專(zhuān)利名稱(chēng)：新的二肽基肽酶iv抑制劑和它們用于降低血壓水平的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二肽基肽酶IV和二肽基肽酶IV樣酶活性抑制劑，更具體地說(shuō)，涉及含有所述化合物的藥物組合物，和所述化合物用于降低哺乳動(dòng)物血壓水平和相關(guān)疾病的用途。
背景技術(shù)：
二肽基肽酶IV(DPIV)為切割肽鏈的N-末端二肽的絲氨酸蛋白酶，所述肽鏈優(yōu)選在倒數(shù)第二位含有脯氨酸殘基。雖然DPIV在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的生物作用尚未完全確認(rèn)，但據(jù)信它在神經(jīng)肽代謝、T細(xì)胞激活和HIV進(jìn)入淋巴樣細(xì)胞中起重要作用。
本發(fā)明提供DPIV抑制劑用于預(yù)防和治療由DPIV和DPIV樣酶抑制介導(dǎo)的病癥，特別是用于降低血壓水平和相關(guān)疾病的新用途，以及例如用于抑制DPIV和DPIV樣酶的藥物組合物和抑制所述酶活性的方法。
本發(fā)明涉及一種治療方法，特別是一種用于降低哺乳動(dòng)物血壓水平的方法，并涉及用于此方法的化合物和組合物。二肽基肽酶IV(DPIV；EC 3.4.14.5；CD26)是在多種組織，包括上皮細(xì)胞和白細(xì)胞亞類(lèi)上表達(dá)的脯氨酸后(較小程度為丙氨酸后、絲氨酸后或甘氨酸后)切割的絲氨酸蛋白酶。此外，它是在其胞外域顯示其活性的膜相關(guān)外肽酶。
低分子量二肽基肽酶IV抑制劑的實(shí)例為諸如以下的試劑四氫異喹啉-3-酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯和-吡咯烷、N-(N′-取代的甘氨酰)-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨酰)-噻唑烷、N-(取代的甘氨酰)-4-氰基噻唑烷、氨基-酰基-二羥硼基-脯氨酰-抑制劑、環(huán)丙基稠合的吡咯烷和雜環(huán)化合物。在以下文獻(xiàn)中描述了二肽基肽酶IV抑制劑US 6,380,398、US 6,011,155、US 6,107,317、US 6,110,949、US6,124,305、US 6,172,081、WO 95/15309、WO 99/61431、WO 99/67278、WO 99/67279、DE 198 34 591、WO 97/40832、DE 196 16 486 C2、WO 98/19998、WO 00/07617、WO 99/38501、WO 99/46272、WO99/38501、WO 01/68603、WO 01/40180、WO 01/81337、WO 01/81304、WO 01/55105、WO 02/02560和WO 02/14271，本文引用這些文獻(xiàn)作參考，特別是有關(guān)這些抑制劑、它們的定義、用途和它們的制備。
術(shù)語(yǔ)DPIV樣酶涉及在結(jié)構(gòu)和/或功能上與DPIV/CD26相關(guān)的酶蛋白(Sedo&Malik，Dipeptidyl peptidase IV-like moleculeshomologous proteins or homologous activities？Biochimica et BiophysicaActa 2001，365061-10)。本質(zhì)上，這一小組酶在進(jìn)化過(guò)程中涉及從寡肽或多肽的N-末端釋放H-Xaa-Pro-二肽和H-Xaa-Ala-二肽。它們表現(xiàn)出共同的特征，即在Pro位置還容納(accomotate)Ala、Ser、Thr和其它具有小疏水側(cè)鏈的氨基酸如Gly或Val。水解效力等級(jí)為Pro＞Ala＞＞Ser，Thr＞＞Gly、Val。相同的蛋白僅以少量存在，使得僅可以完成Pro后或Ala后切割。雖然蛋白DPIV、DP II、FAPα(Seprase)、DP 6、DP 8和DP 9在結(jié)構(gòu)上相關(guān)并表現(xiàn)出高序列同源性，但吸誘素(attractin)是一種特別的功能性DPIV樣酶，其特征是類(lèi)似的活性和抑制模式。
在WO 01/19866、WO 02/04610、WO 02/34900和WO 02/31134中公開(kāi)了其它DPIV樣酶。WO 01/19866公開(kāi)了一種與DPIV和成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似的新的人二肽基氨基肽酶(DPP8)。WO 02/34900公開(kāi)了一種與DPIV和DPP8的氨基酸序列具有顯著同源性的新的二肽基肽酶9(DPP9)。WO 02/31134公開(kāi)了三種DPIV樣酶，DPRP1、DPRP2和DPRP3。序列分析揭示，DPRP1與WO 01/19866中公開(kāi)的DPP8相同，DPRP2與DPP9相同，DPRP3與WO 02/04610中公開(kāi)的KIAA1492相同。
高血壓通常是一種無(wú)癥狀病癥(symptomless condition)，其中動(dòng)脈中的異常高壓增大出現(xiàn)問(wèn)題如中風(fēng)、動(dòng)脈瘤、心力衰竭、心肌梗死和腎損傷的危險(xiǎn)。對(duì)于許多人，高血壓一詞表明過(guò)度緊張、神經(jīng)質(zhì)或壓力。然而，在醫(yī)學(xué)術(shù)語(yǔ)中，高血壓指血壓升高的病癥，而不論其原因。其已經(jīng)被稱(chēng)為“沉默殺手”，因?yàn)槠渫ǔ：芏嗄瓴粚?dǎo)致癥狀，直到重要器官被損傷。高血壓被定義為靜止收縮壓平均為140mmHg或更高，靜止舒張壓平均為90mmHg或更高，或者兩種情況均存在。在高血壓中，通常收縮壓和舒張壓均升高。
作為糖尿病的繼發(fā)效應(yīng)，控制血壓和消化過(guò)程的神經(jīng)受損。這導(dǎo)致血壓擺動(dòng)、吞咽困難和改變的胃腸功能，伴有腹瀉發(fā)作。此外，作為糖尿病的繼發(fā)效應(yīng)，動(dòng)脈粥樣硬化斑在心臟、腦、腿和陰莖中堵塞和阻塞大動(dòng)脈或中等大小的動(dòng)脈。小血管壁被損傷，以至于血管不再正常地輸送氧并可能滲漏。
高血壓的進(jìn)一步的定義和分類(lèi)在Merck Manual of MedicalInformation-Home Edition，Merck&Co.，2000中給出。當(dāng)人的收縮壓和舒張壓進(jìn)入不同的類(lèi)別時(shí)，將較高的類(lèi)別用于分類(lèi)血壓。例如，160/92被分類(lèi)為2期高血壓，而180/120被分類(lèi)為4期高血壓。將心血管問(wèn)題的危險(xiǎn)減至最低的最佳血壓為低于120/80mmHg。然而，通常必須對(duì)低讀數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
類(lèi)別 收縮壓 舒張壓正常血壓 低于130mmHg 低于85mmHg高正常血壓 130～13985～891期(輕微)高血壓 140～15990～992期(中度)高血壓 160～179100～1093期(重度)高血壓 180～209110～1194期(極重度)高血壓210或更高 120或更高如果人具有重度或長(zhǎng)期的高血壓并且不進(jìn)行治療，由于腦、眼、心臟和腎的損傷，諸如頭痛、疲勞、惡心、嘔吐、呼吸短促、不安以及視力障礙的癥狀出現(xiàn)。有時(shí)候，有重度高血壓的人發(fā)生由腦腫脹而導(dǎo)致的瞌睡甚至昏迷。這種病癥稱(chēng)為高血壓腦病，需要急診治療。
不進(jìn)行治療的高血壓增加人在較早年齡發(fā)生心臟病(如心力衰竭或心肌梗死)、腎衰竭和中風(fēng)的危險(xiǎn)。高血壓是中風(fēng)的最重要的危險(xiǎn)因素。高血壓也是人可以對(duì)其做些工作的心肌梗死的三個(gè)主要危險(xiǎn)因素之一；其他兩個(gè)危險(xiǎn)因素是吸煙和高血膽固醇水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供式1-12的DPIV抑制劑及其相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式用于降低哺乳動(dòng)物血壓水平或相關(guān)疾病的新用途。
缺乏DPIV酶活性和表達(dá)的突變體F344大鼠中外肽酶DPIV表達(dá)減少和DPIV樣活性缺乏導(dǎo)致血壓降低。測(cè)試了缺乏DPIV酶活性的突變體F344次代品系和野生型樣F344。兩周內(nèi)通過(guò)滲透性小型真空泵長(zhǎng)期胃內(nèi)灌輸異亮氨酰氰基吡咯烷T(mén)FA和異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽劑量依賴(lài)性地降低大鼠的血壓。因此，通過(guò)使用不同的DPIV抑制劑(異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽；異亮氨酰氰基吡咯烷T(mén)FA)進(jìn)行長(zhǎng)期治療，血壓得以降低，這提示兩種不同的DPIV抑制劑/配體的保護(hù)樣種類(lèi)作用。異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽和異亮氨酰氰基吡咯烷T(mén)FA可能通過(guò)間接地介導(dǎo)相應(yīng)作用的DPIV底物水平增加而防止高血壓。
本發(fā)明涉及一種新方法，在該方法中哺乳動(dòng)物血中酶二肽基肽酶(DPIV或CD26)的活性，或DPIV樣酶活性被特異性酶效應(yīng)物降低將導(dǎo)致內(nèi)源的，或外源給予的促胰島肽(腸降血糖素)、腸抑胃肽/胃抑多肽1-42(GIP1-42)和胰高血糖素樣肽-17-36酰胺(GLP-17-36)(或這些肽的類(lèi)似物)的降解減少。由DPIV和DPIV樣酶降解導(dǎo)致的這些肽或它們的類(lèi)似物的濃度降低將因此而減少或延遲。
作為由DPIV活性降低導(dǎo)致的內(nèi)源的，或外源給予的腸降血糖素或它們的類(lèi)似物的穩(wěn)定性增加的結(jié)果，它們的促胰島作用得以增強(qiáng)，導(dǎo)致從胰島分泌胰島素的強(qiáng)力刺激，以及更快速地從血中除去葡萄糖。結(jié)果，葡萄糖耐量得以改善。
作為結(jié)果，由長(zhǎng)期升高的循環(huán)葡萄糖濃度導(dǎo)致的與糖尿病相關(guān)的代謝異常，包括糖和脂質(zhì)代謝異常、糖尿和糖尿病酮癥酸中毒，以及慢性改變?nèi)缥⒀芎痛笱芗膊?、多神?jīng)病和糖尿病視網(wǎng)膜病變得以預(yù)防或緩解，特別是高血壓水平得以降低。
本發(fā)明是一種降低升高的血糖濃度和升高的血壓水平的新方法。其簡(jiǎn)單、可商業(yè)使用，并且適用于治療，特別是人的由升高的或異常的血糖和/或血壓水平導(dǎo)致的疾病的治療。


