一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖的干擾tgm2基因的小分子rna及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小分子干擾RNA (即shRNA)，尤其涉及一 種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖的干擾TGM2基因的小分子RNA。此外，本發(fā)明還涉及該干擾TGM2基 因的小分子RNA的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] TGM2蛋白是一種廣泛表達(dá)的蛋白交聯(lián)酶，對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附和細(xì)胞凋亡起到 了重要的調(diào)控作用，在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，并參與藥物耐受和腫瘤轉(zhuǎn)移，并與多種神經(jīng)退 行性疾病密切相關(guān)。
[0003] 膠質(zhì)瘤是發(fā)生于神經(jīng)外胚層的腫瘤，故亦稱神經(jīng)外胚層腫瘤或神經(jīng)上皮腫瘤。腫 瘤起源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，即神經(jīng)膠質(zhì)、室管膜、脈絡(luò)叢上皮和神經(jīng)實(shí)質(zhì)細(xì)胞，即神經(jīng)元。大多 數(shù)腫瘤起源于不同類型的神經(jīng)膠質(zhì)，但根據(jù)組織發(fā)生學(xué)來(lái)源及生物學(xué)特征類似，對(duì)發(fā)生于 神經(jīng)外胚層的各種復(fù)查腫瘤病，一般都稱為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0004] 膠質(zhì)瘤的分類方法很多，臨床工作者往往采用的是分類比較簡(jiǎn)單的Kernohan分 類法。各型膠質(zhì)瘤中，以星形細(xì)胞瘤最多，其次為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，其后依次為髓母細(xì)胞瘤、室 管膜瘤、少枝膠質(zhì)瘤、松果體瘤、混合性膠質(zhì)瘤、脈絡(luò)叢乳頭狀瘤、未分類膠質(zhì)瘤及神經(jīng)元性 腫瘤。各型膠質(zhì)瘤的好發(fā)部位不同，如星形細(xì)胞瘤成人多見(jiàn)于大腦半球，兒童則多發(fā)在小 腦；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤幾乎均發(fā)生于大腦半球；髓母細(xì)胞瘤發(fā)生于小腦蚓部；室管膜瘤多見(jiàn)于 第4腦室；少枝膠質(zhì)瘤大多發(fā)生于大腦半球。
[0005] 膠質(zhì)瘤以男性較多見(jiàn)，特別在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤，男性明顯多于女 性。各型膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多見(jiàn)于中年，室管膜瘤多見(jiàn)于兒童及青年，髓母細(xì)胞瘤幾乎都發(fā)生在 兒童。膠質(zhì)瘤的部位與年齡也有一定關(guān)系，如大腦星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多見(jiàn)于成人， 小腦膠質(zhì)瘤（星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤）多見(jiàn)于兒童。
[0006] 膠質(zhì)瘤大多緩慢發(fā)病，自出現(xiàn)癥狀至就診時(shí)間一般為數(shù)周至數(shù)月，少數(shù)可達(dá)數(shù)年。 惡性程度高的和后顱窩腫瘤病史較短，較良性的或位于靜區(qū)的腫瘤病史較長(zhǎng)。腫瘤若有出 血或囊變，癥狀會(huì)突然加重，甚至有類似腦血管病的發(fā)病過(guò)程。膠質(zhì)瘤的臨床癥狀可分兩方 面，一是顱內(nèi)壓增高癥狀，如頭痛、嘔吐、視力減退、復(fù)視、精神癥狀等；另一是腫瘤壓迫、浸 潤(rùn)、破壞腦組織所產(chǎn)生的局灶癥狀，早期可表現(xiàn)為刺激癥狀如局限性癲癇，后期表現(xiàn)為神經(jīng) 功能缺失癥狀如癱瘓。
[0007] 膠質(zhì)瘤的診斷，根據(jù)其生物學(xué)特征、年齡、性別、好發(fā)部位及臨床過(guò)程進(jìn)行分析，在 病史及體征基礎(chǔ)上，采用電生理、超聲波、放射性核素、放射學(xué)及核磁共振等輔助檢查，定位 正確率幾乎是100%，定性診斷正確率可在90 %以上。
[0008] RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指由雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)與其序列同源 的mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 機(jī)制。RNA干擾（RNAi)的基本原理是利用具有同源性的雙鏈RNA (dsRNA)迅速阻斷序列特 異的目標(biāo)基因的表達(dá)活性，是實(shí)驗(yàn)室中一種有效的阻斷基因表達(dá)的工具。
[0009]目前，尚未見(jiàn)有關(guān)用于抑制膠質(zhì)瘤增殖的TGM2基因的相同序列小分子干擾RNA的 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是提供一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖的干擾TGM2基因 的小分子RNA。
[0011] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是提供該干擾TGM2基因的小分子RNA的制備方法。
[0012] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供該干擾TGM2基因的小分子RNA的應(yīng)用。
[0013] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0014] 在本發(fā)明的一方面，提供一種用于抑制膠質(zhì)瘤增殖的干擾TGM2基因的小分子 RNA，其對(duì)應(yīng)的序列為：
