專利名稱：一種重組腺病毒在腦缺血、創(chuàng)傷修復(fù)和組織粘連治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒對腦缺血、創(chuàng)傷愈合和組織粘連的治療方法。
背景技術(shù)：
肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)最初被認為是一種肝細胞有絲分裂原，后來發(fā)現(xiàn)其對多種組織細胞的分裂、擴散和形態(tài)發(fā)生起重要的調(diào)節(jié)作用。HGF具有促進血管內(nèi)皮細胞增生和新生血管形成的作用，可以用于治療各種原因所致組織缺血性疾?。籋GF還能調(diào)節(jié)膠原纖維的合成和炎性反應(yīng)，在治療創(chuàng)傷愈合、防治組織纖維化中起著重要的作用；此外HGF還可促進組織細胞的發(fā)生、生存和再生，抑制細胞凋亡，對神經(jīng)有營養(yǎng)作用，可用于預(yù)防和治療神經(jīng)損傷。由此可見，HGF是一生物活性極為廣泛的細胞因子，HGF將以其多種藥理作用滲透于臨床治療的各個領(lǐng)域。
在HGF蛋白制劑給藥中，因HGF在體內(nèi)半衰期較短，因而需要大劑量、反復(fù)給藥才能維持局部較高的藥物濃度；然而，因局部或體內(nèi)的蛋白酶解作用，即使重復(fù)給藥也往往難以達到有效治療濃度。因而應(yīng)用蛋白制劑花費較高，且因純化工藝不成熟，易產(chǎn)生不良作用，從而給臨床治療帶來副作用。近年來興起的一種新的治療模式——基因治療的方法，有可能克服上述缺點。
基因治療所用的基因?qū)胂到y(tǒng)，大致可分為非病毒載體和病毒載體兩類。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒等，腺病毒因其容易生產(chǎn)、感染率高、感染細胞范圍廣，而成為基因治療普遍應(yīng)用的載體。
隨著現(xiàn)代社會醫(yī)療條件的提高和人口老齡化趨勢，腦血管病已成為危害人類生命的三大殺手之一，其中又以缺血性疾病最為多見，它的發(fā)生率和致殘率都很高，給社會和家庭帶來極大的負擔。目前由于它發(fā)病急及神經(jīng)元死亡的不可逆性，臨床治療效果并不理想。神經(jīng)營養(yǎng)因子作為酪氨酸激酶受體的配體，在神經(jīng)元的發(fā)生。生長和存活中發(fā)揮著非常重要的作用，可用來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷。HGF的受體c-Met也是一種酪氨酸激酶受體，在腦內(nèi)分布廣泛，因此HGF與神經(jīng)系統(tǒng)細胞之間關(guān)系密切。HGF不但可以促進血管新生，改善組織缺血，而且可以提高bcl-2的表達，抑制細胞凋亡，所以HGF可能對腦缺血性疾病有改善和治療作用。
創(chuàng)傷、燒傷包括手術(shù)切口的愈合仍然是臨床存在的一大難題，尤其是糖尿病人的創(chuàng)傷愈合、局部放療傷口的愈合、大面積燒傷或褥創(chuàng)等難愈合傷口的愈合，給患者造成巨大痛苦，也給醫(yī)療工作帶來巨大負擔，目前還沒有非常有效的方法來促進這些傷口的快速愈合。HGF在理論上可從多方面促進傷口的有效、高質(zhì)量愈合。首先，HGF可刺激血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖，形成新生血管，促進局部血液循環(huán)，從而加速愈合；HGF可刺激皮膚角質(zhì)細胞運動、增殖，促使傷口的再表皮化。