參照附圖可以對(duì)本發(fā)明有更進(jìn)一步的理解，其中圖1顯示DPIV催化的GIP1-42(a)和GLP-7-36(b)的水解的MALDI-TOF分析以及異亮氨酰噻唑烷對(duì)它們的抑制。
圖2顯示在DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷的存在下，體內(nèi)GLP-1代謝產(chǎn)物的血清存在的HPLC分析。
圖3顯示DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷對(duì)十二指腸內(nèi)葡萄糖刺激的大鼠的不同血液參數(shù)的影響。
圖4顯示用DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷長(zhǎng)期口服治療肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠(Zucker rat)在12周的藥物施用期間對(duì)禁食血糖的影響。
圖5用DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷長(zhǎng)期治療肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠在8周的藥物施用內(nèi)對(duì)收縮血壓的影響(使用尾套法(tail-cuffprocedure)測(cè)量收縮血壓)。
圖6顯示分別口服給予5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰吡咯烷和安慰劑后，在糖尿病朱克鼠中血糖水平的劑量依賴(lài)性降低；圖7顯示分別口服給予5mg/kg、15mg/kg、50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰噻唑烷和安慰劑后，在糖尿病朱克鼠中血糖水平的劑量依賴(lài)性降低；圖8顯示在將谷氨酰胺酰噻唑烷口服給予威斯塔鼠(Wistar rat)后發(fā)現(xiàn)的降解產(chǎn)物焦谷氨酰胺酰噻唑烷的化學(xué)結(jié)構(gòu)；以及圖9顯示在將谷氨酰胺酰噻唑烷口服給予肥胖威斯塔鼠后獲得的大鼠血漿提取物的色譜圖。在2.95分鐘處的峰代表谷氨酰胺酰噻唑烷，而在6.57分鐘處的峰代表焦谷氨酰胺酰噻唑烷。
具體實(shí)施方案本發(fā)明的目的是一種降低血糖和/或血壓水平的簡(jiǎn)單的新方法，其中由酶二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV樣酶的效應(yīng)物誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物血中這些酶活性的降低將導(dǎo)致內(nèi)源(或外源給予的)促胰島肽腸抑胃肽1-42(GIP1-42)和胰高血糖素樣肽酰胺-17-36(GLP-17-36)(或這些肽的類(lèi)似物)的降解減少。通常由DPIV和DPIV樣酶降解導(dǎo)致的這些肽或它們的類(lèi)似物的濃度降低將因此而減少或延遲。
本發(fā)明基于以下重大發(fā)現(xiàn)，即二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV樣酶在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的酶活性降低導(dǎo)致改善的葡萄糖耐量和高血壓的降低。
我們觀察到1.二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV樣酶活性的降低導(dǎo)致葡萄糖刺激的內(nèi)源釋放的或外源給予的腸降血糖素(或它們的類(lèi)似物)穩(wěn)定性增加，結(jié)果是給予DPIV或DPIV樣蛋白的效應(yīng)物可以用于控制循環(huán)中的腸降血糖素降解。
2.腸降血糖素(或它們的類(lèi)似物)的增加的生物穩(wěn)定性導(dǎo)致胰島素反應(yīng)的改變。
3.由二肽基肽酶IV(DPIV或CD26)或DPIV樣酶減少導(dǎo)致的循環(huán)腸降血糖素的增加的穩(wěn)定性導(dǎo)致隨后的胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖處置的改變，表明葡萄糖耐量可以通過(guò)施用DPIV效應(yīng)物而得到改善。
4.高血壓水平得到降低。
因此，本發(fā)明涉及二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV樣酶活性的效應(yīng)物用于降低如在表現(xiàn)臨床不適的基礎(chǔ)和餐后高血糖的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的升高的血糖和/或血壓水平的用途。更具體而言，本發(fā)明的用途的特征在于在哺乳動(dòng)物代謝病理異常如糖尿、高脂血癥、糖尿病酸中毒、糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病的預(yù)防或緩解中給予DPIV或DPIV樣酶活性的效應(yīng)物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于降低如在表現(xiàn)臨床不適的基礎(chǔ)和餐后高血糖的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的升高的血糖水平的方法，所述方法包括給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物治療有效量的二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV樣酶活性的效應(yīng)物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在降低如在表現(xiàn)臨床不適的基礎(chǔ)和餐后高血糖的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的升高的血糖和/或血壓水平的方法中使用的二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV樣活性的效應(yīng)物。
可以在降低哺乳動(dòng)物中DPIV和DPIV樣蛋白濃度或酶活性的藥物配方如酶抑制劑、底物、假底物、DPIV基因表達(dá)抑制劑、靶酶蛋白的結(jié)合蛋白或抗體或者如這些不同化合物的組合中采用本發(fā)明給予的DPIV和DPIV樣酶的效應(yīng)物。本發(fā)明的效應(yīng)物是，例如，DPIV抑制劑如二肽衍生物或二肽模擬物如丙氨酰pyrolidide、異亮氨酰噻唑烷以及假底物N-纈氨酰脯氨酰、O-苯甲酰羥胺。這些化合物可以從文獻(xiàn)[DEMUTH，H.-U.，Recent developments in the irreversibleinhibition of serine and cysteine proteases，J.Enzyme Inhibition 3，249(1990)]中了解或者可以根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法合成。
本發(fā)明的方法是降低哺乳動(dòng)物血中升高的循環(huán)葡萄糖濃度和降低高血壓水平的新方法。
本發(fā)明涉及二肽基肽酶IV(DPIV)抑制領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及DPIV和DPIV樣酶活性抑制劑用于降低哺乳動(dòng)物高血壓水平或相關(guān)疾病的新用途，以及含有所述化合物的藥物組合物。
與本領(lǐng)域中其它建議的方法相比，本發(fā)明特別地提供一種使用低分子量二肽基肽酶IV抑制劑的可以口服實(shí)現(xiàn)的療法。本發(fā)明代表一種用于降低哺乳動(dòng)物血壓水平或相關(guān)疾病的新方法。它使用方便，可在商業(yè)上使用，并適用于治療方案，特別是關(guān)于人疾病的治療方案。
在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)本發(fā)明，研究DPIV表達(dá)和酶活性在血壓中的作用揭示，口服給予DPIV抑制劑導(dǎo)致血壓水平降低。
本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)二肽基肽酶IV抑制劑和/或配體，它們表現(xiàn)出高生物利用度。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供DPIV抑制劑，該抑制劑在靶組織中具有可精確預(yù)測(cè)的活性時(shí)間。
可口服利用的低分子量試劑的實(shí)例為通式A-B-C的穩(wěn)定和不穩(wěn)定的二肽基肽酶IV抑制劑的前藥，其中A代表氨基酸，B代表A和C之間的化學(xué)鍵或氨基酸，而C代表不穩(wěn)定或穩(wěn)定的二肽基肽酶IV抑制劑。在WO 99/67278和WO 99/67279中描述了它們，本文引用所述文獻(xiàn)關(guān)于條件、定義、使用和生產(chǎn)所述前藥的教導(dǎo)作為參考。尤其是本文引用A、B和C的詳細(xì)定義作為參考。
本發(fā)明涉及一種新方法，其中酶二肽基肽酶(DPIV或CD 26)活性或DPIV樣酶活性的降低，或DPIV特異性配體的結(jié)合在由酶效應(yīng)物誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物器官中發(fā)揮有益作用，并導(dǎo)致哺乳動(dòng)物血壓降低。結(jié)果是具有升高血壓的哺乳動(dòng)物將受益于用DPIV和DPIV樣酶活性抑制劑進(jìn)行的治療。
本發(fā)明的方法和用途包括使用這些酶的抑制劑或配體，通過(guò)抑制DPIV或相關(guān)酶活性來(lái)預(yù)防哺乳動(dòng)物，包括人的升高的血壓或降低血壓和相關(guān)疾病。DPIV抑制劑的口服給予在大部分情況下可能是優(yōu)選的。
現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例例示本發(fā)明，這些實(shí)施例集中于DPIV樣活性和/或結(jié)合降低血壓和血糖的作用。
在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及二肽樣化合物和類(lèi)似于二肽化合物的化合物及其鹽的用途，這些化合物由氨基酸和噻唑烷或吡咯烷基團(tuán)形成，在下文中稱(chēng)為二肽樣化合物。優(yōu)選氨基酸和噻唑烷或吡咯烷基團(tuán)用酰胺鍵連接。
特別適于本發(fā)明目的的是二肽化合物，其中的氨基酸優(yōu)選地選自天然氨基酸，如亮氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸。
根據(jù)本發(fā)明使用的二肽樣化合物在10μM的(二肽化合物)濃度下將二肽基肽酶IV活性或DPIV類(lèi)似酶活性降低至少10％，特別是至少40％。通常活性降低至少60％或至少70％也是需要的。優(yōu)選的效應(yīng)物也可能表現(xiàn)出活性降低最大20％或30％。
優(yōu)選的化合物為N-纈氨酰脯氨酰、O-苯甲酰羥胺、丙氨酰吡咯烷、異亮氨酰噻唑烷如L-別異亮氨酰噻唑烷、L-蘇型異亮氨酰吡咯烷和它們的鹽，特別是延胡索酸鹽，和L-別異亮氨酰吡咯烷和它的鹽。特別優(yōu)選的化合物為式1和2的谷氨酰胺酰吡咯烷和谷氨酰胺酰噻唑烷

進(jìn)一步優(yōu)選的化合物在表1中給出。
二肽樣化合物的鹽可以1∶1或2∶1的二肽(類(lèi)似物)組分與鹽組分的摩爾比存在。例如，這種鹽為(Ile-Thia)2延胡索酸。
表1進(jìn)一步優(yōu)選的二肽化合物的結(jié)構(gòu)

