專(zhuān)利名稱(chēng)：神經(jīng)毒性寡聚體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療或減輕阿爾茨海默氏病和其它與異常蛋白聚集有關(guān)的病癥的方法和組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于阿爾茨海默氏病、帕金森病和內(nèi)障的免疫療法的方法和組合物。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病(AD)特征性的淀粉樣病變主要由淀粉狀蛋白β(Aβ)組成(Glenner & Wong，1984)，這是一種在生物液體中發(fā)現(xiàn)的通?？扇艿暮?9-43個(gè)氨基酸的蛋白。淀粉狀蛋白形成與該疾病的發(fā)病機(jī)理相關(guān)聯(lián)，因此鑒定導(dǎo)致Aβ分解代謝受到抑制及其在新皮質(zhì)中蓄積的神經(jīng)化學(xué)改變會(huì)對(duì)AD的發(fā)病機(jī)理提供重要的線索。
盡管與AD相關(guān)的基礎(chǔ)病理學(xué)、遺傳易感性和生物學(xué)正變得越來(lái)越清楚，開(kāi)發(fā)預(yù)防或治愈該疾病的有效藥物的合理的化學(xué)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)仍難以捉摸。盡管AD的遺傳學(xué)表明Aβ的代謝與該疾病的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，如上所述，迄今為止治療AD的藥物集中在“認(rèn)知增強(qiáng)劑”，其并不針對(duì)潛在的疾病過(guò)程。這些藥物只獲得了有限的成功。
在AD中擾亂的神經(jīng)化學(xué)環(huán)境的性質(zhì)可從淀粉狀蛋白Aβ的翻譯后修飾部分地推斷出。從生物體系提取的Aβ通常在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上作為表觀～4kD的單體遷移(SDS-PAGE；(Shoji等，1992))；然而，從AD患者死后腦標(biāo)本中提取的Aβ在SDS-PAGE上作為SDS-、尿素-和甲酸-抗性寡聚體遷移(Masters等，1985；Roher等，1996；Cherny等，1999)。
對(duì)這些從神經(jīng)炎斑和血管淀粉狀蛋白提取的SDS-抗性寡聚體進(jìn)行的矩陣協(xié)助的激光解吸離子化-質(zhì)譜分析(MALDI-MS)表明存在共價(jià)交聯(lián)的二聚和三聚Aβ種類(lèi)(Roher等，1996)。
合成的Aβ1-40和Aβ1-42通常在SDS-PAGE上作為表觀單體遷移，但經(jīng)溫育形成更高表觀分子量的種類(lèi)(Burdick等，1992)。該過(guò)程通過(guò)暴露于氧化體系而加速(Dyrks等，1992；Atwood等，1997)。
已提出酪氨酸交聯(lián)作為體內(nèi)Aβ寡聚反應(yīng)的一種機(jī)制，因?yàn)樵诤铣傻娜薃β中的酪氨酸殘基可通過(guò)過(guò)氧化物酶催化的氧化體系而交聯(lián)(Galeazzi等，1999)。作為大鼠Aβ，與人Aβ不同，缺乏酪氨酸殘基(Atwood等，1997)，因此它對(duì)金屬催化的氧化寡聚反應(yīng)耐受，而這可能解釋了在這些動(dòng)物中淀粉狀蛋白沉積的罕見(jiàn)(Vaughan和Peters，1991)。
蛋白中的酪氨酸交聯(lián)是氧化應(yīng)激的敏感標(biāo)志。在單一酪氨酰殘基和/或二酪氨酰殘基之間形成共價(jià)碳-碳橋或碳-氧橋，產(chǎn)生多種穩(wěn)定的發(fā)熒光的反應(yīng)產(chǎn)物(Gross和Sizer，1959；Amado等，1984；Jacob等，1996)。游離酪氨酰基團(tuán)的主要反應(yīng)產(chǎn)物是強(qiáng)熒光的氨基酸3，3’-二酪氨酸(DT)、3，3’，3’-三酪氨酸(TT)和pulcherosine(P)，以及無(wú)熒光的異二酪氨酸(iso-DT)(Gross和Sizer，1959；Amado等，1984；Jacob等，1996；Heinecke等，1993)。與正常腦的相同區(qū)域相比，DT和3-硝基酪氨酸水平在AD患者腦的海馬和新皮質(zhì)區(qū)域中升高，并且在AD患者的腦室腦脊液中也升高(Hensley等，1998)。
酪氨酸交聯(lián)在其它神經(jīng)變性疾病如帕金森病和其它α-synucleinfibrils沉積的病癥中可能也是重要的。這些疾病和病癥包括帕金森病本身、伴雷維小體形成的癡呆、多系統(tǒng)萎縮、哈-施病和彌漫性雷維小體病。重組α-synuclein接觸硝化劑導(dǎo)致酪氨酸殘基的硝化以及酪氨酸的氧化以形成DT；這導(dǎo)致α-synuclein的交聯(lián)以形成穩(wěn)定的聚集物(Souza等，2000)。同一作者還發(fā)現(xiàn)針對(duì)硝化的synuclein產(chǎn)生的單克隆抗體特異性結(jié)合在多種synucleinopathies中的雷維小體和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含物(Duda等，關(guān)于制備參見(jiàn)Souza等，2000)。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)源自人淀粉狀蛋白的Aβ含有酪氨酸交聯(lián)，并同時(shí)包括二酪氨酸和三酪氨酸交聯(lián)的種類(lèi)。這些交聯(lián)可以在體外復(fù)制，例如通過(guò)將合成的人Aβ與過(guò)氧化物酶和H2O2一起溫育，或與H2O2在銅離子的存在下一起溫育。這些修飾是耐受蛋白酶的，因而我們提出在AD中由Aβ與H2O2和過(guò)氧化物酶或銅離子的異常相互作用引起的酪氨酸交聯(lián)促成神經(jīng)毒性Aβ寡聚體的形成，以及Aβ的沉積。因此可以使用針對(duì)低分子量酪氨酸交聯(lián)的化合物而不是整個(gè)Aβ的免疫來(lái)治療或預(yù)防AD，而沒(méi)有引發(fā)自身免疫并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，后者可能由用完整Aβ或其大片段進(jìn)行免疫而誘導(dǎo)。通過(guò)將免疫療法的目標(biāo)靶限制到所述分子的異常片段或部分，可以將對(duì)該分子的正常功能造成的不良干擾降至最低，同時(shí)提供針對(duì)異常分子的積極治療。應(yīng)理解可以使用主動(dòng)或被動(dòng)免疫。
引起蛋白通過(guò)酪氨酸發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的氧化過(guò)程還與其它特征在于特定蛋白病理性聚集和蓄積的病癥有關(guān)。因此認(rèn)為這些病癥也可用本發(fā)明的方法預(yù)防或治療。
應(yīng)明確盡管在此參考了多篇現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，這種引用并不表示承認(rèn)這些文獻(xiàn)中的任何一篇構(gòu)成澳大利亞或任何其它國(guó)家中的部分公知常識(shí)。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，其中所述病癥特征在于與氧化損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨酸交聯(lián)，所述方法包括以下步驟用免疫有效劑量的一種或多種選自以下的化合物二酪氨酸、三酪氨酸、四酪氨酸(也稱(chēng)為pulcherosine)、氧化的酪氨酸正源物如鄰-酪氨酸和間-酪氨酸、硝基酪氨酸和含有酪氨酸交聯(lián)的肽，任選還包含與所述化合物絡(luò)合的銅離子，對(duì)需要治療的對(duì)象進(jìn)行免疫。這些化合物在此統(tǒng)稱(chēng)為“酪氨酸交聯(lián)的化合物”。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可所述化合物的免疫有效劑量是會(huì)引發(fā)產(chǎn)生能與酪氨酸交聯(lián)的化合物結(jié)合的抗體的劑量。該技術(shù)人員也能確定特定的酪氨酸交聯(lián)的化合物是否引起抗體產(chǎn)生。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，病理性聚集形式的特定蛋白包含酪氨酸交聯(lián)的部分。在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述酪氨酸交聯(lián)的化合物是一種肽，它是病理性聚集形式的特定蛋白的免疫原性部分，所述肽包含與交聯(lián)的酪氨酸的上游和下游殘基相連接的交聯(lián)的酪氨酸部分。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述酪氨酸交聯(lián)的化合物是二酪氨酸交聯(lián)的化合物。
每當(dāng)量二酪氨酸可以使用多至3當(dāng)量的銅，條件是施用的每一劑含不超過(guò)1μM的銅。
用于免疫的化合物任選與載體蛋白偶聯(lián)，所述載體蛋白本身具有免疫原性，如破傷風(fēng)類(lèi)毒素、匙孔血藍(lán)蛋白或白蛋白。還任選所述化合物可以與佐劑一起施用，如明礬、單磷酰脂、胞壁酰肽、諸如QS21的iscom之類(lèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚知道合適的載體和佐劑。
