專利名稱：免疫調(diào)節(jié)性人mhc ⅱ類抗原結(jié)合性多肽的制作方法
背景技術(shù)：
涉及免疫系統(tǒng)的疾病明顯使患者衰弱，預(yù)期在未來10年內(nèi)會更普遍。這些疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化(MS)、I類糖尿病、移植排斥(TR)和移植物抗宿主病(GvHD)。例如預(yù)期患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人數(shù)目在全球?qū)⒃?010年從6,600,000增加到7,000,000。下面顯示了1995年患這些疾病的病人數(shù)目，2010年預(yù)期的病人數(shù)以及相應(yīng)的市場規(guī)模。
目前免疫系統(tǒng)疾病的治療包括消炎藥，例如NSAIDS(非-甾體消炎藥)、皮質(zhì)醇、細(xì)胞抑制劑(RA用的氨甲蝶呤)和細(xì)胞因子(MS用β-干擾素)。這些治療是對癥性的；它們都不能使疾病完全緩解。大多數(shù)現(xiàn)用藥物的主要問題是它們?nèi)狈x擇性它們抑制整個免疫系統(tǒng)，因此所治療的病人將對感染高度敏感。最后大多數(shù)目前使用的消炎藥的副作用也有理由對這些疾病研制新的治療劑。因此，對于治療免疫系統(tǒng)疾病(例如RA和MS)的基于疾病機(jī)制的選擇性治療劑有空前迫切的未滿足醫(yī)學(xué)需求。
TR和GvHD的免疫學(xué)機(jī)制與免疫系統(tǒng)其它疾病的機(jī)制相似。在TR中，受體免疫系統(tǒng)攻擊外源器官，而GvHD中引入免疫妥協(xié)的宿主的外源造血細(xì)胞攻擊宿主。當(dāng)前用皮質(zhì)醇、硫唑嘌呤、環(huán)胞菌素(Cyclosporin)A和Cell Cept預(yù)防排斥，高劑量的皮質(zhì)醇、OKT3(針對泛T-細(xì)胞標(biāo)記的單克隆抗體(mAb))和Zenapax(針對活化的T細(xì)胞上IL-2R的mAb)用于治療排斥。對于更耐受和更有效的免疫抑制劑，特別是用于治療GvHD的有迫切的醫(yī)學(xué)需求。
每一種迄今研究的哺乳動物攜帶一簇基因，編碼所謂的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)。該緊密連鎖的基因簇編碼表面抗原，它在體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起到了中心作用。在人體內(nèi)MHC編碼的各種產(chǎn)物稱作人白細(xì)胞抗原或HLA。MHC-基因組織在編碼三類分子，I-III類的區(qū)域中。
I類MHC分子是45kD跨膜糖蛋白，與另一種糖蛋白，12kD β-2微球蛋白非共價結(jié)合(Brown等，1993)。后者不插入細(xì)胞膜，而是編碼在MHC外側(cè)。人I類分子是三種不同的同型抗原，稱為HLA-A、-B和-C，在獨(dú)立的基因座編碼。I類分子的組織表達(dá)是普遍存在并且是共顯性的。MHC I類分子遞呈激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞必需的肽抗原。
II類MHC分子與兩種跨膜糖蛋白，35kDα鏈和28kDβ鏈的異二聚體非共價結(jié)合(Brown等，1993)。在人類中，II類分子作為三種不同的同型出現(xiàn)，稱為人白細(xì)胞抗原DR(HLA-DR)、HLA-DP和HLA-DQ。DR的多態(tài)性限于β鏈，而兩條鏈在DP和DQ同型體中都具有多態(tài)性。II類分子共顯性表達(dá)，但與I類相反，顯示有限的組織分布它們僅存在于免疫系統(tǒng)(例如樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和活化的T淋巴細(xì)胞)的細(xì)胞表面。它們還在正常腎上腺的網(wǎng)狀帶的人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，并在正常卵巢黃體的粒層-黃體素細(xì)胞中表達(dá)(Kahoury等，1990)。它們的主要生物學(xué)作用是結(jié)合抗原肽并將其遞呈到抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面，讓CD4輔助T(Th)淋巴細(xì)胞識別(Babbitt等，1985)。MHC II類分子還可在非免疫系統(tǒng)細(xì)胞表面表達(dá)。例如在器官中淋巴樣細(xì)胞外的細(xì)胞可在病理性炎癥反應(yīng)中表達(dá)MHC II類分子。這些細(xì)胞可包括滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、甲狀腺基質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
III類MHC分子也與免疫應(yīng)答有關(guān)，但編碼某種程度上不同的產(chǎn)物。這些包括許多可溶性血清蛋白、酶和蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或類固醇21-羥化酶。在人中，III類分子有三種不同的同型體，稱為Ca、C2和Bf(Kuby，1994，該參考文獻(xiàn)的頁碼不明)。
大量證據(jù)顯示對許多疾病，特別是免疫系統(tǒng)疾病的易感性與主要組織相容性復(fù)合物的特定等位基因密切相關(guān)(Tiwari等的綜述，1985)。雖然存在一些I類相關(guān)的疾病，已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)自身免疫癥狀與II類等位基因有關(guān)。例如，II類等位基因DRB1*0101、0401、0404和0405在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病人中以遞增的頻率存在(McMichael等，1977；Stasny，1978；Ohta等，1982；Schiff等，1982)，其中DRB1*1501與多發(fā)性硬化(MS)有關(guān)，DQ等位基因聯(lián)合DQA1*0301/B1*0302與胰島素依賴性糖尿病(IDDM)有關(guān)。在RA中共＞94％的類風(fēng)濕性因子陽性病人攜帶易感性等位基因之一(Nepom等，1989)。
II類MHC分子是免疫抑制干預(yù)的主要目標(biāo)，原因如下第一，MHC-II分子激活作為免疫調(diào)節(jié)中心的T輔助(Th)細(xì)胞，負(fù)責(zé)炎癥疾病中的大部分免疫病理。第二，大多數(shù)免疫系統(tǒng)疾病與II類等位基因遺傳相關(guān)。第三，MHC II分子僅在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞上表達(dá)，而MHC-1分子存在于大多數(shù)體細(xì)胞上。
