活素多肽變體的同二聚體。在另一些實施方案中,所述二聚體是其中包括一個神經(jīng)胚活素多肽變體和一個野生型神經(jīng)胚活素多肽的異二聚體。其它的二聚體可以包括二個不同的神經(jīng)胚活素多肽變體形式。
在優(yōu)選實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽變體除氨基酸8-113之外還包括SEQ ID NO1的氨基酸1-7。
在優(yōu)選實施方案中,當所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時,其與GFRα3結(jié)合。在另一些優(yōu)選實施方案中,當所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時,其自身或與GFRα3結(jié)合時,刺激RET多肽的酪氨酸磷酸化。
在另一些優(yōu)選實施方案中,所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時,可有助于(enhance)神經(jīng)元的存活,例如有助于感覺神經(jīng)元的存活。。
在另一些優(yōu)選實施方案中,所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時,可使神經(jīng)元,如感覺神經(jīng)元的病理改變恢復(fù)正常。
在另一些優(yōu)選實施方案中,所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時,可促進神經(jīng)元,例如自主神經(jīng)元或多巴胺能神經(jīng)元的存活。
在一些實施方案中,所述多肽變體包括2個,3個或多個選自下組的氨基酸取代在多肽變體氨基酸序列第14位精氨酸由氨基酸取代,在多肽變體氨基酸序列的第39位精氨酸由氨基酸取代,在多肽變體氨基酸序列的第68位精氨酸由氨基酸取代或在多肽變體氨基酸序列的第95位天冬酰胺由氨基酸取代。
在優(yōu)選實施方案中,在位置14,39,68和95之中的一個或多個位置的氨基酸是賴氨酸。
優(yōu)選,神經(jīng)胚活素多肽變體的8-94位氨基酸和96-113位氨基酸與SEQ ID NO1的8-94位氨基酸和96-113位氨基酸至少90%相同。更優(yōu)選95%相同。最優(yōu)選,神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸序列在神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸8-94和氨基酸96-113的位置包括天然大鼠,人或小鼠神經(jīng)胚活素多肽。例如,神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸8-94和96-113包括SEQID NO2,SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸8-94和氨基酸96-113的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供融合蛋白或多肽,包括神經(jīng)胚活素多肽變體或野生型神經(jīng)胚活素多肽,或二個神經(jīng)胚活素融合蛋白的二聚體蛋白。神經(jīng)胚活素融合蛋白在體內(nèi)也具有增強的藥物動力學(xué)和生物利用率特性。
另一方面,本發(fā)明提供了一種編碼神經(jīng)胚活素多肽變體的核酸分子。編碼神經(jīng)胚活素多肽變體的核酸分子優(yōu)選在載體中,例如在表達載體中提供。神經(jīng)胚活素變體核酸或包含該核酸的載體可在細胞中提供。該細胞可以是哺乳動物細胞系,真菌細胞,酵母細胞,昆蟲細胞或細菌細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢細胞(“CHO”細胞)。
本發(fā)明還提供通過在允許神經(jīng)胚活素多肽變體表達的條件下培養(yǎng)包含編碼神經(jīng)胚活素變體的核酸的細胞。然后如需要,回收所述神經(jīng)胚活素多肽變體。本發(fā)明還包括由細胞制備的神經(jīng)胚活素多肽變體。本文同時公開了本發(fā)明融合蛋白(如神經(jīng)胚活素血清白蛋白融合蛋白)的類似的核酸,載體,宿主細胞和多肽的制備方法。
本發(fā)明還提供了包括神經(jīng)胚活素多肽或與非天然多聚體偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多肽變體的組合物。該組合物中的神經(jīng)胚活素多肽變體在包括一個或多個選自下組的取代的情況下,其優(yōu)選包括與SEQ ID NO1的氨基酸8-113至少70%相同的氨基酸序列在多肽變體氨基酸序列第14位精氨酸由氨基酸取代,在多肽變體氨基酸序列的第39位精氨酸由氨基酸取代,在多肽變體的第68位精氨酸由氨基酸取代或在多肽變體的第95位天冬酰胺由氨基酸取代(其中,氨基酸的位置是依照SEQ ID NO1的多肽序列編號的)。
在優(yōu)選實施方案中,多聚體包括聚亞烷基二醇半分子,例如聚乙二醇半分子(PEG)。
在優(yōu)選實施方案中,聚亞烷基二醇半分子與神經(jīng)胚活素多肽的氨基偶聯(lián),或與神經(jīng)胚活素多肽變體中的賴氨酸偶聯(lián)。
偶聯(lián)可以通過N-羥基琥珀酰亞胺(NNS)活性酯來進行。該活性酯可以是,例如PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG),琥珀酰亞胺丁酸酯(SPB-PEG)或琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA-PEG)。
所述聚亞烷基二醇半分子可以是,例如,羧甲基-NHS,正亮氨酸-NHS,SC-PEG,tresylate,醛,環(huán)氧化物,羰基吲哚或PNP碳酸鹽。
在一些實施方案中,聚亞烷基二成半分子與神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的半胱氨酸基團偶聯(lián)。例如所述偶聯(lián)可以通過馬來酰亞胺基團,乙烯基砜(vinylsulfone)基團,鹵代乙酸(haloacetate)基團和巰基來完成。
在一些實施方案中,組合物中的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體是糖基化的。但神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體被糖基化后,多聚體可偶聯(lián)到糖基化的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的糖部分。例如,糖基化的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的腙基或氨基氧化后,或者多聚體的反應(yīng)基團氧化后,多聚體可偶聯(lián)到糖基化的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體。
在各種實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體包含一個,二個,三個或四個PEG半分子。
在優(yōu)選實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽,神經(jīng)胚活素多肽變體或多聚體偶聯(lián)物的血清半壽期比沒有多聚體的多肽或多肽變體的血清半壽期長。
在優(yōu)選實施方案中,在復(fù)合物中的神經(jīng)胚活素多肽,神經(jīng)胚活素多肽變體或多聚體偶聯(lián)物有選自如下的生理活性結(jié)合GFRα3,活化RET,使神經(jīng)元的病理改變正?;蛴兄谏窠?jīng)元存活。
“使神經(jīng)元的病理改變正?;笔侵副景l(fā)明的偶聯(lián)物可誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白表達水平、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體表達水平、離子通道表達水平和神經(jīng)傳導(dǎo)物表達水平中的一種或多種細胞參數(shù)的變化,或者可誘導(dǎo)細胞形態(tài)的改變,在每種情況下,使所述參數(shù)基本恢復(fù)到未受疾病,退化,傷害(insult)或損傷影響時相同或類似表型的神經(jīng)元所處的水平。神經(jīng)元病理改變的正?;捎妹庖呓M化法監(jiān)測,或通過檢測分泌的或脫落的細胞產(chǎn)物水平的變化監(jiān)測,或通過體內(nèi)評估生理上屬于受影響神經(jīng)元的功能的行為方面的變化。例如,在病理改變與神經(jīng)病性疼痛綜合征(neuropathic pain syndrome)有關(guān)的情況下,可監(jiān)測疼痛行為,如痛覺過敏,痛覺減退或異常性疼痛。
“促進神經(jīng)元存活”是指延長受影響神經(jīng)元的存活,使其存活時間超過對受同一類型疾病,病癥,傷害或損傷影響,但沒有經(jīng)過本發(fā)明的神經(jīng)胚活素偶聯(lián)物或融合蛋白治療的相應(yīng)神經(jīng)元所觀察到的存活時間。
在一些實施方案中,多聚體在神經(jīng)胚活素的N末端位點與多肽相偶聯(lián)。在一些實施方案中,多聚體在神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素變體的非末端氨基酸的位點與多肽偶聯(lián)。
在優(yōu)選實施方案中,多聚體與神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的暴露于溶劑的氨基酸偶聯(lián)。
在優(yōu)選實施方案中,多聚體在選自如下的殘基處與神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體偶聯(lián)多肽變體的氨基末端氨基酸,神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸序列的第14位氨基酸,神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸序列的第39位氨基酸,神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸序列的第68位氨基酸或神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸序列的第95位氨基酸。
本發(fā)明也提供了藥物組合物,其包含生理上可接受的載體,其中包含有或分散有神經(jīng)胚活素多肽,神經(jīng)胚活素多肽變體或本發(fā)明偶聯(lián)物。
另一方面,本發(fā)明包括穩(wěn)定的,水溶性的偶聯(lián)型神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的復(fù)合物,該復(fù)合物包括與聚乙二醇半分子偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體,其中的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體通過不穩(wěn)定的鍵與聚乙二醇半分子偶聯(lián)。在一些實施方案中,這種不穩(wěn)定的鍵可通過生化水解作用,蛋白裂解作用切斷,或通過裂解巰基切斷。在優(yōu)選實施方案中,該不穩(wěn)定的鍵可在體內(nèi)條件下斷裂。
本發(fā)明通過提供神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體,以及通過將該多肽或修飾的神經(jīng)胚活素多肽變體與非天然多聚體半分子偶聯(lián),從而形成偶聯(lián)的多聚體神經(jīng)胚活素多肽組合物,來提供制備體內(nèi)、體外活性比野生型神經(jīng)胚活素延長的修飾性神經(jīng)胚活素多肽的方法。
另一方面,本發(fā)明還通過給藥有此需要的受試者治療有效量的神經(jīng)胚活素多肽變體、包含與多聚體偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的組合物、包含穩(wěn)定的、水溶性的偶聯(lián)型神經(jīng)胚活素多肽的復(fù)合物或包含與聚乙二醇半分子偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的神經(jīng)胚活素多肽變體復(fù)合物,來治療或預(yù)防受試者(如人)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。
優(yōu)選,所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是周圍神經(jīng)疾病,如周圍神經(jīng)病或神經(jīng)病性疼痛綜合征。人是優(yōu)選進行治療的受試者。
給藥可以是,例如,全身的或局部的。
除非另有說明,本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與該發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同。盡管在實踐或檢驗本發(fā)明時可以使用與本文所述類似或等同的方法和材料,但本文以下還是對適當?shù)姆椒ê筒牧线M行了描述。本文所涉及的所有出版物、專利申請、專利和其它文獻在此全文引入作參考。在發(fā)生沖突時,以本說明書為準。另外,本發(fā)明的材料、方法和實施例僅用以描述,而非旨在對本發(fā)明進行限制。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點在以下詳細的說明和權(quán)利要求中是非常明顯的。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供能被修飾以提高其藥物動力學(xué)和生物利用率特性的新的神經(jīng)胚活素多肽變體。優(yōu)選的神經(jīng)胚活素多肽變體具有改變的氨基酸序列,該序列可促使與多聚體試劑如聚亞烷基二醇聚合物偶聯(lián)。
神經(jīng)胚活素多肽變體本發(fā)明提供了具有針對野生型神經(jīng)胚活素多肽序列而言改變的氨基酸序列的神經(jīng)胚活素多肽。人和小鼠的神經(jīng)胚活素多肽的氨基酸序列公開于WO00/01815。依照本發(fā)明的神經(jīng)胚活素多肽變體的實例在表1列舉。
優(yōu)選,選擇神經(jīng)胚活素多肽變體中改變的殘基以促進在經(jīng)修飾的氨基酸部位與多聚體如聚亞烷基二醇聚合物偶聯(lián)。神經(jīng)胚活素多肽的修飾的優(yōu)選位點是神經(jīng)胚活素多肽的溶劑可接近的區(qū)域。這些位點可根據(jù)對相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子、GDNF的晶體結(jié)構(gòu)的觀察而選擇(它們的晶體結(jié)構(gòu)描述于Nat.Struct.Biol.4435-38,1997))。這樣的位點也可以基于persephin/神經(jīng)胚活素嵌合蛋自提供的結(jié)構(gòu)-功能信息來選擇。這些嵌合體描述于J.Biol.Chem.2753412-20,2000。通過上述方法學(xué)而鑒定的溶劑可接近的神經(jīng)胚活素氨基酸或暴露于表面的神經(jīng)胚活素氨基酸的實例如表2所示。
本發(fā)明還包括含有與SEQ ID NO1的氨基酸8-113有至少70%相同的氨基酸序列的神經(jīng)胚活素多肽變體,它們列舉于表1。在一些實施方案中,在所述多肽氨基酸序列的第14位、第39位、第68位的精氨酸,或第95位的天冬酰胺被除精氨酸或天冬酰胺以外的其它氨基酸取代。優(yōu)選,野生型氨基酸被賴氨酸或半胱氨酸取代。
表11 AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRF 人AGTRSSRARTTDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRF 小鼠AGTRSSRARATDARGCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRF 大鼠ag---srar---argcrlrsqlvpv-alglgh-sdel-r共有序列41RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC 人RFCSGSCRRARSQHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC 小鼠RFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRSPPGSRPISQPC 大鼠rfcsgscrrars-hdlslasllgagalr-ppgsrp-sqp共有序列81CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVTDRLSATACGCLG 人(SEQ ID NO2)CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG 小鼠(SEQ ID NO3)CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG 大鼠(SEQ ID NO4)crptryeavsfmdvnstwrtvd-lsatacgclg 共有序列(SEQ ID NO1)