使用含有酪氨酸交聯(lián)的肽時(shí)，優(yōu)選與病癥相關(guān)的特定蛋白的最小的且具有免疫原性的部分，其由與交聯(lián)的酪氨酸的上游和下游殘基相連的二酪氨酸部分構(gòu)成。當(dāng)所述病癥是阿爾茨海默氏病時(shí)，優(yōu)選所述包含酪氨酸交聯(lián)的肽來(lái)源于在人Aβ1-40或Aβ1-42的氨基酸序列中酪氨酸10周?chē)男蛄小?br> 在本發(fā)明的所有方面，當(dāng)使用含有酪氨酸交聯(lián)的肽時(shí)，優(yōu)選所述酪氨酸交聯(lián)可通過(guò)在銅離子存在下的氧化而得到。
更優(yōu)選所述肽還包含與二酪氨酸絡(luò)合的銅離子。
可以通過(guò)任何便利的途徑進(jìn)行免疫，包括皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，涂敷至粘膜表面，或局部應(yīng)用，例如藥膏。
所述化合物的給藥劑量會(huì)取決于以下因素而不同個(gè)體化合物的性質(zhì)、患者的體重、年齡和一般健康狀況以及是否使用佐劑。預(yù)計(jì)劑量將在0.1μg至200mgDT的范圍內(nèi)，更優(yōu)選1-50mg，最優(yōu)選10-20mg。盡管可以給予單次免疫，優(yōu)選進(jìn)行多次免疫，例如一周一次進(jìn)行1-12個(gè)月，更優(yōu)選進(jìn)行4個(gè)月。在6-12個(gè)月之后可以給予加強(qiáng)系列。通過(guò)測(cè)定DT抗體監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答；可以采用任何便利的測(cè)定體系，如ELISA。
在任選的技術(shù)方案中，所述方法還包括以下的額外步驟鑒定在病理性聚集的特定蛋白中酪氨酸交聯(lián)的占優(yōu)勢(shì)形式；并合成一種或多種包含一種或多種占優(yōu)勢(shì)形式的酪氨酸交聯(lián)的酪氨酸交聯(lián)的化合物。
在本發(fā)明的這一方面的或選形式中，免疫可以是被動(dòng)的。因而本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，其中所述病癥特征在于與氧化性損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積，并且其中所述病理性聚集形式的特定蛋白包含酪氨酸交聯(lián)，所述方法包括向需要這種治療的對(duì)象施用有效量的抗體或抗體片段的步驟，所述抗體或抗體片段是針對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物產(chǎn)生的，所述化合物是病理性聚集形式的特定蛋白的免疫原性部分并且包含酪氨酸交聯(lián)，并且所述抗體或抗體片段能特異性結(jié)合該病理性聚集形式的特定蛋白。
所述抗體可以是多克隆或單克隆的。當(dāng)抗體是多克隆抗體時(shí)，優(yōu)選其來(lái)源于人，并可以例如來(lái)源于正常健康個(gè)體的混合人血清。或者可以使用來(lái)自對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物進(jìn)行過(guò)超免疫的個(gè)體的血清。超免疫方案在本領(lǐng)域中是已知的。所述抗體可以通過(guò)任何便利的方法從血清中分離；在本領(lǐng)域中已知多種合適的方法。當(dāng)所述抗體是單克隆抗體時(shí)，優(yōu)選將其人源化。很好理解抗體的抗原結(jié)合片段，如F(ab’)、F(ab’)2、Fv或單克隆scFv在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。產(chǎn)生和純化多克隆抗體和單克隆抗體的方法以及重組產(chǎn)生人源化單克隆抗體或scFv片段的方法，在本領(lǐng)域中廣為人知。參見(jiàn)例如Harlow和Lane(1988)；WO90/07861；和WO92/01047。人源化單克隆抗體也可以在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生；參見(jiàn)例如WO91/10741和WO93/12227。
優(yōu)選所述抗體特異性地與病理性聚集形式的特定蛋白發(fā)生反應(yīng)，而不與未聚集形式的該蛋白發(fā)生顯著的反應(yīng)。
在主動(dòng)或被動(dòng)免疫之后，監(jiān)測(cè)患者的臨床改善情況，這可以在短至1周之內(nèi)開(kāi)始，但更通常可以在6周時(shí)觀察到，并可長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月。采用在監(jiān)測(cè)患有相關(guān)病癥患者中所用的常規(guī)臨床指征。參與的臨床醫(yī)生會(huì)知道最適合采用的測(cè)試。
當(dāng)治療是預(yù)防性的時(shí)，監(jiān)測(cè)患者發(fā)生病癥的征象?；颊呖梢允怯捎谶z傳連鎖而具有患病危險(xiǎn)，例如在家族性阿爾茨海默氏病或亨廷頓舞蹈病中。
因此，本發(fā)明在第二方面提供了用于本發(fā)明方法中的預(yù)防性或治療性組合物，其包含酪氨酸交聯(lián)的化合物，以及可藥用載體，并任選還包含佐劑，和/或與所述化合物絡(luò)合的銅離子。
在第二方面的或選方案中，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明的被動(dòng)免疫方法中的預(yù)防性或治療性組合物，其包含針對(duì)如上所定義的酪氨酸交聯(lián)的化合物的抗體或其片段，所述抗體能結(jié)合酪氨酸交聯(lián)的化合物，以及可藥用載體。
在第三方面，本發(fā)明提供了診斷病癥的方法，其中所述病癥特征在于與氧化性損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨酸交聯(lián)，所述方法包括以下步驟測(cè)定來(lái)自懷疑患有所述病癥的對(duì)象的生物液體樣本中是否存在選自以下組的化合物二酪氨酸、三酪氨酸、四酪氨酸、氧化的酪氨酸正源物如鄰-酪氨酸和間-酪氨酸、硝基酪氨酸和含有酪氨酸交聯(lián)的肽。
可選擇地，所述方法包括以下步驟測(cè)定來(lái)自懷疑患有所述病癥的對(duì)象的生物液體中是否存在針對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物的抗體。
優(yōu)選所述生物液體選自血液、血漿、血清、腦脊液、尿和唾液。優(yōu)選所述化合物是二酪氨酸。
所述測(cè)定可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行，但最為方便地通過(guò)ELISA測(cè)定進(jìn)行，使用針對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物的抗體。這種測(cè)定可以反過(guò)來(lái)用于檢測(cè)針對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物的抗體。優(yōu)選所述抗體是單克隆抗體，或單克隆抗體的混合物?；蛘咚鰷y(cè)定可以通過(guò)在325nm的激發(fā)波長(zhǎng)和350-500nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定熒光來(lái)進(jìn)行。
在本發(fā)明的所有這三方面，優(yōu)選所述病癥選自阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、內(nèi)障、帕金森病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、亨廷頓舞蹈病、伴有雷維小體形成的癡呆、多系統(tǒng)萎縮、哈-施病和彌漫性雷維小體病或內(nèi)障。
更優(yōu)選所述病癥是阿爾茨海默氏病或帕金森病。
為了本說(shuō)明書(shū)的目的，應(yīng)清楚理解詞語(yǔ)“包括”指“包括但不限于”，詞語(yǔ)“包含”具有相應(yīng)的含義。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示了人Aβ，而不是大鼠Aβ，在過(guò)氧化物酶催化的氧化之后發(fā)生熒光和SDS-抗性。將人Aβ1-40、人Aβ1-42或大鼠Aβ1-40(50μM)置于50mM硼酸(pH9.5)±H2O2(1mM)和過(guò)氧化物酶(7.5μg/ml)中37℃溫育1天。
(A)熒光光譜(λ激發(fā)325，λ發(fā)射350-500)；(B)在SDS-PAGE上的遷移(通過(guò)使用4G8的蛋白質(zhì)印跡)；(C)將Aβ1-42(10nM)與H2O2(1μM)和過(guò)氧化物酶(7.5μg/ml)在磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)中37℃溫育5天。通過(guò)SDSPAGE和蛋白質(zhì)印跡(4G8)將產(chǎn)物(泳道2)與在相同條件下但缺乏H2O2/過(guò)氧化物酶情況下溫育的肽(泳道1)相比較。
圖2顯示了源于人淀粉狀蛋白的Aβ含有酪氨酸交聯(lián)的寡聚體。將源于人淀粉狀蛋白的Aβ(20μM)(Roher等，1996)用熒光光譜分析，與純DT標(biāo)準(zhǔn)相比(λ激發(fā)325，λ發(fā)射350-500)(A)，以及蛋白質(zhì)印跡(4G8)分析(B)。
圖3顯示了二酪氨酸和三酪氨酸交聯(lián)存在于源自人淀粉狀蛋白的Aβ中，并且它們結(jié)合銅。
(A)將人淀粉狀蛋白純化、水解并在層析分離之后測(cè)定質(zhì)譜。顯示了反映對(duì)在不同層析保留時(shí)間(RT)洗脫的相同樣本的分析的兩次獨(dú)立的掃描。