據(jù)信至少三種機(jī)制在與MHC II類分子結(jié)合的蛋白質(zhì)介導(dǎo)的免疫抑制中起到了某些作用。第一，由于Th細(xì)胞識別與II類分子結(jié)合的抗原肽，II類分子特異性單克隆抗體(mAb)可空間阻礙MHC II類分子與T細(xì)胞受體間的相互作用，從而防止Th細(xì)胞激活。事實(shí)上，這在體外和體內(nèi)都有顯示(Baxevanis等，1980；Nepom等，1981；Rosenbaum等，1983)。第二，用某些小鼠抗MHC II類抗體，MHC II類分子在細(xì)胞表面表達(dá)的下調(diào)已顯示與免疫抑制有關(guān)(Vidovic等，1995)。第三，當(dāng)某些抗-MHC II類抗體與在細(xì)胞表面表達(dá)的抗原結(jié)合時，激活的淋巴樣細(xì)胞被殺死(Vidovic等，1995a)。由于僅表達(dá)特定MHC II類抗原的細(xì)胞可成為特異性單克隆抗體的靶，因此僅能調(diào)節(jié)這些同種異型體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，可實(shí)現(xiàn)治療選擇性的提高。其它MHC分子介導(dǎo)的宿主防御免疫反應(yīng)不被特異性抗原靶向，因此保持不受調(diào)節(jié)，非免疫妥協(xié)。
基于這些觀察結(jié)果，許多年來已設(shè)想用抗-II類mAb作為候選治療劑用于免疫抑制治療免疫系統(tǒng)的疾病，包括移植排斥。事實(shí)上，在一系列動物疾病模型中小鼠衍生抗II類mAb的益處支持了該假想(Waldor等，1983；Jonker等，1988；Stevens等，1990；Smith等，1994)。
盡管有這些早期的支持性的數(shù)據(jù)，迄今未描述顯示所需免疫調(diào)節(jié)和其它生物性質(zhì)(可能包括親和力、增殖抑制或細(xì)胞因子分泌的減少)的人組合物的抗-MAb II類組合物。事實(shí)上，盡管可相對簡單的獲得小鼠衍生的mAb，但用小鼠衍生mAb的工作證明了獲得具有所需生物性質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)性抗體的困難。例如，在不同小鼠抗-II類mAb的T細(xì)胞抑制能力中觀察到顯著和不能充分理解的差異(Naquet等，1983)。另外，體內(nèi)使用某些小鼠衍生的mAb與未預(yù)期的副作用相聯(lián)系，有時引起實(shí)驗(yàn)靈長類的死亡(Billing等，1983；Jonker等，1991)。
普遍接受小鼠衍生的mAb(包括嵌合和所謂的“人源化”mAb)與人mAb(例如Vose等，2000；Kashmiri等，2001)相比，伴有在病人體內(nèi)增加產(chǎn)生不良免疫應(yīng)答的危險(xiǎn)(人抗-小鼠抗體HAMA)。當(dāng)用任何小鼠衍生的mAb治療慢性病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化時，該危險(xiǎn)可能增加；人免疫系統(tǒng)持續(xù)接觸非人分子常常導(dǎo)致不良免疫反應(yīng)。另外，已證明，要獲得對所需抗原具有理想特異性或親和性的小鼠衍生抗體非常難(Pichla等，1997)。這些觀察結(jié)果可對小鼠衍生的mAb的療效和優(yōu)點(diǎn)具有顯著影響，或降低作用。小鼠衍生的mAb的缺點(diǎn)的例子包括下列第一，小鼠衍生的mAb可能受到醫(yī)藥條件，或治療它們適合的病況的療程長短的限制。第二，小鼠衍生的mAb的劑量水平可能需要較高，以補(bǔ)償較低的親和力或療效(低親和力或療效與小鼠來源無關(guān)，然而人體內(nèi)的半衰期可能有關(guān)，因?yàn)樾∈髆Ab可能更容易從血液中被快速清除，這可能還需要更高的劑量)，因此，使得劑量不僅更重，而且可能免疫原性更強(qiáng)，可能更危險(xiǎn)。第三，在需要高產(chǎn)量的合適的治療方案和高劑量比中的限制，可會顯著增加治療的成本，意味著這些小鼠衍生的mAb對于開發(fā)作為商品治療劑是不經(jīng)濟(jì)的。最后，即使能鑒定出顯示所需特異性或親和性的小鼠mAb，通常這些理想特征在減少免疫原性的人源化或嵌合過程中受到有害影響(Slavin-Chiorini等，1997)。一旦小鼠衍生的mAb被人源化或嵌合化，就非常難于優(yōu)化其特異性或親和性。
許多年來，本領(lǐng)域一直在尋找具有適用于治療人類的藥物組合物的免疫調(diào)節(jié)和其它生物性質(zhì)的人抗-MHC II類mAb復(fù)合物。該領(lǐng)域的工作人員已實(shí)踐了步驟首先鑒定一種小鼠衍生的mAb，然后在改善該用于人類病人的非人分子的免疫耐受的幫助下修飾該mAb的結(jié)構(gòu)(對于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，見Jones等，1986；Riechmann等，1988；Presta，1992)。通常用所謂的“人源化”過程或通過構(gòu)建人-小鼠嵌合mAb實(shí)現(xiàn)該修飾。其它工作人員嘗試了鑒定在人抗體多樣性天然庫中具有所需性質(zhì)的與人抗原結(jié)合的人抗體。例如，通過探索孕婦中的胎兒耐受機(jī)制(Bonegura等，1987)或通過篩選抗體天然多樣性文庫(Stausbl-Grn等，1996；Winter等，1994)。然而，迄今未描述過顯示所需免疫調(diào)節(jié)的生物性質(zhì)、特異性、低免疫原性和親和性的人復(fù)合物MHC II類mAb。
發(fā)明簡述本發(fā)明一方面提供了一種組合物，包括含有人組合物的至少一種基于抗體的抗原結(jié)合域的多肽，所述結(jié)合域具有對細(xì)胞表面表達(dá)的一種抗原的結(jié)合特異性。在優(yōu)選例中，用一條或多條多肽處理表達(dá)抗原的細(xì)胞(淋巴樣細(xì)胞或非淋巴樣細(xì)胞)導(dǎo)致或引起免疫應(yīng)答的抑制，如其中抑制劑活性的IC50是1μM或以下，甚至更優(yōu)選100nM、10M或甚至1nM或以下。
在某些優(yōu)選例中，基于抗體的抗原結(jié)合域含有選自Fv、scFv、dsFv和Fab片段的單價抗體片段。在其它優(yōu)選例中，多肽含有F(ab)’2抗體片段或小抗體片段。在另一個優(yōu)選例中，多肽是多價組合物，含有至少一條選自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA和IgM的完整的抗體。
根據(jù)一個優(yōu)選例，多肽針對表達(dá)MHC II類分子的淋巴樣細(xì)胞或非淋巴樣細(xì)胞。后一種細(xì)胞存在于炎癥和/或免疫系統(tǒng)疾病的病理位點(diǎn)。所述細(xì)胞可包括滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、甲狀腺基質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
在某些實(shí)施例中，多肽與HLA-DR分子的α-鏈的至少一個表位結(jié)合。根據(jù)另一個優(yōu)選例，多肽與HLA-DR的α-鏈的第一結(jié)構(gòu)域的至少一個表位結(jié)合，例如多肽與HLA-DR的α-鏈的Glu55-Tyr79的α-螺旋內(nèi)的至少一個表位結(jié)合。
在一些優(yōu)選例中，多肽與HLA-DR分子β-鏈中的至少一種表位結(jié)合，優(yōu)選與HLA-DR的β-鏈第一結(jié)構(gòu)域的至少一個表位結(jié)合。
