專利名稱：基質(zhì)金屬蛋白酶2的小肽抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基質(zhì)金屬蛋白酶2的小肽抑制劑及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。在腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)發(fā)揮了重要作用。MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用可概括如下(1)破壞局部組織結(jié)構(gòu)，促進腫瘤生長；(2)破壞基底膜屏障，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移；(3)通過對細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)促進腫瘤新生血管的形成。
基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，又叫明膠酶A。MMP-2能夠降解基底膜的主要成分-IV型膠原。MMP-2是通過細(xì)胞表面的ανβ3整合素而結(jié)合到血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上的。血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)合了MMP-2之后，細(xì)胞本身的水解能力增強，導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力增強，抑制MMP-2的活性可以有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，進而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤新生血管生成。
MMP-2基因敲除小鼠的血管發(fā)生及腫瘤的進展水平明顯下降。許多證據(jù)表明，MMP-2在腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。臨床研究表明，MMP-2表達的增加與人類多種惡性腫瘤的侵襲潛能及預(yù)后密切相關(guān)。
目前已有許多MMPs抑制劑正進行臨床試驗，但這些MMPs抑制劑多具有廣譜的MMPs抑制活性。由于MMPs在許多組織和細(xì)胞中均有表達，因此，這些廣譜的MMP抑制劑存在明顯的毒副作用。因此，特異性已成為設(shè)計或?qū)ふ襇MPs抑制劑的關(guān)鍵。
噬菌體表面展示技術(shù)是一種在噬菌體表面展示外源蛋白的技術(shù)，目前已廣泛用于抗原表位分析、分子間相互識別、新型疫苗及藥物開發(fā)等各個方面。這項技術(shù)通過“吸附——洗脫——擴增”的親和篩選過程，可以將展示特異性外源肽的噬菌體從噬菌體肽庫篩選出來，經(jīng)擴增可以得到上千倍乃至108的倍的富集，從而可以很容易地對所篩選的克隆進行序列測定，最終確定表達的外源肽的氨基酸序列。
本發(fā)明的目的是利用噬菌體表面展示技術(shù)，以MMP-2的催化結(jié)構(gòu)域(MCD)為靶標(biāo)，篩選具有MMP-2抑制活性的小肽，并用于腫瘤的治療，或作為先導(dǎo)化合物設(shè)計MMP-2特異抑制劑。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的主要內(nèi)容是通過表達、純化基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的催化區(qū)(MCD)，得到MCD蛋白質(zhì)，然后以MCD蛋白質(zhì)為靶標(biāo)篩選環(huán)七肽庫和十二肽庫，得到了6種與MCD結(jié)合活性較高的環(huán)七肽，通過與GST融合表達，得到了相應(yīng)的GST融合表達肽，將GST融合表達肽用Glutathione SepharoseTM4B親和樹脂進行純化。通過競爭ELISA、酶抑制實驗、體外侵襲實驗檢測了融合表達肽的活性。其中GST-C7-1能夠競爭抑制噬菌體單克隆C7-1與MCD的結(jié)合，能夠抑制MCD水解其底物β-casein的活性，并且對人成纖維肉瘤細(xì)胞HT1080的體外侵襲有明顯的抑制作用。通過合成兩端無半胱氨酸的GST-C7-1融合蛋白，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白也具有抑制MCD水解β-casein的活性，證明環(huán)七肽C7-1分子中的二硫鍵并不是其發(fā)揮抑制MMP-2活性所必需的。C7-1小肽在腫瘤的導(dǎo)向治療以及抗腫瘤新生血管生成方面具有潛在的應(yīng)用價值。
結(jié)合


