專利名稱：新的豆豉溶栓酶、其制造方法和產(chǎn)生此溶栓酶的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種新的豆豉溶栓酶及其生產(chǎn)方法和產(chǎn)生此溶栓酶的微生物。
背景技術(shù)：
血栓栓塞性疾病是當(dāng)前危害人類健康，導(dǎo)致死亡率最高的原因之一，如心肌梗塞、腦血管血栓形成、深靜脈血栓形成、腦栓塞、肺栓塞等。此外，血栓形成是許多疾病發(fā)病機(jī)制中涉及的一種重要病理過(guò)程，如腎小球腎炎、糖尿病小血管病變、嚴(yán)重?zé)齻芯植坎∽兊膼夯⒁暰W(wǎng)膜靜脈血栓形成等。全世界有血栓栓塞性病人約1500萬(wàn)，所需的溶栓劑的潛在市場(chǎng)約20億美元。僅我國(guó)每年患急性心肌梗塞和腦血栓的約有300萬(wàn)人。因此世界各國(guó)都致力于這方面藥物的研究開(kāi)發(fā)。
治療血栓栓塞性疾病的手段目前主要有三種第一，外科手術(shù)，即用物理方法清除血栓或切除栓塞部位的血管而用塑料管取代等，如心肌梗塞。這種方法要求的條件復(fù)雜，費(fèi)用高，且手術(shù)后易再栓塞；第二，保守療法，即讓患者長(zhǎng)期服用抗凝劑，減低凝血傾向，這種方法通常與其他方法結(jié)合作為輔助治療；第三，溶栓療法，即注射溶栓劑使血管再通，這種方法越早期使用越有效，它與保守療法相比，治療后兩周內(nèi)死亡率較低，而費(fèi)用比外科手術(shù)少，更適合于我國(guó)國(guó)情。
在現(xiàn)行臨床所用的溶栓劑中主要是鏈激酶和尿激酶，但這兩種藥物都有其局限性。鏈激酶由于人體內(nèi)易產(chǎn)生鏈激酶抗體，因此存在拮抗作用，其用量很不好掌握，并有明顯的副作用。雖然尿激酶無(wú)明顯的抗原性，但因尿激酶很不穩(wěn)定，其活性很難控制，容易引起大出血，或者因失活而起不到溶解血栓的作用，給急救工作造成很大麻煩。
日本專利(JP61162184)、(JP1180834)和(JP5336917)涉及一種新型的溶栓劑——納豆激酶(Nattokianse，NK)。它是從日本的傳統(tǒng)食品納豆(Natto)中發(fā)現(xiàn)的，能顯著地溶解體內(nèi)血栓，作用時(shí)間長(zhǎng)，明顯縮短優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間，靜脈注射內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活劑，而且口服效果也很好。但野生型納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)的納豆激酶的產(chǎn)量不高，由此得到的納豆激酶的生產(chǎn)方法亦不夠理想。
豆豉是我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，具有開(kāi)胃增食，消積化滯，驅(qū)風(fēng)散寒以及預(yù)防心血管疾病等功效。我國(guó)學(xué)者近幾年相繼發(fā)現(xiàn)了豆豉中也存在一種溶栓酶，并進(jìn)行了深入的研究。中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)朇N-97106442.3和申請(qǐng)?zhí)朇N00107589.6)涉及到納豆激酶的生產(chǎn)方法，即采用納豆芽孢桿菌在大豆、無(wú)機(jī)鹽等的固體或液體培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵，產(chǎn)生并提取和純化工藝等生產(chǎn)納豆激酶。中國(guó)專利(申請(qǐng)?zhí)朇N-99119166.8、CN-99125780.4和CN-00112980.5)則采用基因工程技術(shù)，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出納豆激酶的基因，然后在一定的載體和相應(yīng)的宿主菌中進(jìn)行表達(dá)。但是這些專利運(yùn)用的微生物菌株與日本納豆激酶一樣均是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)。