在某些實(shí)施例中，該多肽包括至少一個基于抗體的抗原結(jié)合域，它與人MHC II類抗原特異性結(jié)合的Kd是1μM或以下，更優(yōu)選100nM，10nM或甚至1nM或以下。為了進(jìn)一步說明，基于抗體的抗原結(jié)合域與人HLA-DR抗原特異性結(jié)合。例如，基于抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包括取自MS-GPC-1、MS-GPC-2、MS-GPC-3、MS-GPC-4、MS-GPC-5、MS-GPC-6、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-14、MS-GPC-15、MS-GPC-16、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種組合物，含有具有至少一個基于抗體的抗原結(jié)合域，該結(jié)合域具有與人MHC II類抗原，例如HLA DR結(jié)合特異性在1μM或以下，更優(yōu)選100nM、10nM或甚至1nM或以下?？赏ㄟ^一種方法分離基于抗體的抗原結(jié)合域，該方法包括從重組抗體文庫用與人MHC II類抗原結(jié)合的能力分離人組合物的VL和VH區(qū)。該方法還包括下列步驟a.產(chǎn)生VL和VH區(qū)之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一個的變體文庫，和b.用與人MHC II類抗原以1μM或以下的Kd結(jié)合的能力從變體文庫中分離出VL和VH區(qū)；和c.再用CDR1、CDR2和CDR3序列(可任選的)重復(fù)步驟(a)和(b)。
在某些優(yōu)選例中，該多肽的基于抗體的抗原結(jié)合域與HLA-DR的β-鏈結(jié)合，甚至更優(yōu)選的與HLA-DR β-鏈的第一結(jié)構(gòu)域的表位結(jié)合。
本發(fā)明的一個方面提供了至少一種本發(fā)明的多肽的多價組合物，這些多肽能夠?qū)е禄罨?xì)胞的細(xì)胞死亡，而不需要任何其它附加措施，并對治療的病人具有有限的免疫原性副作用。另外，含有本發(fā)明的多肽的多價組合物能與靶抗原上的至少一個表位結(jié)合，然而幾個表位結(jié)合位點(diǎn)可能結(jié)合在一個分子中。在一個優(yōu)選例中，多肽是含有選自Fv、scFv、dsFv和Fab片段的至少兩個單價抗體片段的多價組合物，還含有一個或多個交聯(lián)部分。
在另一個優(yōu)選例中，多肽與非活化細(xì)胞的低于15％，優(yōu)選低于10％殺傷相比，影響至少50％，優(yōu)選至少80％活化細(xì)胞的殺傷作用。
本發(fā)明的組合物可用于治療各種細(xì)胞，例如淋巴樣細(xì)胞和非淋巴樣細(xì)胞，后者僅優(yōu)選表達(dá)MHC II類抗原的那些細(xì)胞。
在某些優(yōu)選例中，本組合物可抑制IL-2分泌的IC50在1μM或以下，甚至更優(yōu)選100nM、10nM或甚至1nM或以下。
在某些優(yōu)選例中，本組合物可抑制T細(xì)胞增殖的IC50在1μM或以下，甚至更優(yōu)選100nM、10nM或甚至1nM或以下。
本發(fā)明的組合物含有多肽，其中基于抗體的抗原結(jié)合域與一種或多種選自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型結(jié)合。在優(yōu)選例中，本組合物的抗原結(jié)合域提供了廣泛的DR反應(yīng)性，即給定組合物的抗原結(jié)合域與至少3個，更優(yōu)選至少5個或甚至7個不同的所述HLA-DR型上的表位結(jié)合。在一些實(shí)施例中，本組合物的多肽的抗原結(jié)合域與多個HLA-DR型結(jié)合，例如與至少人群60％，更優(yōu)選75％，和甚至更優(yōu)選85％的表達(dá)HLA DR的細(xì)胞結(jié)合。
在某些實(shí)施例中，基于抗體的抗原結(jié)合域包括VH區(qū)與VL區(qū)的組合，其中組合在選自MS-GPC-1、MS-GPC-2、MS-GPC-3、MS-GPC-4、MS-GPC-5、MS-GPC-6、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-14、MS-GPC-15、MS-GPC-16、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發(fā)現(xiàn)。
在其它實(shí)施例中，基于抗體的抗原結(jié)合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3在MS-GPC-1、MS-GPC-4、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發(fā)現(xiàn)。
在某些優(yōu)選例中，基于抗體的抗原結(jié)合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3序列取自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。優(yōu)選VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
在某些實(shí)施例中，基于抗體的抗原結(jié)合域與包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1組合的抗體競爭與抗原的結(jié)合。優(yōu)選競爭性抗體的VH CDR3序列取自共有CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。優(yōu)選VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
本多肽的基于抗體的抗原結(jié)合域可包括用下列通式代表的VL CDR1序列SGSnnNIGnNYVn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。在優(yōu)選例中，CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
在本發(fā)明組合物的某些實(shí)施例中，免疫應(yīng)答的抑制是由在所述細(xì)胞表面表達(dá)的所述抗原表達(dá)的下調(diào)引起或表現(xiàn)的。免疫應(yīng)答的抑制還可以或另選由所述細(xì)胞和其它細(xì)胞之間相互作用的抑制過程引起或表現(xiàn)，其中所述相互作用通常導(dǎo)致免疫應(yīng)答，或殺傷細(xì)胞。在后一種情況下，殺傷可通過用多種基于抗體的抗原結(jié)合域處理表達(dá)抗原的細(xì)胞來介導(dǎo)，每種基于抗體的抗原結(jié)合域是至少一種多價多肽的部分。在這種情況下，不需要細(xì)胞毒性物質(zhì)或免疫學(xué)機(jī)制來導(dǎo)致或引起所述殺傷。
在本多肽組合物的優(yōu)選例中，殺傷影響至少50％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％的活化細(xì)胞，與非活化細(xì)胞相比低于30％，優(yōu)選低于20％，更優(yōu)選低于10％。
本發(fā)明的組合物的鑒定還包括誘導(dǎo)由細(xì)胞的固有的預(yù)編程過程介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。其中細(xì)胞殺傷作用是這類多肽的活性，殺傷優(yōu)選是非凋亡性的，依賴于非天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的作用，如殺傷不依賴于被zVAD-fmk或zDEVD-fmk抑制的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。