(B)在增加濃度的CuSO4或NaCl存在下，純化的DT在280nm和315nm處的吸光度。
圖4顯示了可溶性Aβ高親和力地結(jié)合銅。
(A)粗可溶性提取物(1)和來(lái)自銅螯合Sepharose柱的pH1洗脫物(2)的銀染。
(B)用WO2、G211和G210探測(cè)的pH1洗脫物的蛋白質(zhì)印跡。
圖5顯示了LC-MS分析的結(jié)果，證實(shí)了人Aβ結(jié)合銅。
(A)粗制可溶性提取物和IMAC純化的可溶性提取物的LC-MS分析。
(B)Aβ1-42和結(jié)合兩個(gè)銅原子的Aβ1-40的質(zhì)譜。
IMAC和LC-MS數(shù)據(jù)證實(shí)源自腦的Aβ可結(jié)合銅。
圖6顯示在蛋白質(zhì)印跡中檢測(cè)交聯(lián)的Aβ1-40和Aβ1-42中的二酪氨酸。
還比較了創(chuàng)建二酪氨酸鍵合的兩種技術(shù)。
上面的蛋白質(zhì)印跡(A)使用WO2抗體證實(shí)Aβ的存在。下面的印跡(B)證實(shí)了由單克隆抗體IC3識(shí)別的二酪氨酸鍵合的存在。該抗體是針對(duì)用硼酸/H2O2/辣根過(guò)氧化物酶制備的一種形式的二酪氨酸而產(chǎn)生的。
圖7顯示作為潛在的免疫原產(chǎn)生的酪氨酸交聯(lián)形式的實(shí)例。這些結(jié)構(gòu)含有酪氨酸交聯(lián)并且羧基和氨基末端乙?；阅M額外氨基酸殘基的存在，所述額外氨基酸殘基正常情況下會(huì)存在于酪氨酸交聯(lián)的肽中酪氨酸交聯(lián)的部分的任一側(cè)。設(shè)計(jì)多拷貝二酪氨酸抗原的呈遞以提高所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。
圖8顯示在蛋白質(zhì)印跡中檢測(cè)多種酪氨酸交聯(lián)的種類(lèi)中的二酪氨酸鍵。含DT的種類(lèi)包括連接至BSA的二酪氨酸交聯(lián)的Aβ9-16二聚體或三聚體，和連接至BSA或KLH載體蛋白的多種聚-DT種類(lèi)。上面的蛋白質(zhì)印跡(A)證實(shí)了樣本結(jié)合針對(duì)DT產(chǎn)生的多克隆兔抗血清的能力，其中DT是使用硼酸/H2O2/過(guò)氧化物酶技術(shù)制備的并使用戊二醛連接至KLH(在實(shí)施例7中討論)。下面的蛋白質(zhì)印跡(B)證實(shí)由單克隆抗體IC3識(shí)別的二酪氨酸鍵合的存在。該抗體是針對(duì)也是用硼酸/H2O2/過(guò)氧化物酶技術(shù)制備的一種形式的二酪氨酸而產(chǎn)生的。
發(fā)明詳述本發(fā)明現(xiàn)在將通過(guò)僅參照以下非限定性實(shí)施例和附圖的方式進(jìn)行詳細(xì)描述。
在此使用的縮寫(xiě)如下AD阿爾茨海默氏病DT3，3’-二酪氨酸TT3，3’3’-三酪氨酸P pulcherosineiso-DT異二酪氨酸試驗(yàn)程序試劑和Aβ肽制備如先前所述從患AD的人腦的淀粉樣斑中提取寡聚Aβ(Roher等，1996)。將純化的淀粉狀蛋白Aβ溶于甲酸，然后在使用之前立即用更換5次的100mM的碳酸氫銨(pH7.5)透析。
由W.M.Keck Foundation Biotechnology ResourceLaboratory(Yale University，New Haven，CT)進(jìn)行人Aβ1-40、Aβ1-42和大鼠Aβ1-40的合成、純化并通過(guò)HPLC分析、氨基酸分析和質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行表征，使用由Quality Control Biochemicals，Inc.(Hopkinton，MA)合成的肽進(jìn)行確證研究。
各肽由HPLC鑒定為單一峰。將合成的Aβ肽溶于雙重去離子水中，濃度為0.5-1.0mg/ml，進(jìn)行超聲處理3分鐘，然后于10 000g離心20分鐘，在試驗(yàn)當(dāng)天使用上清(Aβ原液)。如前所述(Atwood等，1998)通過(guò)在214nm分光光度分析吸光度或通過(guò)Micro BCA蛋白測(cè)定(Pierce，Rockford，IL)確定Aβ肽原液的濃度。
使用之前，將所有的緩沖液和金屬離子的原液通過(guò)0.22μm濾器(Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)過(guò)濾以除去顆粒物質(zhì)。所有其它的試劑均為分析級(jí)或更純。辣根過(guò)氧化物酶購(gòu)自SigmaChemical Co.(St.Louis，MO)。
二酪氨酸和酪氨酸交聯(lián)的Aβ的制備和熒光分析通過(guò)將溶于硼酸緩沖液(50mM，pH9.5)中的L-酪氨酸(1mg/ml)與H2O2(5mM)和辣根過(guò)氧化物酶(7.5μg/ml)在37℃溫育1天而產(chǎn)生DT標(biāo)準(zhǔn)(Amado等，1984)。
通過(guò)將在硼酸鹽緩沖液(50mM，pH9.5)中的Aβ(50μM)與H2O2(1mM)和過(guò)氧化物酶(7.5μg/ml)在37℃溫育5天而產(chǎn)生交聯(lián)的Aβ。在接近生理?xiàng)l件下研究該反應(yīng)的一項(xiàng)單獨(dú)的試驗(yàn)中，將Aβ1- 42在磷酸緩沖鹽水(PBS，pH7.4)中稀釋至10nM，并與1μM H2O2和過(guò)氧化物酶(7.5μg/ml)在37℃溫育5天。溫育之后，將樣本凍干以使肽的濃度范圍可通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)(見(jiàn)下)。
反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)快速相液相層析(FPLC)分離。在層析之前先通過(guò)在0℃離心而將過(guò)量的硼酸從樣本中沉淀出來(lái)。然后通過(guò)加入0.25％TFA將樣本酸化，并通過(guò)過(guò)濾(0.22μm孔徑)除去剩余的不溶物質(zhì)。將樣本裝填到3ml Resource RPC柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，并用含0.1％TFA的水洗柱。將結(jié)合的種類(lèi)用0-100％線性梯度的含0.1％TFA的乙腈以1ml/min在45分鐘內(nèi)洗脫，并以0.5ml餾分收集。將餾分干燥、重組于水中并通過(guò)熒光(激發(fā)330nm；發(fā)射400nm)和UV吸光度(284nm)測(cè)定二酪氨酸。峰餾分進(jìn)一步通過(guò)質(zhì)譜分析表征，并使用消光系數(shù)對(duì)二酪氨酸進(jìn)行定量(E315nm＝8380M-1cm-1；Malencik等，1996)。
使用Hitachi F-4500分光熒光計(jì)分析溶液中熒光化合物的存在。DT、TT和P具有特征性的發(fā)射光譜(λ激發(fā)325，λ發(fā)射350-500)，這與酪氨酸和色氨酸完全不同，酪氨酸和色氨酸在這些波長(zhǎng)不發(fā)出熒光。在該發(fā)射范圍內(nèi)隨二酪氨酸濃度在0-50μM增加，熒光呈線性增加。
MALDI-TOF質(zhì)譜分析將SDS抗性的、寡聚的、源自人淀粉狀蛋白的Aβ的樣本用6NHCl在105℃真空下水解48小時(shí)。此后，在Harvard UniversityMass Spectrometry Facility通過(guò)液相色譜MALDI-TOF質(zhì)譜(LC-MS)分析樣本。
使用LCT質(zhì)譜儀(Micromass Inc，Beverly MA)與連到C18反相柱(2.1mm×250mm)的HP1100液相色譜相連接而得到質(zhì)譜。使用緩沖液A(水-0.1％甲酸(FA))和緩沖液B(乙腈-0.1％FA)的梯度進(jìn)行LC-MS。所述梯度從2％B(0-2分鐘)到100％B(20-23分鐘)。
蛋白質(zhì)印跡分析將等份的各反應(yīng)(2ng肽)收集到15μl樣本緩沖液(含4％SDS，5％β-巰基乙醇)中并加熱至95℃(5分鐘)。將樣本在PAGE(Tricine膠，10-20％；Novex，San Diego，CA)上電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF薄膜(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，用戊二醛(1％，v/v)固定，用乳(10％，w/v)封閉，然后用抗-Aβ單克隆抗體4G8(Senetek，Maryland Heights，MI)在4℃探測(cè)過(guò)夜。在一項(xiàng)試驗(yàn)中使用單克隆抗體WO2(表位殘基5-8)、G211(表位殘基35-42)或G210(表位殘基33-40)。然后將印跡與抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶(HRP)綴合物(Pierce，Rockford，IL)于室溫溫育2小時(shí)，并用ECL試劑(Amersham，Little Chalfont，UK)或Supersignal Ultra(Pierce，Rockford，IL)顯象。使用Fluoro-SImage Analysis System(Bio-Rad，Hercules，CA)捕獲化學(xué)發(fā)光信號(hào)，并用Multi-Analyst Software(Bio-Rad，Hercules，CA)分析電子圖象。分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物購(gòu)自Amersham(ArlingtonHeights，IL)。