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供式3的肽化合物用于競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)二肽基肽酶IV催化的用途 其中A、B、C、D和E獨(dú)立地為任何氨基酸部分，包括蛋白原氨基酸、非蛋白原氨基酸、L-氨基酸和D-氨基酸，且其中E和/或D可以不存在。
涉及式(3)的進(jìn)一步條件A為除D-氨基酸之外的氨基酸；B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸(acetidine-(2)-carboxylic acid)和2-哌啶酸的氨基酸，C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸和N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸，D為任何氨基酸或不存在，且E為任何氨基酸或不存在，或者C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸、D-氨基酸之外的任何氨基酸；D為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的任何氨基酸，且E為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸。
可以用于本發(fā)明的氨基酸的實(shí)例為L(zhǎng)和D-氨基酸、N-甲基-氨基酸；allo-和threo-形式的Ile和Thr，例如它們可以是α-、β-或ω-氨基酸，其中優(yōu)選α-氨基酸。
整個(gè)權(quán)利要求書(shū)和說(shuō)明書(shū)中的氨基酸的實(shí)例為天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)、賴(lài)氨酸(Lys)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)和半胱氨酸(Cys)、蘇氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、羥脯氨酸(Hyp)、β-丙氨酸(β-Ala)、2-氨基辛酸(Aoa)、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸(azetidine-(2)-carboxylic acid，Ace)、2-哌啶酸(Pip)、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸等、α-氨基異丁酸(Aib)、肌氨酸(Sar)、鳥(niǎo)氨酸(Om)、瓜氨酸(Cit)、高精氨酸(Har)、叔丁基丙氨酸(叔丁基-Ala)、叔丁基甘氨酸(叔丁基-Gly)、N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、磺基丙氨酸(Cya)和甲硫氨酸亞砜(MSO)、乙酰-Lys，修飾的氨基酸如磷酰-絲氨酸(Ser(P))、芐基-絲氨酸(Ser(Bzl))和磷酰-酪氨酸(Tyr(P))、2-氨基丁酸(Abu)、氨基乙基半胱氨酸(AECys)、羧甲基半胱氨酸(Cmc)、脫氫丙氨酸(Dha)、脫氫氨基-2-丁酸(Dhb)、羧基谷氨酸(Gla)、高絲氨酸(Hse)、羥基賴(lài)氨酸(Hyl)、順式羥脯氨酸(cisHyp)、反式羥脯氨酸(transHyp)、異纈氨酸(Iva)、焦谷氨酸(Pyr)、正纈氨酸(Nva)、2-氨基苯甲酸(2-Abz)、3-氨基苯甲酸(3-Abz)、4-氨基苯甲酸(4-Abz)、4-(氨基甲基)苯甲酸(Amb)、4-(氨基甲基)環(huán)己烷羧酸(4-Amc)、青霉胺(Pen)、2-氨基-4-氰基丁酸(Cba)、環(huán)烷烴羧酸。
ω-氨基酸的實(shí)例為，例如5-Ara(氨基戊酸)、6-Ahx(氨基己酸)、8-Aoc(氨基辛酸)、9-Anc(氨基壬酸)、10-Adc(氨基癸酸)、11-Aun(氨基十一酸)、12-Ado(氨基十二酸)。
其它氨基酸為2，3-二氫化茚基甘氨酸(Igl)、二氫吲哚-2-羧酸(Idc)、八氫吲哚-2-羧酸(Oic)、二氨基丙酸(Dpr)、二氨基丁酸(Dbu)、萘基丙氨酸(1-Nal)、(2-Nal)、4-氨基苯丙氨酸(Phe(4-NH2))、4-苯甲酰苯丙氨酸(Bpa)、二苯丙氨酸(Dip)、4-溴苯丙氨酸(Phe(4-Br))、2-氯苯丙氨酸(Phe(2-Cl))、3-氯苯丙氨酸(Phe(3-Cl))、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、3，4-氯苯丙氨酸(Phe(3，4-Cl2))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、3，4-氟苯丙氨酸(Phe(3，4-F2))、五氟苯丙氨酸(Phe(F5))、4-胍基苯丙氨酸(Phe(4-胍基))、高苯丙氨酸(hPhe)、3-jodo苯丙氨酸(Phe(3-J))、4-jodo苯丙氨酸(Phe(4-J))、4-甲基苯丙氨酸(Phe(4-Me))、4-硝基苯丙氨酸(Phe-4-NO2))、聯(lián)苯基丙氨酸(Bip)、4-膦?；谆奖彼?Pmp)、環(huán)己基甘氨酸(Ghg)、3-吡啶基丙氨酸(3-Pal)、4-吡啶基丙氨酸(4-Pal)、3，4-脫氫脯氨酸(A-Pro)、4-酮脯氨酸(Pro(4-keto))、硫代脯氨酸(Thz)、六氫異煙酸(isonipecotic acid)(lnp)、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)、炔丙基甘氨酸(Pra)、6-羥基正亮氨酸(NU(6-OH))、高酪氨酸(hTyr)、3-jodo酪氨酸(Tyr(3-J))、3，5-二jodo酪氨酸(Tyr(3，5-J2))、d-甲基-酪氨酸(Tyr(Me))、3-NO2-酪氨酸(Tyr(3-NO2))、磷酸酪氨酸(Tyr(PO3H2))、烷基甘氨酸、1-氨基茚滿-1-羧酸、2-氨基茚滿-2-羧酸(Aic)、4-氨基-甲基吡咯-2-羧酸(Py)、4-氨基-吡咯烷-2-羧酸(Abpc)、2-氨基四氫萘-2-羧酸(Atc)、二氨基乙酸(Gly(NH2))、二氨基丁酸(Dab)、1，3-二氫-2H-isoinole-羧酸(Disc)、高環(huán)己基丙氨酸(hCha)、高苯丙氨酸(hPhe或Hof)、反式-3-苯基-氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、4-苯基-吡咯烷-2-羧酸、5-苯基-吡咯烷-2-羧酸、3-吡啶基丙氨酸(3-Pya)、4-吡啶基丙氨酸(4-Pya)、苯乙烯基丙氨酸、四氫異喹啉-1-羧酸(Tiq)、1，2，3，4-四氫去甲哈爾滿(norharmane)-3-羧酸(Tpi)、β-(2-thienryl)-丙氨酸(Tha)。
編碼在遺傳密碼中的氨基酸的氨基酸置換也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的肽化合物中，且可以歸類(lèi)在這種一般方案內(nèi)。
蛋白原氨基酸定義為來(lái)源于天然蛋白的α-氨基酸。非蛋白原氨基酸定義為所有其它氨基酸，這些氨基酸不是常見(jiàn)的天然蛋白的構(gòu)件。
所得的肽可以合成為游離的C-末端酸或合成為C-末端酰胺形式。游離酸肽或酰胺可以通過(guò)側(cè)鏈修飾而改變。這些側(cè)鏈修飾包括，例如但不限于，高絲氨酸形成、焦谷氨酸形成、二硫鍵形成、天冬酰胺或谷氨酰胺殘基的脫酰胺、甲基化、叔丁基化、叔丁氧羰基化、4-甲基芐基化、硫代茴香基化(thioanysilation)、硫代羥甲苯基化(thiocresylation)、芐氧基甲基化、4-硝基苯基化、芐氧羰基化、2-硝基苯甲酰化、2-硝基亞磺?；?、4-甲苯磺酰化、五氟苯基化、二苯基甲基化、2-氯芐氧羰基化、2，4，5-三氯苯基化、2-溴芐氧羰基化、9-芴基甲氧羰基化、三苯基甲基化、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?、羥基化、甲硫氨酸氧化、甲?；?、乙酰化、茴香基化、芐基化、苯甲?；⑷阴；?、天冬氨酸或谷氨酸羧化、磷酰化、硫酸化、半胱氨酰化、用戊糖、脫氧己糖、己糖胺、己糖或N-乙酰己糖胺糖基化(glycolysation)、法呢基化、肉豆蔻酰化、生物素基化、棕櫚?；?、硬脂?；?、香葉基香葉基化、谷胱甘肽基化、5′-腺苷基化、ADP-核糖基化、用N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸、吡哆醛磷酸、硫辛酸、4′-磷酸泛酰巰基乙胺或N-羥基琥珀酰亞胺修飾。
在式(3)的化合物中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)命名法，氨基酸部分A、B、C、D和E分別以常規(guī)方式通過(guò)酰胺鍵與相鄰部分連接，從而使氨基酸(肽)的氨基末端(N-末端)在左邊，而氨基酸(肽)的羧基末端(C-末端)在右邊。
在本申請(qǐng)人的發(fā)明之前，已知的體外脯氨酸特異性絲氨酸蛋白酶二肽基肽酶IV的肽底物為三肽Diprotin A(Ile-Pro-Ile)、Diprotin B(Val-Pro-Leu)和Diprotin C(Val-Pro-Ile)。申請(qǐng)人已意外地發(fā)現(xiàn)本文以上和以下公開(kāi)的藥理學(xué)劑量的化合物擔(dān)當(dāng)哺乳動(dòng)物的體內(nèi)二肽基肽酶IV底物，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性催化降低血壓并緩解哺乳動(dòng)物代謝病理異常如糖尿、高脂血癥、代謝性酸中毒和糖尿病。
用作二肽基肽酶IV和DPIV樣酶調(diào)節(jié)劑的本發(fā)明的特別優(yōu)選的化合物包括顯示DPIV結(jié)合的Ki值，在靜脈內(nèi)和/或口服給予威斯塔鼠后在體內(nèi)有效地抑制DPIV的化合物。
進(jìn)一步優(yōu)選的化合物為式4的肽基酮
其中A選自 X1為H或?；蜓豸驶鶊F(tuán)，包括所有氨基酸和肽殘基，X2為H、n＝2-4的-(CH)n-NH-C5H3N-Y或C5H3N-Y(二價(jià)吡啶基殘基)，而Y選自H、Br、Cl、I、NO2或CN，X3為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，X4為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，X5為H或烷基、烷氧基或苯基殘基，X6為H或烷基殘基；對(duì)于n＝1X選自H、OR2、SR2、NR2R3、N+R2R3R4，其中R2代表酰基殘基，所述?；鶜埢幢蝗〈虮灰弧⒍蚋鄠€(gè)烷基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基殘基取代，或者R2代表所有氨基酸和肽殘基，或烷基殘基，它們未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基殘基取代，R3代表烷基和?；倌軋F(tuán)，其中R2和R3可以是飽和與不飽和碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)的一種或多種環(huán)結(jié)構(gòu)的部分，
R4代表烷基殘基，其中R2和R4或R3和R4可以是飽和與不飽和碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)的一種或多種環(huán)結(jié)構(gòu)的部分，對(duì)于n＝0X選自 其中B代表O、S、NR5，其中R5為H、亞烷基或酰基，C、D、E、F、G、H獨(dú)立地選自不飽和與飽和烷基、氧烷基、硫烷基、氨基烷基、羰基烷基、?；?、氨基甲酰基、芳基和雜芳基殘基；且對(duì)于n＝0和n＝1Z選自H、C1-C9的支鏈或單鏈烷基殘基或C2-C9的支鏈或單鏈鏈烯基殘基、C3-C8的環(huán)烷基殘基、C5-C7的環(huán)烯基殘基、芳基或雜芳基殘基，或者選自所有天然氨基酸或其衍生物的所有側(cè)鏈的側(cè)鏈。
而且，根據(jù)本發(fā)明，式5、6、7、8、9、10和11的化合物，包括它們的所有立體異構(gòu)體和藥學(xué)可接受的鹽得到公開(kāi)并可以使用
其中R1為H、支鏈或直鏈C1-C9烷基殘基、支鏈或直鏈C2-C9鏈烯基殘基、C3-C8環(huán)烷基、C5-C7環(huán)烯基、芳基殘基或雜芳基殘基或者天然氨基酸或其衍生物的側(cè)鏈；R3和R4選自H、羥基、烷基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基或鹵素，A為H或碳酸的等排物(isoster)，如選自CN、SO3H、CONHOH、PO3R5R6、四唑、酰胺、酯、酸酐、噻唑和咪唑的官能團(tuán)；B選自
其中R5為H、n＝2-4的-(CH)n-NH-C5H3N-Y和C5H3N-Y(二價(jià)吡啶基殘基)，Y＝H、Br、Cl、I、NO2或CN，R10為H、?；⒀豸驶虬被釟埢?，W為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，W1為H、烷基、烷氧基或苯基殘基，Z為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，Z1為H或烷基殘基，D為可以未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基取代的環(huán)狀C4-C7烷基、C4-C7鏈烯基殘基或環(huán)狀4-7元雜烷基或環(huán)狀4-7元雜烯基殘基，X2為O、NR6、N+(R7)2或S，X3至X12獨(dú)立地選自CH2、CR8R9、NR6、N+(R7)2、O、S、SO和SO2，包括所有飽和與不飽和結(jié)構(gòu)，R6、R7、R8、R9獨(dú)立地選自H、支鏈或直鏈C1-C9烷基殘基、支鏈或直鏈C2-C9鏈烯基殘基、C3-C8環(huán)烷基殘基、C5-C7環(huán)烯基殘基、芳基或雜芳基殘基，附加條件是式6如果A不為H，則X6為CH，式7如果A不為H，則X10為C，式8如果A不為H，則X7為CH，
式9如果A不為H，則X12為C。
在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，表述“酰基”可以指C1-20?；鶜埢?，優(yōu)選C1-8酰基殘基，特別優(yōu)選C1-4酰基殘基，“環(huán)烷基”可以指C3-12環(huán)烷基殘基，優(yōu)選C4、C5或C6環(huán)烷基殘基，“碳環(huán)”可以指C3-12碳環(huán)殘基，優(yōu)選C4、C5或C6碳環(huán)殘基。“雜芳基”定義為芳基殘基，其中1-4，優(yōu)選1、2或3個(gè)環(huán)原子被雜原子如N、S或O取代?！半s環(huán)”定義為環(huán)烷基殘基，其中1、2或3個(gè)環(huán)原子被雜原子如N、S或O取代?！半摹边x自二肽至十肽，優(yōu)選二肽、三肽、四肽和五肽。用于形成“肽”的氨基酸可以選自以上列出的氨基酸。
由于蛋白在體內(nèi)的廣泛分布和涉及DPIV、DPIV活性和DPIV相關(guān)蛋白的多種機(jī)制，采用DPIV抑制劑的全身治療(腸內(nèi)或腸胃外給藥)可能導(dǎo)致一系列不期望的副作用。
而且要解決的問(wèn)題是提供可以用于靶向影響局部有限的病理生理過(guò)程和生理過(guò)程的化合物。特別地，本發(fā)明的問(wèn)題在于獲得DPIV或DPIV類(lèi)似活性的局部有限的抑制，用于靶向干預(yù)局部活性底物的活性的調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)通式(12)的化合物解決此問(wèn)題 其中A為在側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的氨基酸，B為與A的側(cè)鏈的至少一個(gè)官能團(tuán)共價(jià)連接的化合物，C為酰胺連接于A的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸或哌啶基。
這些化合物可以，例如用于通過(guò)作用于血管內(nèi)皮中的DPIV或DPIV樣酶來(lái)降低血壓。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所用的藥物組合物包含至少一種通式(12)的化合物和至少一種適于作用部位的常規(guī)輔劑。
優(yōu)選A為α-氨基酸，特別是在側(cè)鏈中具有一、二或更多個(gè)官能團(tuán)的天然α-氨基酸，優(yōu)選蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。
優(yōu)選B為鏈長(zhǎng)度達(dá)20個(gè)氨基酸的寡肽、摩爾質(zhì)量達(dá)20000g/mol的聚乙二醇、任選地取代的具有8-50個(gè)C原子的有機(jī)胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物。
在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，表述“烷基”可以指C1-50烷基，優(yōu)選C6-30烷基，特別是C8-12烷基；例如烷基可以是甲基、乙基、丙基、異丙基或丁基。在表述“烷氧基”中的表述“烷”，在表述“烷?；敝械摹巴椤钡亩x與“烷基”的定義相同；芳族化合物優(yōu)選為取代或任選地未被取代的苯基、芐基、萘基、聯(lián)苯基或蒽基，它們優(yōu)選具有至少8個(gè)C原子；表述“鏈烯基”可以指C2-10鏈烯基，優(yōu)選C2-6鏈烯基，它們?cè)谌魏纹谕奈恢镁哂须p鍵并可以是取代或未被取代的；表述“炔基”可以指C2-10炔基，優(yōu)選C2-6炔基，它們?cè)谌魏纹谕奈恢镁哂腥I并可以是取代或未被取代的；表述“取代的”或取代基可以指被一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)或兩個(gè)烷基、鏈烯基、炔基、一價(jià)或多價(jià)?；?、烷?；⑼檠跬轷；蛲檠跬榛娜魏纹谕娜〈?；上述取代基進(jìn)而可以具有一個(gè)或多個(gè)(但優(yōu)選為零個(gè))烷基、鏈烯基、炔基、一價(jià)或多價(jià)酰基、烷酰基、烷氧烷酰基或烷氧烷基作為側(cè)基；各自具有8-50個(gè)C原子，優(yōu)選10-20個(gè)C原子的有機(jī)胺、酰胺、醇或酸可以具有式(烷基)2N-或烷基-NH-、-CO-N(烷基)2或-CO-NH(烷基)、-烷基-OH或-烷基-COOH。