在某些優(yōu)選例中，本發(fā)明的組合物包括選自Fv、scFv、dsFv、Fab片段、F(ab’)2和小抗體片段的抗體片段。本組合物還可包括至少一個完整抗體，例如選自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM家族的抗體。
在某些情況下，本組合物理想的是包括一個或多個交聯(lián)部分，使抗原結(jié)合位點(diǎn)與聚合物交聯(lián)。
在優(yōu)選例中，本組合物可配制在藥物可接受的載體和/或稀釋劑中。例如，本發(fā)明特別考慮含有量足夠抑制動物，特別所述動物是人體內(nèi)的免疫應(yīng)答的本抗原結(jié)合組合物的藥物制劑。
本發(fā)明提供了一種藥物制劑，它包括量足夠抑制動物，例如人體內(nèi)IL-2分泌的本抗原結(jié)合組合物。
本發(fā)明提供了一種藥物制劑，它包括量足夠抑制動物，例如人體內(nèi)T細(xì)胞增殖的本抗原結(jié)合組合物。
本方法還提供了包括抗原結(jié)合組合物的診斷組合物。
在另一個實(shí)施例中，本方法利用本發(fā)明的抗原結(jié)合組合物制備治療動物，例如所述動物是人類的藥物制劑。
本發(fā)明還提供了含有多肽的蛋白質(zhì)編碼序列的核酸，該多肽具有人組合物的至少一個基于抗體的抗原結(jié)合域，該結(jié)合域具有針對細(xì)胞表面表達(dá)的抗原的結(jié)合特異性。在優(yōu)選例中，用核酸編碼的多肽處理表達(dá)抗原的細(xì)胞導(dǎo)致或引起抑制免疫應(yīng)答，例如，其中抑制活性的IC50是1μM或以下，甚至更優(yōu)選100nM、10nM或甚至1nM或以下。特別考慮含有蛋白質(zhì)編碼序列和與其可操縱性連結(jié)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的載體，以及攜帶核酸或載體的細(xì)胞。
可用這些重組宿主細(xì)胞通過在核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，產(chǎn)生免疫抑制組合物。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種抑制免疫系統(tǒng)的細(xì)胞活化和/或增殖的方法。該方法通過用含有人組合物的基于抗體的至少一個抗原結(jié)合域的多肽組合物來處理細(xì)胞，該結(jié)合域與在細(xì)胞表面表達(dá)的抗原有結(jié)合特異性。在優(yōu)選例中，用核酸編碼的多肽處理表達(dá)抗原的細(xì)胞導(dǎo)致或引起免疫應(yīng)答的抑制，例如其中抑制活性的IC50是1μM或以下，甚至更優(yōu)選100nM、10nM或甚至1nM或以下?？捎妙愃频姆椒ㄒ种艻L-2表達(dá)和/或有免疫系統(tǒng)細(xì)胞參與的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。在某些優(yōu)選例中，本方法可用于例如通過對病人施用有效量的抗原-結(jié)合的組合物免疫抑制病人。
本發(fā)明還有一個方面提供了殺傷在所述細(xì)胞表面表達(dá)抗原的細(xì)胞的方法，該方法包括步驟用含有多種基于抗體的抗原結(jié)合域的組合物處理細(xì)胞，例如如上所述，其中基于抗體的抗原結(jié)合域是至少一種多價多肽的一部分，不需要細(xì)胞毒性物質(zhì)或免疫學(xué)機(jī)制來導(dǎo)致或引起死亡。優(yōu)選基于抗體的抗原結(jié)合域與HLA DR結(jié)合。
一些方法可用于治療選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年期關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、Grave氏病、胰島素依賴性糖尿病、發(fā)作性睡病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、腎小球性腎炎、甲狀腺炎、胰腺炎、胰島炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、過敏性腸病和Sjogren綜合征等疾病。
在另一個實(shí)施例中，提供了一種鑒定可以用本發(fā)明的抗原結(jié)合組合物治療的病人的方法，包括步驟a.從病人分離細(xì)胞；b.使所述細(xì)胞與抗原結(jié)合多肽的組合物接觸；和c.測定所述細(xì)胞疫抑制、IL2分泌或增殖的程度。
例如可用例如試劑盒實(shí)施該方法，試劑盒含有a.本發(fā)明的抗原結(jié)合組合物，和b.交聯(lián)基團(tuán)，和/或一個或多個可檢測基團(tuán)(可任選的包括試劑和/或溶液來影響和/或檢測與抗原的結(jié)合)。
在其它實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種含有與細(xì)胞毒性劑可操縱性連結(jié)的本抗原結(jié)合組合物的細(xì)胞毒性組合物。
另一個實(shí)施例提供了含有與免疫原性試劑可操縱性連結(jié)的本抗原結(jié)合組合物的免疫原性組合物。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種殺傷在細(xì)胞表面表達(dá)抗原的細(xì)胞，包括使所述細(xì)胞與本發(fā)明的抗原結(jié)合組合物接觸，該組合物與細(xì)胞毒性或免疫原性試劑可操縱性連結(jié)。對此，本發(fā)明還特別考慮用與細(xì)胞毒性或免疫原性藥劑可操縱性連結(jié)的本抗原結(jié)合組合物制備治療動物的藥物組合物。
本發(fā)明的還有一個方面提供了一種進(jìn)行藥物商業(yè)活動的方法，包括(i)分離一種或多種基于抗體的抗原結(jié)合域，這些抗原結(jié)合域與人細(xì)胞表面表達(dá)的MHC II類以1μM或以下的Kd結(jié)合；(ii)產(chǎn)生含有所述基于抗體的抗原結(jié)合域的組合物，該組合物具有IC50在100nM或以下的免疫抑制性；(iii)進(jìn)行所述組合物在動物中效力和毒性的測量；(iv)制備描述所述組合物免疫抑制治療用途的包裝插頁；和(v)出售所述組合物用作免疫抑制劑。
另一個一種進(jìn)行生命科學(xué)商業(yè)活動的方法的實(shí)施例包括(i)分離一種或多種基于抗體的抗原結(jié)合域，這些抗原結(jié)合域以1μM或以下的Kd與人細(xì)胞表面的MHC II類結(jié)合；(ii)產(chǎn)生含有所述基于抗體的抗原結(jié)合域的組合物，組合物是免疫抑制性的，具有100nM或以下的IC50；(iii)對第三方授權(quán)，與第三方共同開發(fā)或出售給第三方出售所述組合物的權(quán)利。
根據(jù)本商業(yè)方法，可用一種方法分離基于抗體的抗原結(jié)合域，包括a.從重組抗體文庫用與HLA DR結(jié)合的能力分離人組合物的VL和VH區(qū)，b.產(chǎn)生VL和VH區(qū)之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列至少一個的變體文庫，和c.從變體文庫用與HLA DR以1μM或以下的Kd結(jié)合的能力分離VL和VH區(qū)。