共有序列AlaGlyXaa1Xaa2Xaa3Ser Arg AlaArg Xaa4Xaa5Xaa6Ala Arg Gly CysArgLeuArgSer GlnLeu Val ProVal Xaa7Ala Leu Gly Leu Gly His Xaa8SerAspGluLeuXaa9ArgPhe Arg PheCys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Xaa9SerXaa10HisAsp LeuSer Leu AlaSer LeuLeu Gly Ala Gly Ala Leu ArgXaa11ProProGly SerArg Pro Xaa12Ser GlnPro Cys Cys Arg Pro Thr ArgTyrGluAlaVal SerPhe Met AspVal LysSer Thr Trp Arg Thr Val AspXaa13LeuSerAla ThrAla Cys GlyCys LeuGly其中Xaa1是Gly或ThrXaa2是Pro或ArgXaa3是Gly或SerXaa4是Ala或ThrXaa5是Ala或ThrXaa6是Gly或AspXaa7是Arg或SerXaa8是Arg或SerXaa9是Val或IleXaa10是Pro或GlnXaa11是Pro或SerXaa12是Val或IleXaa13是Arg或His
表2提供了人神經(jīng)胚活素中預(yù)測為暴露于表面的殘基和其編號表。暴露于表面的殘基通過檢測由A鏈和B鏈(PDB編碼1AGQ)形成的大鼠GDNF二聚體的結(jié)構(gòu),并檢測殘基是否是在該結(jié)構(gòu)表面來確定。將該結(jié)構(gòu)與GDNF和神經(jīng)胚活素進行序列對比(Baloh等,21卷,1291頁,1998)以確定神經(jīng)胚活素中的適當殘基。表1顯示了編號圖。
表21Ala n/a 40Phe - 79Pro -2Gly n/a 41Arg + 80Cys -3Gly n/a 42Phe + 81Cys -4Pro n/a 43Cys - 82Arg -5Gly n/a 44Ser + 83Pro -6Ser n/a 45Gly + 84Thr +7Arg n/a 46Ser + 85Arg +47Cys - 86Tyr +8Ala n/a 48Arg + 87Glu +9Arg n/a 49Arg + 88Ala +10Ala n/a 50Ala - 89Val +11Ala n/a 51Arg + 90Ser +12Gly + 52Ser + 91Phe -13Ala - 53Pro + 92Met +14Arg + 54His - 93Asp +15Gly + 55Asp - 94Val +16Cys - 56Leu + 95Asa +17Arg + 57Ser - 96Ser+18Leu + 58Leu - 97Thr +19Arg + 59Ala + 98Trp +20Ser + 60Ser + 99Arg +21Gln + 61Leu - 100Thr +22Leu + 62Leu + 101Val -23Val - 63Gly + 102Asp +24Pro + 64Ala + 103Arg +25Val - 65Gly + 104Leu -26Arg + 66Ala + 105Ser -27Ala + 67Leu - 106Ala -28Leu - 68Arg n/a 107Thr +29Gly + 69Pro n/a 108Ala +30Leu + 70Pro n/a 109Cys -31Gly + 71Pro n/a 110Gly +32His + 72Gly + 111Cys -33Arg + 73Ser + 112Leu +34Ser - 74Arg n/a 113Gly35Asp + 75Pro n/a n/a36Glu + 76Val -37Leu + 77Ser -38Val - 78Gln +39Arg +
n/a表示這些殘基不存在于GDNF結(jié)構(gòu)中。這或是因為構(gòu)建體的設(shè)計,可彎曲的區(qū)域,或是因為在相對于GDNF的神經(jīng)胚活素中的插入子(殘基68-71)。
-表示被掩藏的、不是在表面的殘基,或者是參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。因該蛋白是半胱氨酸結(jié)(knot),所以大部分殘基都在表面。
+表示該殘基在GDNF結(jié)構(gòu)中是暴露于表面的,所以盡管包含殘基66-75的環(huán)僅在一個GDNF單體(可能是可彎曲的)中是可見的,但推測該殘基在神經(jīng)胚活素中是暴露于表面的。該環(huán)在相對于GDNF的神經(jīng)胚活素中還包含4個殘基的插入子。
本文所用的“同一性”和“同源性”可互換使用,它們都是指兩個多肽,兩個分子或兩個核酸之間序列的相似性。當兩個相對比序列的同一位置被同一堿基或氨基酸單體亞單位占據(jù)時(例如,如果在兩個DNA分子的同一位置都被腺苷酸占據(jù),或者在兩個多肽的同一位置都被賴氨酸占據(jù)),那么這兩個分子在這一位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分比是兩個序列的吻合數(shù)或共有的同源位置數(shù)除以所有的位置數(shù)乘以100所得的函數(shù)。例如在兩個序列中10個位置中的6個是吻合的或同源的,那么這兩個序列是60%同源。依照這一實例計算,CTGACT和CAGGTT DNA序列之間的同源性是50%(總數(shù)為6的位置中有3個位置是吻合的)。通常,當兩個序列進行對比給出最大同源性時才進行比較。這種對比可如下進行,即使用例如Needleman等,J.Mol Biol.48443-453(1970)的方法,常規(guī)執(zhí)行計算機程序如Align程序(DNAstar,Inc.)而進行?!邦愃频摹毙蛄惺菍Ρ葧r有相同或相似氨基酸殘基的那些序列,其中所述類似的殘基是指對所對比的參考序列中的相應(yīng)的氨基酸殘基進行了保守取代的殘基或“被允許點突變”的殘基。所述參考序列中殘基的“保守取代”是指物理學(xué)或功能方面類似于相應(yīng)參考殘基的殘基對參考殘基的取代,例如所述殘基有類似的大小,形狀,電荷,化學(xué)特性,包括形成共價鍵或氫鍵的能力等等。因此,“保守取代的變體”序列是指與參考序列或野生型序列不同的序列,即存在一個或多個保守取代或允許的點突變的序列。
在優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的多肽與SEQ ID NO1的8-113位氨基酸85%,85%,90%,95%,98%或99%相同。在一些實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸序列包括大鼠,人或小鼠的天然神經(jīng)胚活素多肽1-94位氨基酸和神經(jīng)胚活素多肽變體96-113位氨基酸的氨基酸序列,例如,所述多肽在這些位置含有氨基酸序列SEQ ID NO1,2,3或4。
在序列方面與SEQ ID NO1-4所公開的序列不同的神經(jīng)胚活素多肽變體可包括一個或多個保守的氨基酸取代。或者,或另外地,神經(jīng)胚活素多肽變體通過一個或多個非保守氨基酸取代,或通過缺失或插入而發(fā)生改變。優(yōu)選,這種取代,插入或缺失不破壞分離的蛋白的生物活性。
保守取代通常包括一個氨基酸被另一個具有類似特性的氨基酸所取代,如以下所述的取代纈氨酸,丙氨酸取代甘氨酸;亮氨酸,纈氨酸取代異亮氨酸;天冬氨酸取代谷氨酸;天冬酰胺取代谷氨酰胺;絲氨酸,半胱氨酸取代蘇氨酸;賴氨酸取代精氨酸;苯丙氨酸取代酪氨酸。非極性疏水氨基酸包括丙氨酸,亮氨酸,異亮氨酸,纈氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,酪氨酸和蛋氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸,絲氨酸,蘇氨酸,半胱氨酸,酪氨酸,天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸)包括精氨酸,賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的氨基酸(酸性氨基酸)包括天冬氨酸和谷氨酸。以上提及的極性,堿性或酸性氨基酸組中的一個成員被同一組中另一成員的取代被認為是保守取代。
其它取代可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地鑒定。例如,對于丙氨酸而言,可以用D丙氨酸,甘氨酸,β-丙氨酸,L-半胱氨酸和D-半胱氨酸中的任何一個進行取代。對于賴氨酸而言,可以用D-賴氨酸,精氨酸,D-精氨酸,同型=精氨酸,蛋氨酸,D-蛋氨酸,鳥氨酸或D-鳥氨酸取代。通常,在重要功能區(qū)域進行的、推測可導(dǎo)致所分離的多肽的特性發(fā)生變化的取代是這樣的一些取代,其中(I)極性殘基,例如絲氨酸或蘇氨酸被疏水性殘基,例如亮氨酸,異亮氨酸,苯丙氨酸或纈氨酸所取代;(ii)半胱氨酸殘基被其它殘基所取代;(iii)側(cè)鏈帶正電荷的殘基,例如賴氨酸,精氨酸或組氨酸被側(cè)鏈帶負電荷的殘基,例如谷氨酸或天冬氨酸所取代;或(iV)側(cè)鏈大的氨基酸,例如苯丙氨酸被沒有此類側(cè)鏈的氨基酸例如甘氨酸所取代。一個前述非保守取代改變蛋白功能特性的可能性也與該蛋白重要功能區(qū)域中所發(fā)生取代的位置相關(guān)一些非保守取代可能對功能特性有極小或沒有影響。
本發(fā)明也提供了包括神經(jīng)胚活素多肽變體的多聚體多肽。該多聚體多肽優(yōu)選作為純化的多聚體多肽提供。多聚體復(fù)合物的實例包括,例如,二聚體復(fù)合物。多聚體復(fù)合物可以作為異聚體(heteromeric)或同聚體(homomeric)復(fù)合物來提供。因此,多聚體復(fù)合物可以是包含一個神經(jīng)胚活素多肽變體和一個非神經(jīng)胚活素變體的異二聚體復(fù)合物,或者是包含二個或多個神經(jīng)胚活素多肽變體的異二聚體復(fù)合物。
在一些實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽變體結(jié)合GFRα3。優(yōu)選,神經(jīng)胚活素多肽變體的結(jié)合刺激RET多肽的磷酸化。為確定該多肽是否結(jié)合了GFRα3,可進行WO00/01815中所描述的檢測。例如神經(jīng)胚活素在CHO細胞系培養(yǎng)上清中的存在可用Sanicola等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,946238)所描述的四聚體復(fù)合物檢測法的修改形式來指示。在這種檢測中,GDNF樣分子的能力可用通過其介導(dǎo)RET胞外區(qū)與各種共同受體,RET的GFRα1,GFRα2和GFRα3的結(jié)合的能力來評估??芍苽銻ET的可溶形式和共同受體的融合蛋白。大鼠RET胞外區(qū)和胎盤堿性磷酸酶(RET-AP)之間形成的融合蛋白,大鼠GFRα-1胞外區(qū)(在1997年11月27日公開的申請WO9744356中公布,在此引入本文作參考)和人IgG1的Fc區(qū)(rGFR(α1-Ig)之間形成的融合蛋白已有描述(Sanicola et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,946238)。
在一些實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽變體能促進神經(jīng)元的存活,或使神經(jīng)元的病理改變正?;蜻@兩種功能都具備。檢測多肽是否能促進神經(jīng)元的存活,或是否能使神經(jīng)元的病理改變正?;姆椒ㄔ诶鏦O00/01815中描述。優(yōu)選,所述神經(jīng)元是感覺神經(jīng)元,自主神經(jīng)元或多巴胺能神經(jīng)元。
神經(jīng)胚活素多肽變體的合成和分離神經(jīng)胚活素多肽變體可用本領(lǐng)域已知的方法分離。天然的神經(jīng)胚活素多肽可用標準的蛋白純化技術(shù)通過適當?shù)募兓桨笍募毎蚪M織中分離?;蛘?,神經(jīng)胚活素多肽變體用標準的肽合成技術(shù)化學(xué)合成。短氨基酸序列的合成方法在肽領(lǐng)域中已相當成熟。參見,例如,Stewart,et al.,Solid Phase PeptideSynthesis(2d ed.,1984)。
在另一實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽變體通過重組DNA技術(shù)制備。例如,將編碼神經(jīng)胚活素多肽變體的核酸分子插入到載體,再將該核酸導(dǎo)入到細胞。適當?shù)募毎ǎ?,哺乳動物細?如人細胞或中國倉鼠卵巢細胞),真菌細胞,酵母細胞,昆蟲細胞和細菌細胞。但在重組細胞中進行表達時,該細胞優(yōu)選在允許神經(jīng)胚活素多肽變體表達的條件下培養(yǎng)。如需要,該神經(jīng)胚活素多肽變體可從細胞懸液中回收。所謂“回收”是指多肽變體從回收之前其所存在的細胞或培養(yǎng)基的那些成分中分離出來?;厥者^程包括一個或多個重折疊或純化步驟。
神經(jīng)胚活素多肽變體可用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種方法來構(gòu)建。一種這樣的方法是定點突變,其中特定核苷酸(或如需要,數(shù)個特定核苷酸)被改變以改變所編碼的神經(jīng)胚活素多肽中的單個氨基酸(或如需要,數(shù)個預(yù)先確定的氨基酸殘基)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道定點突變是一種常規(guī)和廣泛應(yīng)用的技術(shù)。實際上,許多定點突變試劑盒可以從商業(yè)渠道購買。一種這樣的試劑盒是Clontech Laboratories(Palo Alto,Calif.)出售的“TransformerSite Directed Mutagenesis Kit”。
如果不另加說明,實踐本發(fā)明所應(yīng)用的是本領(lǐng)域范圍內(nèi)的細胞生物學(xué),細胞培養(yǎng),分子生物學(xué),微生物學(xué),重組DNA,蛋白質(zhì)化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有描述。參見,例如,Molecular CloningALaboratory Manual,2ndedition.(Sambrook,F(xiàn)ritsch and Maniatis,eds.),ColdSpring harbor Laboratory Press,1989;DNA Cloning,Volumes I and II(D.N.Golver,ed),1985;Oligonucleotide Synthesis,(M.J.Gait,ed.),1984;U.S.PatentNo.4,683,195(Mullis dt al.,);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Haines and S.J.Higgins,eds.),1984;Transcription and Translation(B.D.Hames and S.J.Higgins,ed.),1984;Culture of Animal Cells(R.I.Freshney,ed).Alan R.Liss,Inc.,1987;Immobilized Cells and Enzymes,IRL Press,1986;A Practical Guideto Molecular Cloning(13.Perbal),1984;Methods in Enzymology,Volumes 154and 155(Wu et al.,eds),Academic Press,New York;Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos,eds.),1987,Cold Spring HarborLaboratory;Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayerand Walker,eds.),Academic Press,London,1987;Handbook of ExperimentImmunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.),1986;Manipulating and Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1986.