盡管式(12)的化合物具有延伸的側(cè)鏈官能團(tuán)，它仍可以與酶二肽基肽酶Ⅳ和類(lèi)似酶的活性中心結(jié)合，但不再被肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PepT1活性轉(zhuǎn)運(yùn)。作為結(jié)果的本發(fā)明的化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低或大大受限導(dǎo)致DPIV和DPIV樣酶活性的局部或部位定向的抑制。
根據(jù)本發(fā)明使用的式(12)的化合物或其它化合物和前藥可以分別以消旋體的形式或光學(xué)純化合物的形式，優(yōu)選以式(12)的A部分的L-threo或L-allo的形式存在或使用。
因此，通過(guò)延伸/擴(kuò)展側(cè)鏈修飾，例如超出7個(gè)碳原子數(shù)目的側(cè)鏈修飾，可能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)能力的大幅降低(參見(jiàn)實(shí)施例12)。表12.1中的實(shí)例清楚地表明，通過(guò)增加側(cè)鏈的空間大小，物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)空間和立體延伸側(cè)鏈，例如超過(guò)一取代的苯基、羥基胺基或氨基酸殘基的原子基團(tuán)大小的側(cè)鏈，可能改變或抑制靶物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。
根據(jù)本發(fā)明，式(12)的化合物以部位特異性方式抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)的DPIV或DPIV樣酶活性。因此可能有效地影響局部生理和病理生理癥狀(炎癥、銀屑病、關(guān)節(jié)炎、自體免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)、癌、轉(zhuǎn)移、血管內(nèi)皮中的血壓)，同時(shí)大幅降低副作用。
優(yōu)選的式(12)的化合物是，鏈長(zhǎng)度為3-15，特別是4-10個(gè)氨基酸的寡肽，和/或摩爾質(zhì)量為至少250g/mol，優(yōu)選至少1500g/mol和達(dá)15000g/mol的聚乙二醇，和/或具有至少12個(gè)C原子，優(yōu)選達(dá)30個(gè)C原子的任選地取代的有機(jī)胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物。
可以將本發(fā)明的化合物轉(zhuǎn)化為酸加成鹽，特別是藥學(xué)可接受的酸加成鹽，或以上述形式使用。藥學(xué)可接受的鹽一般采取其中氨基酸堿基側(cè)鏈被無(wú)機(jī)或有機(jī)酸質(zhì)子化的形式。代表性的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、延胡索酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、羥基乙磺酸、苯磺酸、草酸、雙羥萘酸、2-萘磺酸、對(duì)甲苯磺酸、環(huán)己烷氨基磺酸、水楊酸、己糖酸或三氟乙酸。式(1)-(12)的化合物的所有藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
考慮到游離化合物及其鹽形式的化合物之間的緊密關(guān)系，不管本文何時(shí)提及化合物，它還意指相應(yīng)的鹽，條件是這種鹽是可能的或在這些情況下是合適的。
本發(fā)明在其范圍內(nèi)還包括本發(fā)明的化合物的前藥。一般而言，這種前藥是這些化合物的可以在體內(nèi)容易地轉(zhuǎn)化為期望的治療活性化合物的官能衍生物。因此在這些情況下，本發(fā)明的用途包括用一種或多種所要求的化合物的前藥形式治療所述的多種疾病，所述前藥在給予受試者后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為上述化合物。例如在以下文獻(xiàn)中描述了用于選擇和制備適宜的前藥衍生物的常規(guī)方法“Design of Prodrugs”，ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985和專(zhuān)利申請(qǐng)DE 198 28 113和DE 19828 114，本文引用所述文獻(xiàn)作為參考。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的化合物或前藥具有至少一個(gè)手性中心時(shí)，它們可以相應(yīng)地以消旋體存在。當(dāng)這些化合物或前藥具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心時(shí)，它們還可以以非對(duì)映體存在。應(yīng)該理解，所有這些異構(gòu)體及其混合物都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。而且，所述化合物或前藥的某些結(jié)晶形式可以以多晶型物存在并同樣包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，某些所述化合物可以與水(即水合物)或常規(guī)有機(jī)溶劑形成溶劑化物，而這些溶劑化物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所述化合物，包括它們的鹽，也可以它們的水合物的形式獲得，或者包含用于它們的結(jié)晶的其它溶劑。
如上述，本發(fā)明的化合物和前藥，以及它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式用于抑制DPIV和DPIV樣酶活性。如實(shí)施例7和8所述，可以使用DPIV活性實(shí)驗(yàn)體外測(cè)定Ki值和IC50值，從而證明本發(fā)明的化合物和前藥，以及它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式抑制DPIV和DPIV樣酶活性的能力。
如實(shí)施例11所述，可以通過(guò)口服或血管內(nèi)給予威斯塔鼠來(lái)證明本發(fā)明的化合物和它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式體內(nèi)抑制DPIV的能力。本發(fā)明的化合物在口服和血管內(nèi)給予威斯塔鼠后在體內(nèi)抑制DPIV活性。
DPIV存在于多種哺乳動(dòng)物器官和組織例如腸刷狀緣(GutschmidtS.等人，“In situ”-measurements of protein contents in the brush borderregion along rat jejunal villi and their correlations with four enzymeactivities，Histochemistry 1981，72(3)，467-79)、外分泌上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小管、內(nèi)皮、肌成纖維細(xì)胞(Feller A.C.等人，A monoclonalantibody detecting dipeptidyl peptidase IV in human tissue.VirchowsArch.A.Pathol.Anat.Histopathol.1986；409(2)263-73)、神經(jīng)細(xì)胞、某些表面上皮，例如輸卵管、子宮和精囊(vesicular gland)的外側(cè)膜，存在于腔細(xì)胞質(zhì)例如精囊上皮中，并存在于布倫納腺的粘液細(xì)胞中(Hartel S.等人，Dipeptidyl peptidase(DPP)IV in rat organs.Comparisonof immunohistochemistry and active histochemistry，Histochemistry 1988；89(2)151-61)、生殖器官例如附睪尾和壺腹、精囊和它們的分泌物中(Agrawal&Vanha-Perttula，Dipeptidyl peptidases in bovinereproductive organs and secretions.Int.J.Androl.1986，9(6)435-52)。在人血清中存在二肽基肽酶的兩種分子形式(Krepela E.等人，Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV innormal human serum.Physiol.Bohemoslov.1983，32(6)486-96)。血清高分子量形式的DPIV在活化的T細(xì)胞表面表達(dá)(Duke-Cohan J.S.等人，Serum high molecular weight dipeptidyl peptidase IV(CD26)issimilar to a novel antigen DPPT-L released from activated T cells.J.Immunol.1996，156(5)1714-21)。
本發(fā)明的化合物和前藥，以及它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式能夠在體內(nèi)抑制DPIV。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自所有哺乳動(dòng)物組織和器官的DPIV以及仍未發(fā)現(xiàn)的DPIV的所有分子形式、同系物和表位都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在少數(shù)的脯氨酸特異性蛋白酶組中，最初相信DPIV是對(duì)作為多肽鏈的氨基末端倒數(shù)第二位殘基的脯氨酸具有特異性的唯一膜結(jié)合酶。但是，最近已鑒定了其它分子，甚至結(jié)構(gòu)上與DPIV不同源但具有相應(yīng)的酶活性的分子。目前鑒定的DPIV樣酶例如成纖維細(xì)胞激活蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨基肽酶樣蛋白、N-乙?；摩吝B接的酸性二肽酶、休眠細(xì)胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、吸誘素和二肽基肽酶IV相關(guān)蛋白(DPP 8)，且它們描述在以下的綜述文章中Sedo&Malik(Sedo&Malik，Dipeptidyl peptidase IV-like moleculeshomologous proteins or homologous activities？Biochimica et BiophysicaActa 2001，365061-10)。其它DPIV樣酶公開(kāi)在WO 01/19866、WO02/04610和WO 02/34900中。WO 01/19866公開(kāi)了結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似于DPIV和成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)的新的人二肽基氨基肽酶(DPP8)。WO 02/04610的二肽基肽酶V樣酶在本領(lǐng)域中是已知的。在Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中，此酶注冊(cè)為KIAA1492。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自所有哺乳動(dòng)物組織和器官的具有DPIV樣酶活性的蛋白，以及仍未發(fā)現(xiàn)的蛋白的所有分子形式、同系物和表位都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的化合物和前藥，以及它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式抑制DPIV樣酶的能力可以使用實(shí)施例9所述的體外測(cè)定Ki值的酶活性實(shí)驗(yàn)證明。例如測(cè)定本發(fā)明的化合物抗豬二肽基肽酶II的Ki值為對(duì)于谷氨酰胺酰吡咯烷，Ki＝8.52*10-5M±6.33*10-6M；而對(duì)于谷氨酰胺酰噻唑烷，Ki＝1.07*10-5M±3.81*10-7M。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物和前藥，以及它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式僅有低的(可能沒(méi)有)對(duì)非DPIV和非DPIV樣脯氨酸特異性酶的抑制活性。如在實(shí)施例10中所述，例如用谷氨酰胺酰噻唑烷和谷氨酰胺酰吡咯烷，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二肽基肽酶I和脯氨酰寡肽酶的抑制。兩種化合物對(duì)氨?；彼岫拿傅男Я@著低于對(duì)DPIV的效力。測(cè)定對(duì)氨?；彼岫拿傅腎C50值為對(duì)于谷氨酰胺酰噻唑烷，IC50＞3mM；而對(duì)于谷氨酰胺酰吡咯烷，IC50＝3.4*10-4M±5.63*10-5。
本發(fā)明提供預(yù)防或治療需要其的受試者中由DPIV或DPIV樣酶活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括以有效治療所述病癥的量和劑量方案給予本發(fā)明的任何化合物或其藥物組合物。此外，本發(fā)明包括本發(fā)明的化合物和前藥以及它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式用于制備預(yù)防或治療受試者的由DPIV活性的調(diào)節(jié)介導(dǎo)的病癥的藥物的用途。所述化合物可以通過(guò)任何常規(guī)給藥途徑給予患者，包括但不限于，靜脈內(nèi)、口服、皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腸胃外給藥及其組合。
在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供式1-12的化合物和它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的前藥和酸加成鹽形式在藥物組合物中的配方。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“受試者”指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人，它是治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對(duì)象。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)生尋求的在組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人中引起生物或藥物反應(yīng)，包括緩解在治療的疾病或病癥的癥狀的活性化合物或藥學(xué)試劑的量。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“組合物”意指包括含有治療有效量的所要求的化合物的產(chǎn)品和任何直接或間接地由所要求的化合物的組合得到的產(chǎn)品。
為了制備本發(fā)明所用的藥物組合物，首先根據(jù)常規(guī)藥物復(fù)合技術(shù)，將作為活性成分的一種或多種式1-12的化合物或它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的前藥或酸加成鹽形式與藥物載體混合，所述載體根據(jù)給藥例如口服或腸胃外給藥如肌內(nèi)給藥所需的制劑形式而采用多種形式。在制備口服劑型的組合物中，可以使用任何常規(guī)藥物介質(zhì)。因此，對(duì)于液體口服制劑如混懸劑、酏劑和溶液劑，適宜的載體和添加劑可以有利地包括水、乙二醇、油、醇、食用香料、防腐劑、著色劑等；對(duì)于固體口服制劑如散劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑(gelcap)和片劑，適宜的載體和添加劑包括淀粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等。由于片劑和膠囊劑給藥方便，因而它們代表最有利的口服單元?jiǎng)┬?，在這種情況下使用固體藥物載體。如果需要的話，片劑可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包糖衣或包腸溶衣。對(duì)于腸胃外給藥，載體通常包含無(wú)菌水，雖然也可以包括其它成分，例如用于幫助溶解或用于保存。
也可以制備注射混懸劑，在這種情況下可以使用適宜的液體載體、助懸劑等。本文的藥物組合物的每劑量單元，如片劑、膠囊劑、散劑、注射劑、一茶匙量(teaspoonful)等含有轉(zhuǎn)運(yùn)上述有效劑量所需量的活性成分量。本文的藥物組合物的每劑量單元，如片劑、膠囊劑、散劑、注射劑、栓劑、一茶匙量等含有約0.01mg至約1000mg(優(yōu)選約5至約500mg)，并可以約0.01至約300mg/kg體重/天(優(yōu)選1-50mg/kg/天)的劑量給藥。但是，劑量可以根據(jù)患者的需要、在治療的病癥的嚴(yán)重程度和所用的化合物而改變。可以采用每日給藥或周期后(post-periodic)給藥。通常劑量由醫(yī)師根據(jù)患者的特征、他的/她的病癥和期望的治療效果來(lái)調(diào)節(jié)。