本發(fā)明的具體實施方法如下圖1重組表達載體pET-MCD的構(gòu)建圖譜圖2MCD純化的SDS-PADE圖譜1.Marker 2-5.不同濃度咪唑洗脫下的MCD蛋白6. 8M尿素裂解的包涵體 7.全菌(IPTG誘導(dǎo))圖3明膠酶譜法分析MCD活性的SDS-PADE圖譜圖4具有MCD結(jié)合活性的小肽序列C7-1～C7-6為環(huán)7小肽；L12-1～L12-11為線性12肽。氨基酸序列從左到右為N端到C端。
圖5噬菌體單克隆與MCD結(jié)合活性的ELISA檢測結(jié)果圖6GST-MCD結(jié)合肽融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜圖7GST-C7-1和GST-125蛋白表達鑒定的SDS-PAGE圖譜1.Marker 2，4，6，8.GST-C7-1 3，5，7，9.GST-L1252-5全菌體(2，3.誘導(dǎo)前 4，5.誘導(dǎo)后)6，7超聲上清 8，9超聲沉淀圖8GST-MCD結(jié)合肽融合蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜(一)1.Marker 2.GST 3.GST-C7-1 4.GST-C72 5.GST-C76圖9GST-MCD結(jié)合肽融合蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜(二)1.GST-L129 2.GST-L125 3.GST-L126 4.Marker圖10GST-MCD結(jié)合肽抑制MCD水解活性的SDS-PAGE圖譜1.GST 2.GST+β-casein 3.GST+MCD+β-casein4.GST-C7-1 5.GST-C7-1+MCD+β-casein 6.GST-C7-1+β-casein7.MCD+β-casein 8.β-casein 9.Marker圖11GST-C7-1抑制MCD水解的SDS-PAGE圖譜1.GST-C7-1+β-casein 2-6.GST-C7-1+MCD+β-casein(從2到6GST-C7-1的濃度依次升高，濃度分別為21.25μg/ml，42.50μg/ml，85μg/ml，170μg/ml，340μg/ml)7.MCD+β-casein 8.Marker 9.β-casein10.GST-C7-1(340μg/ml)圖12GST-L7-1抑制MCD水解的SDS-PAGE圖譜1.Marker 2.GST-L7-1(0.6mg/ml)3-5.GST-L7-1+MCD+β-casein(GST-L7-1的濃度依次是150μg/ml，300μg/ml，600μg/ml)6.MCD+β-casein 7.β-casein 8.GST-L7-1+β-casein圖13GST-C7-1競爭抑制噬菌體單克隆C7-1與MCD結(jié)合的ELISA結(jié)果圖14GST-C7-1對HT1080細(xì)胞侵襲能力的影響圖15不同濃度GST-C7-1對HT1080細(xì)胞侵襲能力的影響實施例一MMP-2催化區(qū)(MCD)的克隆與表達本實施例的實驗步驟如下應(yīng)用PCR方法從含有人MMP-2全長cDNA的質(zhì)粒中擴增MMP-2的催化結(jié)構(gòu)域(MCD)，然后構(gòu)建MCD的表達載體pET-MCD(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達重組的MCD。經(jīng)SDS-PAGE分析，重組人MMP-2催化區(qū)(MCD)以包涵體形式存在。8000r/min收集菌體，用10倍培養(yǎng)物體積的TE緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)懸浮。加入溶菌酶(1mg/ml)于4℃裂解，然后置于冰水中超聲破碎，10000g離心10min，回收沉淀即包涵體。包涵體經(jīng)TE緩沖液(pH8.0)、1％ Triton X-100、1mol/LNaCl和2mol/L尿素依次洗滌后，用溶解于20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)的8mol/L尿素裂解包涵體，8000g離心10min，回收裂解上清。將上述裂解上清用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀釋至尿素濃度為2mol/L，加入NaCl至終濃度0.5mol/L，然后上樣于Ni2+螯合層析柱，純化后得到了電泳純的樣品MCD(圖2)。將純化的MCD用溶解于20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)的2mol/L尿素稀釋至蛋白濃度為50-100μg/ml，4℃放置過夜。次日，用透析緩沖液(20mmol/L Tris-HCl pH8.0，1μmol/L ZnCl2，5mmol/LCaCl2)于4℃充分透析復(fù)性。通過明膠酶譜檢測發(fā)現(xiàn)MCD具有良好的明膠水解活性(圖3)，說明MCD已成功復(fù)性，可以用作靶蛋白進行后續(xù)的噬菌體肽庫篩選工作。