組織創(chuàng)傷或手術(shù)后產(chǎn)生的組織粘連問題也困擾著醫(yī)患雙方，組織粘連不僅影響器官的正常功能，而且有的粘連給患者的生活造成很大不便。現(xiàn)代研究表明，創(chuàng)傷或手術(shù)后缺血組織引起的炎癥是粘連的重要原因，由于缺血，組織纖溶活性降低而發(fā)生粘連。因此改善組織血供，是預(yù)防和減輕粘連的重要環(huán)節(jié)。HGF作為促血管生長因子，不僅可以改善損傷組織的血供，還能調(diào)節(jié)組織炎性反應(yīng)，減少組織液體滲出，此外還可顯著抑制TGF-β的產(chǎn)生。而TGFβ是迄今了解最多、與膠原蛋白形成最密切的細胞因子，HGF由于對抗TGF-β的產(chǎn)生而可減少組織粘連的形成。另外HGF可增強膠原酶的活性，促使多余形成的膠原蛋白有效地降解，這些都有助于防止和減輕組織粘連的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建攜帶人肝細胞生長因子的重組腺病毒載體(Ad-HGF)；Ad-HGF能減輕腦缺血引起的神經(jīng)細胞死亡、促進創(chuàng)傷修復(fù)和減少損傷后的組織粘連。解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案1.通過細胞內(nèi)質(zhì)粒同源重組將人肝細胞生長因子基因整合到腺病毒載體上，獲得重組腺病毒，并制備一定量的病毒顆粒。
2.建立腦缺血動物模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，觀察腺病毒在腦內(nèi)的表達(圖1)，證明人肝細胞生長因子能減輕腦缺血引起的神經(jīng)細胞死亡(圖2，3)。
3.建立創(chuàng)傷動物模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，證明人肝細胞生長因子能促進創(chuàng)傷的愈合，促進毛發(fā)和皮脂腺的再生(圖4)。
4.建立組織粘連動物模型和合適的基因轉(zhuǎn)移方法，證明人肝細胞生長因子能減輕因組織損傷而形成的粘連。


圖1是動物右側(cè)大腦室注射Ad-GFP后三天，作冰凍切片，在熒光顯微鏡下(×100)可見熒光蛋白在雙側(cè)側(cè)腦室壁及其內(nèi)部的脈絡(luò)膜細胞表達。
圖2是動物缺血治療后三天，取大腦平均切成四片，進行1％TTC染色觀察，缺血區(qū)不著色，非缺血區(qū)被染成磚紅色。左側(cè)四片為對照，右側(cè)四片為Ad-HGF治療組。
圖3是Ad-HGF對動物腦缺血的影響(實驗組與對照比較，P＜0.05)。
圖4是涂抹Ad-HGF組創(chuàng)口愈合后的組織切片，可見毛囊及皮脂腺的存在，并可見毛囊及皮脂腺的分裂相(×200)。
具體實施例 下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細說明但不意味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例1重組腺病毒的構(gòu)建和制備(1)重組腺病毒的構(gòu)建構(gòu)建攜帶人肝細胞生長因子基因的穿梭質(zhì)粒，命名為pXCJL1-CMV/HGF/P。將pXCJL1-CMV/HGF/P與攜帶腺病毒基因組DNA的重組質(zhì)粒GT4050共轉(zhuǎn)染293細胞，二者在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組，形成攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒，命名為Ad-HGF，結(jié)構(gòu)如下5’ITR V40pA HGF hCMV啟動子Ad5 3533-3’ITR 攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒(Ad-GFP)由美國百特醫(yī)療用品公司基因治療部(Gene Therapy Unit，Baxter Healthcare Company，USA)惠贈，293細胞系購自ATCC。
(2)病毒擴增與純化將293細胞接種于150mm平皿中，待細胞生長至90％匯合狀態(tài)時，加入病毒，感染強度(multiplicity of infection，MOI)約為10個空斑形成單位(plaque forming unit，pfu)/細胞，36-48h后，細胞出現(xiàn)完全CPE(cell pathology effect)時，收集細胞，凍存于-80℃，待累計到50-60個平皿時，統(tǒng)一純化病毒。