優(yōu)選這些組合物為諸如以下的單元?jiǎng)┬推瑒?、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、無(wú)菌腸胃外溶液或混懸劑、計(jì)量氣霧劑或液體噴霧劑、滴劑、安瓿、自我注射器裝置或栓劑；用于口、腸胃外、鼻內(nèi)、舌下或直腸給藥，或者用于吸入或吹入給藥?；蛘?，所述組合物可以適于一周一次或一月一次給藥的形式存在；例如可以使用活性化合物的不溶性鹽，如癸酸鹽以提供用于肌內(nèi)注射的長(zhǎng)效制劑。對(duì)于制備固體組合物如片劑，將主要的活性成分與藥物載體，例如常規(guī)片劑成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹(shù)膠和其它藥物稀釋劑如水理想地混合，以形成含有本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽的均勻混合物的固體處方設(shè)計(jì)前組合物。當(dāng)說(shuō)這些處方設(shè)計(jì)前組合物均勻時(shí)，它意指活性成分理想地均勻分散在整個(gè)組合物中，從而使組合物可以容易地再分為同等有效的劑型，如片劑、丸劑和膠囊劑。然后可以將這種固體處方設(shè)計(jì)前組合物再分成含約0.01至約1000mg，優(yōu)選約5至約500mg的本發(fā)明的活性成分的上述類(lèi)型的單元?jiǎng)┬汀?br> 可以有利地將所述新組合物的片劑或丸劑包衣或復(fù)合，以提供帶來(lái)延長(zhǎng)作用優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑和丸劑可以包含內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者為在前者上的外殼的形式。兩組分可以由腸溶層分開(kāi)，該腸溶層用于抗胃中崩解并允許內(nèi)部組分完整地進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。許多材料可以用作這種腸溶層或包衣，這些材料包括具有諸如蟲(chóng)膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素的材料的許多聚合酸。
可以有利地引入本發(fā)明的新組合物用于口服或注射的液體劑型包括水溶液、適宜調(diào)味的糖漿、含水或油的混懸劑、用食用油如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油調(diào)味的乳劑，以及酏劑和類(lèi)似的藥物載體。用于含水混懸劑的適宜的分散劑或助懸劑包括合成和天然樹(shù)膠如黃芪膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
當(dāng)用于制備本發(fā)明的化合物的方法產(chǎn)生立體異構(gòu)體的混合物時(shí)，可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)如制備色譜法分離這些異構(gòu)體。這些化合物可以制成外消旋形式，或者可以通過(guò)對(duì)映體特異性合成或拆分而制備單獨(dú)的對(duì)映體。例如，可以通過(guò)諸如以下的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將所述化合物拆分成它們的組成對(duì)映體與光學(xué)活性酸，如(-)-二對(duì)甲苯甲酰-d-酒石酸和/或(+)-二對(duì)甲苯甲酰-1-酒石酸成鹽而形成非對(duì)映體對(duì)，然后分步結(jié)晶并再生游離堿。還可以通過(guò)形成非對(duì)映體酯或酰胺，然后進(jìn)行色譜分離并除去手性輔劑而拆分化合物。或者，可以使用手性HPLC柱拆分化合物。
在制備本發(fā)明的化合物的任何方法的過(guò)程中，可能需要和/或期望保護(hù)相關(guān)的任何分子上的敏感性或反應(yīng)性基團(tuán)。這可以通過(guò)常規(guī)保護(hù)基實(shí)現(xiàn)，如在Protective Groups in Organic Chemistry，ed.J.F.W.MeOmie，Plenum Press，1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts，Protective Groupa in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，1991中所述，本文引用這些文獻(xiàn)作為參考。這些保護(hù)基可以在隨后階段使用本領(lǐng)域中已知的方法方便地除去。
本發(fā)明所述的由二肽基肽酶IV和DPIV樣酶調(diào)節(jié)的病癥的治療方法還可以使用包含一種或多種本文定義的化合物和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物來(lái)完成。該藥物組合物可以含有約0.01mg至1000mg，優(yōu)選約5至約500mg的一種或多種所述化合物，并可以組成任何適于所選擇的給藥模式的劑型。載體包括必需的和惰性的藥物載體，包括但不限于粘合劑、助懸劑、潤(rùn)滑劑、食用香料、甜味劑、防腐劑、染料和包衣。適于口服給藥的組合物包括固體形式，如丸劑、片劑、囊片、膠囊劑(各自包括中等釋放、定時(shí)釋放和延時(shí)釋放配方)、顆粒劑、散劑和液體形式如溶液劑、糖漿劑、酏劑、乳劑和混懸劑。用于腸胃外給藥的形式包括無(wú)菌溶液劑、乳劑和混懸劑。
有利地，本發(fā)明的化合物可以一次日劑量給藥，或者總?cè)談┝靠梢悦刻於?、三或四次的分開(kāi)的劑量給藥。而且，本發(fā)明的化合物可以通過(guò)局部應(yīng)用適宜的鼻內(nèi)載體，以鼻內(nèi)形式給藥，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的透皮藥貼給藥。為了以透皮遞送系統(tǒng)的形式給藥，在整個(gè)劑量方案中劑量給藥當(dāng)然是連續(xù)的而不是間歇的，需要相應(yīng)地改變劑量強(qiáng)度以獲得期望的治療效果。
更優(yōu)選地，對(duì)于片劑或膠囊劑形式的口服給藥，可以將活性藥物組分與口服、無(wú)毒的藥學(xué)可接受的惰性載體如乙醇、甘油、水等組合。而且，如果期望或必需的話，還可以將適宜的粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑和著色劑引入此混合物中。適宜的粘合劑包括但不限于淀粉、明膠、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑、天然和合成樹(shù)膠如阿拉伯膠、黃芪膠或油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤(rùn)土、黃原膠和在本領(lǐng)域中已知的其它化合物。
液體形式適于處在調(diào)味助懸劑或分散劑如合成和天然樹(shù)膠，如黃芪膠、阿拉伯膠、甲基纖維素等中。對(duì)于腸胃外給藥，無(wú)菌懸浮液和溶液是期望的。當(dāng)期望靜脈內(nèi)給藥時(shí)，使用一般含有適宜防腐劑的等滲制劑。
本發(fā)明的化合物還可以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，如小單室載體、大單室載體和多室載體的形式給藥?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中良好描述的方法，由多種磷脂如膽固醇、硬脂酰胺或磷脂酰膽堿形成脂質(zhì)體。
本發(fā)明的化合物還可以與作為靶向藥物載體的可溶性聚合物偶聯(lián)。這些聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基丙基甲基丙烯酰胺酚、聚羥基乙基天冬酰胺酚或被棕櫚酰殘基取代的聚環(huán)氧乙烷聚賴(lài)氨酸。而且，本發(fā)明的化合物可以與一類(lèi)用于實(shí)現(xiàn)藥物控釋的可生物降解的聚合物偶聯(lián)，這些聚合物例如聚乙酸、聚ε-己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝膠的交聯(lián)或兩親嵌段共聚物。
在需要治療所述疾病的任何時(shí)候，本發(fā)明的化合物可以在任何前述組合物中，并根據(jù)本領(lǐng)域中確立的劑量方案給藥。
產(chǎn)品的日劑量可以在0.01-1.000mg/成人/天的寬范圍內(nèi)變化。對(duì)于口服給藥，組合物優(yōu)選以片劑形式提供，所述片劑含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250、500和1000毫克活性成分，用于根據(jù)癥狀調(diào)節(jié)待治療患者的劑量。有效量的藥物通常以約0.1mg/kg至約300mg/kg體重/天的劑量水平提供。優(yōu)選范圍為約1至約50mg/kg體重/天。這些化合物可以每天1-4次的方案給藥。
最佳的給藥劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，且它隨所用的特定化合物、給藥方式、制劑強(qiáng)度、由于給藥方式導(dǎo)致的生物利用度以及疾病的推進(jìn)而改變。此外，在調(diào)節(jié)劑量中一般應(yīng)考慮與特定的治療患者有關(guān)的因素，包括患者年齡、體重、飲食和給藥時(shí)間。
本發(fā)明的化合物或組合物可以在飯前、飯時(shí)或飯后服用。如果在飯時(shí)服用，可以將本發(fā)明的化合物或組合物混入膳食或以上述的單獨(dú)劑型服用。
實(shí)施例實(shí)施例1二肽樣化合物的合成1.1異亮氨酰噻唑烷鹽的一般合成將Boc-保護(hù)的氨基酸BOC-Ile-OH置于乙酸乙酯中并將批料冷卻至約-5℃。滴加N-甲基嗎啉，在恒溫下滴加特戊酰氯(pivalic acid)(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)或新己酰氯(中試規(guī)模)。將反應(yīng)物攪拌數(shù)分鐘從而活化。連續(xù)滴加N-甲基嗎啉(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)和噻唑烷鹽酸鹽(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)，加入噻唑烷(中試規(guī)模)。以常規(guī)方式，使用鹽溶液，以中試規(guī)模進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室中的處理，用NaOH和CH3COOH溶液純化批料。
使用HCl/二噁烷(實(shí)驗(yàn)室規(guī)模)或H2SO4(中試規(guī)模)進(jìn)行BOC保護(hù)基的去除。在實(shí)驗(yàn)室中用EtOH/乙醚結(jié)晶鹽酸鹽。
在中試規(guī)模下，加入NaOH/NH3制備游離胺。將延胡索酸溶于熱乙醇，滴加游離胺，(Ile-Thia)2延胡索酸鹽(M＝520.71gmol-1)沉淀。通過(guò)電泳進(jìn)行異構(gòu)體和對(duì)映體的分析。
1.2谷氨酰胺酰吡咯烷游離堿的合成?；瘜-芐基-氧羰基谷氨酰胺(2.02g，7.21mmol)溶于35ml THF中并使其變?yōu)?15℃。往此混合物中加入CAIBE(氯甲酸異丁酯)(0.937ml，7.21mmol)和4-甲基嗎啉(0.795ml，7.21mmol)并將溶液攪拌15min。通過(guò)TLC檢查混合酸酐的形成(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)。暖至-10℃后加入吡咯烷(0.596ml，7.21mmol)。將混合物變?yōu)槭覝夭嚢柽^(guò)夜。
處理濾出形成的沉淀并蒸發(fā)溶劑。將所得的油置于乙酸乙酯(20ml)中并用飽和硫酸氫鈉溶液洗滌，然后用飽和碳酸氫鈉溶液、水和鹽水洗滌。分離有機(jī)層，干燥并蒸發(fā)。通過(guò)TLC檢查所得產(chǎn)物的純度(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)收率1.18g，蠟狀固體切割將1.18g所得的固體Z保護(hù)的化合物溶于40ml無(wú)水乙醇中。往溶液中加入約20mg在炭上的Pd(10％，F(xiàn)LUKA)，并在氫氣氛下將懸浮液振蕩3小時(shí)。通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)展(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)。反應(yīng)結(jié)束后除去，得到游離堿。
收率99％通過(guò)TLC檢查純度正丁醇/AcOH/水/乙酸乙酯1/1/1/1，Rf＝0.4。通過(guò)NMR分析檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的同一性。
1.3谷氨酰胺酰噻唑烷鹽酸鹽的合成?；瘜-叔丁基-氧羰基谷氨酰胺(2.0g，8.12mmol)溶于5ml THF中并使其變?yōu)?15℃。往此混合物中加入CAIBE(氯甲酸異丁酯)(1.06ml，8.12mmol)和4-甲基嗎啉(0.895ml，8.12mmol)并將溶液攪拌15min。通過(guò)TLC檢查混合酸酐的形成(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)。暖至-10℃后另外加入等量的4-甲基嗎啉(0.895ml，8.12mmol)和噻唑烷鹽酸鹽(1.02g，8.12mmol)。將混合物變?yōu)槭覝夭嚢柽^(guò)夜。
處理濾出形成的沉淀并蒸發(fā)溶劑。將所得的油置于氯仿(20ml)中并用飽和硫酸氫鈉溶液洗滌，然后用飽和碳酸氫鈉溶液、水和鹽水洗滌。分離有機(jī)層，干燥并蒸發(fā)。通過(guò)TLC檢查所得產(chǎn)物的純度(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)收率1.64g，固體切割將640mg所得的固體Boc保護(hù)的化合物溶于3.1ml在二噁烷(12.98M，20當(dāng)量)中的冰冷HCl中并將其置于冰上。通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)展(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)。在反應(yīng)完成后除去溶劑，并將所得的油置于甲醇中并再次蒸發(fā)。此后用磷-V-氧化物干燥所得的油，并用乙醚研磨兩次。通過(guò)HPLC檢查純度。
收率0.265g通過(guò)HPLC檢查純度。通過(guò)NMR分析檢查反應(yīng)產(chǎn)物的同一性。
1.4谷氨酰胺酰吡咯烷鹽酸鹽的合成?；瘜-叔丁基-氧羰基谷氨酰胺(3.0g，12.18mmol)溶于7ml THF中并使其變?yōu)?15℃。往此混合物中加入CAIBE(氯甲酸異丁酯)(1.6ml，12.18mmol)和4-甲基嗎啉(1.3ml，12.18mmol)并將溶液攪拌15min。通過(guò)TLC檢查混合酸酐的形成(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)。暖至-10℃后加入1當(dāng)量吡咯烷(1.0ml，12.18mmol)。將混合物變?yōu)槭覝夭嚢柽^(guò)夜。
處理濾出形成的沉淀并蒸發(fā)溶劑。將所得的油置于氯仿(20ml)中并用飽和硫酸氫鈉溶液洗滌，然后用飽和碳酸氫鈉溶液、水和鹽水洗滌。分離有機(jī)層，干燥并蒸發(fā)。通過(guò)TLC檢查所得產(chǎn)物的純度(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)
收率2.7g，固體切割將2.7g所得的固體溶于13.0ml在二噁烷(12.98M，20當(dāng)量)中的冰冷HCl中并將其置于冰上。通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)展(洗脫劑CHCl3/MeOH9/1)。在反應(yīng)完成后除去溶劑，并將所得的油置于甲醇中并再次蒸發(fā)。此后用磷-V-氧化物干燥所得的油，并用乙醚研磨兩次。
收率980mg通過(guò)HPLC檢查純度。通過(guò)NMR分析檢查反應(yīng)產(chǎn)物的同一性。
實(shí)施例2所選擇的二肽化合物的化學(xué)表征2.1熔點(diǎn)測(cè)定在來(lái)自Leica Aktiengesellschaft的Kofler加熱平臺(tái)顯微鏡上測(cè)定熔點(diǎn)，數(shù)值未經(jīng)校正，或者在DSC裝置(Heumann-Pharma)上測(cè)定。
2.2旋光度在來(lái)自Perkin-Elmer公司的“Polarimeter 341”或更高級(jí)的儀器上，在不同波長(zhǎng)下記錄旋光值。
2.3質(zhì)譜的測(cè)定條件通過(guò)在來(lái)自PE Sciex公司的“API 165”或API 365“上進(jìn)行電噴霧電離(ESI)而記錄質(zhì)譜。使用c＝10μg/ml的大約濃度進(jìn)行操作，將物質(zhì)置于MeOH/H2O 50∶50，0.1％HCO2H中，使用噴霧泵(20μl/min)進(jìn)行灌輸。以正電模式[M+H]+進(jìn)行測(cè)定，ESI電壓為U＝5600V。
2.4.結(jié)果2.4.1異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽(異構(gòu)體)測(cè)試