實施例二MCD抑制劑的篩選在得到純化的有生物活性的MCD蛋白的基礎(chǔ)上，以MCD為靶標(biāo)從噬菌體隨機環(huán)七肽庫和十二肽庫中，分別經(jīng)過三輪篩選得到了MCD特異的結(jié)合肽。通過DNA序列分析，推斷出相應(yīng)的結(jié)合肽氨基酸序列，共得到了16種MCD結(jié)合肽(圖4)。
通過ELISA方法檢測得到6種與MCD結(jié)合最強的噬菌體(圖5)，它們分別是C7-1、C7-2、C7-6、L12-5、L12-6、L12-9。
實施例三GST-小肽融合蛋白的表達和純化為了探討我們篩到的MCD結(jié)合肽能否具有抑制MMP-2的活性，我們以GST融合表達的方式將C7-1、C7-2、C7-6、L12-5、L12-6、L12-9分別與GST融合表達。
本實施例的實驗步驟如下a、GST-小肽融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建(圖6)為了不影響結(jié)合肽本身的結(jié)構(gòu)，在合成結(jié)合肽編碼序列時引入了兩個甘氨酸密碼子，并在此序列的兩端加上了EcoRI和HindIII酶切位點。將合成的小肽基因片段的兩互補序列分別溶于滅菌的去離子水中，使其終濃度為1μg/μl，各取5μl，加入40μl滅菌去離子水中，終體積為50μl，混勻后放入95℃水浴中5分鐘，然后緩慢降至室溫使兩互補片段退火。將經(jīng)EcoRI/HindIII酶切回收的pGEX-KG載體片段與上述退火的MCD結(jié)合小肽基因片段按1∶5的摩爾比連接，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑單克隆測序。
b、GST-結(jié)合肽融合蛋白的表達將經(jīng)鑒定正確的重組菌菌液按1∶100接種于含有氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.5，加入終濃度為0.1-0.5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達3小時，離心后，棄去上清，將菌體進行超聲破碎，將超聲處理后的菌液于4℃，12,000r/min離心10min。SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達形式(圖7)，證明目的蛋白以可溶性形式存在。
c、GST-結(jié)合肽融合蛋白的純化將離心上清用Glutathione Sepharose 4B親和純化樹脂進行純化。首先將樣品結(jié)合于Glutathione Sepharose 4B樹脂，然后用10倍體積的PBS洗去非特異結(jié)合的雜蛋白，用10mmol/L還原型谷胱甘肽(用50mmol/L的Tris-HCl緩沖液配制，pH8.0)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE檢測純化效果(圖8，圖9)。
實施例四GST融合蛋白抑酶活性的檢測為檢測GST-小肽的抑制活性，取純化的MCD(50μg/ml)與不同濃度的融合肽孵育1-2小時，然后加入基質(zhì)金屬蛋白酶的底物-β-casein(終濃度為0.8mg/ml)，22℃孵育1-2小時。β-casein的降解通過SDS-PAGE分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種GST融合蛋白中，GST-C7-1具有明顯的抑制活性，且具有量效關(guān)系(圖10，圖11)。為了檢測GST-C7-1中的兩個半胱氨酸是否是發(fā)揮其活性必須的，我們又設(shè)計了不帶半胱氨酸的GST-L7-1，其中的半胱氨酸用甘氨酸取代，將純化后的GST-L7-1也進行了MMP-2抑酶活性的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GST-L7-1仍然具有抑制MCD水解其底物β-casein的活性(圖12)，這說明小肽C7-1兩端的二硫鍵并不是C7-1發(fā)揮其MMP-2抑制活性所必需的。
實施例五GST-C7-1競爭抑制噬菌體單克隆C7-1與MCD的結(jié)合以50μg/ml的MCD包被96孔板，4℃過夜，PBST(0.1％Tween 20的PBS)洗滌3次后用0.5％的BSA封閉，室溫3小時，每孔加入不同濃度的GST-C7-1與固定濃度(1010pfu/ml)的噬菌體C7-1的溶液100μl，每一濃度設(shè)3個平行孔，37℃結(jié)合1小時，PBST洗板6次，加HRP標(biāo)記的M13單抗，37℃結(jié)合1小時，PBST洗板6次，加入TMB底物顯色5-15min，2M H2SO4終止反應(yīng)，酶聯(lián)儀測OD450。結(jié)果表明隨著GST-C7-1蛋白濃度的提高，噬菌體單克隆C7-1與MCD的結(jié)合逐漸降低，而不同濃度的GST則對噬菌體單克隆C7-1與MCD的結(jié)合沒有明顯影響(圖13)，證明GST-C7-1能夠競爭抑制噬菌體單克隆C7-1與MCD的結(jié)合。這一實驗結(jié)果表明，表達在噬菌體表面的小肽與表達在GST蛋白C末端的小肽具有類似的空間結(jié)構(gòu)，都能與MCD特異性結(jié)合。