實(shí)施例1過(guò)氧化物酶催化的Aβ聚合伴隨著酪氨酸交聯(lián)的形成我們最初測(cè)試了過(guò)氧化物酶催化的氧化條件是否可以促進(jìn)Aβ聚合，通過(guò)測(cè)定與或不與H2O2和過(guò)氧化物酶溫育1天的人Aβ1-40、人Aβ1- 42和大鼠Aβ1-40(50μM)的熒光。對(duì)這些樣本的熒光計(jì)分析指示在含Aβ1-40和Aβ1-42的樣本中熒光顯著增加，如圖1A所示。這些結(jié)果與先前關(guān)于合成的人Aβ所報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似，后者在高得多的肽濃度1.25mM下實(shí)現(xiàn)(Galeazzi等，1999)。與人序列Aβ肽的行為相比，與H2O2和過(guò)氧化物酶溫育后沒(méi)有觀察到大鼠Aβ1-40熒光信號(hào)的增加，亦如圖1A所示。這提示熒光信號(hào)是對(duì)Aβ的酪氨酸氧化產(chǎn)物特異性的，因?yàn)榇笫驛β缺乏酪氨酸(Shivers等，1988)。
為了證實(shí)這些反應(yīng)導(dǎo)致Aβ聚合，將如上所述處理的Aβ1-40和Aβ1-42在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析。與未經(jīng)處理的Aβ相比，與H2O2和過(guò)氧化物酶一起溫育的人合成Aβ1-40和Aβ1-42均顯示出表觀SDS抗性聚合物的顯著增加，如圖1B所示。當(dāng)Aβ與單獨(dú)H2O2或過(guò)氧化物酶溫育時(shí)，既沒(méi)有觀察到聚合也沒(méi)有觀察到熒光增加。
實(shí)施例2聚合在生理?xiàng)l件下發(fā)生為了確定H2O2/過(guò)氧化物酶誘導(dǎo)的合成Aβ的聚合是否在接近生理的條件下發(fā)生，我們還將10nM的Aβ1-42與1μM H2O2和過(guò)氧化物酶(7.5μg/ml)在PBS(pH7.4)中溫育。我們觀察到肽的SDS抗性被再次誘導(dǎo)，如圖1C所示；然而，產(chǎn)生的寡聚體的表觀分子量比通過(guò)使用更高濃度底物所產(chǎn)生的要低，如圖1B所示。在這些條件下表觀Aβ聚合物在SDS-PAGE上的遷移提示形成了二聚體(8kD)、三聚體(13kD)和四聚體(17kD)。
分別如圖2A和圖2B所示，對(duì)從患AD的死后腦組織純化的Aβ的熒光分析顯示了酪氨酸交聯(lián)的種類(lèi)的特征性分光熒光譜模式；該純化的蛋白在SDS-PAGE上作為表觀的寡聚體遷移，如先前所述(Roher等，1996)。
實(shí)施例3寡聚體的酪氨酸交聯(lián)為了證實(shí)表觀寡聚的源自人淀粉狀蛋白的Aβ是酪氨酸交聯(lián)的，將樣本進(jìn)行水解，然后通過(guò)MALDITOF-MS分析。該分析，如圖3A所示，指示相當(dāng)于361Da(m/z 361，代表M+H)的峰，從而證實(shí)了樣本中DT或iso-DT的存在。還檢測(cè)到相當(dāng)于540Da的較小峰，與TT或P的存在一致。其它顯著的峰在247、263、307、309和538Da檢測(cè)到；這些可能代表對(duì)Aβ氨基酸的其它修飾，如羰基化(Atwood，1999)和其它氨基酸交聯(lián)。
在423和425Da(比值3∶2)還檢測(cè)到水解人Aβ所得到的更大量片段，提示Cu結(jié)合到DT或iso-DT(Cu質(zhì)量＝63 & 65Da，≈2∶1天然同位素豐度)。
實(shí)施例4二酪氨酸對(duì)銅的結(jié)合為了測(cè)試在423和425的峰是否會(huì)是由于DT結(jié)合Cu所致，我們通過(guò)光譜分析檢查了Cu2+與DT的相互作用。將二酪氨酸(50μM)溶于磷酸緩沖液(50mM，pH7.4)中，并在SPECTRAmax Plus(Molecular Devices)上測(cè)量吸收光譜(200-1000nm)。波谷(280nm)和波峰(315nm)明顯。然后將二酪氨酸與遞增濃度的CuNO3(0-200μM)或NaCl(0-200μM)一起溫育，并監(jiān)測(cè)在280nm和315nm處吸光度的變化。
我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)DT與遞增濃度的Cu2+一起溫育時(shí)，它在315nm處的特征性吸收峰消失，而在280nm出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰?；瘜W(xué)計(jì)量比在1∶1-2∶1(Cu∶DT)之間時(shí)光譜變化達(dá)到平臺(tái)，然后在3∶1飽和，提示DT可結(jié)合多至3當(dāng)量的Cu。二氯化物結(jié)合也會(huì)產(chǎn)生類(lèi)似的p+2質(zhì)量單位增加(Cl質(zhì)量＝35和37Da，≈3∶1天然同位素豐度)，但將DT與NaCl共溫育不誘導(dǎo)光譜吸收改變。這些結(jié)果如圖3B所示。
實(shí)施例5Aβ的二酪氨酸化增加其銅結(jié)合能力我們預(yù)測(cè)一部分在人腦可溶性級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的Aβ由于二酪氨酸化會(huì)顯示出增強(qiáng)的銅結(jié)合性能。為了測(cè)試這是否是真實(shí)的情況，我們將患AD腦的一部分可溶性提取物通過(guò)帶有銅的螯合Sepharose柱。將來(lái)自冷凍AD腦和對(duì)照腦(AC)的0.5g大腦皮層灰質(zhì)在3ml冰冷的磷酸緩沖鹽水(PBS)中勻漿化。將樣本于175 000g離心1小時(shí)，并保留上清用于分析Aβ含量。將10ml上清裝填到帶有1mg/ml硫酸銅的螯合Sepharose柱上。使用含0.5M NaCl的0.05M乙酸鈉緩沖液(pH8)洗出未結(jié)合的蛋白。以分步梯度的增加酸度洗脫結(jié)合的物質(zhì)，使用pH5.5、3和1的連續(xù)步驟，然后用50mM EDTA洗以解吸柱。使用2kDa的大小截?cái)嘀祵⑾疵撐镞M(jìn)行徹底透析以除去游離的銅和鹽，凍干并進(jìn)行SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡和LC-MS分析。在QuatroII triple quadrupole(Micromass)上獲得ESI質(zhì)譜(+ve離子)。以連續(xù)模式每8秒從650-1650m/z收集質(zhì)譜。將樣本引入在5mM乙酸銨緩沖液中的離子源。狹線印跡分析顯示在pH3洗脫物中無(wú)WO2免疫反應(yīng)性，并在pH1再進(jìn)行一次洗脫。在該pH檢測(cè)到強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，并且經(jīng)透析的樣本呈藍(lán)色。
蛋白質(zhì)印跡分析顯示在pH1和EDTA餾分中存在Aβ；這提示與銅的非常高親和力的結(jié)合，因?yàn)閜H3通常足以從這種柱上洗脫大多數(shù)的銅結(jié)合蛋白。在這些餾分中的物質(zhì)顯示出高度富含寡聚Aβ。這些結(jié)果如圖4所示。
銀染(圖4A)證實(shí)了實(shí)質(zhì)性的基于金屬親和力的純化(泳道1vs.2)，而蛋白質(zhì)印跡分析展示了似乎相當(dāng)于多個(gè)單體Aβ的免疫反應(yīng)性條帶(圖4B)。圖5顯示來(lái)自AD腦組織的粗制的和IMAC-純化的上清提取物的LC(上)和MS(下)曲線。值得注意的是IMAC純化的樣本的LC和MS譜實(shí)質(zhì)上更為清楚。對(duì)IMAC純化的樣本的LC-MS分析產(chǎn)生相當(dāng)于Aβ種類(lèi)的信號(hào)，包括帶有2個(gè)銅原子的Aβ1-40，如在銅存在或缺失情況下對(duì)合成肽的LC-MS分析所證實(shí)的。在代表性質(zhì)譜上突出的峰群表明質(zhì)量/電荷比與母離子一致，其質(zhì)量為4515.1(Aβ1-42)和4457.9(Aβ1-40+2Cu)。
為了證實(shí)該強(qiáng)結(jié)合銅的Aβ餾分是否含有DT，我們采用了針對(duì)使用H2O2和辣根過(guò)氧化物酶的方法產(chǎn)生的DT所產(chǎn)生的單克隆抗體IC3(Kato等，(1998)；這是Himeji Institute of Technology，Himeji，Japan的Dr.Yoji Kato贈(zèng)送的禮物)。我們發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)印跡上觀察到的更高分子量的Aβ寡聚體與對(duì)DT的正染色定位在共同區(qū)域。
含Aβ的餾分還展示出存在二酪氨酸部分特征性的熒光發(fā)射光譜。該發(fā)射通過(guò)加入銅而終止，其方式是對(duì)由于該修飾引起銅結(jié)合增強(qiáng)所預(yù)測(cè)到的。
實(shí)施例6對(duì)二酪氨酸化的Aβ的進(jìn)一步表征將富含DT的Aβ從人腦的可溶性級(jí)分中分離出來(lái)，其量足以進(jìn)行進(jìn)一步表征。這些研究包括在組織培養(yǎng)中的毒性研究、氨基酸測(cè)序、金屬結(jié)合研究和測(cè)定富含DT的Aβ是否具有增強(qiáng)的電化學(xué)活性的試驗(yàn)，所述電化學(xué)活性例如誘導(dǎo)過(guò)氧化氫形成和銅還原。
實(shí)施例7針對(duì)二酪氨酸的免疫的效果我們嘗試在野生型小鼠中產(chǎn)生對(duì)DT的免疫應(yīng)答。在該試驗(yàn)中，通過(guò)以下步驟制備DT將在硼酸緩沖液中的酪氨酸與H2O2混合，并將該混合物與辣根過(guò)氧化物酶一起溫育，如在試驗(yàn)程序中所述。