IT*F＝異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽NMR和HPLC數(shù)據(jù)證實(shí)所討論的物質(zhì)的同一性。
2.4.2其它異亮氨酰噻唑烷鹽測(cè)試

實(shí)施例3Xaa-Pro-Yaa三肽的合成在肽合成器SP 650(Labortec AG)上，應(yīng)用Fmoc/tBu策略進(jìn)行所有的合成。保護(hù)的氨基酸購(gòu)自Novabiochem或Bachem。三氟乙酸(TFA)購(gòu)自Merck，三異丙基硅烷(TIS)購(gòu)自Fluka。
使用20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)將預(yù)填充的Fmoc-Yaa-Wang樹(shù)脂(2.8g/取代水平0.57mmol/g)脫保護(hù)。用DMF洗滌后，將2eq(1.1g)Fmoc-Pro-OH溶液溶于DMF中(12ml溶劑/克樹(shù)脂)。加入2eq(1.04g)2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)和4eq(1.11ml)N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，并將其置于反應(yīng)容器中。室溫下將混合物振蕩20min。然后重復(fù)偶聯(lián)循環(huán)。隨后用DMF、二氯甲烷、異丙醇和乙醚洗滌后，將所得的Fmoc-Pro-Ile-Wang樹(shù)脂干燥，然后在偶聯(lián)最后的氨基酸衍生物之前分成6份。
如上述除去Fmoc保護(hù)基。然后將在DMF中的0.54mmol Boc-氨基酸、0.54mmol TBTU和0.108mmol DIEA振蕩20min。重復(fù)偶聯(lián)循環(huán)。最后洗滌肽樹(shù)脂并如上述干燥。
使用三氟乙酸(TFA)的混合物從樹(shù)脂上切割肽，進(jìn)行2.5小時(shí)，所述混合物包含以下凈化劑TFA/H2O/三異丙基硅烷(TIS)＝9.5/0.25/0.25。
粗品肽的收率平均為80-90％。在Nucleosil C18柱(7μm，250*21.20mm，100A)上通過(guò)HPLC純化粗品肽，使用0.1％TFA/H2O的線性梯度，以6ml/min增大0.1％TFA/乙腈的濃度(40min內(nèi)從5％增至65％)。
凍干得到純肽，通過(guò)電噴霧質(zhì)譜和HPLC分析進(jìn)行鑒定。
3.1結(jié)果-化學(xué)合成后Xaa-Pro-Yaa三肽的鑒定


1[M+H+]通過(guò)電噴霧質(zhì)譜以正電離模式測(cè)定。
2RP-HPLC條件柱 LiChrospher 100 RP 18(5μm)，125×4mm檢測(cè)(UV) 214nm梯度系統(tǒng) 乙腈(ACN)/H2O(0.1％TFA)15min內(nèi)從5％ACN至50％，流速 1ml/mink’＝(tr-t0)/t0t0＝1.16min叔丁基-Gly定義為

Ser(Bzl)和Ser(P)分別定義為芐基絲氨酸和磷酰絲氨酸。
Tyr(P)定義為磷酰酪氨酸。
實(shí)施例4肽基酮的合成 H-Val-Pro-OMe*HCl 2將Boc-Val-OH(3.00g，13.8mmol)溶于10ml無(wú)水THF中并冷卻至-15℃。往混合物中加入CAIBE(1.80ml，13.8mmol)和NMM(1.52ml，13.8mmol)，并攪拌溶液直至完成混合酸酐的形成。然后將混合物變?yōu)?10℃并加入NMM(1.52ml，13.8mmol)，隨后加入H-Pro-OMe*HCl(2.29g，13.8mmol)。使混合物達(dá)到室溫并靜置過(guò)夜。在除去溶劑和常規(guī)處理后，不經(jīng)進(jìn)一步表征而獲取所得的酯1。將酯1溶于HCl/HOAc(5ml，6N)中，并在0℃下靜置直至完成Boc基團(tuán)的除去。然后除去溶劑并用乙醚處理所得的油，得到白色固體2。
收率2.5g，80％
Z-Ala-Val-Pro-OMe 3以與上述1相同的方式處理Z-Ala OH(3.5g，15.7mmol)和2(4.18g，15.7mmol)，得到3，為白色固體。
收率4.2g，64％Z-Ala-Val-Pro-OH 4將3(4.2g，9.6mmol)溶于30ml水/丙酮(1/5v/v)并加入11.6mlNaOH(1N)。反應(yīng)完成后，蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑并用15ml NaHCO3溶液(飽和)稀釋所得的溶液。然后用10ml乙酸乙酯萃取混合物三次。此后加入HCl(15％，在水中)使溶液變?yōu)閜H 2。用30ml乙酸乙酯萃取所得的混合物三次。分離有機(jī)層并用鹽水洗滌三次，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。
收率3.5g，87％Z-Ala-Val-Pro-CH2-Br 5將4(2.00g，4.76mmol)溶于15ml無(wú)水THF中，并使用CAIBE(0.623ml，4.76mmol)和NMM(0.525ml，4.76mmol)將其轉(zhuǎn)化為混合酸酐(參見(jiàn)化合物1)。濾出所形成的沉淀并冷卻至-15℃。然后在氬氣氛下將重氮甲烷(23.8mmol，在30ml乙醚中)滴入溶液中。在將混合物于0℃下靜置1小時(shí)后，加入1.27ml HBr(33％，在AcOH中)，并在室溫下將溶液攪拌30min。然后加入70ml乙醚并用20ml水洗滌混合物。分離有機(jī)層并干燥(Na2SO4)和蒸發(fā)。
收率(粗品)1.8g，80％Z-保護(hù)的酰氧基亞甲基酮將酸(2eq)溶于DMF中并加入等摩爾量的KF。室溫下將懸浮液攪拌1小時(shí)。然后加入溴亞甲基(brommethylene)(1eq)組分，并將溶液攪拌過(guò)夜。然后在真空下除去溶劑，將所得的油溶于氯仿中并用鹽水洗滌。隨后分離有機(jī)層，干燥(Na2SO4)并除去溶劑。使用硅膠和庚烷/氯仿對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行柱色譜純化。
Z-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)-CH36乙酸(230μl，4.02mmol)，KF(0.234g，4.02mmol)，5(1.00g，2.01mmol)收率0.351g，36％Z-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)-Ph 7苯甲酸(0.275g，2.25mmol)，KF(0.131mg，2.25mmol)，5(0.56g，1.13mmol)收率0.34g，56％脫保護(hù)將Z-保護(hù)的化合物溶于HBr/AcOH中并攪拌。當(dāng)反應(yīng)完全時(shí)加入乙醚，濾出形成的白色沉淀并干燥。
H-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)CH3*HBr 86(0.351g，0.73mmol)收率0.252g，98％H-Ala-Val-Pro-CH2O-C(O)-Ph*HBr 97(0.34g，0.63mmol)收率0.251g，99％實(shí)施例5環(huán)烷基酮的合成
Boc-異亮氨酸(isoleucinal)2將草酰氯(714μl，8.28mmol)溶于10ml無(wú)水二氯甲烷中并使其變?yōu)?78℃。然后滴加DMSO(817μl，8.28mmol)。將溶液于-78℃下攪拌20min。隨后加入1(1.00g，4.6mmol)并將混合物攪拌20min。然后加入TEA(2.58ml，18.4mmol)并使混合物達(dá)到室溫。用己烷/乙酸乙酯(2/1v/v)稀釋混合物并加入10ml HCl(10％，在水中)。分離有機(jī)層并用20ml二氯甲烷萃取水相。收集所有的有機(jī)層并用鹽水洗滌，然后用水洗滌，接著干燥。使用硅膠和庚烷/氯仿對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行柱色譜純化。
收率0.52g，52％N-1-[環(huán)戊基(羥基)甲基]-2-甲基丁基氨基甲酸叔丁酯3將2(0.52g，2.42mmol)溶于10ml無(wú)水THF中并冷卻至0℃。然后加入環(huán)戊基溴化鎂(1.45ml的2M溶液)。反應(yīng)完成后，加入2ml水，并通過(guò)加入HCl水溶液而中和溶液。然后加入二氯甲烷，分離有機(jī)層并干燥(Na2SO4)。蒸發(fā)后將所得的油不經(jīng)進(jìn)一步表征而使用。
N-[1-(環(huán)戊基羰基)-2-甲基丁基]氨基甲酸叔丁酯4如1一樣處理3(0.61g，2.15mmol)。草酰氯(333μl，3.87mmol)，DMSO(382μl，5.37mmol)，TEA(1.2ml，8.59mmol)收率0.180g，30％氯化1-環(huán)戊基-3-甲基-1-氧-2-戊鎓(pentanaminium)5將4(0.18g，0.63mmol)溶于2ml HCl(7N，在二噁烷中)。反應(yīng)完成后除去溶劑，并使用氯仿/甲醇/水梯度對(duì)所得的油進(jìn)行硅膠柱色譜純化。用乙醚研磨所得的油。
收率0.060g，54％
實(shí)施例6側(cè)鏈修飾的DPIV抑制劑的合成6.1 Boc-谷氨酰-噻唑烷(Boc-Glu-Thia)的合成根據(jù)方法B(見(jiàn)方法第6.4部分)使Boc-Glu(OMe)-OH與Thia*HCl反應(yīng)，根據(jù)方法G水解Boc-Glu(OMe)-Thia。
6.1.1 Boc-Glu-Thia的分析數(shù)據(jù)

1薄層色譜系統(tǒng)A氯仿/甲醇 90∶10系統(tǒng)B苯/丙酮/乙酸 25∶10∶0.5系統(tǒng)C正丁醇/EA/乙酸/H2O 1∶1∶1∶12HPLC分離條件柱Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm洗脫劑等度，40％ACN/水/0.1％TFA流速6ml/minλ＝220nm6.2側(cè)鏈修飾的Boc-谷氨酰噻唑烷通過(guò)引入不同大小的基團(tuán)而在γ-羧酸官能團(tuán)上修飾Boc-Glu-Thia。通過(guò)所述基團(tuán)的氨基形成酰胺鍵而將它們偶聯(lián)于γ-羧酸官能團(tuán)，根據(jù)具體的基團(tuán)而使用不同的偶聯(lián)方法。使用所述的方法將以下氨基組分連接到Boc-Glu-Thia上