本發(fā)明的目的是提供一種新的豆豉溶栓酶、制造這種溶栓酶的方法和產(chǎn)生這種溶栓酶的微生物。本發(fā)明涉及的微生物是從中國(guó)傳統(tǒng)食品豆豉中篩選的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，該菌株產(chǎn)生的溶栓酶的特性及其所產(chǎn)的溶栓酶在相關(guān)文獻(xiàn)和專利中未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)由芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株UN-20-N-38產(chǎn)生的豆豉溶栓酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE)是一種弱堿性蛋白酶。僅使用此酶進(jìn)行的體外溶栓實(shí)驗(yàn)表明，該酶具有非常好的溶栓效果。因此，本發(fā)明提供了這種新的溶栓酶、它的生產(chǎn)方法和酶學(xué)性質(zhì)，及其產(chǎn)生這種溶栓酶的微生物。
產(chǎn)生酶的微生物產(chǎn)生本發(fā)明酶的微生物是芽孢桿菌屬的一種與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)在細(xì)菌學(xué)上密切相關(guān)的菌株UN-20-N-38。
細(xì)菌學(xué)特性與本發(fā)明相關(guān)的芽孢桿菌屬菌株UN-20-N-38具有下列的細(xì)菌學(xué)特性(a)形式芽孢桿菌(b)革蘭氏染色陽(yáng)性(c)孢子的產(chǎn)生陽(yáng)性(d)孢子的形狀橢園(e)移動(dòng)性陽(yáng)性(f)對(duì)氧的反應(yīng)需氧菌(g)過(guò)氧化氫酶的產(chǎn)生陽(yáng)性(h)在厭氧條件下的生長(zhǎng)陰性(i)伏一普二氏反應(yīng)(VP)反應(yīng)陽(yáng)性(j)酸的產(chǎn)生葡萄糖陽(yáng)性阿拉伯糖陽(yáng)性甘露糖醇陽(yáng)性蔗糖陽(yáng)性木糖陽(yáng)性乳糖陽(yáng)性(k)耐鹽性10％NaCl(l)明膠的液化作用陽(yáng)性(m)淀粉的降解陽(yáng)性(n)抗溶菌酶(0.001％)陽(yáng)性(o)檸檬酸鹽、丙酸鹽的利用陽(yáng)性(p)50℃的生長(zhǎng)陰性根據(jù)Bergey的系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(Vol.2，William和Wilkins，1986)，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌，定名UN-20-N-38。并且用美國(guó)Biolog微生物鑒定儀鑒定得到相同的結(jié)果。
此外，屬于所說(shuō)菌株UN-20-N-38的溶栓酶生產(chǎn)力改進(jìn)突變體(通過(guò)自發(fā)或者誘導(dǎo)突變而得)可以作為產(chǎn)生本發(fā)明溶栓酶的細(xì)菌。為了制備這些突變體，可以使用常規(guī)的方法，例如由紫外線照射或者誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)對(duì)原始菌株誘導(dǎo)突變后，將培養(yǎng)物接種到含有纖維蛋白的瓊脂培養(yǎng)基中。從在菌落周圍形成較大清晰環(huán)帶的菌落中選擇具有極好生產(chǎn)力的突變體；配合通過(guò)搖瓶實(shí)驗(yàn)測(cè)定纖溶活性，以及體外溶栓實(shí)驗(yàn)等，得到產(chǎn)生本發(fā)明溶栓酶的微生物菌株。
產(chǎn)生溶栓酶的方法任何能夠使產(chǎn)生本發(fā)明溶栓酶的微生物生長(zhǎng)并產(chǎn)生所說(shuō)的溶栓酶的培養(yǎng)基都可以用于生產(chǎn)本發(fā)明的溶栓酶。
例如，可以使用木糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、糊精作為碳源，使用無(wú)機(jī)的氮化合物(如硝酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二銨等)或有機(jī)氮化合物(如纖維蛋白、蛋白胨、玉米浸液、黃豆粉等)作為氮源，此外還要加入礦物質(zhì)，如磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽和鈣鹽。培養(yǎng)基的初始pH值為7.0-8.0。在本發(fā)明中，將培養(yǎng)物在需氧的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為60h到72h，即可得到最大產(chǎn)量的酶。