使用戊二醛并按照標(biāo)準(zhǔn)方案將DT綴合至載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。在弗氏完全佐劑中制備DT-KLH、單獨(dú)KLH或未經(jīng)處理的酪氨酸每一種的乳液，對(duì)每?jī)芍粍?dòng)物各用含100mg DT-KLH或者未經(jīng)處理的酪氨酸或單獨(dú)KLH的接種物進(jìn)行腹膜內(nèi)接種。在此時(shí)取免疫前血清。在免疫接種之后10天收集第一免疫血清。在此后以?xún)芍艿拈g隔給予兩次加強(qiáng)免疫。在每次接種時(shí)和在最后的強(qiáng)化后一周時(shí)取血樣。
采用ELISA測(cè)定對(duì)DT的免疫應(yīng)答。我們發(fā)現(xiàn)用DT-KLH或未處理的酪氨酸免疫的小鼠對(duì)DT的免疫應(yīng)答從未超過(guò)用單獨(dú)KLH免疫的小鼠的應(yīng)答。用獲自Dr.Kato的DT單克隆抗體IC3作為陽(yáng)性對(duì)照，在該測(cè)定中產(chǎn)生了針對(duì)DT的適度的陽(yáng)性反應(yīng)。
在第二項(xiàng)試驗(yàn)中，用DT-KLH以上述方式免疫兩只兔。對(duì)這些動(dòng)物所產(chǎn)生的血清的ELISA結(jié)果證實(shí)產(chǎn)生了針對(duì)DT的適中的免疫應(yīng)答。
我們還嘗試證實(shí)在來(lái)自4名通過(guò)死后的組織病理學(xué)檢查被診斷患有阿爾茨海默氏病的患者的個(gè)體血清中是否存在針對(duì)DT的內(nèi)源抗體。通過(guò)ELISA或通過(guò)蛋白質(zhì)印跡在這些血清中沒(méi)有觀察到針對(duì)DT的免疫反應(yīng)性。
在進(jìn)一步的試驗(yàn)重復(fù)中，我們檢查了上述針對(duì)DT-KLH產(chǎn)生的小鼠或兔抗血清是否識(shí)別從人腦提取的Aβ二聚體或更高級(jí)別寡聚體中的DT部分。令人驚奇地是，上述血清均未顯示針對(duì)人腦Aβ中的DT部分的活性。陽(yáng)性對(duì)照抗體IC3在該測(cè)定中也呈陰性。
實(shí)施例8制備二酪氨酸部分的方法對(duì)免疫原性和抗體反應(yīng)性的影響我們懷疑免疫應(yīng)答的意外缺乏可能是由于二酪氨酸部分的抗原性差所致。
為了調(diào)查研究這一假設(shè)，我們用兩種不同的方法制備了酪氨酸交聯(lián)的合成Aβ1-40和Aβ1-42。第一種方法包括將在硼酸緩沖液中的Aβ肽與辣根過(guò)氧化物酶和H2O2一起溫育，如在上面試驗(yàn)程序中所描述的。
在第二種方法中，在含30μM CuCl2和200μM H2O2的雙重去離子水中制備2.5μM Aβ溶液，并于室溫溫育1-5天。
將交聯(lián)的Aβ的各變種的樣本進(jìn)行PAGE，并使用Aβ特異性抗體WO2或陽(yáng)性對(duì)照抗DT抗體IC3進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。這些印跡的結(jié)果如圖6所示。
在ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析中IC3抗體在交聯(lián)的Aβ中均檢測(cè)到DT。此外，在蛋白質(zhì)印跡中所述抗體識(shí)別實(shí)施例7中制備的DT-KLH中二酪氨酸的存在。從這些結(jié)果似乎由硼酸或銅方法Aβ1-42比Aβ1-40更有效地交聯(lián)。另外，當(dāng)用涉及銅的方法交聯(lián)時(shí)，Aβ1-40喪失對(duì)WO2的免疫反應(yīng)性。這可能是由于該肽對(duì)自由基損傷或交聯(lián)之后抗體結(jié)合部位的修飾、掩蔽或阻礙更為敏感。
令人驚奇的是，從用IC3的鑒別染色很明顯Aβ通過(guò)二酪氨酸交聯(lián)的模式取決于產(chǎn)生交聯(lián)所用的不同反應(yīng)。IC3單克隆抗體檢測(cè)不出由硼酸方法制備的DT，但確實(shí)檢測(cè)出由銅方法制備的DT。
同樣令人驚奇的是，IC3抗體在Aβ1-40中檢測(cè)DT交聯(lián)優(yōu)先于在Aβ1-42中。這一模式與用抗Aβ抗體WO2所觀察到的情況相反。
這些結(jié)果證實(shí)誘導(dǎo)DT交聯(lián)的方法和被交聯(lián)的多肽的結(jié)構(gòu)在抗體對(duì)DT的識(shí)別中是關(guān)鍵的變量。在這種情況中，向二酪氨酸連接的Aβ1-40添加2個(gè)氨基酸殘基導(dǎo)致抗二酪氨酸抗體結(jié)合的能力大大降低。這一結(jié)果可以推至體內(nèi)情形，提示對(duì)抗原的選擇對(duì)引發(fā)生理學(xué)相關(guān)的免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的。
實(shí)施例9酪氨酸交聯(lián)的形式對(duì)抗體識(shí)別的影響預(yù)計(jì)DT接種物必須綴合至大的載體蛋白以引起免疫應(yīng)答。而且，所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的質(zhì)量在部分程度上也會(huì)取決于對(duì)適合載體的選擇。為了檢查這一點(diǎn)，我們?yōu)楦鱀T種類(lèi)選擇了兩種可供選擇的載體，牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
另外，為了調(diào)查二酪氨酸的不同形式在免疫識(shí)別中的作用，我們制備了含有多種形式DT的粗混合物，包括多種寡聚體和分支形式的DT。在該粗混合物中的酪氨酸交聯(lián)是用如上所述的硼酸/H2O2/過(guò)氧化物酶方法創(chuàng)建的。所得的DT混合物含有在酪氨酸分子的環(huán)和骨架上的多個(gè)位點(diǎn)鍵合的分子。所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的實(shí)例如圖7所示。
然后通過(guò)反相HPLC將粗混合物分離成主要含單-二酪氨酸、二酪氨酸、三酪氨酸和聚酪氨酸的餾分。
寡聚結(jié)構(gòu)的兩個(gè)重要特征是它們可以呈遞多個(gè)拷貝的目標(biāo)抗原以提高免疫原性并增強(qiáng)免疫應(yīng)答，以及它們可以呈現(xiàn)酪氨酸殘基之間化學(xué)鍵的或選形式。
為了研究在AD中構(gòu)成在體內(nèi)對(duì)Aβ氧化修飾的酪氨酸交聯(lián)的性質(zhì)，我們還制備了酪氨酸交聯(lián)的Aβ片段。使用相同的技術(shù)，我們制備了由兩條或更多條Aβ9-16肽鏈組成通過(guò)二酪氨酸交聯(lián)的分子(結(jié)構(gòu)未顯示)。所得到的交聯(lián)最可能代表多種形式酪氨酸交聯(lián)的外消旋混合物。
上述的多種新結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)印跡中得到表征，使用抗-DT單克隆IC3或來(lái)自用DT-KLH免疫的兔的免疫血清(如實(shí)施例7中所述)。這些結(jié)果如圖8所示。
結(jié)果證實(shí)與BSA相連的Aβ9-16的二聚體而不是三聚體對(duì)兔免疫血清和單克隆抗體IC3均具有免疫反應(yīng)性。
在印跡中KLH的存在被兔免疫血清識(shí)別，無(wú)論其是否綴合至另外的酪氨酸交聯(lián)抗原。聚酪氨酸-BSA和聚酪氨酸-KLH被IC3識(shí)別，但兔免疫血清不能區(qū)分單獨(dú)KLH和聚酪氨酸-KLH。
從這些結(jié)果清楚可見(jiàn)對(duì)兔的免疫產(chǎn)生了對(duì)某些形式的二酪氨酸具有反應(yīng)性但對(duì)其它形式無(wú)反應(yīng)性的抗體，正如從圖6中的數(shù)據(jù)所預(yù)測(cè)的。
實(shí)施例10在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中用二酪氨酸免疫對(duì)Aβ沉積的作用可以得到多種神經(jīng)疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，包括阿爾茨海默氏病(Games等，1995；Hsiao等，1996)；帕金森病(Masliah等，2000)；家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)(Gurney等，1994)；亨廷頓舞蹈病(Reddy等，1998)；和克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病(CJD)(Telling等，1994)。
我們已發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏病的轉(zhuǎn)基因模型之一APP2576 tg小鼠(Hsiao等，1996)還具有高的內(nèi)障發(fā)生率。這些動(dòng)物模型適于測(cè)試本發(fā)明的方法。
使用APP2576品系的轉(zhuǎn)基因小鼠(Hsiao等，1996)。選擇8-9月齡的雌性小鼠并分組進(jìn)行治療。
使用多種技術(shù)制備酪氨酸交聯(lián)的抗原以產(chǎn)生不同形式的酪氨酸交聯(lián)。所用的抗原包括
每次免疫包含在弗氏完全佐劑中的25μg抗原，總體積為0.5ml，皮下給予。
對(duì)照動(dòng)物接受不含酪氨酸交聯(lián)的抗原的載體蛋白。
以14天間隔取血清樣本，在28天給予加強(qiáng)免疫。測(cè)定血清樣本中是否存在抗-DT抗體，例如使用Kato等的ELISA方法。預(yù)期在最后的強(qiáng)化注射后大約5周內(nèi)獲得高抗體效價(jià)。還測(cè)定了血中Aβ的水平。
一旦出現(xiàn)高效價(jià)抗體，每隔一段時(shí)間處死動(dòng)物，并檢查它們的腦以確定所述免疫接種是否減少了腦淀粉狀蛋白形成，并鑒定最有效的免疫方案。使用校準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定在腦和血清中的可溶性和不溶性Aβ的水平。用免疫組化方法檢查腦中的Aβ斑負(fù)荷。