神經(jīng)胚活素融合蛋白變體如需要,神經(jīng)胚活素多肽變體可以作為融合蛋白提供。本發(fā)明蛋白的融合蛋白衍生物也包括保持生物活性的原始蛋白的各種結(jié)構(gòu)形式。此處所用“融合”是指兩個或多個蛋白或其片段通過它們各自的肽骨架,最優(yōu)選通過編碼這些蛋白的同一讀框中多核苷酸分子的基因表達而實現(xiàn)共同的線性連接,共價連接。優(yōu)選所述蛋白或其片段來自不同的來源。因此,優(yōu)選的融合蛋白包括神經(jīng)胚活素多肽變體或與非神經(jīng)胚活素變體的第二個半分子共價相連的片段。優(yōu)選,所述第二個半分子來源于以單體形式存在的多肽,而且其可足以對神經(jīng)胚活素多肽賦予提高的可溶性和/或生物利用率特性。
例如,“神經(jīng)胚活素變體/人血清白蛋白融合體”是一種包含本發(fā)明神經(jīng)胚活素多肽變體的蛋白,或其片段,它們的N末端或C末端在讀框內(nèi)和人血清白蛋白多肽連接(參見Syed er al,Blood,1997,893243 and Yeh et al.,P.N.A.S.USA 1992,891904和美國專利號5,876,969和5,302,697)。術(shù)語“融合蛋白”還包括通過相同的(homo-)或不同的(hetero-)功能分子與第二個半分子化學(xué)連接的神經(jīng)胚活素變體,所述半分子不是神經(jīng)胚活素蛋白變體,它是如下所述從純化的蛋白中重新制備的。
神經(jīng)胚活素血清白蛋白融合體可利用本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建。許多包含相應(yīng)氨基酸反應(yīng)基團和巰基(thiol)反應(yīng)基團的交聯(lián)劑中的任何一種都可以用于連接神經(jīng)胚活素與血清白蛋白。適當?shù)倪B接劑的實例包括插入了巰基反應(yīng)性馬來酰亞胺的氨基反應(yīng)交聯(lián)劑。這些交聯(lián)劑包括,例如,SMCC,AMAS,BMPS,MBS,EMCS,SMPB,SMPH,KMUS或GMBS。其它適合的連接劑插入了巰基反應(yīng)性鹵代乙酸基團。這樣的連接劑包括,例如,SBAP,SIA,SIAB,為與巰基反應(yīng)而提供了被保護或未被保護的硫醇以產(chǎn)生可還原連接的連接劑是SPDP,SMPT,SATA或SATP,所有這些連接劑都可以商購(例如,Pierce Chemicals)。本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣能想象出連接神經(jīng)胚活素N末端和血清白蛋白的其它策略。
也可以想象本領(lǐng)域技術(shù)人員能制備出與血清白蛋白的偶聯(lián)物,該偶聯(lián)物不是以NBN的N末端或血清白蛋白的硫醇半分子處為靶點的。如需要,NBN-血清白蛋白可用基因工程技術(shù)制備,其中NBN在其N末端,C末端或在兩端與血清白蛋白基因融合。
人們還可以考慮用類似的策略制備能在動物體內(nèi)(包括人)產(chǎn)生半壽期長的產(chǎn)物的任何NBN偶聯(lián)物。
神經(jīng)胚活素變體的其它衍生物包括神經(jīng)胚活素變體或其片段與其它蛋白或多肽,如通過在重組培養(yǎng)基中合成為額外的N末端或C末端而形成的共價或聚集的偶聯(lián)物。例如,所述偶聯(lián)的多肽可以是蛋白N末端區(qū)的信號(前導(dǎo))肽序列,在翻譯的同時或翻譯后引導(dǎo)蛋白從其合成的部位轉(zhuǎn)移到細胞膜或細胞壁的內(nèi)部或外部的功能部位(例如,酵母α因子前導(dǎo)肽)。神經(jīng)胚活素受體蛋白可包含所添加的肽以促進對神經(jīng)胚活素的純化或鑒定(例如,組氨酸/神經(jīng)胚活素融合體)。神經(jīng)胚活素的氨基酸序列也可以與肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)連接(Hopp et al.,Biotechnology61204,1988.)。后者具有高度抗原性,能提供可與特異性單克隆抗體可逆性結(jié)合的表位,從而使所表達的重組蛋白快速檢測和易于純化。
這一序列也可以被牛粘膜腸激酶在緊接Asp-Lys對之前的殘基處特異性地切割。
神經(jīng)胚活素蛋白變體與聚合物偶聯(lián)如需要,可將單個聚合物分子用于同神經(jīng)胚活素多肽偶聯(lián),盡管也考慮到一個以上的多聚體分子也能偶聯(lián)。本發(fā)明偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素組合物在體內(nèi)及體外的應(yīng)用中都可以找到效用。另外,人們可發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)的多聚體可利用對最終應(yīng)用適合的任何其它基團,半分子或所偶聯(lián)的其它種類的物質(zhì)。這樣的實例如,在某些應(yīng)用中使多聚體與可賦予該多聚體UV降解抗性,抗氧化性或其它特性或特征的功能半分子共價連接可能是有利的。另一個實例是,在某些應(yīng)用中本質(zhì)上賦予多聚體反應(yīng)或可交叉連接的職能,以提高偶聯(lián)物整體的各種特性或特征可能是有利的。因此,為了其所達到的目的,多聚體可以包含任何功能(functionality),重復(fù)的基團,連接或其它不妨礙偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素突變蛋白組合物的效力的組成結(jié)構(gòu)。
對獲得上述所需特性有用的聚合物的實例在本文以下例證性反應(yīng)方案中說明。在共價連接的肽的應(yīng)用中,可以賦予多聚體以功能,然后再將其與肽的游離氨基酸偶聯(lián)以形成不穩(wěn)定的鍵。
在一些實施方案中,神經(jīng)胚活素多肽通過多肽上的末端反應(yīng)基團與多聚體連接?;蛘?,或另外,神經(jīng)胚活素多肽可通過內(nèi)部的賴氨酸殘基,例如,被導(dǎo)入到天然神經(jīng)胚活素多肽氨基酸序列中的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基進行連接。因此偶聯(lián)物也可以從非末端反應(yīng)基團分支。本文設(shè)計了具有反應(yīng)基團的多聚體作為“活化的多聚體”。該反應(yīng)基團選擇性地與蛋白上的游離氨基或其它反應(yīng)基團反應(yīng)。
連接可發(fā)生在活化的聚合物中,在任何可利用的神經(jīng)胚活素的氨基基團部位,如賴氨酸殘基或?qū)氲缴窠?jīng)胚活素多肽或其變體的氨基酸序列中的殘基的α氨基或的ε氨基部位。游離的羧基,適當活化的羧基,羥基,胍基,咪唑基,氧化的糖半分子和神經(jīng)胚活素的含巰基的基團(如果可利用的話)也可以用作連接位點。
通常,每摩爾蛋白(取決于蛋白的濃度)使用大約1.0摩爾-大約10摩爾的活化的多聚體。最終的量是當最小化對產(chǎn)物的非特異性修飾時的最大化的反應(yīng)程度,與同一時間最優(yōu)化(如果可能)蛋白的半壽期時,同一時間維持最佳活性所限定的化學(xué)之間的平衡。優(yōu)選,蛋白至少約50%的生物活性得到維持,最優(yōu)選近100%的生物活性得到維持。
上述反應(yīng)可以通過用于使生物活性物質(zhì)與惰性多聚體反應(yīng)的任何適當?shù)姆椒▉硗瓿桑瑑?yōu)選在約pH5-8,例如,5,6,7或8時,如果反應(yīng)基團是在N末端的α氨基上。通常該方法涉及制備活化的多聚體并因此使蛋白與活化的多聚體反應(yīng)以產(chǎn)生適合制成制劑的可溶性蛋白。上述修飾反應(yīng)可通過數(shù)種方法(其可涉及一個或多個步驟)來進行。
可以將多聚體用本領(lǐng)域已知的方法偶聯(lián)到神經(jīng)胚活素多肽變體上。例如,在一個實施方案中,多聚亞烷基二醇半分子被偶聯(lián)到神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的賴氨酸基團上。與賴氨酸基團的連接可以用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯如PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG)和琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA-PEG)來進行。適當?shù)亩嗑蹃喭榛及敕肿影?,例如,羧甲?NHS,正亮氨酸,NHS,SC-PEG,treslate,醛,環(huán)氧化物,羰基吲哚和PNP碳酸鹽。
另外的氨基反應(yīng)PEG連接物可替代琥珀酰亞胺半分子。它們包括,例如異硫氰酸鹽,碳酸硝基苯,環(huán)氧化物和碳酸苯并三唑。對條件進行優(yōu)選以使選擇性、程度和反應(yīng)最大化。線性或分支形式的PEG以及其他烷基形式都可以使用。PEG的長度可以改變。最常用的大小是2K-100K。當本發(fā)明的實例報告在N末端所靶向的PEG化不影響藥物動力學(xué)特性時,所得物質(zhì)保持了生理功能的事實表明在本發(fā)明所公開的位點進行的修飾沒有破壞性。所以,在制備能夠提供通過插入賴氨酸殘基進行連接的額外位點的NBN突變形式時,可考慮接受的結(jié)果是這些形式可在賴氨酸和N末端被PEG化。
如果需要,神經(jīng)胚活素多肽變體可包含標記,例如能隨后通過蛋白裂解而釋放的標記。因此,可通過首先使his標記變體與低分子量連接物如Traut′s試劑(Pierce)(其既可以與賴氨酸反應(yīng)又可以與N末端反應(yīng))反應(yīng),然后再釋放所述his標記來選擇性地修飾賴氨酸半分子。那么該多肽便包含游離的SH基,該SH基能用包含巰基反應(yīng)性的頭部基團如馬來酰亞胺基團,乙烯基砜基團,鹵代乙酸基團或游離的或被保護的SH來選擇性修飾。
Traut′s試劑可用將為PEG的附著建立特異性位點的任何連接劑來替換。這方面的實例有,Traut′s試劑可用SPDP,SMPT,SATA或SATP(所有這些都可以在Pierce得到)替換。同樣,人們可以使蛋白與插入了馬來酰亞胺(例如SMCC,AMAS,BMPS,MBS,EMCS,SMPB,SMPH,KMUS或GMBS),鹵代乙酸(SBAP,SIA,SIAB),或乙烯基砜基團的氨基反應(yīng)性連接劑反應(yīng),且可以使產(chǎn)生的產(chǎn)物與包含游離SH的PEG進行反應(yīng)。對所使用的連接劑大小的唯一限制是其不能妨礙隨后除去N末端標記。
因此,在其它實施方案中,半分子與神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的半胱氨酸基團偶聯(lián)。用例如馬來酰亞胺基團,乙烯基砜基團,鹵代乙酸基團和巰基完成上述偶聯(lián)。
神經(jīng)胚活素多肽上的一個或多個位點可偶聯(lián)多聚體。例如,可將一個,二個,三個,四個或五個PEG半分子與多聚體連接。在一些實施方案中,PEG半分子可在氨基末端和/或如表1所示命名的神經(jīng)胚活素多肽的氨基酸14,39,68和95處連接。
在優(yōu)選實施方案中,組合物中的神經(jīng)胚活素多肽變體相對于沒有多聚體的多肽變體的血清半壽期要長?;蛘呋蝾~外地,組合物中的神經(jīng)胚活素多肽變體結(jié)合GFRα3,活化RET,使神經(jīng)元的病理改變正常化,或促進神經(jīng)元的存活,或表現(xiàn)為這些生理功能的組合。