可以按照常規(guī)的分離和純化方法對(duì)通過(guò)以上過(guò)程獲得的培養(yǎng)物進(jìn)行純化。通過(guò)鹽析沉淀蛋白質(zhì)、噴霧干燥方法、凍干法等，將可溶性鹽加入到所得的上清液或?yàn)V液(所說(shuō)的上清液和濾液是通過(guò)離心或者過(guò)濾菌體細(xì)胞和培養(yǎng)基的固體剩余物而得到的)中，即可獲得了本發(fā)明的溶栓酶。而且可以結(jié)合使用其它的純化方法(如離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析)來(lái)進(jìn)一步純化所說(shuō)的酶。發(fā)明人把通過(guò)上述方式所獲得的本發(fā)明的溶栓酶命名為(DouchiFibrinolytic Enzyme，DFE)。通過(guò)下述方法測(cè)定溶栓酶的活性并測(cè)試它的體外溶栓效果。
1、纖溶活力的測(cè)定16.2mL 1％的瓊脂糖凝膠液于55℃時(shí)加入16.2mL 0.3％的纖維蛋白原溶液及1.3mL凝血酶(1BP/mL)，混勻倒入平板中，靜置冷卻。在平板上打孔點(diǎn)樣，于37℃保溫18h，測(cè)定水解圈的大小，計(jì)算其面積。以尿激酶作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、體外溶栓的測(cè)試加抗凝劑的新鮮人血經(jīng)3000rpm離心15min，所得的血漿作為貧凝血酶的血漿樣品。在冰浴中混合250μL血漿和750μL TNTC緩沖液(20mmol/L Tris.HCl，0.16mol/LNaCl，0.01％Tween-80，30mmol/L CaCl2，pH7.4)，迅速混勻后用注射器加入到Ep管底部，每管100μL。將小試管于37℃保溫30min，凝塊形成后，編號(hào)稱重，小心加入100μL待測(cè)樣品，封口并于37℃保溫12h，吸凈管中溶液，稱重，兩次重量之差即為血凝塊溶解得量。
豆豉溶栓酶的特性本發(fā)明所獲得的溶栓酶的物理和化學(xué)特性如下1.酰胺水解酶活性利用幾種人工合成的底物測(cè)定了DFE水解酰胺鍵活性的高低，結(jié)果見(jiàn)表1。DFE的最適底物是Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，它是枯草桿菌蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的最適底物。DFE水解Lys羧基端形成的肽鍵比Arg羧基端形成的肽鍵更容易一些，而對(duì)Bz-Val-Gly-Arg-NA和CBz-Gly-Pro-Arg-NA.水解能力很弱。因此，DFE可以被認(rèn)為是類似于枯草桿菌蛋白酶的一種蛋白酶，這與納豆桿菌產(chǎn)生的納豆激酶，枯草桿菌IMR-NK1和芽孢桿菌CK11-4產(chǎn)生的纖溶酶類似。
表1 豆豉溶栓酶對(duì)幾種人工合成底物的水解底物 水解活性Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 0.687H-D-Val-Leu-Lys-pNA 0.326Bz-Val-Gly-Arg-NA 0.029CBz-Gly-Pro-Arg-NA 0.015BANA0BTEE0.0112、最適pH值用不同pH值的緩沖液稀釋酶液，37℃下測(cè)定酶活性，結(jié)果如附圖1所示。在pH6.0-9.0的范圍內(nèi)，酶活隨pH升高而升高，隨后便隨pH升高而下降。因此最適pH值為8.0(見(jiàn)附圖1)。
3、最適反應(yīng)溫度以Tris-HCl緩沖液(pH9.0)稀釋酶液，在不同反應(yīng)溫度下測(cè)定酶活。結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為48℃，超過(guò)52℃酶活迅速降低(見(jiàn)附圖2)。
4、抑制劑的影響使用了7種不同的抑制劑，測(cè)定了它們對(duì)該溶栓酶的影響。以未加入抑制劑的樣品酶活作為100％，加入抑制劑后的樣品的酶活進(jìn)行換算后為剩余相對(duì)酶活，結(jié)果示于表2。
表2不同抑制劑對(duì)豆豉溶栓酶活性的影響抑制劑 濃度 剩余酶活(％)None0 100PMSF0.1mmol/L 0Benzamidine HCl 0.8mg/mL 43Leupeptin 0.25mg/mL 76.5Pepstatin A 0.25mg/mL 84.2Aproptin1000IU/mL 100EGTA10mmol/L 100EDTA10mmol/L 100結(jié)果表明，特異性抑制絲氨酸蛋白酶的抑制劑PMSF能完全抑制該溶栓酶的活性，表明該溶栓酶為一種絲氨酸蛋白酶。EDTA，EGTA和aproptin對(duì)該酶不抑制，表明該溶栓酶的活性不需要金屬離子的參與。