在2種情況下，反應(yīng)產(chǎn)物的純化不同于合成的一般描述。
Boc-Glu(Gly5)-Thia在攪拌過(guò)夜時(shí)產(chǎn)物已經(jīng)從混合物中沉淀出來(lái)；然后將其濾出，用0.1N HCl和大量的水洗滌，隨后用P4O10在真空下干燥。
Boc-GIu(PEG)-Thia與常規(guī)方法相反，將合成的原料溶于500倍過(guò)量的DMF中。在反應(yīng)完成后，真空下完全除去DMF并將殘留物溶于大量甲醇中。在傾入乙醚，形成上層后，產(chǎn)物與未反應(yīng)的PEG一起沉淀出來(lái)。通過(guò)在制備HPLC分離在凝膠過(guò)濾柱(Pharmazia，Sephadex G-25，90μm，260mm-100mm)上進(jìn)行精細(xì)純化。
分離條件洗脫劑水；流速5ml/min；λ＝220nm6.2.2側(cè)鏈修飾的Boc-谷氨酰噻唑烷的合成數(shù)據(jù)

2HPLC分離條件柱Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm洗脫劑等度，40％ACN/水/0.1％TFA流速6ml/min
λ＝220nm6.3側(cè)鏈修飾的谷氨酰噻唑烷使用方法F從表6.2.2中所述的化合物上切割N-末端Boc保護(hù)基。用Gly衍生物修飾的物質(zhì)通過(guò)制備HPLC分離純化，且它以三氟乙酸鹽存在。以與Boc保護(hù)的前體相同的方式在凝膠過(guò)濾柱上將H-Glu(PEG)-Thia純化。
6.3.1側(cè)鏈修飾的谷氨酰噻唑烷的合成數(shù)據(jù)

3HPLC分離條件柱Nucleosil C-18，7μ，250mm×21mm洗脫劑ACN/水/0.1％TFA梯度在30分鐘內(nèi)20％ACN→90％ACN流速6ml/minλ＝220nmn.dm.一未檢測(cè)或不可檢測(cè)6.4一般合成方法方法A通過(guò)混合酸酐方法使用CFIBE作為活化試劑進(jìn)行的肽鍵連接將10mmol N-末端保護(hù)的氨基酸或肽溶于20ml無(wú)水THF中。將溶液冷卻至-15℃±2℃。在每種情況下在攪拌下將10mmol N-MM和10mmol氯甲酸異丁酯連續(xù)加入，并嚴(yán)格保持所述的溫度范圍。約6min后，加入10mmol氨基組分。當(dāng)氨基組分為鹽時(shí)，再往反應(yīng)混合物中加入10mmol N-MM。然后將反應(yīng)混合物在冷狀態(tài)下攪拌2小時(shí)并在室溫下攪拌過(guò)夜。
使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮反應(yīng)混合物，將其置于EA中，用5％KHSO4溶液、飽和NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液洗滌，并用Na2SO4干燥。真空下除去溶劑后，用EA/戊烷重結(jié)晶化合物。
方法B通過(guò)混合酸酐方法使用特戊酰氯作為活化試劑進(jìn)行的肽鍵連接將10mmol N-末端保護(hù)的氨基酸或肽溶于20ml無(wú)水THF中。將溶液冷卻至0℃。在每種情況下在攪拌下將10mmol N-MM和10mmol特戊酰氯連續(xù)加入，并嚴(yán)格保持所述的溫度范圍。約6min后，將混合物冷卻至-15℃，且一旦到達(dá)更低的溫度即加入10mmol氨基組分。當(dāng)氨基組分為鹽時(shí)，再往反應(yīng)混合物中加入10mmol N-MM。然后將反應(yīng)混合物在冷狀態(tài)下攪拌2小時(shí)并在室溫下攪拌過(guò)夜。
如方法A中所述進(jìn)行進(jìn)一步的處理。
方法C使用TBTU作為活化試劑的肽鍵連接將10mmol N-末端保護(hù)的氨基酸或肽和10mmol C-末端保護(hù)的氨基組分溶于20ml無(wú)水DMF中。將溶液冷卻至0℃。在每種情況下在攪拌下將10mmol DIPEA和10mmol TBTU連續(xù)加入。將反應(yīng)混合物于0℃下攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌過(guò)夜。真空下完全除去DMF并如方法中所述處理產(chǎn)物。
方法D活性酯(N-羥基琥珀酰亞胺酯)的合成將10mmol N-末端保護(hù)的氨基酸或肽和10mmol N-羥基琥珀酰亞胺溶于20ml無(wú)水THF中。將溶液冷卻至0℃并在攪拌下加入10mmol二環(huán)己基碳二亞胺。0℃下將反應(yīng)混合物再攪拌2小時(shí)，然后在室溫下攪拌過(guò)夜。濾出所得的N，N′-二環(huán)己基脲，真空下除去溶劑，并用EA/戊烷重結(jié)晶剩余的產(chǎn)物。
方法E使用N-羥基琥珀酰亞胺酯的酰胺鍵連接將10mmol C-末端未保護(hù)的氨基組分引入NaHCO3溶液(20mmol，在20ml水中)中。室溫和攪拌下，緩慢滴加溶于10ml二噁烷中的10mmol N-末端保護(hù)的N-羥基琥珀酰亞胺酯。繼續(xù)攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜并在真空下除去溶劑。
如方法A中所述進(jìn)行進(jìn)一步的處理。
方法FBoc保護(hù)基的切割將3ml 1.1N HCl/冰醋酸(方法F1)或3ml 1.1N HCl/二噁烷(方法F2)或在DCM中的3ml 50％TFA(方法F3)加入1mmol Boc保護(hù)的氨基酸吡咯烷(pyrrolidide)、噻唑烷(thiazolidide)或肽中。通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)RT下的切割。反應(yīng)完成后(約2小時(shí))，使用無(wú)水乙醚沉淀鹽酸鹽形式的化合物，通過(guò)抽吸進(jìn)行純化，并在真空下用P4O10干燥。使用甲醇/乙醚重結(jié)晶或再沉淀產(chǎn)物。
方法G水解將1mmol肽甲酯溶于10ml丙酮和11ml 0.1M NaOH溶液中并在室溫下攪拌。通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)水解過(guò)程。反應(yīng)完成后，真空下除去丙酮。使用濃K2HSO4將剩余的水溶液酸化至到達(dá)pH 2-3。然后用EA將產(chǎn)物萃取數(shù)次；用飽和NaCl溶液洗滌合并的乙酸乙酯部分并用NaSO4干燥，真空下除去溶劑。用EA/戊烷結(jié)晶。
實(shí)施例7Ki測(cè)定為了進(jìn)行Ki測(cè)定，使用來(lái)自豬腎的對(duì)甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺的特異性活性為37.5U/mg的二肽基肽酶IV，儲(chǔ)備溶液中的酶濃度為1.41mg/ml。
試驗(yàn)混合物將100μl濃度范圍分別為1*10-5M-1*10-8M的測(cè)試化合物與50μl不同濃度(0.4mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM)的甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺和100μl HEPES(40mM，pH 7.6；離子強(qiáng)度＝0.125)混合。在30℃下將試驗(yàn)混合物預(yù)溫育30min。預(yù)溫育后，加入20μlDPIV(1∶600稀釋)，并在30℃和λ＝405nm下，在10min內(nèi)，使用平板讀數(shù)器(HTS7000 plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)測(cè)定由于4-硝基苯胺釋放而產(chǎn)生的黃顏色。
使用Graphit version 4.0.13、4.0.13和4.0.15(Erithacus Software，Ltd，UK)計(jì)算Ki值。
7.1結(jié)果-DPIV抑制的Ki值



叔丁基-Gly定義為

Ser(Bzl)和Ser(P)分別定義為芐基-絲氨酸和磷酰-絲氨酸。
Tyr(P)定義為磷酰-酪氨酸。
實(shí)施例8IC50值的測(cè)定將100μl抑制劑儲(chǔ)備溶液與100μl緩沖液(HEPES pH 7.6)和50μl底物(Gly-Pro-pNA，最終濃度0.4mM)混合并在30℃下預(yù)溫育。通過(guò)加入20μl純化的豬DPIV而開(kāi)始反應(yīng)。在405nm下在10min內(nèi)使用HTS 7000 Plus平板讀數(shù)器(Perkin Elmer)測(cè)定產(chǎn)物pNA的形成并計(jì)算斜率。最終的抑制劑濃度范圍為1mM-30nM。為了進(jìn)行IC50的計(jì)算，使用GraFit 4.0.13(Erithacus Software)。
8.1結(jié)果-IC50值的測(cè)定


叔丁基-Gly定義為

Ser(Bzl)和Ser(P)分別定義為芐基-絲氨酸和磷酰-絲氨酸。
Tyr(P)定義為磷酰-酪氨酸。
實(shí)施例9DPIV樣酶-二肽基肽酶II的抑制如果N-末端未被質(zhì)子化，則DP II(3.4.14.2)從寡肽中釋放N-末端二肽(McDonald，J.K.，Ellis，S.&Reilly，T.J.，1966，J.Biol.Chem.，241，1494-1501)。P1位的Pro和Ala是優(yōu)選的殘基。酶活性描述為DPIV樣活性，但DP II具有酸性pH-最佳值。所用的酶從豬腎中純化。
試驗(yàn)將100μl濃度范圍為1*1-4M-5*10-8M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷與100μl緩沖液(40mM HEPES，pH 7.6，0.015％Brij，1mM DTT)、50μl賴(lài)氨酰丙氨酰氨基甲基香豆素溶液(5mM)和20μl豬DP II(在緩沖液中稀釋250倍)混合。在30℃和λ激發(fā)＝380nm，λ發(fā)射＝465nm下使用平板讀數(shù)器(HTS7000plus，AppliedBiosystems，Weiterstadt，Germany)進(jìn)行熒光測(cè)定25min。使用Graphit4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)計(jì)算Ki值，并測(cè)定如下對(duì)于谷氨酰胺酰吡咯烷，Ki＝8.52*10-5M±6.33*10-6M；而對(duì)于谷氨酰胺酰噻唑烷，Ki＝1.07*10-5M±3.81*10-7M。
實(shí)施例10交叉反應(yīng)酶測(cè)試谷氨酰胺酰吡咯烷和谷氨酰胺酰噻唑烷的抗二肽基肽酶I、脯氨酰寡肽酶和氨?；彼岫拿傅慕徊娣磻?yīng)效力。
二肽基肽酶I(DPI，組織蛋白酶C)DPI或組織蛋白酶C是從它們的底物的N-末端切割二肽的溶酶體半胱氨酸蛋白酶(Gutman，H.R.&Fruton，J.S.，1948，J.Biol.Chem.，174，851-858)。它歸類(lèi)于半胱氨酸蛋白酶。所用的酶購(gòu)自Qiagen(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。為了獲得完全活性的酶，將酶在MES緩沖液pH 5.6(40mM MES，4mM DTT，4mM KCl，2mMEDTA，0.015％Brij)中稀釋1000倍并在30℃下預(yù)溫育30min。
試驗(yàn)將50μl濃度范圍為1*10-5M-1*10-7M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷與110μl緩沖液-酶-混合物混合。將試驗(yàn)混合物于30℃下預(yù)溫育15min。預(yù)溫育后，加入100μl組氨酰絲氨酰-硝基苯胺(2*10-5M)，并在30℃和λ激發(fā)＝380nm，λ發(fā)射＝465nm下使用平板讀數(shù)器(HTS7000plus，Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)測(cè)定由于β-硝基苯胺釋放而產(chǎn)生的黃顏色10min。
使用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)計(jì)算IC50值。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷導(dǎo)致的DP I酶活性的抑制。
脯氨酰寡肽酶(POP)脯氨酰寡肽酶(EC 3.4.21.26)是從Xaa-Pro鍵的N-末端部分切割肽的絲氨酸型內(nèi)切蛋白酶(Walter，R.，Shlank，H.，Glass，J.D.，Schwartz，I.L.&Kerenyi，T.D.，1971，Science，173，827-829)。底物是分子量達(dá)3000Da的肽。所用的酶是重組人脯氨酰寡肽酶。在如現(xiàn)有技術(shù)其它地方所述的標(biāo)準(zhǔn)條件下在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)。
試驗(yàn)將100μl濃度范圍為1*10-4M-5*10-8M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷與110μl緩沖液(40mM HEPES，pH 7.6，0.015％Brij，1mM DTT)和20μl POP溶液混合。將試驗(yàn)混合物于30℃下預(yù)溫育15min。預(yù)溫育后，加入50μl甘氨酰脯氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺溶液(0.29mM)，并在30℃和λ＝405nm下，使用平板讀數(shù)器(sunrise，Tecan，Crailsheim，Germany)測(cè)定由于4-硝基苯胺釋放而產(chǎn)生的黃顏色10min。使用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)計(jì)算IC50值。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷導(dǎo)致的POP活性的抑制。
氨?；彼岫拿?X-Pro二肽酶)Bergmann&Fruton首先描述了氨?；彼岫拿?EC 3.4.13.9)(Bergmann，M.&Fruton，JS，1937，J.Biol.Chem.189-202)。氨?；彼岫拿笍腦aa-Pro二肽中釋放N-末端氨基酸，且其pH最佳值為6-9。
將來(lái)自豬腎的氨?；彼岫拿?ICN Biomedicals，Eschwege，Germany)溶于(1mg/ml)試驗(yàn)緩沖液(20mM NH4(CH3COO)2，3mMMnCl2，pH 7.6)中。為了獲得完全活性的酶，將溶液于室溫下預(yù)溫育60min。
試驗(yàn)將450μl濃度范圍為5*10-3M-5*10-7M的谷氨酰胺酰吡咯烷或谷氨酰胺酰噻唑烷與500μl緩沖液(20mM NH4(CH3COO)2，pH 7.6)和250μl Ile-Pro-OH(0.5mM，在試驗(yàn)混合物中)混合。將試驗(yàn)混合物于30C下預(yù)溫育5min。預(yù)溫育后，加入75μl氨?；彼岫拿?在試驗(yàn)緩沖液中1∶10稀釋)，并在30℃和λ＝220nm下使用UV/Vis光度計(jì)，UV1(Thermo Spectronic，Cambridge，UK)測(cè)定20min。
使用Graphit 4.0.15(Erithacus Software，Ltd.，UK)計(jì)算IC50值。測(cè)定它們?nèi)缦聦?duì)于谷氨酰胺酰噻唑烷，IC50＞3mM；而對(duì)于谷氨酰胺酰吡咯烷，IC50＝3.4*10-4M±5.63*10-5。
實(shí)施例11血管內(nèi)和口服給予威斯塔鼠后DPIV抑制活性的測(cè)定動(dòng)物從Tierzucht Schnwalde(Schnwalde，Germany)購(gòu)得體重范圍為250-350g的雄性威斯塔鼠(ShoeWist(Sho))。
飼養(yǎng)條件在常規(guī)條件下，使用受控的溫度(22+2℃)，以12/12小時(shí)光/暗循環(huán)(在06:00AM給光)單一籠養(yǎng)大鼠。允許其隨意獲取標(biāo)準(zhǔn)丸狀固體食物(ssniffSoest，Germany)和用HCl酸化的自來(lái)水。
導(dǎo)管插入頸動(dòng)脈在≥一周的飼養(yǎng)條件適應(yīng)后，在全身麻醉(腹膜內(nèi)注射0.25ml/kg b.w.Rompun[20％]，BayerVital，Germany和0.5ml/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，Germany)下將導(dǎo)管植入威斯塔鼠的頸動(dòng)脈。使動(dòng)物恢復(fù)一周。每周用肝素-鹽水(100IU/ml)沖洗導(dǎo)管三次。如果導(dǎo)管功能不良，則將第二根導(dǎo)管插入相應(yīng)的大鼠的對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈。從外科手術(shù)恢復(fù)一周后，使該動(dòng)物恢復(fù)至研究。如果第二根導(dǎo)管功能不良，則將動(dòng)物從研究中撤出。補(bǔ)充新的動(dòng)物并以計(jì)劃的順序繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)起始于導(dǎo)管植入后至少7天。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)口服和血管內(nèi)(動(dòng)脈內(nèi))途徑給予具有完整導(dǎo)管功能的大鼠安慰劑(1ml鹽水，0.154mol/l)或測(cè)試化合物。在禁食過(guò)夜后，在-30、-5和0min收集100μl肝素化動(dòng)脈血樣。將測(cè)試物質(zhì)新鮮溶于1.0ml鹽水(0.154mol/l)中，并在0min時(shí)通過(guò)飼管(75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，Germany)口服或通過(guò)血管內(nèi)途徑給藥。在口服給藥的情況下，將另外1ml體積的鹽水注入動(dòng)脈導(dǎo)管。在動(dòng)脈內(nèi)給藥的情況下，立即用30μl鹽水沖洗導(dǎo)管并通過(guò)飼管另外口服給予1ml鹽水。
在施用安慰劑或測(cè)試物質(zhì)后，在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120min，從有意識(shí)的不受限制的大鼠的頸動(dòng)脈導(dǎo)管取動(dòng)脈血樣。將所有的血樣收集到冰冷的填充有10μl 1M檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0)的Eppendorf管(Eppendorf-Netheler-Hinz，Hamburg，Germany)中用于血漿DPIV活性測(cè)定。立即將Eppendorf管離心(12000rpm持續(xù)2min，Hettich Zentrifuge EBA 12，Tuttlingen；Germany)將血漿部分保存在冰上直至分析或在-20℃下冷凍直至分析。所有的血漿樣品用以下數(shù)據(jù)標(biāo)記·序號(hào)·動(dòng)物號(hào)·取樣日期·取樣時(shí)間分析方法用于測(cè)定血漿DPIV活性的試驗(yàn)混合物由80μl試劑和20μl血漿樣品組成。在30℃下預(yù)溫育2min后于相同的溫度下在390nm對(duì)來(lái)自底物甘氨酰脯氨酰-4-硝基苯胺的黃色產(chǎn)物4-硝基苯胺的形成進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)定。DPIV活性以mU/ml表示。
統(tǒng)計(jì)方法用PRISM3.02(GraphPad Software，Inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)和制圖。以描述的方式分析所有參數(shù)，包括平均值和SD。
11.1結(jié)果-在tmax的體內(nèi)DPIV抑制