在一些實施方案中,提供的這種組合物可以是穩(wěn)定的,水溶性的偶聯(lián)型神經(jīng)胚活素多肽或包含神經(jīng)胚活素多肽或與聚乙二醇半分子偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多肽變體的神經(jīng)胚活素多肽變體復(fù)合物。如需要,所示神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體可通過不穩(wěn)定的鍵與聚乙二醇偶聯(lián)。該不穩(wěn)定的鍵可在例如生化水解,蛋白裂解,或巰基裂解過程中被裂解。例如所述鍵可在體內(nèi)(生理)條件下被裂解。
包含神經(jīng)胚活素變體-多聚體偶聯(lián)物的藥物組合物本發(fā)明也提供了包含神經(jīng)胚活素變體-多聚體偶聯(lián)物的藥物組合物。此處所用“藥物組合物”定義為包含本發(fā)明神經(jīng)胚活素蛋白或偶聯(lián)物,其被分散在生理可接受的載體中,任選還包括一種或多種其它的生理上相容的成分。因此藥物組合物可包含賦形劑如水,一種或多種礦物質(zhì),糖,清潔劑(detergent),和一種或多種載體如惰性蛋白(例如,肝素或白蛋白)。
可給藥本發(fā)明的多聚體-神經(jīng)胚活素偶聯(lián)物本身和其藥學(xué)可接受的酯,鹽以及其它生理功能衍生物。在這樣的藥物制劑中,神經(jīng)胚活素變體偶聯(lián)物優(yōu)選與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體以及任選地和任何其它治療成分共同應(yīng)用。
所述載體必須是在與制劑的其它成分相容的意義上的藥學(xué)上可接受的,且不能對其賦形劑產(chǎn)生不應(yīng)有的損害。神經(jīng)胚活素變體可以,如本文所述,以對獲得所需藥學(xué)效果或有益的醫(yī)藥效果有效的量提供,且所提供的量在體內(nèi)劑量和濃度的情況下應(yīng)適合獲得所需的生物利用率。
這些制劑包括那些適合腸胃外給藥和非腸胃外給藥的制劑,以及特定的給藥形式包括口服,直腸,口腔(buccal),局部,鼻腔,眼部,皮下,肌肉內(nèi),靜脈內(nèi),經(jīng)皮,鞘內(nèi),動脈內(nèi),蛛網(wǎng)膜,器官,淋巴腺,陰道以及子宮內(nèi)給藥的制劑。適合氣霧劑和腸胃外給藥的制劑,局部以及全身的都是優(yōu)選的。
當神經(jīng)胚活素變體用于包含液體溶液的制劑中時,該制劑優(yōu)選口服給藥,氣管給藥或腸胃外給藥。當神經(jīng)胚活素用于液體懸浮制劑或以粉末用于生物相容性載體制劑中時,該制劑優(yōu)選口服給藥,直腸給藥或氣管給藥?;蛘撸瑢⑸窠?jīng)胚活素粉末放入載體氣體中形成粉末的氣體擴散物,使患者從包含適當噴霧器設(shè)備的呼吸循環(huán)器將其吸入。
包含本發(fā)明蛋白的制劑可方便地以單位劑量形式存在,且可通過制藥領(lǐng)域已知的任何方法制備。所述方法通常包括使活性成分和構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體組合。
通常,制劑如下制備使活性成分與液體載體,微細的固體載體或它們兩者均一且緊密地結(jié)合在一起,然后,如需要,將該產(chǎn)物制成所需制劑的劑量形式。
適合口服的本發(fā)明制劑可以分開的單位存在,如膠囊,扁膠囊,片劑或錠劑(每種包含作為粉末或顆粒的活性成分的預(yù)先確定的量);或在水溶液或非水溶液中的懸浮劑,如糖漿,酏劑,乳劑或飲劑(drought)。
適合腸胃外給藥的制劑通常包括活性偶聯(lián)物無菌的水制劑,其優(yōu)選與接受者的血液等張(例如,生理鹽溶液)。這樣的制劑可包括懸浮劑和增稠劑或其他所涉及的將化合物靶向血液成分或一個或多個器官的微顆粒系統(tǒng)。這些制劑可以單劑或多劑形式存在。
鼻腔噴霧制劑包含純化的活性偶聯(lián)物的水溶液和防腐劑與等張劑。優(yōu)選將這些制劑調(diào)整到與鼻粘膜相容的PH和等張狀態(tài)。
直腸給藥的制劑可以作為與適當載體如可可脂,氫化脂,或氫化脂肪酸形成的栓劑來提供。眼用制劑如眼滴劑由與鼻噴霧劑類似的方法制備,除了優(yōu)選調(diào)整PH和等張因素以使其與眼的狀況相吻合。
局部給藥制劑包含在一種或多種介質(zhì)中溶解或懸浮的本發(fā)明偶聯(lián)物,所述介質(zhì)如礦物油,石油(petroleum),多羥基醇,或其他用于局部藥物制劑的堿。
除了前述的成分外,本發(fā)明的制劑還包括一種或多種選自如下的輔助成分溶劑,緩沖液,調(diào)味劑,分解劑,表面活性劑,增稠劑,潤滑劑,防腐劑(包括抗氧化劑),等等。前述考慮還可應(yīng)用于本發(fā)明的神經(jīng)胚活素融合蛋白(例如,神經(jīng)胚活素-HSA融合蛋白)。
因此,本發(fā)明考慮到提供適當?shù)娜诤系鞍子糜隗w外穩(wěn)定溶液中的神經(jīng)胚活素變體偶聯(lián)物,作為優(yōu)選的本發(fā)明的例證性的應(yīng)用。該融合蛋白可應(yīng)用于例如增強神經(jīng)胚活素多體變體對酶降解的抗性,并提供延長保存期限,改善室溫穩(wěn)定性等的方法??梢岳斫?,前述考慮也可用于本發(fā)明的神經(jīng)胚活素-血清白蛋白融合蛋白(包括人神經(jīng)胚活素-人血清白蛋白融合蛋白)。
處理方法神經(jīng)胚活素多肽變體以及融合蛋白或其偶聯(lián)物可用于治療或緩解活動物的紊亂或疾病,所述動物優(yōu)選其疾病可對神經(jīng)營養(yǎng)制劑的活性有反應(yīng)的哺乳動物,更優(yōu)選包括人的靈長類動物。本發(fā)明的組合物可通過,例如注射,植入或消化的藥物組合物來治療對神經(jīng)胚活素多肽反應(yīng)的病理狀況。該組合物可應(yīng)用于緩解包括人的活體動物的紊亂或疾病,其紊亂或疾病對神經(jīng)營養(yǎng)性制劑有反應(yīng)。所述紊亂或疾病尤其是由外傷,手術(shù),缺血,感染,代謝性疾病,營養(yǎng)缺陷,惡性腫瘤,毒性制劑以及遺傳或自發(fā)性疾病的過程。
所述損傷尤其發(fā)生在感覺神經(jīng)元或視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞,包括脊髓背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元或以下組織中的神經(jīng)元膝神經(jīng)節(jié),巖神經(jīng)節(jié),結(jié)狀神經(jīng)節(jié);第八對腦神經(jīng)的前庭聲學(xué)復(fù)合物;三叉神經(jīng)節(jié)的上下頜葉的腹側(cè)極以及中腦三叉神經(jīng)核。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中,神經(jīng)退化性疾病涉及損傷(lesioned)和創(chuàng)傷性(traumatic)神經(jīng)元,如外周神經(jīng),延腦和/或脊髓的創(chuàng)傷,腦缺血性神經(jīng)損傷,神經(jīng)病尤其是外周神經(jīng)病,外周神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷,缺血性休克,極性腦損傷,極性脊髓損傷,神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,多發(fā)性硬化,神經(jīng)毒素的接觸,代謝性疾病如糖尿病或腎功能障礙和由感染因子導(dǎo)致的損傷,神經(jīng)退化性疾病包括阿爾茨海默病,亨廷頓氏病,帕金森氏病,Parkinson-Plus綜合征,進行性核上麻痹(Steele-Richardson-Olszewski綜合征),橄欖紅核小腦性萎縮(Olivopontocerebellar Atrophy)(OPCA),Shy-Drager綜合征(多系統(tǒng)萎縮),Guamanian帕金森氏癡呆綜合征,肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)或任何其它先天或神經(jīng)退化性疾病,以及與癡呆有關(guān)的記憶減退。
在優(yōu)選實施方案中,可處理感覺和/或自主系統(tǒng)神經(jīng)元。尤其是,感受傷害的(nociceptive)神經(jīng)元以及機械感受(mechamoreceptive)神經(jīng)元 ,尤其是δ纖維和C纖維神經(jīng)元。另外,可治療自主神經(jīng)系統(tǒng)的交感神經(jīng)元和副交感神經(jīng)元。
在另一實施方案中,可治療運動神經(jīng)元疾病如肌萎縮性側(cè)索硬化(“ALS”)和脊柱肌肉萎縮。在另一優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的神經(jīng)胚活素分子可用于改善創(chuàng)傷后的神經(jīng)恢復(fù)?;蛘?,或另外,具有含神經(jīng)胚活素多肽變體或神經(jīng)胚活素多肽變體融合體或偶聯(lián)物基質(zhì)的神經(jīng)引導(dǎo)通道(nerve guidance channel)也可以用于本文所述方法中。這樣的神經(jīng)引導(dǎo)通道已在如美國專利5,834,029,中公開,并已納入本文作參考。
在優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明所公開的組合物(包含其藥物組合物)可用于治療外周神經(jīng)病。在外周神經(jīng)病中,用本發(fā)明分子治療的是創(chuàng)傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病,例如,由物理創(chuàng)傷或疾病引起的神經(jīng)病,對腦的物理損傷,對脊髓的物理損傷,與腦損傷有關(guān)的休克以及與神經(jīng)退化有關(guān)的神經(jīng)疾病。包括在本發(fā)明中的還有繼發(fā)于感染,中毒,藥物接觸之后的那些神經(jīng)病。繼發(fā)于全身或代謝性疾病的那些神經(jīng)病也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的組合物也可應(yīng)用于治療化療所導(dǎo)致的神經(jīng)病(如由運送化療藥物,如taxol或cisplatin所導(dǎo)致的那些神經(jīng)病);毒素誘導(dǎo)經(jīng)病,藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病,維生素缺乏誘導(dǎo)的神經(jīng)?。蛔园l(fā)性神經(jīng)??;以及代謝性神經(jīng)病。參見,例如,美國專利5,496,804和5,916,555,它們都納入了本文作參考。
可用本發(fā)明組合物治療的其它疾病是單一神經(jīng)病(mono-neuropathies),單一的多發(fā)性神經(jīng)病(mono-multiplex neuropathies)以及多神經(jīng)病(poly-neuropathies)包括,軸突的神經(jīng)病和脫髓鞘性神經(jīng)病,它們可用本發(fā)明所述組合物治療。
在另一優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明組合物(包含其藥物組合物)可用于眼睛各種疾病的治療,包括患黃斑變性,色素性視網(wǎng)膜炎,青光眼以及類似疾病的患者視網(wǎng)膜中的光感喪失。