根據(jù)本商業(yè)活動方法，抗原結(jié)合域可以是在選自MS-GPC-1、MS-GPC-2、MS-GPC-3、MS-GPC-4、MS-GPC-5、MS-GPC-6、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-14、MS-GPC-15、MS-GPC-16、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆中發(fā)現(xiàn)的VH和VL區(qū)的組合。
本文所用的術(shù)語“肽”指含有多個，即兩個或多個通過肽鍵連結(jié)的氨基酸的一條或多條鏈的分子。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”指肽，其中至少一部分肽具有或能夠通過在肽鏈內(nèi)和/或在肽鏈之間形成二級、三級或四級結(jié)構(gòu)，獲得確定的立體排列。該定義包括天然存在或至少部分人工的蛋白質(zhì)，以及全蛋白的片段或結(jié)構(gòu)域，只要這些片段或結(jié)構(gòu)域能獲得如上所述的確定立體排列。
術(shù)語“多肽”互換的指肽和/或蛋白質(zhì)。另外，術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”只要上下文允許，也可包括多鏈蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如具有重鏈和輕鏈的免疫球蛋白多肽。
在此，“含有至少一個基于抗體的抗原結(jié)合域的多肽”指免疫球蛋白(如IgG、IgA或IgM分子或抗體)或其功能性片段。術(shù)語“功能性片段”或“抗體片段”如常常所指的，指保留免疫球蛋白的抗原結(jié)合部分的免疫球蛋白的片段。本發(fā)明的功能性免疫球蛋白片段可以是Fv(Skerra和Plückthun，1988)、scFv(Bird等，1988；Huston等，1988)、二硫鍵連結(jié)的Fv(Glockshuber等，1992；Brinkmann等，1993)、Fab、F(ab’)2片段或其它本領(lǐng)域?qū)嵺`者熟知的片段，其包含免疫球蛋白或功能性免疫球蛋白片段的可變結(jié)構(gòu)域。
含有一條鏈的多肽的例子是單鏈Fv抗體片段，含有多條鏈的多肽的例子是Fab抗體片段。
本文所用的術(shù)語“抗體”，除非另外說明，廣泛用于同時指抗體分子和各種抗體衍生分子。該抗體衍生分子含有至少一個可變區(qū)(重鏈或輕鏈可變區(qū))并含有上述片段，以及獨(dú)立的抗體輕鏈、獨(dú)立的抗體重鏈、抗體鏈和其它分子之間的嵌合融合蛋白等。
為了本申請的目的，“價”指本多肽擁有的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。因此，二價多肽指具有兩個結(jié)合位點(diǎn)的多肽。術(shù)語“多價多肽”包含多肽的二價、三價、四價等形式。
免疫球蛋白分子的“抗原結(jié)合位點(diǎn)”指與抗原特異性結(jié)合必需的分子部分。抗原結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)選以1μM或以下，優(yōu)選小于100nM、10nM或甚至在某些情況下1nM的Kd與抗原結(jié)合。與抗原特異性結(jié)合應(yīng)包括與抗原的結(jié)合比與任何其它抗原的結(jié)合具有顯著高的親和力。
重(“H”)和輕(“L”)鏈N-末端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。在重鏈和輕鏈的V區(qū)內(nèi)有高度分散的三個延伸段稱為“超變區(qū)”，位于更保守的被稱作“框架區(qū)”或“FR”的旁側(cè)區(qū)之間。因此術(shù)語“FR”指天然存在于免疫球蛋白的超變區(qū)之間和附近的氨基酸序列。在一個抗體分子中，輕鏈的三個超變區(qū)和重鏈的三個超變區(qū)在立體空間相對排列，形成抗原結(jié)合表面?？乖Y(jié)合表面與結(jié)合抗原的立體表面互補(bǔ)，各重鏈和輕鏈的三個超變區(qū)稱為“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”。
因此，“基于抗體的抗原結(jié)合域”指一種或多種多肽，其形成保留抗體的至少一些結(jié)構(gòu)特征，例如至少一個CDR序列的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在某些優(yōu)選例中，基于抗體的抗原結(jié)合域包括足夠視為可變區(qū)的結(jié)構(gòu)，例如三個CDR區(qū)和分散的框架區(qū)?；诳贵w的抗原結(jié)合域可由一條對應(yīng)于VH或VL序列的多肽鏈，或由VH和VL序列的分子間或分子間聯(lián)系形成。
術(shù)語“重組抗體文庫”描述了展示包裝，如生物學(xué)顆粒的集合，它們各具有(a)在顆粒表面上的至少一個抗原結(jié)合域表達(dá)的遺傳信息，和(b)提供使顆粒能復(fù)制的遺傳信息。例如，包裝能顯示含有抗原結(jié)合域的融合蛋白。融合蛋白的抗原結(jié)合域由顯示包裝代表，條件是允許抗原結(jié)合域與顯示包裝接觸的靶表位結(jié)合。顯示包裝通常衍生自能夠采集非常多樣的抗體文庫樣品的系統(tǒng)。顯示包裝可以衍生自例如植物細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌孢子和細(xì)菌病毒。
在本發(fā)明的一個示范性實(shí)施例中，顯示包裝是噬菌體顆粒，其含有含測試抗原結(jié)合域的氨基酸序列的肽融合外殼蛋白。因此，產(chǎn)生了編碼肽融合外殼蛋白文庫的可復(fù)制噬菌體載體，尤其是噬菌粒(如本文定義)的文庫，用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。根據(jù)與特定噬菌體顆粒結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合靶表位的能力，通過親和篩選分離嵌合蛋白形成的噬菌體顆粒。在一個優(yōu)選例中，文庫的各獨(dú)立噬菌體顆粒包括顯示在包裝表面的編碼肽融合包裹蛋白的拷貝。產(chǎn)生本多樣化肽文庫的示范性噬菌體包括M13、f1、fd、lf1、lke、Xf、Pf1、Pf3、λ、T4、T7、P2、P4、φX-174、MS2和f2。
術(shù)語“產(chǎn)生CDR1、CDR2和CDR3至少一種的變體文庫”指產(chǎn)生變體抗原結(jié)合位點(diǎn)文庫的方法，其中文庫成員的差異是CDR序列，例如非FR序列中的一個或多個改變。這些文庫可通過從所選的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一個或多個CDR序列隨機(jī)或半隨機(jī)誘變產(chǎn)生。