實施例六GST-C7-1抑制HT1080細(xì)胞體外侵襲實驗胰酶消化HT1080細(xì)胞，以培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×105cell/ml，取0.5ml細(xì)胞懸液，種植于0.8μm膜孔徑的小杯(MATRIGEL Invasion Chambers)內(nèi)，同時加入不同濃度的GST-C7-1(GST蛋白作對照)；24孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入含有各種濃度的GST-C7-1的培養(yǎng)液DMEM 0.7ml，然后將小杯放入培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃，5％CO2培養(yǎng)18小時，取出小杯，PBS輕輕沖洗膜內(nèi)外，用棉簽擦去內(nèi)層細(xì)胞，95％乙醇固定外層細(xì)胞后，結(jié)晶紫染色，待膜干燥后可從小杯上揭下并用樹膠固定封片。40×10顯微視野下數(shù)5個不同視野的細(xì)胞數(shù)，取平均值。結(jié)果表明GST-C7-1通過抑制HT1080細(xì)胞降解基底膜，抑制了HT1080細(xì)胞的遷移(圖14，圖15)。
權(quán)利要求
1.一種具有基質(zhì)金屬蛋白酶2抑制活性的小肽，其氨基酸序列從N末端到C末端為A-S-R-S-S-L-T。
2.一組具有基質(zhì)金屬蛋白酶2結(jié)合活性的小肽，其氨基酸序列從N末端到C末端為C7-1、A S R S S L TC7-2、Q S K N R K MC7-3、K K S Q T R QC7-4、S T L K H N TC7-5、S P S Q Y P RC7-6、R T P S S K RL12-1、K P I P K P N H P H H LL12-2、A P P H K H H A P T P RL12-3、K P H P H H T T W S S AL12-4、H T D T S R L H P F P GL12-5、Q V P D V H P L R K R RL12-6、K P R P S M K P Q D L LL12-7、D H R P L Q G A F S R SL12-9、S P I K K N Y T F A A SL12-10、L P H H K H R V P P P TL12-11、A T K V H H Q H A T H R
3.一組根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽的變異體。
4.一組根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽的的基因序列。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽的融合蛋白。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽作為腫瘤導(dǎo)向治療的載體。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1和2所述小肽作為載體的腫瘤體內(nèi)造影的診斷方法。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述小肽作為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑治療腫瘤的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基質(zhì)金屬蛋白酶2的小肽抑制劑的氨基酸序列及一組具有基質(zhì)金屬蛋白酶2結(jié)合活性的小肽，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在表達并純化了基質(zhì)金屬蛋白酶－2(MMP－2)的催化區(qū)MCD的基礎(chǔ)上，以MCD為靶標(biāo)篩選噬菌體隨機環(huán)七肽庫和十二肽庫，得到了一種能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2水解活性的小肽，此小肽具有抑制腫瘤細(xì)胞體外侵襲活性。另外，還得到了一組具有基質(zhì)金屬蛋白酶2結(jié)合活性的小肽。這些小肽在腫瘤的導(dǎo)向治療以及抑制腫瘤血管生成方面具有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號A61K38/10GK1502625SQ0214942
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者王清明, 高紅偉, 陳惠鵬, 陳吉中, 范國才, 孔麗君, 劉剛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)