將出現(xiàn)CPE的293細胞于-80℃和37℃水浴間反復(fù)凍融三次，2500rpm離心10min以除去細胞碎片；配制1.5g/ml CsCl溶液(取30g CsCl，加PBS至終體積42.5ml)、1.35g/ml CsCl溶液(取15ml 1.5g/ml的CsCl液，加PBS至終體積21ml)和1.25g/ml CsCl溶液(取11ml1.5g/ml的CsCl液，加PBS至終體積20ml)；制備CsCl密度梯度依次將0.5ml 1.5g/ml CsCl溶液、2.5ml 1.35g/ml CsCl溶液和2.5ml 1.25g/ml CsCl溶液加入12ml超速離心管中；將凍融后的待純化病毒液加于各管的CsCl梯度液之上；150,000g，10℃離心1h，于1.35g/mlCsCl溶液和1.25g/ml CsCl溶液之間出現(xiàn)白色霧狀病毒帶；收集病毒帶，并與1.35g/ml CsCl溶液混和；150,000g，10℃離心18h，進一步純化病毒；吸出病毒帶，以1-2倍體積的Hanks液稀釋病毒，以Hanks液為透析液于4℃透析病毒，每2h更換一次透析液，共換液5次；取出純化的病毒液，加無菌甘油至終濃度為10％，分裝后于-80℃凍存。
實施例2重組腺病毒介導(dǎo)人肝細胞生長因子對大腦局灶性缺血基因治療的實驗研究(1)動物模型與基因轉(zhuǎn)移Wistar雄性大鼠體重200-250g，腹腔注射異戊巴比妥鈉(100mg/kg)麻醉，無菌分離右側(cè)頸總，頸外和頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈分支起始處和頸總動脈近心端，動脈夾夾住頸內(nèi)動脈，在頸總動脈剪一小口，把末端為球型4-0的尼龍線水平向頸內(nèi)動脈端插入約20mm左右，至大腦中動脈造成大鼠右側(cè)大腦局灶性缺血，縫合傷口。然后在立體定位儀的輔助下，于大鼠大腦前囪尾側(cè)1.5mm，右側(cè)2mm，深度3.5mm，用微量進樣器向側(cè)腦室注入107pfu/10μl腺病毒載體。HGF組給予Ad-HGF，對照組給予生理鹽水。
(2)攜帶綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-GFP)在大鼠腦內(nèi)的表達和分布大鼠側(cè)腦室注入107pfu/10μl Ad-GFP后三天麻醉，心臟進行生理鹽水灌注后，取大腦作全腦冰凍切片，熒光顯微鏡下可見熒光蛋白主要表達在大鼠雙側(cè)側(cè)腦室壁和腦室內(nèi)的脈絡(luò)膜細胞(圖1)。
(3)大腦局灶性缺血基因治療的效果動物在治療三天后麻醉，對心臟進行生理鹽水灌注后，取大腦平均切成四片，用含1％TTC(四氮唑紅)的磷酸鹽緩沖液在37℃染色30分鐘，然后用4％甲醛PBS溶液固定后觀察，缺血區(qū)不著色，非缺血區(qū)被染成磚紅色(圖2)。染色后的大腦切片經(jīng)高分辨率掃描儀掃描進計算機內(nèi)，用ImageTool軟件計算出大腦不著色區(qū)占全腦體積的百分比，用Excel的TTEST統(tǒng)計實驗組(10只)和對照組(8只)動物差別的顯著性，結(jié)果顯示HGF基因治療組動物大腦缺血體積明顯小于對照組(圖3)。
實施例3.重組腺病毒介導(dǎo)人肝細胞生長因子(Ad-HGF)對皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的作用(1)動物模型與基因轉(zhuǎn)移選用2.5kg左右健康的雌性新西蘭大白兔10只，戊巴比妥鈉靜脈麻醉(30mg/kg)，在雙耳腹側(cè)以無菌手術(shù)方法切除圓形全層皮膚直至軟骨，切口直徑0.7cm，每側(cè)耳5個。被隨機分成5組，每組兩只Ad-HGF1組，Ad-HGF2組，Ad-HGF3組，Ad-GFP組和溶劑組。手術(shù)即刻將6×107pfu Ad-HGF，6×108pfu Ad-HGF，6×109pfu Ad-HGF，6×109pfu Ad-GFP或同體積的溶劑一次性依次涂抹于上述各組傷口表面。
涂抹重組腺病毒后，每天觀察各組傷口愈合情況，并對傷口未愈合面積進行測量。至第23天時動物全部活殺，并將創(chuàng)面及其臨近無創(chuàng)傷處皮膚全層一并切下，10％福爾馬林固定，做常規(guī)石蠟切片，進行HE染色。