本文所用的“人組合物的基于抗體的抗原結(jié)合域”優(yōu)選意味著含有至少一個抗體VH區(qū)和抗體VL區(qū)的肽，其中在含有免疫球蛋白序列的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中的同源性檢索得到人起源的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域中VH和VL區(qū)都以最高的序列相同性程度命中。這樣的同源性檢索可以是BLAST檢索，例如通過登錄國家生物信息中心的序列數(shù)據(jù)庫，用“blastp”例行程序進(jìn)行“BasicBLAST”檢索。另見Altschul等(1990)J Mol Biol 215403-410。優(yōu)選當(dāng)施給人受體時，這樣的組合物不導(dǎo)致不良免疫應(yīng)答。在某些優(yōu)選例中，人組合物的抗原結(jié)合域包括天然人免疫球蛋白的框架區(qū)，并可從激活的人B細(xì)胞克隆，雖然不需要天然人抗體的所有CDR。
本文所用的術(shù)語“小抗體片段”指含有通過與所述結(jié)構(gòu)域分別融合的自我結(jié)合的各結(jié)構(gòu)域，而聚合的抗原結(jié)合域的多價抗體片段(Pack等，1994)，例如，含有兩條scFv片段的二聚體，分別與自我結(jié)合的二聚結(jié)構(gòu)域融合。特別優(yōu)選的二聚結(jié)構(gòu)域包括衍生自亮氨酸拉鏈(Pack和Plückthun，1992)或螺旋-轉(zhuǎn)彎-螺旋基序(Pack等，1993)的結(jié)構(gòu)域。
本文所用的“活化的細(xì)胞”指一群感興趣的細(xì)胞，它們不在休眠?；罨梢杂煽乖?、有絲分裂原(例如脂多糖、植物血凝素)或細(xì)胞因子(如干擾素γ)引起。優(yōu)選所述活化在免疫應(yīng)答產(chǎn)生過程中的休眠T和B細(xì)胞受刺激發(fā)生的?；罨?xì)胞可以是某些淋巴腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選活化的細(xì)胞的特征是在細(xì)胞表面表達(dá)MHC II類分子和一種或多種其它特征，包括細(xì)胞尺寸變大，細(xì)胞分化，DNA復(fù)制，CD45或CD11表達(dá)和產(chǎn)生/分泌免疫球蛋白。
本文所用的“非活化細(xì)胞”意味著一群感興趣的細(xì)胞，大多數(shù)處于休眠和不分裂狀態(tài)。所述非活化的細(xì)胞可包括從健康人血液純化的休眠B細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選的特征是在細(xì)胞表面表達(dá)的MHC II類分子缺乏或減少，并且一種或多種其它特征，包括細(xì)胞尺寸變大，細(xì)胞分化，DNA復(fù)制，CD45或CD11表達(dá)和產(chǎn)生/分泌免疫球蛋白缺乏或減少。
當(dāng)用于細(xì)胞系或細(xì)胞時，“淋巴樣細(xì)胞”意味著該細(xì)胞系或細(xì)胞衍生自淋巴品系，包括B和T淋巴細(xì)胞品系和巨噬細(xì)胞品系。
“非淋巴樣細(xì)胞和表達(dá)MHC II類”意味著除了淋巴樣細(xì)胞以外的在病理性炎癥反應(yīng)中表達(dá)MHC II類分子的細(xì)胞。例如所述細(xì)胞包括滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，還可以含有基因改變的能表達(dá)MHC II類分子的細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語“HLA-DRα鏈的第一結(jié)構(gòu)域”意味著α-鏈的N-末端結(jié)構(gòu)域。
本文所用的術(shù)語“HLA-DR β鏈的第一結(jié)構(gòu)域”意味著β-鏈的N-末端結(jié)構(gòu)域。
本文所用的術(shù)語“免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)”涉及個體的免疫應(yīng)答活性的改變或代表免疫系統(tǒng)部分的體外系統(tǒng)的改變。所述活性的改變導(dǎo)致或引起免疫抑制。
術(shù)語“免疫抑制”指通過輻照處理或施用抗代謝藥物、抗淋巴細(xì)胞血清或特異性抗體防止或減弱免疫應(yīng)答。
術(shù)語“免疫應(yīng)答”指任何免疫系統(tǒng)或形成免疫系統(tǒng)部分的細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)對抗原性刺激的反應(yīng)，包括但不限于抗體產(chǎn)生，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力和免疫耐受。
本文所用的關(guān)于免疫抑制的術(shù)語“IC50”指產(chǎn)生50％最大應(yīng)答或效果，例如抑制免疫應(yīng)答，如可由T細(xì)胞活化(細(xì)胞應(yīng)答)或B-細(xì)胞活化(體液應(yīng)答)體現(xiàn)的該組合物的濃度。
術(shù)語“凋亡”和“凋亡活性”指哺乳動物中的細(xì)胞死亡形式，其特征是伴有一種或多種形態(tài)和生物化學(xué)特征，包括核與胞質(zhì)縮合，染色質(zhì)聚集，原生質(zhì)膜微絨毛喪失，胞質(zhì)和核分解到含有核糖體、形態(tài)完整的線粒體和核物質(zhì)的膜結(jié)合小泡(凋亡體)中，染色體DNA的降解或喪失線粒體功能。凋亡遵循非常嚴(yán)格的時間過程，并由天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶執(zhí)行，它是非常專一的一組蛋白酶。可通過細(xì)胞存活率試驗(yàn)，Annexin V染色或天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制試驗(yàn)確定或測定凋亡活性?？捎媒宦?lián)抗體，例如抗CD95如實(shí)施例H中所述誘導(dǎo)凋亡。
術(shù)語“天然預(yù)編程過程”指一個一旦開始就沿自動的級聯(lián)機(jī)制在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的過程，它不需要從所述細(xì)胞的環(huán)境中獲得任何其它輔助支持來完成該過程。
本文所用的術(shù)語“HuCAL”指Knappik等(2000)所述的完全合成的人組合抗體文庫。
本文所用的術(shù)語“CDR3”指抗體或其片段的VH和VL區(qū)的第三互補(bǔ)決定區(qū)，其中VH CDR3覆蓋位置95-102(可能在位置100后的插入列為100a-100z)，VL CDR3位置89-96(可能在Vλ中95位后的插入列為95a-95c)(見Knappik等，2000)。
本文所用的關(guān)于免疫球蛋白分子的術(shù)語“可變區(qū)”具有本來由免疫學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對術(shù)語確定的普通意義?？贵w的重鏈和抗體輕鏈都分成“可變區(qū)”和“恒定區(qū)”。可變區(qū)和重鏈區(qū)之間的分界點(diǎn)可輕易的由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)描述抗體結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)確定，例如Kabat等“免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)序列第五版”，美國健康和人類服務(wù)部，美國政府出版署(1991)。