5、分子量和等電點(diǎn)的測(cè)定將純化得到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(12％膠濃度)，無(wú)論有無(wú)還原劑β-巰基乙醇，DFE均呈現(xiàn)一條帶(見(jiàn)附圖3)，說(shuō)明DFE為單鏈蛋白質(zhì)，分子量為28kD。等電聚焦電泳(見(jiàn)附圖4)顯示，DFE的等電點(diǎn)約為8.0。
6、溫度對(duì)豆豉溶栓酶的纖溶活性的影響將酶液分別置于40℃，50℃，60℃，70℃的水浴中保溫不同時(shí)間，然后檢測(cè)纖溶活性。結(jié)果見(jiàn)附圖5所示。豆豉溶栓酶在40℃保溫60min后，活力幾乎沒(méi)有喪失。在50℃，60℃保溫60min后，分別保留76％，10％的活性；在70℃保溫10min，完全喪失活性。該酶在37℃，pH6-10的緩沖液中存放1h，其酶活基本穩(wěn)定，而且反復(fù)凍融幾乎不影響酶活性。
7、溶解纖維蛋白的作用方式將纖維蛋白平板于85℃烘箱內(nèi)放置30min制成加熱平板，其中的血纖維蛋白溶酶原因加熱而失活。將樣品分別點(diǎn)在纖維蛋白平板和加熱平板上測(cè)定酶活，結(jié)果表明，在兩塊平板上的水解圈沒(méi)有顯著的差異，這說(shuō)明豆豉溶栓酶溶解纖維蛋白的作用方式為直接溶解纖維蛋白，不能激活纖溶酶原形成纖溶酶。


圖1、豆豉溶栓酶(DFE)的最適反應(yīng)pH值；
圖2、豆豉溶栓酶(DFE)最適反應(yīng)溫度；圖3、豆豉溶栓酶(DFE)的SDS-PAGE圖；圖4、豆豉溶栓酶(DFE)的等點(diǎn)聚焦電泳圖；圖5、溫度對(duì)豆豉溶栓酶(DFE)的纖溶活性的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、解淀粉芽孢桿菌UN-20-N-38的培養(yǎng)將菌株UN-20-N-38在含有纖維蛋白2.0％，蛋白胨0.5％，糊精2.0％，酵母膏0.15％，K2HPO4 0.4％，NaH2PO4 0.04％，CaCO30.5％的培養(yǎng)基中，于32℃搖瓶培養(yǎng)72h，將培養(yǎng)液10000rpm離心10min后取上清液。上清液的酶活為820U/mL。
實(shí)施例2、豆豉溶栓酶(DFE)的純化將在實(shí)施例1中獲得的培養(yǎng)物10000rpm離心10min后，取上清液，用30-65％飽和度的硫酸銨將此溶液進(jìn)行分段鹽析。將獲得的沉淀溶解于20mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.8)，并用此緩沖液透析。然后在pH7.8下，將此溶液加入到CM-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia公司)中，使用含0.02mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.8)洗脫。將酶活峰于10mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.4)中充分透析后，再上DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia公司)柱，使用含0.01mol/L NaCl的10mmol/LTris-HCl緩沖液(pH8.4)洗脫。將酶活峰中加入硫酸銨至終濃度為1mol/L，上Phenyl Sepharose 6 Fast Flow柱，洗脫出的活性峰透析后凍干。溶解后上Sepheadex G-50柱(Pharmacia公司)中，使用含0.15mol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.8)洗脫，收集酶活峰。對(duì)此組分進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，表明此酶為一條單一的帶。利用此法所獲得的豆豉溶栓酶純度提高11.5倍，回收率達(dá)到2.8％(表4)。