在長(zhǎng)達(dá)8個(gè)月的時(shí)間內(nèi)測(cè)試各組中其它小鼠的認(rèn)知表現(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使用Morris水迷宮。每天還由不知情的操作者測(cè)定動(dòng)物的總體健康狀況，使用的5分整數(shù)等級(jí)主觀地評(píng)價(jià)包括運(yùn)動(dòng)活性、警覺(jué)和一般健康指征在內(nèi)的特征組合。
實(shí)施例11用針對(duì)二酪氨酸的抗體治療的效果通過(guò)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)操作用一種或多種實(shí)施例7中描述的免疫原對(duì)正常小鼠進(jìn)行超免疫。每隔一段時(shí)間對(duì)小鼠進(jìn)行放血并如上所述測(cè)定其血清中的抗-DT。檢測(cè)到高效價(jià)抗體時(shí)，收獲血清并用本領(lǐng)域常用方法分離和/或富集抗體成分。
將這些抗體靜脈內(nèi)注射或直接注射入APP2576轉(zhuǎn)基因小鼠的CSF中，在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)以單劑或重復(fù)多劑給予。
在用抗二酪氨酸抗體治療后每隔一段時(shí)間處死轉(zhuǎn)基因小鼠，并檢查它們的腦以確定抗體治療是否減少了腦淀粉狀蛋白形成。
實(shí)施例12診斷與酪氨酸交聯(lián)相關(guān)的病癥對(duì)來(lái)自證實(shí)患有AD的患者和來(lái)自年齡相匹配的對(duì)照的血清和腦脊液(CSF)樣本使用如上所述的熒光分析測(cè)定其中酪氨酸交聯(lián)的化合物的存在。在一組樣本中，首先使樣本通過(guò)偶聯(lián)至次氮基三乙酸的固相支持體而富集樣本中的酪氨酸交聯(lián)的化合物，如美國(guó)專(zhuān)利No.5972674中所述。
使用來(lái)自患有ALS、帕金森病和CJD的患者的樣本進(jìn)行類(lèi)似的測(cè)定。
可能患者還具有針對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物的循環(huán)抗體，因此在可供選擇的測(cè)定中，用ELISA測(cè)定利用針對(duì)DT的單克隆抗體檢測(cè)血清或CSF中的這種抗體(Kato等，1998)。
實(shí)施例13鑒定存在于經(jīng)氧化修飾的Aβ中的二酪氨酸的形式為了鑒定存在于經(jīng)氧化修飾的Aβ中的DT的主要形式，產(chǎn)生銅催化的Aβ寡聚體的酶促消化片段，并通過(guò)質(zhì)譜分析所述片段。該技術(shù)近來(lái)被應(yīng)用于分析對(duì)朊病毒蛋白的銅催化氧化修飾(Requena，J.R.，等，2001 PNAS 987170-7175)。
這使得對(duì)抗原的鑒定最可能有效產(chǎn)生適用于被動(dòng)免疫的單克隆抗體，如實(shí)施例11中所述。產(chǎn)生針對(duì)任何特定抗原的高度特異性單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域中是廣為人知的。一旦選出了抗原，則使用已知的方法進(jìn)行對(duì)最有效抗原呈遞方式的系統(tǒng)性分析。
討論在AD中的神經(jīng)元損傷與可溶性Aβ相關(guān)，而不與固定在神經(jīng)炎斑中的不溶性Aβ相關(guān)(McLean等，1999)?，F(xiàn)在我們首次顯示了從罹患AD的腦中提取的神經(jīng)毒性Aβ寡聚體含有酪氨酸交聯(lián)，其可以是DT、iso-DT、TT和/或P。這些修飾通過(guò)將Aβ與過(guò)氧化物酶和H2O2一起溫育，或通過(guò)在銅離子存在下氧化Aβ而在體外得到模仿。這些修飾可干擾Aβ的代謝，可促成在AD中看到的神經(jīng)毒性，并且指示在所述疾病中的神經(jīng)化學(xué)紊亂。
DT、T和P之間碳-碳橋的形成被認(rèn)為是不可逆的；DT交聯(lián)對(duì)6NHCl在110℃水解切割24小時(shí)和蛋白酶消化非常耐受(Smail等，1995)。在病理學(xué)上，蛋白的DT修飾對(duì)分解代謝的抗性可以解釋酪氨酸聚合物對(duì)脂褐質(zhì)形成所起的作用(Kato等，1998)，和對(duì)熒光內(nèi)障形成中α-晶體蛋白的交聯(lián)所起的作用(Kikugawa等，1991)。顯然，預(yù)期Aβ的酪氨酸交聯(lián)會(huì)抑制其分解代謝，并因此在AD中淀粉樣蛋白斑沉積的發(fā)展中可能是重要的步驟。
酪氨酸交聯(lián)的形成必需要使含有酪氨酰殘基的分子進(jìn)行接觸。我們的結(jié)果提示Aβ的酪氨酸殘基必須對(duì)于過(guò)氧化物酶是可接近的，并且淀粉狀蛋白的Aβ亞基之間的酪氨酰殘基必須在某些階段并置。
由于DT形成需要H2O2，檢測(cè)在來(lái)自AD的腦Aβ中的DT修飾暗示在AD中腦中的H2O2升高。不希望受到任何已提出的機(jī)制的約束，我們認(rèn)為在腦實(shí)質(zhì)中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活化，與AD中的淀粉狀蛋白形成密切相關(guān)(Sheng等，1997)，可能提供過(guò)氧化物酶活性和H2O2以引起Aβ的酪氨酸交聯(lián)。已觀察到活化的大鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)氧化物酶水平增加(Lindenau等，1998)，并且體外試驗(yàn)已證實(shí)了Aβ引發(fā)和/或觸發(fā)培養(yǎng)的大鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和人吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)的能力(Van Muiswinkel等，1996)?；罨耐淌杉?xì)胞釋放髓過(guò)氧化物酶(Pember等，1983)，并在呼吸爆發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生活性氧種類(lèi)。這一反應(yīng)被設(shè)計(jì)用來(lái)殺死入侵的病原體或腫瘤細(xì)胞；但是，也顯示該環(huán)境促進(jìn)周?chē)鞍缀椭?lèi)的氧化(Byun等，1999)。在活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞鄰近可以產(chǎn)生類(lèi)似的微環(huán)境。在體外，髓過(guò)氧化物酶-H2O2體系促進(jìn)酪氨酸交聯(lián)的種類(lèi)如DT、TT、P和isoDT的合成(Jacob等，1996)。
因此，對(duì)Aβ蓄積作出反應(yīng)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化可促進(jìn)Aβ的酪氨酸交聯(lián)，抑制其清除并導(dǎo)致惡性循環(huán)。Aβ本身可能產(chǎn)生用于形成DT的最近H2O2源，促成這一可能的惡性循環(huán)，因?yàn)锳β與O2反應(yīng)通過(guò)還原亞化學(xué)計(jì)算量的Cu2+或Fe2+而形成H2O2(Huang，Atwood等，1999；Huang，Cuajungco等，1999)。所以，非常重要的是從人淀粉狀蛋白中純化完整的結(jié)合有銅的Aβ(圖3A)。合成的Aβ1-42以阿托摩爾(attomolar)親和力結(jié)合Cu2+，并且由于在AD淀粉狀蛋白中富集銅(Lovell等，1998)，我們?cè)鴳岩葾β可能在體內(nèi)結(jié)合銅。源自淀粉狀蛋白的Aβ含有銅這一發(fā)現(xiàn)也與AD的病理生理學(xué)相關(guān)，因?yàn)镃u2+沉淀Aβ(Atwood等，1998)，并且Cu2+加強(qiáng)所述肽的毒性(Huang等，1999)。
令人產(chǎn)生興趣的是，在用酸水解源自人淀粉狀蛋白的Aβ之后，以及在質(zhì)譜分析的酸性條件下，Cu2+仍保持與DT結(jié)合(圖3A)。對(duì)Cu2+的這一不同尋常的親和力可能是由DT修飾在Aβ上形成外加的高親和力Cu2+結(jié)合部位的結(jié)果。由于該增加的對(duì)Cu2+的親和力，DT-修飾的Aβ的神經(jīng)毒性或其電化學(xué)活性與未修飾的Aβ相比可增高。由DT修飾引起的外加的Cu2+結(jié)合還可增加Aβ沉淀為淀粉狀蛋白，這可以解釋為什么用螯合劑在pH7.4處理促進(jìn)二聚體Aβ從死后AD腦組織中釋放的程度高于單體Aβ(通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定)(Cherny等，1999)。對(duì)蛋白水解抗性增加和外加金屬結(jié)合的組合可能是促成AD病理的Aβ的酪氨酸交聯(lián)的特別有害的后果。
PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)量產(chǎn)生人形式的Aβ1-42并隨著老化顯示出廣泛的腦淀粉樣蛋白斑沉積，以及行為和認(rèn)知缺陷(Games等，1995；WO96/40896)。用合成的Aβ1-42免疫成熟PDAPP小鼠導(dǎo)致淀粉樣蛋白斑在數(shù)量和強(qiáng)度上的驚人減低，而用該抗原免疫的PDAPP小鼠不產(chǎn)生淀粉樣蛋白斑(Schenk等，1999和WO99/27944)?？磥?lái)已誘導(dǎo)了對(duì)Aβ1-42的成功的免疫應(yīng)答，證據(jù)是在緊靠殘余淀粉樣蛋白斑附近的清除性小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以及在血中存在針對(duì)Aβ1-42的抗體。作者建議用Aβ免疫可用于預(yù)防或治療AD。然而，廣泛認(rèn)為對(duì)AD進(jìn)行免疫療法似乎并不切實(shí)可行，因?yàn)橛捎诿庖吣褪苋耸荏w對(duì)自身蛋白不能產(chǎn)生有意義的免疫應(yīng)答。Schenk等得到的結(jié)果提示，給予適宜的刺激，腦可能具有再吸收或清除頑固的淀粉狀蛋白沉積的能力。但是，用Aβ本身進(jìn)行免疫并不理想，因?yàn)榭赡苷T導(dǎo)有害的自身免疫應(yīng)答，和/或誘導(dǎo)不充分的、不能清除斑的應(yīng)答。通過(guò)用根據(jù)本發(fā)明的非天然二酪氨酸或含有二酪氨酸的化合物進(jìn)行免疫，可以避免這一問(wèn)題。
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很明顯，盡管出于清楚和理解的目的詳細(xì)描述了本發(fā)明的某些細(xì)節(jié)，可以對(duì)在此描述的技術(shù)方案和方法作出多種修改和變化，而不偏離本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的發(fā)明概念的范圍。
在此引用的參考文獻(xiàn)列于以下數(shù)頁(yè)，并在此引入作為參考。參考文獻(xiàn)Amado，R.，Aeschbach，R.，and Neukom，H.(1984)Methods Enzymol 107，377-88.13Atwood，C.S.，Huang，X.，Moir，R.D.，Scarpa，R.C.，Bacarra，N.M.E.，Hartshorn，M.A.，Goldstein，L.E.，Romano，D.M.，Tanzi，R.E.，and Bush，A.I.(1997)Soc.Neurosci.Abstr.23，1883Atwood，C.S.，Moir，R.D.，Huang，X.，Bacarra，N.M.E.，Scarpa，R.C.，Romano，D.M.，Hartshorn，M.A.，Tanzi，R.E.，and Bush，A.I.(1998)J.Biol.Chem.273，12817-12826Atwood，C.S.，Scarpa，R.C.，Huang，X.，F(xiàn)arrag，Y.W.，Moir，R.D.，Cuajungco，M.P.，Tanzi，R.E.，and Bush，A.I.(1999)Soc.Neurosci.Abstr.24，546Atwood，C.S.，Scarpa，R.C.，Huang，X.，Moir，R.D.，Jones，W.D.，F(xiàn)airlie，D.P.，Tanzi，R.E.，and Bush，A.I.(2000)J.Neurochemistry 75，1219-1233Burdick，D.，Soreghan，B.，Kwon，M.，Kosmoski，J.，Knauer，M.，Henschen，A.，Yates，J.，Cotman，C.，and Glabe，C.(1992)J.Biol.Chem.267，546-554Byun，J.，Henderson，J.P.，Mueller，D.M.，and Heinecke，J.W.(1999)Biochemistry 38(8)，2590-600Cherny，R.A.，Legg，J.T.，McLean，C.A.，F(xiàn)airlie，D.，Huang，X.，Atwood，C.S.，Beyreuther，K.，Tanzi，R.E.，Masters，C.L.，and Bush，A.I.(1999)J.Biol.Chem.274，23223-23228Dyrks，T.，Dyrks，E.，Hartmann，T.，Masters，C.，andBeyreuther，K.(1992)J.Biol.Chem.267，18210-18217Galeazzi，L.，Ronchi，P.，F(xiàn)ranceschi，C.，and Giunta，S.(1999)Amyloid 6(1)，7-13Glenner，G.G.，and Wong，C.W.(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.120，885-890Gross，A.J.，and Sizer，I.W.(1959)J.Biol.Chem.234，1611-1614Hsiao，K.，Chapman，P.，Nilsen，S.，Eckman，C.，Harigaya，Y.，Younkin，S.，Yahg，F(xiàn).，Cole，G.Correlative memorydeficits，Aβelevation，and amyloid plaques in transgenicmice.(1996)Science；274(5284)99-102.Heinecke，J.W.，Li，W.，F(xiàn)rancis，G.A.，and Goldstein，J.A.(1993)J Clin Invest 91(6)，2866-72Hensley，K.，Maidt，M.L.，Yu，Z.，Sang，H.，Markesbery，W.R.，and Floyd，R.A.(1998)J.Neurosci188126-8132Huang，X.，Cuajungco，M.P.，Atwood，C.S.，Hartshorn，M.A.，Tyndall，J.，Hanson，G.R.，Stokes，K.C.，Leopold，M.，Multhaup，G.，Goldstein，L.E.，Scarpa，R.C.，Saunders，A.J.，Lim，J.，Moir，R.D.，Glabe，C.，Bowden，E.F.，Masters，C.L.，F(xiàn)airlie，D.P.，Tanzi，R.E.，and Bush，A.I.(1999)J.Biol.Chem.274，37111-6Huang，X.，Atwood，C.S.，Hartshorn，M.A.，Multhaup，G.，Goldstein，L.E.，Scarpa，R.C.，Cuajungco，M.P.，Gray，D.N.，Lim，J.，Moir，R.D.，Tanzi，R.E.，.and Bush，A.I.(1999)Biochemistry 38，7609-7616Jacob，J.S.，Cistola，D.P.，Hsu，F(xiàn).F.，Muzaffar，S.，Mueller，D.M.，Hazen，S.L.，and Heinecke，J.W.(1996)J Biol Chem 271(33)，19950-6Kato，Y.，Maruyama，W.，Naoi，M.，Hashizume，Y.，and Osawa，T.(1998)FEBS Letters 439(3)，231-4Kikugawa，K.，Kato，T.，Beppu，M.，and Hayasaka，A.(1991)Biochim Biophys Acta 1096(2)，108-14Lindenau，J.，Noack，H.，Asayama，K.，and Wolf，G.(1998)Glia 24(2)，252-6Lovell，M.A.，Robertson，J.D.，Teesdale，W.J.，Campbell，J.L.，and Markesbery，W.R.(1998)J Neurol Sci 158(1)，47-52.15Malencik，D.A.，Sprouse，J.F.，Swanson，C.A.，andAnderson，S.R.(1996)Anal Biochem 242(2)，202-13Masters，C.L.，Multhaup，G.，Simms，G.，Pottgiesser，J.，Martins，R.N.，and Beyreuther，K.(1985)The EMBO Journal 4，2757-2763McLean et al.，(1999)，Ann.Neurol.46，860-866.Pember，S.O.，and Kinkade，J.M.，Jr.(1983)Blood 61(6)，1116-24.14Requena，J.R.，et al.(2001)PNAS 98，7170-7175)Roher，A.E.，Chaney，M.O.，Kuo，Y.M.，Webster，S.D.，Stine，W.B.，Haverkamp，L.J.，Woods，A.S.，Cotter，R.J.，Tuohy，J.M.，Krafft，G.A.，Bonnell，B.S.，andEmmerling，M.R.(1996)J Biol Chem 271(34)，20631-5Sela M.and Arnon，R.(1960)Biochem J.75，91-102.Sheng，J.G.，Mrak，R.E.，and Griffin，W.S.(1997)ActaNeuropathol(Berl)94(1)，1-5Schenk，D.et al.，(1992)Nature400，173-177.Shivers，B.D.，Hilbich，C.，Multhaup，G.，Salbaum，M.，Beyreuther，K.，and Seeburg，P.H.(1988)EMBO J.7，1365-1370Shoji，M.，Golde，T.E.，Ghiso，J.，Cheung，T.T.，Estus，S.，Shaffer，L.M.，Cai，X.-D.，McKay，D.M.，Tintner，R.，F(xiàn)rangione，B.，and Younkin，S.G.(1992)Science 258，126-129Smail，E.H.，Briza，P.，Panagos，A.，and Berenfeld，L.(1995)Infect Immun 63(10)，4078-83Souza，J.M.，Giasson，B.I.，Chen，Q.，Lee，V.M-Y.，andIschiropoulos(2000)J.Biol.Chem.，295，18344-18349Van Muiswinkel，F(xiàn).L.，Veerhuis，R.，and Eikelenboom，P.(1996)J.Neurochem.66，2468-2476Vaughan，D.W.，and Peters，A.(1981)J.Neuropathol.Exp.Neurol.40，472-48權(quán)利要求