本文所用的術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”要描述雜交和洗滌條件，在該條件下至少60％彼此同源的核苷酸通常維持彼此雜交。優(yōu)選條件是至少65％，更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選75％彼此同源的序列維持彼此雜交。這種嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York(1999)，6.3.1-6.3.6中發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選的嚴(yán)格雜交條件的非限制性例子是在約45℃下在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后用0.2x SSC、0.1％SDS在50-65℃洗滌一次或多次。
“蛋白質(zhì)編碼序列”或“編碼”特定多肽或肽的序列是一種在體外或體內(nèi)當(dāng)置于合適調(diào)控序列控制下時轉(zhuǎn)錄(就DNA而言)并翻譯(就mRNA而言)成多肽的核酸序列。編碼序列的邊界由5’(氨基)端的起始密碼子和3’(羧基)端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限于來自原核或真核mRNA的cDNA，來自原核或真核DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3’。
類似的，不論從其上下文是否明顯，“編碼”將意味著包括編碼多肽的DNA序列，如該術(shù)語通常使用的，也包括轉(zhuǎn)錄成抑制性反義分子的DNA序列。
本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”意味著在受體細(xì)胞中通過核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移引入異源核酸，例如表達(dá)載體?！八矔r轉(zhuǎn)染”指外源DNA不整合入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組的情況，例如附加體DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，翻譯成蛋白質(zhì)。當(dāng)核酸構(gòu)建體能由子代細(xì)胞繼承時，細(xì)胞被核酸構(gòu)建物“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染”。
“表達(dá)載體”指用于表達(dá)DNA的可復(fù)制DNA構(gòu)建物，該DNA表達(dá)所需蛋白質(zhì)并含有轉(zhuǎn)錄單元，該單元含有集合，包括(1)具有基因表達(dá)調(diào)控作用的因子，例如啟動子、操縱子或增強(qiáng)子，可操縱性連結(jié)到(2)編碼所需蛋白質(zhì)(例如本發(fā)明的多肽)的DNA序列，其轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成蛋白質(zhì)，和(3)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件起始和終止序列。啟動子和其它調(diào)控元件的選擇通常根據(jù)所需的宿主細(xì)胞變化。一般在重組DNA技術(shù)中所用的表達(dá)載體常常是“質(zhì)粒”形式，指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，它們在載體形式下不與染色體結(jié)合。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明應(yīng)包括其它起到相等功能，并在下文中提到的本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體形式。
在表達(dá)載體中，控制轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)控元件通?？裳苌圆溉閯游?、微生物、病毒或昆蟲基因?？闪硗鈸饺朐谒拗髦袕?fù)制的能力，例如由復(fù)制起始點(diǎn)賦予的，和促使轉(zhuǎn)化子識別的選擇基因?？梢允褂醚苌圆《荆绶崔D(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等的載體。
“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”是整篇文獻(xiàn)中使用的術(shù)語，指DNA序列，例如起始信號、增強(qiáng)子和啟動子等，其誘導(dǎo)或控制與其可操縱連結(jié)的蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。應(yīng)理解重組基因可以在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的控制下，該序列可以與控制基因天然存在形式的轉(zhuǎn)錄的序列(如存在)相同或不同。
當(dāng)描述兩個DNA區(qū)域之間的關(guān)系時，“可操縱性連接”簡單意味著它們在功能上彼此相關(guān)。例如，如果啟動子或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，它與編碼序列可操縱性連接。
本文所用的術(shù)語“融合蛋白”是領(lǐng)域內(nèi)已知的，指一種嵌合蛋白，其至少最初表達(dá)成含有衍生自兩種或多種不同蛋白質(zhì)的氨基酸序列的單鏈蛋白質(zhì)，例如融合蛋白是融合基因的基因產(chǎn)物。
本文所用的術(shù)語“動物”指哺乳動物，優(yōu)選人等哺乳動物。類似的，用本發(fā)明的方法治療的“病人”或“個體”可以指人或非人動物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以藥物學(xué)可接受的組合物施用肽。一般單克隆抗體、抗體片段和肽的藥物學(xué)可接受的載體是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的。本文所用的術(shù)語“藥物學(xué)可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、糖衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。在優(yōu)選例中，施用不影響活性成分的生物活性作用和在給藥濃度下對宿主沒有過度毒性的載體介質(zhì)。給藥可以用任何合適技術(shù)進(jìn)行，包括皮下和胃腸外給藥，優(yōu)選胃腸外。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和腹膜內(nèi)，其中靜脈內(nèi)是優(yōu)選的。