(2)效果評價兔耳創(chuàng)面局部涂抹重組腺病毒后第6天，大體外觀即可觀察到Ad-HGF組創(chuàng)口愈合速度較Ad-GFP及溶劑組快，至第8天時，兩組創(chuàng)口未愈合面積百分比在統(tǒng)計學(xué)上有顯著意義Ad-HGF1、Ad-HGF2和Ad-HGF3分別為9.36％，4.46％和4.59％，Ad-GFP及溶劑組分別為26.88％和32.16％(p＜0.05)，而Ad-GFP及溶劑組之間無顯著性差異(p＞0.05)。至第23天時，涂抹Ad HGF組創(chuàng)口已全部愈合(20/20)，而Ad-GFP及溶劑組各有2/20和6/20個創(chuàng)口明顯地未完全愈合。而且Ad-HGF組創(chuàng)口愈合較為平坦，有的甚至與周圍鄰近正常皮膚完全相同，而Ad-GFP及溶劑組均明顯增厚。光學(xué)顯微鏡下觀察表明，涂抹Ad-HGF組創(chuàng)口只有2/20個尚未完全再表皮化，而Ad GFP及溶劑組各有10/20個未完全再表皮化。涂抹Ad-HGF組創(chuàng)口真皮中纖維薄且排列整齊，而對照組的纖維厚且排紊亂。
另外，在涂抹Ad-HGF組創(chuàng)口組織中可見毛囊及皮脂腺的存在，并可見毛囊及皮脂腺的分裂相，尤以大劑量組(109pfu和108pfu組)較為明顯(圖4)，表明HGF可促進毛發(fā)的生長，對皮膚功能的恢復(fù)有重要意義。
實施例4重組腺病毒介導(dǎo)人肝細胞生長因子(Ad-HGF)對組織粘連的作用(1)Ad-HGF治療脊髓半離斷效果評價Wistar雌性大鼠體重200-250g，異戊巴比妥鈉腹腔注射(100mg/kg)麻醉，背部備皮，分層切開皮膚、皮下組織和椎旁肌，咬除脊突和椎板，暴露胸10節(jié)段脊髓作左側(cè)半離斷，實驗組局部肌注109pfuAd-HGF，對照組用100μl生理鹽水，逐層縫合切口。術(shù)后六周，心臟灌流生理鹽水和4％多聚甲醛的PBS溶液固定動物，取脊髓觀察，可見用藥組動物局部脊髓與周圍肌肉粘連較對照組明顯減輕，且瘢痕亦明顯減少。
(2)Ad-HGF治療腸粘連效果評價Wistar雄性大鼠體重200-250g，麻醉后剪開腹腔，暴露小腸回盲部，用止血鉗由回盲部起，鉗夾回腸三處，間隔1.5cm。夾后腸管局部發(fā)紺，有少量滲血，在鉗夾部位涂抹109pfuAd-HGF或生理鹽水情20μl，關(guān)閉腹腔。10天后處死，剖腹觀察，用藥組動物形成的粘連較少且粘連帶短于對照組。
權(quán)利要求
1.一種重組腺病毒在腦缺血、創(chuàng)傷修復(fù)和組織粘連治療中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征是攜帶人肝細胞生長因子基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征是該腺病毒可以用于治療腦缺血、創(chuàng)傷修復(fù)和組織粘連。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征是該腺病毒可以被配成注射液、噴涂劑或凍干劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒(AdHGF)在腦缺血、創(chuàng)傷愈合和組織粘連治療中的應(yīng)用，具體的是通過細胞內(nèi)質(zhì)粒同源重組將人肝細胞生長因子基因整合到腺病毒載體上，獲得重組腺病毒。Ad－HGF配制成的注射液用于腦缺血的基因治療，能夠明顯減小大腦缺血區(qū)的面積，改善腦功能。Ad－HGF配制成的注射液作噴涂劑，對皮膚全層創(chuàng)傷能加速創(chuàng)面愈合，并促進毛囊和皮脂腺的再生，表明Ad－HGF可促進毛發(fā)的生長，對皮膚功能的恢復(fù)有重要作用。Ad－HGF在脊髓損傷部位局部肌肉注射或小腸損傷局部涂抹，可以減輕損傷部位組織粘連的形成。
文檔編號A61P17/02GK1502368SQ02149418
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者靳繼德, 吳祖澤, 劉鋮, 哈小琴, 吳丹莉, 勞妙芬 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所, 北京魯銀利華醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)