1. 預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，包括以下步驟用免疫有效劑量的一種或多種酪氨酸交聯(lián)的化合物對(duì)需要治療的對(duì)象進(jìn)行免疫，其中所述病癥特征在于與氧化性損傷有關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨酸交聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述病理性聚集形式的特定蛋白包含酪氨酸交聯(lián)的部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述酪氨酸交聯(lián)的化合物是一種肽，它是所述病理性聚集形式的特定蛋白的免疫原性部分，所述肽包含與交聯(lián)的酪氨酸的上游和下游殘基相連接的交聯(lián)的酪氨酸部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物中的酪氨酸交聯(lián)可通過(guò)在銅離子存在下氧化而得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酪氨酸交聯(lián)的化合物是二酪氨酸交聯(lián)的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酪氨酸交聯(lián)的化合物與銅離子絡(luò)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中銅離子與二酪氨酸的比小于或等于3∶1，條件是所施用的每一劑量含有不超過(guò)1μM銅。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物偶聯(lián)至本身具有免疫原性的載體蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述載體蛋白選自破傷風(fēng)類(lèi)毒素、匙孔血藍(lán)蛋白和白蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物與佐劑一起施用。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述特定蛋白的免疫原性部分是具有免疫原性的最小部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是阿爾茨海默氏病，所述特定蛋白是Aβ，并且所述酪氨酸交聯(lián)的化合物是來(lái)源于人Aβ1-40或Aβ1-42氨基酸序列中圍繞酪氨酸10周?chē)蛄械睦野彼峤宦?lián)的肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述酪氨酸交聯(lián)的肽含有二酪氨酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述酪氨酸交聯(lián)的肽與銅離子絡(luò)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括以下額外步驟鑒定在病理性聚集的特定蛋白中占優(yōu)勢(shì)的酪氨酸交聯(lián)形式；和合成一種或多種酪氨酸交聯(lián)的化合物，所述化合物包含一種或多種占優(yōu)勢(shì)形式的酪氨酸交聯(lián)。
16.預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，其中所述病癥特征為與氧化性損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積，并且其中病理性聚集形式的特定蛋白含有酪氨酸交聯(lián)，所述方法包括給需要這種治療的對(duì)象施用有效量的抗體或抗體片段的步驟，所述抗體或抗體片段是針對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物產(chǎn)生的，所述化合物是病理性聚集形式的特定蛋白的免疫原性部分并包含酪氨酸交聯(lián)，并且所述抗體或抗體片段能特異性結(jié)合病理性聚集形式的特定蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體是多克隆的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體是人類(lèi)來(lái)源的。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體是單克隆的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述抗體是人源化的。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述抗體或抗體片段特異性與病理性聚集形式的特定蛋白發(fā)生反應(yīng)，而不與未聚集形式的特定蛋白發(fā)生顯著反應(yīng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述化合物中的酪氨酸交聯(lián)可通過(guò)在銅離子存在下氧化而得到。
23.用于根據(jù)權(quán)利要求1的方法的預(yù)防性或治療性組合物，包含酪氨酸交聯(lián)的化合物，以及可藥用載體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的預(yù)防性或治療性組合物，其中所述酪氨酸交聯(lián)的化合物與銅離子絡(luò)合。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的預(yù)防性或治療性組合物，還包含佐劑。
26.用于根據(jù)權(quán)利要求16的方法的預(yù)防性或治療性組合物，所述組合物包含針對(duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物而產(chǎn)生的抗體或抗體片段，以及可藥用載體，所述化合物是病理性聚集形式的特定蛋白的免疫原性部分并包含酪氨酸交聯(lián)，并且所述抗體或抗體片段能特異性結(jié)合所述病理性聚集形式的特定蛋白。
27.診斷病癥的方法，其中所述病癥特征在于與氧化性損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨酸交聯(lián)，所述方法包括以下步驟測(cè)定來(lái)自懷疑患有所述病癥的對(duì)象的生物液體樣本中是否存在包含酪氨酸交聯(lián)的分子。
28.診斷病癥的方法，所述病癥特征在于與氧化性損傷相關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨酸交聯(lián)，所述方法包括以下步驟測(cè)定來(lái)自懷疑患有所述病癥的對(duì)象的生物液體中是否存在針對(duì)包含酪氨酸交聯(lián)的分子的抗體。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的方法，其中所述分子包含二酪氨酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求27或28的方法，其中所述生物液體選自血液、血漿、血清、腦脊液、尿和唾液。
31.根據(jù)權(quán)利要求1、16、27或28的方法，其中所述病癥選自阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、內(nèi)障、帕金森病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、亨廷頓舞蹈病、伴有雷維小體形成的癡呆、多系統(tǒng)萎縮、哈-施病和彌漫性雷維小體病。
32.根據(jù)權(quán)利要求1、16、27或28的方法，其中所述病癥是阿爾茨海默氏病或帕金森病。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療或減輕阿爾茨海默氏病和其它與異常蛋白聚集有關(guān)的病癥的方法和組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用于阿爾茨海默氏病、帕金森病和內(nèi)障的免疫療法的方法和組合物。一方面本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或減輕病癥的方法，所述病癥特征在于與氧化性損傷有關(guān)的特定蛋白的病理性聚集和蓄積以及形成酪氨酸交聯(lián)，該方法包括以下步驟用免疫有效劑量的一種或多種酪氨酸交聯(lián)的化合物，任選還包含與所述化合物絡(luò)合的銅離子，對(duì)需要這種治療的對(duì)象進(jìn)行免疫?；蛘呖梢圆捎冕槍?duì)酪氨酸交聯(lián)的化合物的被動(dòng)免疫。還公開(kāi)并要求保護(hù)預(yù)防性或治療性組合物和診斷方法。
文檔編號(hào)A61P21/00GK1450908SQ01813312
公開(kāi)日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2001年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月28日
發(fā)明者A·布什, R·徹尼 申請(qǐng)人:普拉納生物技術(shù)有限公司, 綜合醫(yī)院有限公司