本發(fā)明進一步以下列非限制性實例作進一步詳細描述。
實施例1N末端PEG化的神經(jīng)胚活素的生物利用率如果向大鼠靜脈給藥,可觀察到CHO細胞衍生的重組人神經(jīng)胚活素被快速從循環(huán)中清除。皮下給藥之后,在血清中沒有檢測到該蛋白。為增加神經(jīng)胚活素的生物利用率,構(gòu)建神經(jīng)胚活素的PEG形式。
因在NBN序列中沒有賴氨酸,所以氨基特異性的PEG化學(xué)將產(chǎn)生NBN多肽氨基末端的PEG化。因此,對每種神經(jīng)胚活素二聚體而言,應(yīng)該連接有二個PEG半分子。因此,PEG形式首先通過氨基特異性化學(xué)直接靶向N末端。令人吃驚的是,即使連接了二個20K PEG的PEG化對半壽期仍幾乎沒有提高,這表示,基于清除途徑的機制不能如所期望的那樣通過PEG化來提高半壽期。
實施例2PEG化的神經(jīng)胚活素N95K突變體的構(gòu)建檢測在內(nèi)部氨基酸殘基處被PEG化的NBN突變體形式的生物利用率。設(shè)計在位置14,39,68和95處取代天然殘基的四個突變體,以在該序列的選擇位點上插入賴氨酸。這些賴氨酸將為PEG的連接提供不同的位點。用GDNF的晶體結(jié)構(gòu)(Nat.Struct.Biol.4435-8,1997)作為構(gòu)架結(jié)構(gòu)選擇這些位點以鑒定表面殘基,并對persephin/神經(jīng)胚活素嵌合體作誘變研究(J.Biol.Chem.2753412-20,2000)以鑒定該結(jié)構(gòu)中應(yīng)該避開的重要功能區(qū)域。
根據(jù)表面陽電荷分布,在能代表肝素結(jié)合位點的區(qū)域進行二個突變(R39和R68),該蛋白的特性可能有助于其快速清除。第三個位點靶向N95,即野生型NBN的天然糖基化位點。該位點在天然狀態(tài)下被復(fù)合的糖結(jié)構(gòu)修飾。所以,在該位點進行的修飾預(yù)計不會影響功能。在不被任何其它修飾所占據(jù)的區(qū)域選擇第四個位點(R14)。從該位點的突變體中,選擇在位置95的天冬酰胺殘基被賴氨酸取代(N95K突變體)用于本發(fā)明所公開的研究。
構(gòu)建在大鼠神經(jīng)胚活素多肽野生型序列中包含一個或多個改變的四種大鼠神經(jīng)胚活素突變體。這些突變體包含具有單一的N95K的突變蛋白和包含在大鼠神經(jīng)胚活素氨基酸序列其它位點上的單一取代R14K;R68K和R39K的突變蛋白。在“X1N1X2”通式中,X1是指野生型神經(jīng)胚活素多肽的氨基酸,N1是指序列中X1氨基酸根據(jù)SEQ ID NO1編號的編號位置。X2是指在該序列指定編號位置上取代了野生型氨基酸的氨基酸。
為構(gòu)建大鼠N95K神經(jīng)胚活素突變,在編碼野生型大鼠神經(jīng)胚活素的質(zhì)粒pCMB020上進行定點誘變。野生型大鼠神經(jīng)胚活素核酸和由其編碼的多肽的氨基酸序列表示如下1ATGGAACTGG GACTTGGAGA GCCTACTGCA TTGTCCCACT GCCTCCGGCC51 TAGGTGGCAA CCAGCCTTGT GGCCAACCCT AGCTGCTCTA GCCCTGCTGA101 GCAGCGTCAC AGAAGCTTCC CTGGACCCAA TGTCCCGCAG CCCCGCCTCT151 CGCGATGTTC CCTCGCCGGT CCTGGCGCCC CCAACAGACT ACCTACCTGG201 GGGACACACC GCACATCTGT GCAGCGAAAG AGCCCTGCGA CCACCGCCGC251 AGTCTCCTCA GCCCGCACCC CCACCACCGG GTCCCGCGCT CCAGTCTCCT301 CCCGCTGCGC TCCGCGGGGC ACGCGCGGCG CGTGCAGGAA CCCGGAGCAG351 CCGCGCACGG GCTACAGATG CGCGCGGCTG CCGCCTGCGC TCACAGCTGG401 TGCCGGTGAG CGCTCTCGGC CTGGGCCACA GCTCCGACGA GCTGATACGT451 TTCCGCTTCT GCAGCGGTTC GTGCCGCCGA GCACGCTCCC CGCACGATCT501 CAGCCTGGCC AGCCTGCTGG GCGCCGGGGC CCTGCGGTCT CCTCCCGGGT551 CCCGGCCGAT CAGCCAGCCC TGTTGCCGGC CCACTCGCTA TGAGGCAGTC601 TCCTTCATGG ACGTGAACAG CACCTGGAGA ACCGTGGACC ATCTCTCCGC651 CACCGCCTGC GGCTGTCTGG GCTGA (SEQ ID NO5)1MELGLGEPTA LSHCLRPRWQ PALWPTLAAL ALLSSVTEAS LDPMSRSPAS51 RDVPSPVLAP PTDYLPGGHT AHLCSERALR PPPQSPQPAP PPPGPALQSP101 PAALRGARAA RAGTRSSRAR ATDARGCRLR SQLVPVSALG LGHSSDELIR151 FRFCSGSCRR ARSPHDLSLA SLLGAGALRS PPGSRPISQP CCRPTRYEAV201 SFMDVNSTWR TVDHLSATAC GCLG*(SEQ ID NO4)
用寡核苷酸KD2-310和KD3-211對pCMB020進行誘變得到質(zhì)粒pCMB027KD2-3105′-GTATCTTTCATGGACGTAAAGTCTACATGGAGAACCGTAGATCATCTATCTGCAACC-3′(SEQ-ID-NO6)KD2-3115′-GGTTGCAGATAGATGATCTACGGTTCTCCATGTAGACTTTACGTCCATGAAAGATAC-3′(SEQ-ID-NO7)在pCMB027中,在位置95處編碼天冬酰胺的密碼子已經(jīng)被編碼賴氨酸的密碼子所取代。
在pCMB020的神經(jīng)胚活素編碼序列中,將位置14處編碼精氨酸的密碼子用編碼賴氨酸的密碼子取代,得到R14K神經(jīng)胚活素突變體。用寡核苷酸KD3-254和KD3-255對pCMB020進行定點誘變KD3-2545′-GCTGGAACTCGCAGCTCTCGTGCTCGTGCAACGGATGCAAAAGGCTGTCG-3′(SEQ-ID-NO8)KD2-2555′-CGACAGCCTTTTGCATCCGTTGCACGAGCACGAGAGCTGCGAGTTCCAGC-3′(SEQ-ID-NO9)所得構(gòu)建體命名為pCMB029。
pCMB020的神經(jīng)胚活素編碼序列中,將位置68處的編碼精氨酸的密碼子用編碼賴氨酸的密碼子取代,形成R68K神經(jīng)胚活素突變體。用寡核苷酸KD3-258和KD3-259對pCMB020進行定點誘變KD3-2585′-GGAGCCGGAGCACTAAAATCTCCCCGGGATCTAGACC-3′(SEQ-ID-NO10)KD3-2595′-GGTCTAGATCCCGGGGGAGATTTTAGTGCTCCGGCTCC-3′(SEQ-ID-NO11)所得構(gòu)建體命名為pCMB030。
pCMB020的神經(jīng)胚活素編碼序列中,將位置68處的編碼精氨酸的密碼子用編碼賴氨酸的密碼子取代,形成R39K神經(jīng)胚活素突變體。用寡核苷酸KD3-256和KD3-257對pCMB027進行定點誘變KD3-2565′-GACGAATTAATTAAGTTTCGTTTTTGTTCAGG-3′(SEQ-ID-NO12)KD3-2575′-CCTGAACAAAAACGAAACTTAATTAATTCGTC-3′(SEQ-ID-NO13)為表達和純化,編碼大鼠NBN N95K突變體的質(zhì)粒在大腸桿菌中表達為帶組氨酸標簽的融合蛋白,該融合蛋白在緊靠近成熟的113位氨基酸的NBN序列的起始處有腸激酶裂解位點。將大腸桿菌培養(yǎng)在500L發(fā)酵液中并獲取冷凍的細胞團(paste)。在Manton Gaulin Press中裂解這些大腸桿菌,并從不溶性的洗滌過的沉淀(pellet)級分中回收大鼠NBN NK。
從沉淀中用鹽酸胍提取NBN,再進行重折疊,并用腸激酶除去組氨酸標簽。所得產(chǎn)物在鎳NTA瓊脂糖(Qiagen)和Bakerbond WP CBX陽離子交換樹酯上層析。
腸激酶處理帶組氨酸標簽的產(chǎn)物得到在成熟序列第7位精氨酸處蛋白質(zhì)的異常裂解。所產(chǎn)生的des1-7NBN產(chǎn)物在KIRA ELISA中具備完全活性,且在結(jié)構(gòu)上在其對胍誘導(dǎo)的變性方面不同于成熟形式,因此用來作后續(xù)的工作。
大鼠NBN N95K用分子量為10,000Da的羧甲基聚(乙二醇)琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA-PEG)作為反應(yīng)物以每分子平均3.3個PEG半分子的比例進行PEG化。對所得PEG化產(chǎn)物進行進一步定性,包括用SDS-PAGE分析,分子大小排阻層析(PEC)分析,反向HPLC分析,基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化質(zhì)譜分析(MALD/IMS),肽圖分析,KIRAELISA法進行活性檢測以及內(nèi)毒素含量的檢測。PEG化之前NBNN95K產(chǎn)物的純度通過SDS-PAGE和SEC檢測為高于95%。在非還原條件下NBN N95K產(chǎn)物以二聚體形式遷移,這與對其所預(yù)計的結(jié)構(gòu)相一致。PEG化后,由一系列修飾的加合物(adduct)(其中5%的產(chǎn)物每分子2個PEG,60%的產(chǎn)物每分子3個PEG,30%的產(chǎn)物每分子4個PEG和少量的數(shù)個更高質(zhì)量的形式)組成。在PEG化的樣品中,沒有聚集的證據(jù)。在產(chǎn)物中剩余的沒有修飾的NBN的水平在數(shù)量限制以下。材料中內(nèi)毒素的含量常規(guī)低于1EU/mg。PEG化的NBN的比活性用KIRAELISA測定是10nM。PEG化的產(chǎn)物以1.1mg/mL與PBS pH6.5制成制劑。在效力方面與野生型NBN類似的該材料可以作為-70℃儲存的冷凍液體提供。
R14K,R39K和R68K突變體在大腸桿菌中表達并用如上對N95K-NBN所述的同樣的方法純化,PEG化和功能評估。
PEG化的NBN的制備在大腸桿菌中制備出230ml重折疊的大鼠NBN N95K(2.6mg/mL)并儲存在4℃5mM的磷酸鈉pH6.5中,用77ml水,14.4mL 1M HEPES pH7.5和2.8g(終濃度為10mg/ml)的PEG SPA 10.000Da(Shearwater Polymers,Inc.)稀釋100mM NaCl。樣品在室溫避光溫育4小時,然后用5mM的咪唑(終濃度)處理,過濾,并4℃儲存過夜。分兩批制備產(chǎn)物,一批包含130mL NBN N95K的體積,另一批包含100mL的體積。PEG化的NBN在Fractogel EMDSO3-(M)(EM Industries)上從反應(yīng)混合物中純化。柱層析在室溫進行。制備的所有的緩沖液都無熱原。將NaCl加入到反應(yīng)混合物中至終濃度87mM,然后將樣品加樣至45mL的Fractogel柱上(5cm內(nèi)徑)。