表4 解淀粉芽孢桿菌豆豉溶栓酶的分離純化總活力總蛋白 比活 純化倍數(shù)回收率步驟(U) (mg)(U/mg) (x-fold)(％)發(fā)酵上清液899470 2210407 1 10030～60％硫酸銨分段鹽析811322 715 11352.890.2CM陽(yáng)離子交換層析 318412 153 20815.135.4DEAE陰離子交換層析142116 44 32307.915.8疏水層析 8005321 38129.48.9Sephadex G-50凝膠過(guò)濾 251855.4 466411.5 2.8實(shí)施例3、豆豉溶栓酶(DFE)的體外溶栓實(shí)驗(yàn)將在實(shí)施例2中獲得的豆豉溶栓酶純品測(cè)定體外溶栓效果。加抗凝劑的新鮮人血經(jīng)3000rpm離心15min，所得得血漿作為貧凝血酶的血漿樣品。在冰浴中混合250μL血漿和750μL TNTC緩沖液(20mmol/L Tris.HCl，0.16mol/L NaCl，0.01％TweeN-80，30mmol/LCaCl2，pH7.4)，迅速混勻后加入到Ep管底部，每管100μL。將小試管于37℃保溫60min，凝塊形成后，編號(hào)稱重，小心加入100μL待測(cè)樣品，封口并于37℃保溫12h，吸凈管中溶液，稱重，兩次重量之差即為血凝塊溶解得量。
權(quán)利要求
1.一種溶栓酶，其特征是滿足下列(a)-(e)所規(guī)定的至少一個(gè)條件(a)室溫下，在10mmol/L的EDTA作用下，剩余活力達(dá)100％；(b)室溫下，在10mmol/L的EGTA作用下，剩余活力達(dá)100％；(c)室溫下，在1000IU/mL的Aproptin作用下，剩余酶活達(dá)100％；(d)室溫下，在0.1mmol/L的PMSF作用下，剩余活力達(dá)0；(e)室溫下，在0.8mg/mL的鹽酸苯甲醚作用下，剩余活力達(dá)43％；
2.按照權(quán)利要求1的溶栓酶，其特征是所說(shuō)的溶栓酶具有下列特性(1)作用此溶栓酶能水解蛋白質(zhì)和肽；(2)最適pH48℃下在pH9.0時(shí)酶活最高；(3)穩(wěn)定pH范圍37℃下在pH6.0-pH10.0范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定；(4)最適溫度該酶的最適反應(yīng)溫度為48℃；(5)分子量通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得的該酶的分子量為28,000道爾頓。
3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的溶栓酶，其特征是所說(shuō)的溶栓酶是由屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物產(chǎn)生的。
4.按照權(quán)利要求3的溶栓酶，其特征是所說(shuō)的產(chǎn)生溶栓酶的微生物是解淀粉芽孢桿菌UN-20-N-38(保藏號(hào)CGMCC NO.0625)。
5.一種生產(chǎn)溶栓酶的方法，其特征是從產(chǎn)生權(quán)利要求1-4所說(shuō)的溶栓酶產(chǎn)生菌解淀粉芽孢桿菌UN-20-N-38(保藏號(hào)CGMCC NO.0625)或其變種培養(yǎng)物中獲得所說(shuō)的蛋白酶。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其特征是所說(shuō)的微生物是解淀粉芽孢桿菌UN-20-N-38(保藏號(hào)CGMCC NO.0625)。
7.一種產(chǎn)生溶栓酶的微生物，其特征是它是解淀粉芽孢桿菌UN-20-N-38(保藏號(hào)CGMCCNO.0625)和它的突變體。
8.溶栓劑，其特征是其中包括權(quán)利要求1-4所規(guī)定的溶栓酶。
9.一種溶栓劑，其特征是其中包括權(quán)利要求1-4所規(guī)定的溶栓酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的芽孢桿菌屬未知菌株(保藏號(hào)CGMCC NO.0625)，通過(guò)培養(yǎng)所說(shuō)的菌株或其突變體所獲得的、具有下列特性的溶栓酶、此溶栓酶的產(chǎn)生方法。該酶能水解蛋白質(zhì)和肽；在48℃下，在pH9.0時(shí)的酶活最高；在37℃下，pH6.0－pH10.0范圍內(nèi)酶活力穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度48℃；分子量為28,000道爾頓。本發(fā)明的溶栓酶可以特異水解纖維蛋白，高效溶解血栓。本發(fā)明的豆豉溶栓酶經(jīng)處理后可制成溶血栓類藥品和預(yù)防心血管疾病的保健食品。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1473931SQ02133580
公開(kāi)日2004年2月11日 申請(qǐng)日期2002年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月5日
發(fā)明者張義正, 彭勇, 李珉, 王海燕, 童英 申請(qǐng)人:四川大學(xué)