[0015] Sense (正義鏈）：5 ' -CTAGACCACTTCATTTTGCTCTTCCTCGAGGAAGAGCAAAATGAAGTG GG-3'，如 SEQ ID NO. 1 所示；
[0016] Antisense (反義鏈）：5，-GATCCCCACTTCATTTTGCTCTTCCTCGAGGAAGAGCAAAATGAAGT GGT-3'，如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備上述用于抑制膠質(zhì)瘤增殖的干擾TGM2基因 的小分子RNA的方法，該方法的具體步驟為：
[0018] 步驟一、根據(jù)PMT98載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于TGM2基因第499-517位， 即：CCACTTCATTTTGCTCTTC的shRNA寡核苷酸序列并進(jìn)行合成，所述的shRNA的寡核苷酸序 列序列為：如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所不的喊基序列；
[0019] 步驟二、依據(jù)PMT98載體設(shè)計(jì)的要求，將設(shè)計(jì)的shRNA序列和PMT98質(zhì)粒進(jìn)行連 接，得到用于抑制膠質(zhì)瘤的干擾TGM2基因的一種小分子RNA。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種上述干擾TGM2基因的小分子RNA在制備抑制膠質(zhì) 瘤增殖的藥物中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明設(shè)計(jì)對(duì)膠質(zhì)瘤增殖關(guān)聯(lián)的TGM2基因的RNAi，并應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型（U373 細(xì)胞模型）研宄其對(duì)抗膠質(zhì)瘤增殖的抑制作用，為RNAi在膠質(zhì)瘤的治療應(yīng)用提供了一種新 藥物分子。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，轉(zhuǎn)染TGM2RNA干擾組中的腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本 發(fā)明的小分子干擾RNA能下調(diào)膠質(zhì)瘤中的TGM2基因表達(dá)，能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中shRNA的寡核苷酸序列和PMT98質(zhì)粒的連接示意圖。
[0023] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中TGM2RNAi對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TGM2的干擾作用示意圖， 其中，blank表示空細(xì)胞組，empty vector表示轉(zhuǎn)染空載體組；TGM2RNAi表示轉(zhuǎn)染TGM2RNA 干擾組。
[0024] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中TGM2RNAi對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響示意圖，其中， blank表示空細(xì)胞組，empty vector表示轉(zhuǎn)染空載體組；TGM2RNAi表示轉(zhuǎn)染TGM2RNA干擾 組。
[0025] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中三個(gè)小分子RNA對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TGM2的干擾作用對(duì) 比示意圖，其中，blank表示空細(xì)胞組，empty vector表示轉(zhuǎn)染空載體組。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具 體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] -、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：
[0029] 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373細(xì)胞系（購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心）培 養(yǎng)于37°C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化脫壁，之后加入適量培養(yǎng)液并 反復(fù)吹打以混勻細(xì)胞；將得到的細(xì)胞懸液移入15ml離心管中，1500rpm離心3min ;去上清； 用5ml無(wú)菌I XPBS將細(xì)胞懸起，吹打混勻；加約Iml細(xì)胞懸液于裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的新 培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約2天左右傳代1次（主要查看細(xì)胞有無(wú)鋪滿 培養(yǎng)瓶）。
[0030] 二、TGM2-RNAi質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)染：
[0031] I. TGM2-RNAi 質(zhì)粒的設(shè)計(jì)：
[0032] 根據(jù)PMT98載體設(shè)計(jì)的具體要求，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于TGM2基因第499-517位， 即：CCACTTCATTTTGCTCTTC的shRNA寡核苷酸序列并進(jìn)行合成，送上海捷瑞生物工程有限公 司進(jìn)行合成。
[0033] TGM2-RNAi對(duì)應(yīng)的序列為：
[0034] Sense (正義鏈）：5 ' -CTAGACCACTTCATTTTGCTCTTCCTCGAGGAAGAGCAAAATGAAGTG GG-3'，如 SEQ ID NO.