用一個柱體積的5mM的磷酸鈉pH6.5,80mM NaCl洗柱,然后用三個柱體積的包含50mM NaCl的5mM磷酸鈉洗柱。將樹酯轉(zhuǎn)移到2.5cm直徑的柱中并用10ml包含5mM磷酸鈉pH6.5,400mM NaCl的液體洗脫6次,包含500mL NaCl的液體洗脫3次,包含600mM NaCl的液體洗脫6次。用280nm處的吸光度值來分析蛋白的含量,然后用SDS-PAGE分析修飾的程度。匯集所選擇的級分,用0.2μm的濾膜過濾。將最終的物質(zhì)分成等份并-70℃儲存。
純化的PEG化的NBN NK的UV譜對純樣本進行PEG化的NBN NK的UV譜(240-340nm)分析。該樣本作平行三份的分析。在275-277nm處PEG化的樣本顯示最大的吸光度,在247-249nm處顯示最小的吸光度。該結(jié)果與從未經(jīng)修飾的NBN大體積的中間物所觀察到的一致。使用消光系數(shù)∑2800.1%=0.50從所述譜值來估測PEG化產(chǎn)物的蛋白濃度。PEG化的大分子的蛋白濃度是1.1mg/mL。因在320nm處沒有吸收,證明該樣品中不存在混濁(turbidity)。
用SDS-PAGE對PEG化的NBN NK進行定性將包含3,1.5,0.75和0.3μg產(chǎn)物的PEG化的NBN的等份樣品在4-20%的梯度膠(Owl)上進行SDS-PAGE電泳。用考馬氏亮藍R-250對該膠染色。同時進行電泳的還有分子量標記物(GIBCO-BRL)。
在非還原條件下對PEG化的NBN NK進行的SDS-PAGE分析顯示了對應(yīng)于具有2,3,4和4個以上PEG/分子的修飾物的一系列條帶。具有98kDa表觀分子量的主條帶包含3個PEG/分子。在純化后的PEG化產(chǎn)物中沒有檢測到未經(jīng)修飾的NBN。MALDI質(zhì)譜分析證實存在連接有2,3和4個PEG的產(chǎn)物的混合物。包含2,3和4個PEG的產(chǎn)物的比例用密度計量法來測定,所測定的結(jié)果分別為占總量的7%,62%和30%。
用大小排阻層析對PEG化白NBN進行定性在分析性的Superose 6HR10/30 FPLC層析柱上,用5mM MES pH6.5,300mM NaCl作為流動相對PEG化的NBN進行大小排阻層析。流速是20mL/小時。洗脫的級分在280nm處監(jiān)測吸光度。PEG化的NBN作為單一的峰洗脫,表觀分子量為約200kDa,這與PEG的大流體動力學(xué)體積相一致。沒有觀察到聚集物的證據(jù)。表觀分子量為約30kDa的游離NBN在制劑中沒有檢測到。
用反相HPLC分析PEG化的NBN在Vydac C4(5μm,1×250mm)層析柱上進行反相HPLC。用60mm的梯度從40%到60%B(緩沖液A0.1%TFA,緩沖液B75%乙腈/0.085%TFA)展開層析柱。在214nm處監(jiān)測流出液的吸光度,并收集級分用于后續(xù)分析。在C4層析柱上用反相HPLC將PEG化的NBNNK分級分離成其不同的2個PEG化的組分(60.5mm),3個PEG化的組分(63.3mm)和4個PEG化的組分(67.8mm)。所述峰的相對強度提示各組分的比例分別是5.4%,60.5%和30.1%。用MALDI-MS證實各峰的身份。沒有證據(jù)證明在產(chǎn)物中有非PEG化的NBN NK(在5-15mm處洗脫)。
質(zhì)譜分析PEG化的NBN在C4 Zip Tip上對PEG化的NBNNK脫鹽,并在Voyager-DE STR(PerSeptive Biosystems)基質(zhì)輔助激光解吸/離子化時間飛行(matrix-assistedlaser desorption/isoization time-of-flight)(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀上用介子酸作為基質(zhì)進行質(zhì)譜分析。將0.5μL純化的蛋白和0.5μL基質(zhì)在靶板上混合。對PEG化的NBN的質(zhì)譜分析顯示了三種加合物的單電荷和雙電荷形式。所觀察到的43803Da,54046Da和64438Da的質(zhì)量與2,3和4個PEG/分子的修飾物相一致。
通過作肽圖對PEG化的NBN進行分析通過對肽作圖來測試PEG化反應(yīng)的特異性。將PEG化的NBN分離成2分子,3分子和4分子PEG化的組分,然后將其還原,烷基化,并進一步在C4層析柱上通過HPLC分離成它們的單鏈組分。這些組分和作為對照的還原型和烷基化的未修飾的NBN NK用Asp-N蛋白酶消化,所得到的消化片段用反相HPLC在Vydac Cis(5μm,1×250mm)層析柱上用60mm梯度從0到60%B(緩沖液A0.1%TFA,緩沖液B75%乙腈/0.085%TFA)進行分級分離。在214mm處監(jiān)測層析柱的流出液的吸光度。
大鼠NBN序列包含四個內(nèi)部的半胱氨酸,因此當用內(nèi)蛋白酶Asp-N消化時期望會產(chǎn)生單一的裂解圖。來自對大鼠NBN NK的Asp-N消化的所有峰已用質(zhì)譜法和/或Edman N末端測序鑒定,因此肽圖可以用作簡單的工具通過峰的存在與否探詢修飾的位點。對各種峰的鑒定總結(jié)于以下的表3。
表3

(M)失去一個質(zhì)子的(monolostopic)質(zhì)量*由于MALDI時包含在肽中的蛋氨酸的氧化因為NBN是以同二聚體存在,所以大鼠NBN NK產(chǎn)物包含四個潛在的PEG化位點,其中兩個來自每一條鏈的N末端氨基,另外兩個是通過基因工程引入到構(gòu)建體中的N95K位點。在PEG化的鏈的肽圖中,僅包含具有NK突變的肽的峰經(jīng)過PEG修飾而改變。因此,肽圖的數(shù)據(jù)提示所述PEG半分子是與該肽特異性連接的,而不與任何所篩選的其他肽連接。第二個潛在的連接位點,即N末端是在肽上,其僅僅三個氨基酸長,在肽圖上沒有被檢測出來。優(yōu)選另外的PEG連接是發(fā)生在該位點。與此相吻合的是,沒有被截短的大鼠NBN NK只占少量的百分比,且包含成熟的Ala-1序列。該肽在30μm處洗脫,且可見于來自非PEG化的消化物的肽圖中,但不存在于PEG化的NBN NK消化物中。
實施例3用ELISA評估內(nèi)部PEG化的神經(jīng)胚活素在激酶受體活性(KIRA)方面的效力PEG化的大鼠NBN的效力用NBN依賴的活性/作為NBN受體的c-Ret的磷酸化活性利用ELISA檢測,所述ELISA是特異性針對磷酸化的RET的存在的。NB41A3-mRL3細胞,一種表達Ret和GFRa3的粘附性的小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系,以2×105細胞/孔鋪板于含補充有10%胎牛血清的達氏修正依氏培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium)(DMEM)的24孔板中,37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)18小時。
用PBS洗滌細胞,然后對NBN在37℃和5%CO2條件下在0.25mLDMEM中進行連續(xù)稀釋10分鐘。對每一樣品進行平行雙份分析。用1mLPBS洗滌細胞,然后在4℃用0.30mL的10mM Tris HCl,pH8.0,0.5%NonidetP40,0.2%脫氧膽酸鈉,50mM NaF,0.1mM Na3VO4,1mM苯甲基磺酰氟,輕輕搖動培養(yǎng)板裂解該細胞。反復(fù)用吸量管混勻裂解物,取0.25mL樣品轉(zhuǎn)移至在4℃已用含5μg/mL of抗-Ret mAb(AA.GE7.3)的50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6包被了18小時的96孔ELISA板中,在室溫用封閉緩沖液(20mMTris HCl pH7.5,150mM NaCI,0.1%Tween-20(TBST),其中含1%正常小鼠血清和3%牛血清白蛋白)封閉1小時。
室溫下溫育2小時后,用TBST洗滌各孔6次。磷酸化的Ret如下檢測在室溫下用含2g/mL的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗磷酸酪氨酸4G10抗體的封閉緩沖液溫育2小時,用TBST洗滌6次,然后在450nm用比色檢測試劑檢測HRP的活性。檢測用裂解物或用裂解緩沖液處理的各孔的吸光度值,并將背景校正信號作為活化混合物中存在的NBN濃度的函數(shù)做圖。在KIRA ELISA中的PEG化NBN的效力是10nM,其與NBN NK起始物質(zhì)的效力不同。兩次凍融循環(huán)對效力沒用影響,而且該處理后對樣品的渾濁度沒有明顯增加,這提示樣品在用于研究時融化是安全的。在對分別含三個和四個10kDa PEG/分子的產(chǎn)物的活性進行評估的獨立研究中,確定了含3個PEG的加合物是具有完全活性的,而含有四個PEG的產(chǎn)物的活性有所降低。
實施例4內(nèi)部PEG化的大鼠神經(jīng)胚活素在大鼠和小鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究對各種PEG化的和非PEG化的NBN產(chǎn)物在大鼠和小鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征都進行了檢測。
所得數(shù)據(jù)顯示,大鼠NBN NK用3.3,10000Da PEG進行的PEG化能對神經(jīng)胚活素的半衰期和生物利用率產(chǎn)生明顯的影響。血管內(nèi)給藥SpragueDawley大鼠1mg/kg后,3000ng/mL的PEG化的NBN的峰水平在7分鐘后檢測出來,而700ng/mL的水平在24小時后檢測出來,200ng/mL的在48小時后檢測出來,100ng/mL的在72小時后檢測出來。相反,在靜脈內(nèi)給藥非PEG化的NBN 1mg/kg后7分鐘檢測到1500ng/mL的水平,但3小時后該水平迅速降至70ng/mL,7小時后降至不能檢測到的水平。在皮下給藥PEG化的NBN治療的動物中PEG化所帶來的效果更明顯。
皮下給藥1mg/kg 24小時后PEG化的NBN的循環(huán)水平達到200ng/mL的最大值,并且在三天研究期間都持續(xù)在該水平。相反,在給藥未經(jīng)修飾的NBN后的任何時間點都沒觀察到可檢測的NBN。
對PEG化的NBN樣品的分析由于存在每個分子包含2個,3個和4個PEG的加合物而變得復(fù)雜,這些加合物中每個加合物都呈現(xiàn)不同的PK圖。在早期PK研究中,用小鼠來篩選各種侯選物和給藥途徑。從小鼠的研究發(fā)現(xiàn),各種侯選物的生物利用率有顯著差異。但當在大鼠中評價3.3 10K PEG加合物時發(fā)現(xiàn),在大鼠中的生物利用率比在小鼠中的生物利用率低。在生物利用率方面的這種差異在腹膜內(nèi)給藥后尤其明顯。在7小時后,在小鼠中的水平即達到1600ng/mL,且24小時后仍保持在400ng/mL。相反,大鼠的水平在4到48小時期間維持在100ng/mL。