實(shí)施例12側(cè)鏈修飾的谷氨酰噻唑烷作為非易轉(zhuǎn)運(yùn)的DPIV抑制劑的作用用不同鏈長(zhǎng)的聚乙二醇或甘氨酸寡聚物作為X(參見(jiàn)描述合成的實(shí)施例的方法A)，合成側(cè)鏈修飾的谷氨酰噻唑烷。研究了那些衍生物的結(jié)合特征和它們被肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
令人驚奇地，發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈修飾僅輕微地改變化合物與DPIV的結(jié)合特征。相反，側(cè)鏈修飾大幅地降低抑制劑被肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。
因此，側(cè)鏈修飾的DPIV或DPIV樣酶抑制劑非常適于在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)部位定向的DPIV抑制。
12.1結(jié)果所選擇的DPIV抑制劑的轉(zhuǎn)運(yùn)能力

150％抑制3H-D-Phe-Ala(80mM)與PepT1-表達(dá)P.pastoris細(xì)胞結(jié)合的化合物的有效濃度(EC50值)2在X.leavis的PepT1-表達(dá)卵母細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運(yùn)特征-通過(guò)雙電極電壓夾方法，I＝由轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生的向內(nèi)電流實(shí)施例13DPIV-催化的腸降血糖素GIP1-42和GLP-17-36體內(nèi)水解的抑制可能使用純化的酶或混合人血清抑制由DPIV和DPIV樣酶活性導(dǎo)致的腸降血糖素的體內(nèi)水解(圖1)。
根據(jù)本發(fā)明，兩種肽激素的體內(nèi)酶催化的水解的完全抑制如下實(shí)現(xiàn)將30mM GIP1-42或30mM GLP-17-36和20mM異亮氨酰噻唑烷(1a)，一種可逆DPIV-抑制劑在20％的混合血清中在pH 7.6和30℃下溫育24小時(shí)(1b和1c，均為上部譜(upper spectra)。將合成的GIP1-42(5mM)和合成的GLP-17-36(15μM)和人血清(20％)一起在0.1mMTRICINE Puffer中在pH 7.6和30℃下溫育24小時(shí)。在不同的時(shí)間間隔后抽取溫育實(shí)驗(yàn)的樣品(在GIP1-42的情況下2.5pmol，在GLP-17-36的情況下7.5pmol)。將樣品用2’，6’-二羥基乙酰苯作為基質(zhì)進(jìn)行共結(jié)晶并通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行分析。圖譜(圖1)顯示每份樣品250單激光發(fā)射(single laser shot)的蓄積。
(1b)m/z 4980.1±5.3的單峰相應(yīng)于DPIV底物GIP1-42(M 4975.6)，而質(zhì)量m/z 4745.2±5.5的信號(hào)相應(yīng)于DPIV釋放的產(chǎn)物GIP3-42(M4740.4)。
(1c)m/z 3325.0±1.2的單峰相應(yīng)于DPIV底物GLP-17-36(M3297.7)，而質(zhì)量m/z 3116.7±1.3的信號(hào)相應(yīng)于DPIV釋放的產(chǎn)物GLP-19-36(M 3089.6)。
在不含抑制劑的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，腸降血糖素幾乎完全降解(圖1b和1c，均為底部譜(bottom spectra))。
實(shí)施例14通過(guò)DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷的GLP17-36體內(nèi)降解的抑制在DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷(靜脈注射在0.9％鹽溶液中的1.5M抑制劑)存在或不存在下對(duì)大鼠和對(duì)照循環(huán)中的天然腸降血糖素(此例中為GLP-17-36)的代謝進(jìn)行分析。在試驗(yàn)的時(shí)間進(jìn)程中，在0.1mg/kg的抑制劑異亮氨酰噻唑烷的濃度下，所治療的動(dòng)物(n＝5)中沒(méi)有發(fā)生促胰島肽激素GLP-17-36的降解(圖2)。
為了分析在DPIV抑制劑存在和不存在下腸降血糖素的代謝產(chǎn)物，試驗(yàn)動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物在最初靜脈注射抑制劑和/或鹽水給藥20分鐘后再接受靜脈注射50-100pM125I-GLP-17-36(比活為約1μCi/pM)。在2-5分鐘的溫育時(shí)間后收集血樣并用20％乙腈提取血漿。隨后用RP-HPLC分離肽提取物。在12-18分鐘間收集洗脫液的多個(gè)部分并用γ-計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)以相對(duì)于最大值的每分鐘數(shù)目(cpm)表示。
實(shí)施例15靜脈注射給予DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷后體內(nèi)的胰島素反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及血糖水平的降低附圖顯示在異亮氨酰噻唑烷(0.1mg/kg)存在和不存在下對(duì)十二指腸內(nèi)(i.d.)給予大鼠葡萄糖的循環(huán)葡萄糖和胰島素反應(yīng)。與未治療的對(duì)照相比，接受DPIV效應(yīng)物的動(dòng)物中的循環(huán)葡萄糖濃度的降低更快。在每千克大鼠輸注0.05mg/min DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷結(jié)束后所觀察到的效應(yīng)是劑量依賴(lài)性的并且是可逆的。與十二指腸內(nèi)葡萄糖刺激的動(dòng)物不同，在抑制劑治療的對(duì)照動(dòng)物中靜脈注射給予相同量的葡萄糖后沒(méi)有可觀察到的可比的效應(yīng)。在圖3中證明了這些關(guān)系，顯示所選擇的血漿參數(shù)的抑制劑依賴(lài)性變化A-DPIV活性，B-血漿胰島素水平，C-血糖水平。
實(shí)施例16在12周的口服藥物施用期間長(zhǎng)期治療肥胖朱克鼠對(duì)禁食血糖的影響長(zhǎng)期施用DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽導(dǎo)致所選擇的糖尿病大鼠模型中禁食血糖的顯著降低和幾乎正?；?圖4)。
動(dòng)物將六對(duì)雄性肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠同窩出生仔畜在440g體重時(shí)(年齡為11+0.5周)隨機(jī)分配入對(duì)照組或治療(異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽)組。單獨(dú)豢養(yǎng)動(dòng)物，12小時(shí)光/暗循環(huán)(6am開(kāi)始給光)，并允許其隨意獲取標(biāo)準(zhǔn)大鼠食品和水。
每日監(jiān)測(cè)和藥物給予的方案治療組通過(guò)口服管飼每日兩次(8:00a.m.和5:00p.m.)接受10mg/kg異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽，持續(xù)100天，而對(duì)照動(dòng)物接受由1％葡萄糖溶液組成的載體給藥。每隔兩天評(píng)價(jià)體重、早晨和晚上的血糖，以及食品和水?dāng)z入。從尾部血流獲得用于葡萄糖測(cè)定的血樣，并用SureStep葡萄糖分析儀(Lifescan Danada Ltd.，Burnaby)進(jìn)行測(cè)量。
每月評(píng)價(jià)葡萄糖耐量的方案從試驗(yàn)開(kāi)始，每四周進(jìn)行口服葡萄糖耐量測(cè)試(OGTT)在1700h給藥并口服給予1g/kg葡萄糖后，動(dòng)物禁食18小時(shí)。此時(shí)間等于異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽的約12個(gè)循環(huán)半衰期。
實(shí)施例17用DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷長(zhǎng)期口服治療朱克鼠對(duì)收縮血壓的影響長(zhǎng)期施用DPIV抑制劑異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽導(dǎo)致所選擇的糖尿病大鼠模型中收縮血壓的穩(wěn)定化(圖5)。
動(dòng)物將六對(duì)雄性肥胖(fa/fa)VDF朱克鼠同窩出生仔畜在440g體重時(shí)(年齡為11±0.5周)隨機(jī)分配入對(duì)照組或治療(異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽)組。單獨(dú)豢養(yǎng)動(dòng)物，12小時(shí)光/暗循環(huán)(6am開(kāi)始給光)，并允許其隨意獲取標(biāo)準(zhǔn)大鼠食品和水。
每日監(jiān)測(cè)和藥物給予的方案治療組通過(guò)口服管飼每日兩次(8:00a.m.和5:00p.m.)接受10mg/kg異亮氨酰噻唑烷延胡索酸鹽，持續(xù)100天，而對(duì)照動(dòng)物接受由1％葡萄糖溶液組成的載體給藥。用尾套法每周測(cè)量收縮血壓。
試驗(yàn)動(dòng)物(n＝5，雄性威斯塔鼠，200-225g)最初接受在0.9％鹽溶液中的1.5M異亮氨酰噻唑烷(▲)或相同體積的普通0.9％鹽水(■)(對(duì)照組n＝5)。試驗(yàn)組在30分鐘試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)另外接受0.75M/min的抑制劑輸注(*)。對(duì)照組在相同的時(shí)間間隔內(nèi)接受無(wú)抑制劑的0.9％鹽溶液輸注。在開(kāi)始時(shí)間t＝0，十二指腸內(nèi)給予所有動(dòng)物1g/kg 40％右旋糖溶液(w/v)的葡萄糖劑量。以10分鐘時(shí)間間隔收集所有試驗(yàn)動(dòng)物的血樣。使用全血分析葡萄糖(Lifescan One Touch II分析儀)，而在血漿中分析DPIV活性和胰島素濃度。在10和160mU/ml的范圍內(nèi)，胰島素放射免役測(cè)定靈敏[PEDERSON，R.A.，BUCHAN，A.M.J.，ZAHEDI-ASH，S.，CHEN，C.B.&BROWN，J.C.Reg.Peptides.3，53-63(1982)]。DPIV活性用分光光度法進(jìn)行估計(jì)[DEMUTH，H.-U.和HEINS，J.，On the catalytic Mechanism of Dipeptidyl Peptidase IV.in DipeptidylPeptidase IV(CD26)in Metabolism and the Immune Response(B.Fleischer，Ed.)R.G.Landes，Biomedical Publishers，Georgetown，1-35(1995)]。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±s.e.m。
實(shí)施例18口服給予谷氨酰胺酰吡咯烷后肥胖朱克鼠中的劑量增加研究動(dòng)物N＝30只雄性朱克鼠(fa/fa)購(gòu)自Charles River(Sulzfeld，德國(guó))，平均年齡為11周(5-12周)，平均體重為350g(150-400g)。交付后將它們飼養(yǎng)＞12周，直至幾乎所有肥胖朱克鼠均具有明顯的糖尿病特征。N＝3只動(dòng)物被用于測(cè)試三種逐級(jí)增加的谷氨酰胺酰吡咯烷對(duì)安慰劑(鹽水)的劑量。
豢養(yǎng)條件將動(dòng)物在具有受控制的溫度(22±2℃)，12/12小時(shí)光/暗循環(huán)(在06:00 AM開(kāi)始給光)的標(biāo)準(zhǔn)化條件下單籠豢養(yǎng)。允許其隨意獲取無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)小丸食品(ssniffSoest，德國(guó))和用HCl酸化的自來(lái)水。
頸動(dòng)脈插管術(shù)準(zhǔn)備適應(yīng)了豢養(yǎng)條件的24-31周(平均25周)齡的肥胖朱克鼠用于研究。在全身麻醉(腹膜內(nèi)注射0.25ml/kg b.w.Rompun[2％]，BayerVital，德國(guó)和0.5ml/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，德國(guó))下將導(dǎo)管植入肥胖朱克鼠的頸動(dòng)脈中。允許動(dòng)物恢復(fù)一周。每周用肝素-鹽水(100IU/ml)沖洗導(dǎo)管三次。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)將安慰劑(1ml鹽水，0.154mol/1)或劑量逐漸增加的谷氨酰胺酰吡咯烷(5、15和50mg/kg b.w.)給予N＝8只朱克鼠的組。將375mg谷氨酰胺酰吡咯烷溶于1000μl DMSO(E.Merck，Darmstadt；德國(guó)[二甲基亞砜p.a.])中。加入10ml鹽水，將每份含34.09mg谷氨酰胺酰吡咯烷的1ml等分試樣貯存在-20℃下。為了制備測(cè)試物質(zhì)，將劑量依賴(lài)性等分試樣在鹽水中稀釋。
在禁食過(guò)夜后，在-10分鐘時(shí)經(jīng)飼管(15G，75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，德國(guó))將安慰劑或測(cè)試物質(zhì)口服給予肥胖朱克鼠。在±0分鐘時(shí)經(jīng)第二飼管給予2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.BraunMelsungen，Melsungen，德國(guó))的口服葡萄糖耐量測(cè)試(OGTT)。在-30分鐘、-15分鐘、±0分鐘和在5、10、15、20、30、40、60、90和120分鐘將來(lái)自尾靜脈的靜脈血樣收集入20μl玻璃毛細(xì)管中，這些毛細(xì)管被放置于填充有1ml溶液的標(biāo)準(zhǔn)管中用于血糖測(cè)量。
所有血樣均標(biāo)記有如下數(shù)據(jù)●序號(hào)●動(dòng)物號(hào)●取樣日期●取樣時(shí)間分析方法用葡萄糖氧化酶法(Super G Glucose分析儀；Dr.MüllerGertebau，F(xiàn)reital，德國(guó))測(cè)量葡萄糖水平。
統(tǒng)計(jì)方法用PRISM3.02(GraphPad Software，Inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)和制圖。以描述方式分析所有的參數(shù)，包括平均值和SD。
藥物對(duì)葡萄糖耐量的影響安慰劑治療的糖尿病朱克鼠顯示顯著升高的血糖移動(dòng)，表明明顯的糖尿病葡萄糖耐量。給予5mg/kg b.w.谷氨酰胺酰吡咯烷導(dǎo)致糖尿病朱克鼠中有限的葡萄糖耐量改善。給予15mg/kg和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰吡咯烷后實(shí)現(xiàn)了升高的血糖水平的顯著降低和葡萄糖耐量的改善(參見(jiàn)圖6)。
實(shí)施例19口服給予谷氨酰胺酰噻唑烷后肥胖朱克鼠中的劑量增加研究動(dòng)物N＝30只雄性朱克鼠(fa/fa)購(gòu)自Charles River(Sulzfeld，德國(guó))，平均年齡為11周(5-12周)，平均體重為350g(150-400g)。交付后將它們飼養(yǎng)＞12周，直至幾乎所有肥胖朱克鼠均具有明顯的糖尿病特征。N＝8只動(dòng)物的組被用于測(cè)試三種逐級(jí)增加的谷氨酰胺酰噻唑烷對(duì)安慰劑(鹽水)的劑量。
豢養(yǎng)條件將動(dòng)物在具有受控制的溫度(22±2℃)，12/12小時(shí)光/暗循環(huán)(在06:00 AM開(kāi)始給光)的標(biāo)準(zhǔn)化條件下單籠豢養(yǎng)。允許其隨意獲取無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)小丸食品(ssniffSoest，德國(guó))和用HCl酸化的自來(lái)水。
頸動(dòng)脈插管術(shù)準(zhǔn)備適應(yīng)了豢養(yǎng)條件的24-31周(平均25周)齡的肥胖朱克鼠用于研究。在全身麻醉(腹膜內(nèi)注射0.25ml/kg b.w.Rompun[2％]，BayerVital，德國(guó)和0.5ml/kg b.w.Ketamin 10，Atarost GmbH&Co.，Twistringen，德國(guó))下將導(dǎo)管植入肥胖朱克鼠的頸動(dòng)脈中。允許動(dòng)物恢復(fù)一周。每周用肝素-鹽水(100IU/ml)沖洗導(dǎo)管三次。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)將安慰劑(1ml鹽水，0.154mol/l)或劑量逐漸增加的谷氨酰胺酰噻唑烷(5、15和50mg/kg b.w.)給予N＝8只朱克鼠的組。將相應(yīng)量的谷氨酰胺酰噻唑烷溶于1000μl鹽水中。
在禁食過(guò)夜后，在-10分鐘時(shí)經(jīng)飼管(15G，75mm；Fine ScienceTools，Heidelberg，德國(guó))將安慰劑或測(cè)試物質(zhì)口服給予肥胖朱克鼠。在±0分鐘時(shí)經(jīng)第二飼管給予2g/kg b.w.葡萄糖(40％溶液，B.BraunMelsungen，Melsungen，德國(guó))的口服葡萄糖耐量測(cè)試(OGTT)。在-30分鐘、-15分鐘、±0分鐘和在5、10、15、20、30、40、60、90和120分鐘將來(lái)自尾靜脈的靜脈血樣收集入20μl玻璃毛細(xì)管中，這些毛細(xì)管被放置于填充有1ml溶液的標(biāo)準(zhǔn)管中用于血糖測(cè)量。
所有血樣均標(biāo)記有如下數(shù)據(jù)●序號(hào)●動(dòng)物號(hào)
●取樣日期●取樣時(shí)間分析方法用葡萄糖氧化酶法(Super G Glucose分析儀；Dr.MüllerGertebau，F(xiàn)reital，德國(guó))測(cè)量葡萄糖水平。
統(tǒng)計(jì)方法用PRISM3.02(GraphPad Software，Inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)和制圖。以描述方式分析所有的參數(shù)，包括平均值和SD。
藥物對(duì)葡萄糖耐量的影響安慰劑治療的糖尿病朱克鼠顯示顯著升高的血糖移動(dòng)，表明明顯的糖尿病葡萄糖耐量。給予5mg/kg b.w.、15mg/kg和50mg/kg b.w.谷氨酰胺酰噻唑烷導(dǎo)致糖尿病朱克鼠中升高的血糖水平的顯著降低和葡萄糖耐量的改善(參見(jiàn)圖7)。
實(shí)施例20口服給予威斯塔鼠后谷氨酰胺酰噻唑烷的體內(nèi)失活動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)如實(shí)施例9中所述，將谷氨酰胺酰噻唑烷口服給予威斯塔鼠。
分析方法施用安慰劑或谷氨酰胺酰噻唑烷后，在2.5、5、7.5、10、15、20、40、60和120分鐘時(shí)從清醒不受約束的大鼠的頸動(dòng)脈導(dǎo)管取動(dòng)脈血樣，以測(cè)定谷氨酰胺酰噻唑烷的降解產(chǎn)物的形成。
為了進(jìn)行分析，使用在C18柱體上進(jìn)行的簡(jiǎn)單固相萃取過(guò)程從血漿中分離感興趣的化合物。用在連接有以大氣壓化學(xué)電離(APCI)陽(yáng)性模式工作的串聯(lián)質(zhì)譜的Lichrospher 60 RP Select B柱上進(jìn)行的反相液相色譜分析萃取物。使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。
結(jié)果將谷氨酰胺酰噻唑烷口服給予威斯塔鼠后，發(fā)現(xiàn)該化合物的降解。使用LC/MS，可以將降解產(chǎn)物定義為焦谷氨酰胺酰噻唑烷。參見(jiàn)圖8和9。
權(quán)利要求
1.至少一種二肽基肽酶IV(DPIV)或DPIV樣酶活性抑制劑用于制備降低哺乳動(dòng)物血壓水平或相關(guān)疾病的藥物組合物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中抑制劑選自二肽化合物、包括三、四和五肽在內(nèi)的肽化合物、肽基酮、氨基酮衍生物和側(cè)鏈修飾的DPIV抑制劑。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，其中二肽基肽酶IV樣酶選自成纖維細(xì)胞激活蛋白α、二肽基肽酶IVβ、二肽基氨基肽酶樣蛋白、N-乙酰化的α-連接的酸性二肽酶、休眠細(xì)胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶II、吸誘素和二肽基肽酶IV相關(guān)蛋白(DPP 8)、二肽基肽酶9(DPP9)、DPRP1、DPRP2、DPRP3或KIAA1492。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，其中二肽基肽酶IV樣酶的結(jié)構(gòu)是未發(fā)現(xiàn)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的用途，其中抑制劑是由氨基酸和噻唑烷或吡咯烷基團(tuán)形成的二肽樣化合物和它們的鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中二肽化合物選自L-蘇型異亮氨酰吡咯烷、L-別異亮氨酰噻唑烷、L-蘇型異亮氨酰吡咯烷、L-別異亮氨酰吡咯烷、L-谷氨酰胺酰噻唑烷、L-谷氨酰胺酰吡咯烷、L-谷氨酸噻唑烷、L-谷氨酸吡咯烷、丙氨酰吡咯烷、N-纈氨酰脯氨酰-O-苯甲酰羥胺和它們的鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的用途，其中抑制劑為由以下通式表示的用于競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)二肽基肽酶IV催化的肽化合物 其中A為除D-氨基酸之外的氨基酸；B為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的氨基酸；C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸和N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸，D為任何氨基酸或不存在，且E為任何氨基酸或不存在，或者C為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸、D-氨基酸之外的任何氨基酸；D為選自Pro、Ala、Ser、Gly、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸和2-哌啶酸的任何氨基酸，且E為除Pro、Hyp、氮雜環(huán)丁烷-(2)-羧酸、2-哌啶酸、N-烷基化的氨基酸例如N-甲基纈氨酸和肌氨酸之外的任何氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的用途，其中抑制劑為由以下通式表示的肽基酮 包括它們的所有立體異構(gòu)體和藥學(xué)可接受的鹽，其中A選自 且X1為H或?；蜓豸驶鶊F(tuán)或氨基酸或肽殘基，X2為H、n＝2-4的-(CH)n-NH-C5H3N-Y或C5H3N-Y(二價(jià)吡啶基殘基)，而Y選自H、Br、Cl、I、NO2或CN，X3為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，X4為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，X5為H或烷基、烷氧基或苯基殘基，X6為H或烷基殘基；對(duì)于n＝1X選自H、OR2、SR2、NR2R3、N+R2R3R4，其中R2代表?；鶜埢?，所述?；鶜埢幢蝗〈虮灰弧⒍蚋鄠€(gè)烷基、環(huán)烷基、芳基或雜芳基殘基取代，或者R2代表所有氨基酸和肽殘基，或烷基殘基，它們未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、環(huán)烷基、芳基和雜芳基殘基取代，R3代表烷基和?；倌軋F(tuán)，其中R2和R3可以是飽和與不飽和碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)的一種或多種環(huán)結(jié)構(gòu)的部分，R4代表烷基殘基，其中R2和R4或R3和R4可以是飽和與不飽和碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)的一種或多種環(huán)結(jié)構(gòu)的部分，對(duì)于n＝0X選自 其中B代表O、S、NR5，其中R5為H、亞烷基或?；?，C、D、E、F、G、H獨(dú)立地選自未被取代和取代的烷基、氧烷基、硫烷基、氨基烷基、羰基烷基、酰基、氨基甲?；?、芳基和雜芳基殘基；且對(duì)于n＝0和n＝1Z選自H、C1-C9的支鏈或單鏈烷基殘基或C2-C9的支鏈或單鏈鏈烯基殘基、C3-C8的環(huán)烷基殘基、C5-C7的環(huán)烯基殘基、芳基或雜芳基殘基，或選自所有天然氨基酸或其衍生物的所有側(cè)鏈的側(cè)鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的用途，其中抑制劑為由通式5、6、7、8、9、10和11代表的氨基酮衍生物，包括它們的所有立體異構(gòu)體和藥學(xué)可接受的鹽 其中R1為H、支鏈或直鏈C1-C9烷基殘基、支鏈或直鏈C2-C9鏈烯基殘基、C3-C8環(huán)烷基、C5-C7環(huán)烯基、芳基殘基或雜芳基殘基或天然氨基酸或其衍生物的側(cè)鏈；R3和R4獨(dú)立地選自H、羥基、烷基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基或鹵素，A為H或碳酸的等排物，如選自CN、SO3H、CONHOH、PO3R5R6、四唑、酰胺、酯、酸酐、噻唑和咪唑的官能團(tuán)；B選自 其中R5為H、n＝2-4的-(CH)n-NH-C5H3N-Y和C5H3N-Y(二價(jià)吡啶基殘基)，Y＝H、Br、Cl、I、NO2或CN，R10為H、?；?、氧羰基或氨基酸殘基，W為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，W1為H、烷基、烷氧基或苯基殘基，Z為H或苯基或吡啶基殘基，未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基、烷氧基、鹵素、硝基、氰基或羧基殘基取代，Z1為H或烷基殘基，D為可以未被取代或被一、二或更多個(gè)烷基取代的環(huán)狀C4-C7烷基、C4-C7鏈烯基殘基或環(huán)狀4-7元雜烷基或環(huán)狀4-7元雜烯基殘基，X2為O、NR6、N+(R7)2或S，X3至X12獨(dú)立地選自CH2、CR8R9、NR6、N+(R7)2、O、S、SO和SO2，包括所有飽和與不飽和結(jié)構(gòu)，R6、R7、R8、R9獨(dú)立地選自H、支鏈或直鏈C1-C9烷基殘基、支鏈或直鏈C2-C9鏈烯基殘基、C3-C8環(huán)烷基殘基、C5-C7環(huán)烯基殘基、芳基或雜芳基殘基，附加條件是式6如果A不為H，則X6為CH，式7如果A不為H，則X10為C，式8如果A不為H，則X7為CH，式9如果A不為H，則X12為C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)的用途，其中DPIV或DPIV樣酶活性抑制劑由以下通式表示 包括它們的所有立體異構(gòu)體和藥學(xué)可接受的鹽，其中A為在側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的氨基酸，B為與A的側(cè)鏈的至少一個(gè)官能團(tuán)共價(jià)連接的化合物，特別是-鏈長(zhǎng)度達(dá)20個(gè)氨基酸的寡肽，或者-摩爾質(zhì)量達(dá)20000g/mol的聚乙二醇，-任選地取代的具有8-50個(gè)C原子的有機(jī)胺、酰胺、醇、酸或芳族化合物，且C為酰胺連接于A的噻唑烷、吡咯烷、氰基吡咯烷、羥脯氨酸、脫氫脯氨酸或哌啶基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中A為氨基酸，優(yōu)選為α-氨基酸，特別是在側(cè)鏈中具有至少一個(gè)官能團(tuán)的選自以下的天然α-氨基酸蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、精氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，其中所述抑制劑為包含藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑和治療有效量的所述抑制劑或其藥學(xué)可接受的酸加成鹽的藥物組合物。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，其中一種或多種抑制劑與藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑組合使用。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，其中所述至少一種抑制劑以多次給藥來(lái)給予。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，其中哺乳動(dòng)物表現(xiàn)臨床不適的基礎(chǔ)和餐后高血糖或血壓水平或二者均有。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，用于預(yù)防或緩解導(dǎo)致血壓降低的哺乳動(dòng)物代謝病理異常如糖尿、高脂血癥、代謝性酸中毒和糖尿病。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，用于降低血壓超過(guò)140mmHg的哺乳動(dòng)物的血壓水平，其中定時(shí)給予至少一種抑制劑。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的用途，包括口服給予至少一種抑制劑或藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供本發(fā)明的DPIV抑制劑和它們相應(yīng)的藥學(xué)可接受的酸加成鹽形式用于降低血壓水平的新用途。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1582149SQ02802674
公開(kāi)日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2002年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月17日
發(fā)明者安德魯·J·波斯皮希里克, 漢斯-烏爾里希·德穆特, 康拉德·格隆德, 馬蒂亞斯·霍夫曼, 克里斯托弗·S·麥金托什, 雷·A·佩德森 申請(qǐng)人:前體生物藥物股份有限公司