在STZ糖尿病大鼠神經(jīng)病模型中,野生型大鼠神經(jīng)胚活素(wt-NBN)和在第95位有Asn變?yōu)長ys的取代的神經(jīng)胚活素(NK-NBN)都進行重折疊并被純化至95%以上以用于效力測試。Wt-NBN配制成制劑后直接進行動物測試,而NK-NBN需要用10kDa的PEG-SPA進行PEG化。為實現(xiàn)重折疊和純化的目的,需建立利用大小排阻層析(SEC)的重折疊方法,該方法使來自大腸桿菌包涵體的NBN大量且高濃度復(fù)性。除SEC之外,NiNTA和CM硅石柱層析步驟用來增加最后的蛋白純度。對蛋白進行深入定性,包括用如下方法進行分析SDS-PAGE,大小排阻層析,ESMS,用KIRA ELISA進行活性評估,以及檢測內(nèi)毒素的含量。對最終蛋白產(chǎn)物進行SDS-PAGE和SEC證明其純度在95%以上。每種產(chǎn)物的內(nèi)毒素水平小于0.2EU/mg。在KIRAELISA中兩種蛋白的比活性都約為10nM。用磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)pH6.5將Wt-NBN配制成1.0mg/ml的濃度,NK-NBN配制成2.6mg/ml的濃度。將wt-NBN按每管15ml等分并-70℃冰凍保存。而NK-NBN要首先PEG化,然后再等分和冰凍。
實施例5野生型神經(jīng)胚活素和N95K神經(jīng)胚活素突變體的重折疊將兩種形式的NBN作為帶His標簽的融合蛋白在大腸桿菌中表達。該蛋白在成熟的113位氨基酸序列的緊靠近起點的位置有腸激酶切割位點。用Gaulin press在2升PBS中裂解表達Wt-(1.8kg細菌團)或NK-NBN(2.5kg細菌團)的細菌。離心(10,000rpm)以沉淀包涵體,棄去每次制備過程中的上清液。用緩沖液(0.02M Tris-HCI pH8.5,0.5mM EDTA)洗滌包涵體沉淀兩次,然后用包含Triton X-100(2%,v/v)的同一緩沖液洗滌兩次,之后再用無洗滌劑的另外兩種緩沖液洗滌。將兩種沉淀用6M鹽酸胍,0.1M Tris pH8.5,0.1M DTT和1mM EDTA溶解。為輔助溶解過程,將每一種沉淀用polytron勻漿機均化,然后室溫過夜攪拌。通過離心澄清溶解的蛋白,再用Superdex200(用0.05M甘氨酸/H3PO4pH3.0和2M鹽酸胍平衡過的5.5升層析柱)以每分鐘20ml進行變性層析。
用SDS-PAGE鑒定變性的NBN。匯集包含Wt-NBN或NK-NBN的級分,用Amicon 2.5升攪拌型細胞濃縮儀濃縮至約250mL。過濾除去任何沉淀,濃縮后的蛋白用0.1M Tris-HCl pH7.8,0.5M鹽酸胍,8.8mM還原型谷胱甘肽和0.22mM氧化型谷胱甘肽平衡過的Superdex 200進行依大小的復(fù)性層析。用0.5M鹽酸胍以每分鐘20mL展開層析柱。包含復(fù)性后的wt-NBN或NK-NBN的級分用SDS-PAGE鑒定,匯集,并4℃保存直至需要除去His標簽時用Ni-NTA層析柱對NBN進行的濃縮(TR5919-138)在進行純化以促進NBN單體之間形成二硫鍵之前4℃保存復(fù)性的NBN至少24小時。這期間,所形成的沉淀用0.2μPES濾膜過濾去除。為減少非特異性結(jié)合,在上樣至用層析柱緩沖液(0.5M胍和20mM咪唑)以每分鐘50ml平衡的100ml Ni-NTA(Qiagen)層析柱之前,將蛋白溶液與20mM咪唑接觸。上樣后,用同一緩沖液洗滌層析柱至基線。用包含0.5M鹽酸胍和0.4M咪唑的洗脫緩沖液約300ml從樹脂中將NBN洗脫出來。洗脫后,室溫下用10體積的5mM HCI對NBN透析過夜(用10kDa的透析管)。透析可促進污染的物質(zhì)水解,并將鹽酸胍和咪唑的濃度分別降低到0.05M和0.04M。
Lysyl內(nèi)肽酶或腸激酶對His標簽的切割第二天,過濾除去透析過程中形成的任何沉淀物。加入5M的原液將蛋白樣品配制成0.1M NaCI溶液,使最終的鹽濃度(包括剩余的鹽酸胍)約為150mM。這一濃度用傳導(dǎo)儀來確定。另外,加入1M HERPES pH8至最終濃度為25mM。為切除標簽,將lysyl內(nèi)肽酶加入wt-NBN,腸激酶加入到NK-NBN中,它們的蛋白酶與NBN的比例都約為1∶300。由于在突變蛋白的Lys95處存在另外的蛋白酶切割位點,對于NK-NBN需用腸激酶代替lysyl內(nèi)肽酶。室溫下攪拌樣品2小時并用SDS-PAGE監(jiān)測消化情況。
用Ni-NTA除去His標簽將蛋白酶處理后的NBN上樣至用0.5M鹽酸胍和20mM咪唑以每分鐘50mL平衡過的100mL Ni-NTA層析柱上。用同樣的緩沖液洗滌層析柱至基線。匯集從層析柱上洗下來的任何蛋白和包含無His標簽的NBN蛋白的流出液(flowthrough)。
CM硅層析Ni-NTA層析后,用CM硅樹脂直接對蛋白進行進一步的純化。用上樣緩沖液(5mM磷酸鹽pH6.5,150mM NaCI)平衡20mL CM硅層析柱,然后以每分鐘20mL上樣NBN。用20個柱體積的洗滌緩沖液(5mM磷酸鹽pH6.5,400mM NaCI)洗滌層析柱,用包含5mM磷酸鹽pH6.5和1M NaCI洗脫緩沖液洗脫蛋白。所洗脫的蛋白只針對磷酸鹽進行過夜透析,使鹽濃渡對NK-NBN而言為100nM,對wt-NBN而言為150mM。兩種樣品通過0.2μPES濾膜過濾,用SDS-PAGE分析,并貯存在4℃直至進一步鑒定和/或PEG化。
對Wt-NBN和NK-NBN進行UV譜分析以評估它們在280納米處的吸光度。用微量石英測試管和單獨緩沖液的空白對照,利用Beckman分光光度計從230至330nm連續(xù)篩選wt-NBN或NK-NBN。在該分析的基礎(chǔ)上測得的Wt-NBN的濃度為1.1mg/ml,NK-NBN的濃度為2.6mg/ml(A280nm-E 1%=0.5用于每種蛋白)?;?30nm處的吸光度鑒定的沉淀物在1%以下。為評估兩種蛋白制品的純度,用16/30 Superdex 75層析柱對每一樣品(0.5mg)進行大小排阻層析。層析柱用包含400mM NaCI的5mM磷酸鹽pH6.5平衡,用每分鐘1.5mL的流速展開。基于280nm處的吸光度,wt-和NK-NBN都遷移為具有預(yù)計分子量為(23-24kDa)單峰,且不包含任何明顯的蛋白污染。
將wt-和NK-NBN在2.5M鹽酸胍,60mM Tris pH.8.0和16mM DTT中還原。然后將還原后的樣品通過短的C4柱脫鹽,并用三相四極儀(triplequadrupole instrument)用ESMS在線分析。將ESMS的原始數(shù)據(jù)用MaxEnt程序進行重疊合(deconvolute)以產(chǎn)生質(zhì)譜。該方法可是多個電荷信號重疊成直接對應(yīng)于以千道爾頓(kDa)表示的分子量的一個峰。wt-NBN的重疊合質(zhì)譜顯示占絕對優(yōu)勢的物質(zhì)的分子量是12046kDa,這與對113個氨基酸形式的蛋白所預(yù)測的分子量一致。還觀察到一種極少的組分(12063kDa),這提示氧化產(chǎn)物的存在。在NK-NBN樣品中鑒定到三個峰。其中主要成分的表觀分子量為11345kDa,與對106個氨基酸形式的蛋白所預(yù)測的分子量相一致。其他兩個峰的質(zhì)量為11362和12061kDa,這分別提示NK-NBN的氧化和113個氨基酸形式的存在。
在NK-NBN制品中存在106和113個氨基酸的形式歸因于腸激酶的消化。這種來自Biozyme的蛋白酶是純化自小牛腸粘膜的天然酶制品,并據(jù)報道其包含少量的胰蛋白酶污染(每微克腸激酶含0.25ng胰蛋白酶)。所以胰蛋白酶可能作用于NK-NBN的羧基末端Arg7處,產(chǎn)生大多數(shù)的106個氨基酸的形式。另一方面,用于切割Wt-NBN的Lysyl內(nèi)肽酶具有單一蛋白酶活性,作用于包含在His標簽內(nèi)羧基末端賴氨酸殘基,產(chǎn)生成熟的113個氨基酸的NBN形式。106和113氨基酸形式的NBN在所有試驗檢測中有同樣的活性,且在鹽酸胍穩(wěn)定性檢驗中的表現(xiàn)相似。
NBN的活性由其刺激NB41A3-mRL3細胞中c-Ret磷酸化能力,通過實施例3所述的KIRA ELISA檢測。Ret的磷酸化如下檢測使俘獲的受體與HRP偶聯(lián)的磷酸化的酪氨酸抗體(4G10;0.2μg每孔)一起溫育(2小時)。溫育后,各孔用TBST洗滌6次,用比色計在450nm檢測HRP的活性。檢測裂解物或只有裂解緩沖液處理的各孔的吸光度值,進行背景校正后,將所得數(shù)據(jù)作為活性混合物中存在的神經(jīng)胚活素濃度的函數(shù)做圖。這些數(shù)據(jù)表明純化的NBN可導(dǎo)致磷酸化的RET的出現(xiàn),這表明純化的NBN在該試驗中是有活性的。
實施例6血清白蛋白神經(jīng)胚活素偶聯(lián)物的制備含野生型大鼠神經(jīng)胚活素1mg/ml的PBS溶液用1mM硫-SMCC(Pierce)處理并脫鹽以除去過多的交聯(lián)劑。因為野生型NBN蛋白在N末端僅包含一個氨基,并沒有巰基,所以預(yù)計與SMCC的反應(yīng)會導(dǎo)致NBN的位點特異性的修飾,SMCC連接到NBN的N末端。
將60μg的NBN-SMCC偶聯(lián)物與120μg的牛血清白蛋白共同溫育并用SDS-PAGE分析交聯(lián)的程度。BSA包含一個游離的巰基,因此預(yù)計與NBN-SMCC的反應(yīng)會通過SMCC上的馬來酰亞胺對該位點產(chǎn)生修飾。在這些條件下即可觀察到具有較高分子量的另外的兩條帶,它們與用一個BSA半分子和用二個BSA分子修飾的NBN的分子量相一致,因為每個NBN分子都包含兩個可以反應(yīng)的N末端,從而產(chǎn)生上述情況。由于上述那些條帶同時形成,所以NBN-SMCC和BSA條帶的密度都下降了。根據(jù)剩余的NBN條帶的密度推測反應(yīng)已經(jīng)完成了70-80%。
從反應(yīng)混合物中純化單個取代的產(chǎn)物如下進行基本按照以上PEG化研究中所討論的方法,使物質(zhì)經(jīng)過陽離子交換層析和在Superdex 200層析柱(Pharmacia)上的大小排阻層析。用SDS-PAGE分析來自凝膠過濾的層析柱級分,在280nm處通過吸光度分析包含單個取代產(chǎn)物的那些級分中蛋白的含量。因為BSA的質(zhì)量約為神經(jīng)胚活素的兩倍,所以表觀濃度應(yīng)被因數(shù)3相除才能等于NBN的量。用KIRA ELISA分析該級分的功能。野生型NBN和BSA-偶聯(lián)的NBN的IC50值都是3-6nM,這表示與BSA偶聯(lián)不損害功能。
用BSA進行這些最初的研究時發(fā)現(xiàn),來自大鼠和人的相應(yīng)的血清白蛋白也包含游離的SH。所以可以用類似的方法來制備大鼠血清白蛋白-大鼠NBN偶聯(lián)物,用于進行大鼠和人血清白蛋白-人NBN的PK和效力研究,以進行臨床試驗。類似地,SMCC可用在一端包含氨基反應(yīng)基團,另一端包含巰基反應(yīng)基團的多種交聯(lián)劑中的任何一種來替換。插入巰基反應(yīng)性馬來酰亞胺的氨基反應(yīng)基團的實例是AMAS,BMPS,MBS,EMCS,SMPB,SMPH,KMUS或GMBS,插入巰基反應(yīng)基團的是SBAP,SIA,SIAB以及為與巰基反應(yīng)以產(chǎn)生可還原性連接而提供的保護性或非保護性巰基是SPDP,SMPT,SATA或SATP,所有這些都可以從Pierce得到。這些交聯(lián)劑僅僅為了舉例,可以預(yù)測還有許多連接NBN N末端與血清白蛋白的其他策略。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以制備不是靶向NBN N末端或血清白蛋白巰基半分子的血清白蛋白偶聯(lián)物。當NBN與血清白蛋白在其N末端,C末端或兩端融合時,預(yù)計用基因工程制備的這些NBN血清白蛋白融合體也是具有功能的。
序列表<110>比奧根公司(Biogen,Inc.)Sah.Dinah W.Y.
Pepinsky.Blake RBorjack-Sjodin,Paula AnnMiller.Stephan SRossomando,Anthony<120>神經(jīng)胚活素的多聚體偶聯(lián)物及其應(yīng)用方法<130>00689-506-061<140>待定<141>2002-01-23<150>60/266,071<151>2001-02-01<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述共有序列<220>
<221>VARIANT<222>(3)<223>其中Xaa是Gly或Thr<220>
<221>VARIANT<222>(4)<223>其中Xaa是Pro或Arg<220>
<221>VARIANT<222>(5)<223>其中Xaa是Gly或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(10)<223>其中Xaa是Ala或Thr<220>
<221>VARIANT<222>(11)<223>其中Xaa是Ala或Thr<220>
<221>VARIANT<222>(12)<223>其中Xaa是Gly或Asp<220>
<221>VARIANT
<222>(26)<223>其中Xaa是Arg或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(33)<223>其中Xaa是Arg或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(38)<223>其中Xaa是Val或Ile<220>
<221>VARIANT<222>(51)<223>其中Xaa是Val或Ile<220>
<221>VARIANT<222>(53)<223>其中Xaa是Pro或Gln<220>
<221>VARIANT<222>(69)<223>其中Xaa是Pro或Ser<220>
<221>VARIANT<222>(76)<223>其中Xaa是Val或Ile<220>
<221>VARIANT<222>(103)<223>其中Xaa是Arg或His<400>1A1a Gly Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Xaa Xaa Xaa Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Xaa Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Xaa Ser Asp Glu Leu Xaa Arg Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg35 40 45Ala Arg Ser Xaa His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly50 55 60Ala Leu Arg Xaa Pro Pro Gly Ser Arg Pro Xaa Ser Gln Pro Cys Arg65 70 75 80Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp85 90 95Arg Thr Val Asp Xaa Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105 110<210>2<211>113
<2l2>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>3<211>113<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>3Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>4<211>113<212>PRT
<213>褐家鼠(rattus norvegicus)<400>4Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys1 5 10 15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His20 25 30Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35 40 45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50 55 60Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys65 70 75 80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85 90 95Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>5<211>675<212>DNA<213>褐家鼠(rattus norvegicus)<400>5atggaactgg gacttggaga gcctactgca ttgtcccact gcctccggcc taggtggcaa 60ccagccttgt ggccaaccct agctgctcta gccctgctga gcagcgtcac agaagcttcc 120ctggacccaa tgtcccgcag ccccgcctct cgcgatgttc cctcgccggt cctggcgccc 180ccaacagact acctacctgg gggacacacc gcacatctgt gcagcgaaag agccctgcga 240ccaccgccgc agtctcctca gcccgcaccc ccaccaccgg gtcccgcgct ccagtctcct 300cccgctgcgc tccgcggggc acgcgcggcg cgtgcaggaa cccggagcag ccgcgcacgg 360gctacagatg cgcgcggctg ccgcctgcgc tcacagctgg tgccggtgag cgctctcggc 420ctgggccaca gctccgacga gctgatacgt ttccgcttct gcagcggttc gtgccgccga 480gcacgctccc cgcacgatct cagcctggcc agcctgctgg gcgccggggc cctgcggtct 540cctcccgggt cccggccgat cagccagccc tgttgccggc ccactcgcta tgaggcagtc 600tccttcatgg acgtgaacag cacctggaga accgtggacc atctctccgc caccgcctgc 660ggctgtctgg gctga 675<210>6<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD2-310寡核苷酸<400>6gtatctttca tggacgtaaa gtctacatgg agaaccgtag atcatctatc tgcaacc57<210>7
<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-211寡核苷酸<400>7ggttgcagat agatgatcta cggttctcca tgtagacttt acgtccatga aagatac57<210>8<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-254寡核苷酸<400>8gctggaactc gcagctctcg tgctcgtgca acggatgcaa aaggctgtcg50<210>9<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD2-255寡核苷酸<400>9cgacagcctt ttgcatccgt tgcacgagca cgagagctgc gagttccagc50<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-258寡核苷酸<400>10ggagccggag cactaaaatc tccccgggat ctagacc 37<210>11<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-259寡核苷酸<400>11ggtctagatc ccgggggaga ttttagtgct ccggctcc 38
<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-256寡核苷酸<400>12gacgaattaa ttaagtttcg tttttgttca gg 32<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述KD3-257寡核苷酸<400>13cctgaacaaa aacgaaactt aattaattcg tc 3權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)胚活素多肽變體,其包含與SEQ ID NO1中的氨基酸8-113至少70%相同的氨基酸序列,條件是該神經(jīng)胚活素多肽變體包括選自如下的一個或多個氨基酸取代在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置14處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置68處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置95處除了天冬酰胺以外的氨基酸,其中,所述氨基酸的位置是根據(jù)SEQ ID NO1的多肽序列編號的。
2.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體進一步包括SEQ ID NO1的氨基酸1-7。
3.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時與GFRα3結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時刺激RET多肽的酪氨酸磷酸化。
5.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時提高神經(jīng)元的存活。
6.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時提高感覺神經(jīng)元的存活。
7.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時使神經(jīng)元的病理改變正?;?br> 8.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時使感覺神經(jīng)元的病理改變正?;?。
9.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時提高自主神經(jīng)元的存活。
10.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時提高多巴胺能神經(jīng)元的存活。
11.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述變體多肽包括選自如下的二個或多個氨基酸取代在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置14處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置68處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置95處除了天冬酰胺以外的氨基酸。
12.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述變體多肽包括選自如下的三個或多個氨基酸取代在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置14處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置68處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置95處除了天冬酰胺以外的氨基酸。
13.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述變體多肽包括在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置14處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置68處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置95處除了天冬酰胺以外的氨基酸。
14.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中在所述神經(jīng)胚活素多肽變體的位置95處的氨基酸不是天冬酰胺。
15.權(quán)利要求14的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中在所述神經(jīng)胚活素多肽變體的位置95處的氨基酸是賴氨酸。
16.權(quán)利要求14的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體進一步包含選自如下的取代在位置14處除了精氨酸以外的氨基酸;在位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,以及在位置68處除了精氨酸以外的氨基酸。
17.權(quán)利要求16的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中在位置14,39或68處的所述取代是賴氨酸。
18.權(quán)利要求14的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體進一步包含選自如下的二個取代在位置14處除了精氨酸以外的氨基酸;在位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,以及在位置68處除了精氨酸以外的氨基酸。
19.權(quán)利要求18的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述二個取代是賴氨酸。
20.權(quán)利要求14的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體進一步包括如下的三個取代在位置14處除了精氨酸以外的氨基酸;在位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,以及在位置68處除了精氨酸以外的氨基酸。
21.權(quán)利要求20的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述3個取代是賴氨酸。
22.權(quán)利要求15的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸8-94和96-113與SEQ ID NO1的氨基酸8-94和96-113至少90%相同。
23.權(quán)利要求15的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸8-94和96-113與SEQ ID NO1的氨基酸8-94和96-113至少95%相同。
24.權(quán)利要求22的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸序列包括所述神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸8-94和96-113的大鼠,人或小鼠天然神經(jīng)胚活素多肽氨基酸序列。
25.權(quán)利要求23的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體的氨基酸8-94和96-113選自SEQ ID NO2,SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的氨基酸8-94和96-113的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求15的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述多肽包括SEQ IDNO2的氨基酸8-113。
27.權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽變體是融合蛋白。
28.權(quán)利要求27的神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述融合蛋白包括與所述神經(jīng)胚活素多肽變體框內(nèi)融合的人血清白蛋白序列。
29.一種融合蛋白,包含與人血清白蛋白可操作連接的神經(jīng)胚活素多肽。
30.一種核酸分子,其編碼權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體。
31.包含權(quán)利要求30的核酸的載體。
32.權(quán)利要求30的載體,其中所述載體是表達載體。
33.包含權(quán)利要求32的載體的細胞。
34.權(quán)利要求33的細胞,其中所述細胞選自哺乳動物細胞,真菌細胞,酵母細胞,昆蟲細胞以及細菌細胞。
35.權(quán)利要求34的細胞,其中所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
36.一種制備神經(jīng)胚活素多肽變體的方法,該方法包括在允許神經(jīng)胚活素多肽變體表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求33的細胞。
37.權(quán)利要求36的方法,其進一步包括回收所述神經(jīng)胚活素多肽變體。
38.由權(quán)利要求36的方法制備的神經(jīng)胚活素多肽變體。
39.一種核酸分子,其編碼權(quán)利要求28的神經(jīng)胚活素多肽變體。
40.包含權(quán)利要求39的核酸的載體。
41.權(quán)利要求40的載體,其中所述載體是表達載體。
42.包含權(quán)利要求41的載體的細胞。
43.權(quán)利要求42的細胞,其中所述細胞選自哺乳動物細胞,真菌細胞,酵母細胞,昆蟲細胞以及細菌細胞。
44.權(quán)利要求43的細胞,其中所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
45.一種制備神經(jīng)胚活素多肽變體的方法,包括在允許神經(jīng)胚活素多肽變體表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求42的細胞。
46.權(quán)利要求45的方法,其進一步包括回收所述神經(jīng)胚活素多肽變體。
47.由權(quán)利要求46的方法制備的神經(jīng)胚活素多肽變體。
48.包含權(quán)利要求1的神經(jīng)胚活素多肽變體的多聚體多肽組合物。
49.權(quán)利要求48的多聚體多肽組合物,其中所述多聚體多肽組合物是二聚體。
50.權(quán)利要求49的多聚體多肽組合物,其中所述多聚體多肽組合物是同二聚體。
51.權(quán)利要求48的多聚體多肽組合物,其中所述多聚體多肽組合物是異二聚體。
52.一種組合物,包含與非天然聚合物偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體。
53.依照權(quán)利要求52的組合物,其中所述非天然的多聚體通過使所述多肽的暴露于溶劑的氨基酸與該多肽偶聯(lián)。
54.權(quán)利要求52的組合物,其中所述組合物包含神經(jīng)胚活素多肽變體,該變體包含與SEQ ID NO1的氨基酸8-113至少70%相同的氨基酸序列,條件是該神經(jīng)胚活素多肽變體包括選自如下的一個或多個氨基酸取代在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置14處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的氨基酸序列中的位置39處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置68處除了精氨酸以外的氨基酸,在所述變體多肽的位置95處除了天冬酰胺以外的氨基酸,其中,所述氨基酸的位置是根據(jù)SEQ ID NO1的多肽序列編號的。
55.權(quán)利要求52的組合物,其中所述多聚體包含聚亞烷基二醇半分子。
56.權(quán)利要求55的組合物,其中所述聚亞烷基二醇半分子是聚乙二醇(PEG)半分子。
57.權(quán)利要求55的組合物,其中所述聚亞烷基二醇半分子與所述神經(jīng)胚活素多肽的氨基偶聯(lián),或與神經(jīng)胚活素多肽變體的賴氨酸或其它氨基偶聯(lián)。
58.權(quán)利要求57的組合物,其中所述聚亞烷基二醇半分子通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯偶聯(lián)。
59.權(quán)利要求58的組合物,其中所述活性酯選自PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS-PEG),琥珀酰亞胺丁酸酯(SPB-PEG)或琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA-PEG)。
60.權(quán)利要求57的組合物,其中所述聚亞烷基二醇半分子選自羧甲基-NHS,正亮氨酸-NHS,SC-PEG,tresylate,醛,環(huán)氧化物,羰基吲哚或PNP碳酸鹽。
61.權(quán)利要求55的組合物,其中所述聚亞烷基二醇半分子與所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的半胱氨酸基團偶聯(lián)。
62.權(quán)利要求61的組合物,其中所述聚亞烷基二醇半分子通過選自如下的基團偶聯(lián)馬來酰亞胺基團,乙烯基砜基團,鹵代乙酸基團或巰基。
63.權(quán)利要求52的組合物,其中所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體是糖基化的。
64.權(quán)利要求63的組合物,其中所述多聚體與所述糖基化的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的糖半分子偶聯(lián)。
65.權(quán)利要求64的組合物,其中所述多聚體在氧化所述糖基化的神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的腙(hydrazole)基團或氨基之后,與所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體偶聯(lián)。
66.權(quán)利要求52的組合物,其中所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體包含一個,二個,三個或四個PEG半分子。
67.權(quán)利要求52的組合物,其中所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的血清半衰期比沒有所述多聚體的所述多肽或多肽變體的半衰期長。
68.權(quán)利要求52的組合物,其中所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體二聚化時,具有選自如下的生理活性結(jié)合GFRα3,RET活化,使神經(jīng)元的病理改變正?;约按偈股窠?jīng)元的存活。
69.權(quán)利要求68的組合物,其中所述多聚體在多肽的N末端與所述多肽偶聯(lián)。
70.權(quán)利要求68的組合物,其中所述多聚體在多肽的非末端氨基酸部位與所述多肽偶聯(lián)。
71.權(quán)利要求68的組合物,其中所述多聚體與神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體的暴露于溶劑的氨基酸偶聯(lián)。
72.權(quán)利要求68的組合物,其中所述多聚體與所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體在選自如下的殘基處偶聯(lián)所述多肽變體的氨基末端,所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體氨基酸序列的位置14,所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體氨基酸序列的位置39,所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體氨基酸序列的位置68,所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體氨基酸序列的位置95。
73.一種藥物組合物,包含分散于其中的生理可接受的載體和權(quán)利要求68的組合物。
74.一種穩(wěn)定的,水溶性的偶聯(lián)型神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體復(fù)合物,包含與聚亞烷基二醇半分子偶聯(lián)的二聚體型神經(jīng)胚活素多肽或二聚體型神經(jīng)胚活素多肽變體,其中所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體通過不穩(wěn)定的鍵與聚乙二醇半分子偶聯(lián)。
75.權(quán)利要求74的復(fù)合物,其中所述不穩(wěn)定的鍵可通過生化水解,蛋白水解或巰基裂解作用裂解。
76.權(quán)利要求75的復(fù)合物,其中所述不穩(wěn)定的鍵在體內(nèi)條件下是可裂解的。
77.一種制備修飾的神經(jīng)胚活素多肽的方法,該多肽在二聚化時在體外或體內(nèi),相對于二聚化的野生型神經(jīng)胚活素多肽,具有延長的活性,該方法包括提供神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體;以及將所述多肽或修飾的神經(jīng)胚活素多肽變體與非天然的多聚體半分子偶聯(lián),從而形成偶聯(lián)的多聚體神經(jīng)胚活素多肽組合物。
78.一種治療或預(yù)防受試者的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法,包括給藥有此需要的受試者治療有效量的包含權(quán)利要求1多肽的二聚體,權(quán)利要求52的包含所述神經(jīng)胚活素多肽或神經(jīng)胚活素多肽變體偶聯(lián)物二聚體的組合物,權(quán)利要求69的藥物組合物或權(quán)利要求74的復(fù)合物。
79.權(quán)利要求78的方法,其中所述神經(jīng)疾病是外周神經(jīng)的疾病。
80.權(quán)利要求78的方法,其中所述疾病是外周神經(jīng)病。
81.權(quán)利要求78的方法,其中所述疾病是神經(jīng)病的疼痛綜合征。
82.權(quán)利要求78的方法,其中所述受試者是人。
83.權(quán)利要求78的方法,其中所述給藥是全身給藥。
84.權(quán)利要求78的方法,其中所述給藥是局部給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)胚活素多體變體,該變體適合形成包含與多聚體偶聯(lián)的神經(jīng)胚活素多體變體的偶聯(lián)物,所述多聚體包含聚亞烷基二醇半分子。本發(fā)明所述偶聯(lián)物具有延長的生物利用率,并且在優(yōu)選實施方案中,其與未修飾的或野生型的神經(jīng)胚活素相比,具有延長的生物活性。本發(fā)明的偶聯(lián)物可用于治療目的,也可用于非治療目的,例如用于診斷。
文檔編號A61P29/02GK1500095SQ02807753
公開日2004年5月26日 申請日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月1日
發(fā)明者黛娜·W·Y·薩, 黛娜 W Y 薩, R·布萊克·佩平斯基, 晨恕づ迤剿夠, A 博杰克-斯喬丁, 葆拉·A·博杰克-斯喬丁, S 米勒, 斯蒂芬·S·米勒, 羅索曼多, 安東尼·羅索曼多 申請人:比奧根公司
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