適合注射用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體和用于當(dāng)場制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。就所有情況而言，形式必須是無菌的，而且必須是達(dá)到能夠方便用于注射。它必須在制造和儲藏條件下穩(wěn)定，必須保護(hù)免受微生物，例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物和植物油。可通過使用包衣，例如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需粒徑并使用表面活性劑來維持合適的流動性。可用各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選含有等滲劑，例如糖或氯化鈉。延長注射組合物的吸收可通過在組合物中使用延緩吸收劑組合物，例如單硬脂酸鋁和明膠實(shí)現(xiàn)。
通過在合適溶劑中摻入所需量的活性化合物，例如主題多肽以及各種其它如需要的上述成分過濾消毒制備無菌注射溶液。一般通過將各種滅菌的活性成分摻入無菌載體，其含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的其它上述成分，制備分散體。就制備無菌注射溶液的無菌粉末而言，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和凍干技術(shù)，得到活性成分加上任何其它所需的來自先前無菌過濾的溶液的成分的粉末。
為了口腔給藥，本發(fā)明的多肽可與賦形劑一起摻入，并以非吞服的漱口液和潔牙劑形式使用。漱口液可以通過將活性成分以所需量摻入合適的溶劑，如硼酸鈉溶液(Dobell溶液)制備?；钚猿煞诌€可以分散在潔牙劑中，包括凝膠、軟膏、粉末和漿液?；钚猿煞挚梢砸灾委熡行Я考拥窖栏嘀校梢院兴?、粘合劑、摩擦劑、調(diào)味劑、發(fā)泡劑和濕潤劑。
本發(fā)明的組合物可以配制成中性或鹽形式。藥物學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(由蛋白質(zhì)的游離氨基形成)和無機(jī)酸，例如鹽酸或磷酸形成的鹽類，或有機(jī)酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸形成的酸，從無機(jī)堿，例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物衍生的堿，和有機(jī)堿，例如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等衍生的有機(jī)堿也都可衍生形成不含羧基的鹽類。
對于在水溶液中胃腸外給藥，例如該溶液如需要必須是合適緩沖的，而液態(tài)稀釋劑首先用足量鹽水或葡萄糖變成等滲。這些特定水溶液尤其適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。因此，可以使用的無菌水相介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開已知的。例如，一劑量能夠溶于1毫升等滲NaCl溶液，并加到1000ml皮下灌注液中或注射到指定的輸液位點(diǎn)(見例如“Remington’s PharmaceuticalSciences”15版，1035-1038頁和1570-1580)。劑量中的一些變化必須根據(jù)要治療的個體的病況而定。負(fù)責(zé)給藥的人將在任何事件中確定對于各病人的合適劑量。另外，對于人類給藥，制劑必須符合無菌、致熱性、FDA局的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)所要求的基本安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。
配制后，溶液可以按與定量制劑相同的方式施用，其用量具有同樣的治療效果。各種制劑很容易以各種劑量方式施用，例如各種注射用溶液、藥物緩釋膠囊等。
本文所用的術(shù)語“預(yù)防性或治療性”處理指在醫(yī)療條件下施給宿主，例如導(dǎo)致免疫抑制。如果在接觸該條件前施用，處理是預(yù)防性的，而如果在感染或疾病開始后給藥，處理是治療性的。
本發(fā)明的多肽含有人組合物的至少一個基于抗體的抗原結(jié)合域，該結(jié)合域?qū)τ谌薓HC II類抗原具有結(jié)合特異性，其中所述多肽與所述在細(xì)胞表面表達(dá)的抗原的結(jié)合導(dǎo)致或引起免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，含有至少一種本發(fā)明的抗體結(jié)合性多肽，可任選的含有藥物學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。本發(fā)明的多肽優(yōu)選用于制備治療動物，優(yōu)選人類的藥物組合物。本發(fā)明的多肽優(yōu)選用于治療或預(yù)防以MHC II類介導(dǎo)的T和/或B細(xì)胞活化為特征的病況。在另一個優(yōu)選例中，所述處理是治療或預(yù)防一種以在炎癥的病理位點(diǎn)表達(dá)MHC II類分子為特征的病況。在另一個優(yōu)選例中，所述治療是治療或預(yù)防免疫系統(tǒng)的疾病。
在一個優(yōu)選例中，本發(fā)明的抗原結(jié)合性組合物可用于治療免疫系統(tǒng)疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年期關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、Grave氏病、發(fā)作性睡眠病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重癥肌無力、尋常性天皰瘡、腎小球性腎炎、甲狀腺炎、胰腺炎、胰島炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、過敏性腸病和Sjogren綜合征。
本發(fā)明還涉及一種診斷組合物，其含有至少一種本發(fā)明的多肽和/或核酸，可任選的含有其它試劑，例如緩沖劑來進(jìn)行診斷。
另外，本發(fā)明涉及一種試劑盒，它含有(i)本發(fā)明的多肽，(ii)一個或多個可檢測基團(tuán)，和(iii)影響和/或檢測(i)與抗原的結(jié)合的試劑和/或溶液。
附圖簡述

圖1a.抗-HLA-DR抗體片段的特異性MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6與HLA-DR蛋白、陰性對照蛋白(BSA、睪丸酮-BSA、溶菌酶和人脫輔基轉(zhuǎn)鐵蛋白)，和空微量滴定板孔(塑料)的結(jié)合。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA法評估特異性。
b.抗-HLA-DR抗體片段的特異性從HuCAL文庫分離到的MS-GPC-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、15和16與HLA-DR蛋白、小鼠-人嵌合HLA蛋白和陰性對照蛋白(溶菌酶、脫氧鐵運(yùn)鐵蛋白、BSA和人γ-球蛋白)的結(jié)合。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA法評估特異性。用非相關(guān)抗體片段(irr.scFv)作為對照。
圖2抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、15和16，以及MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-6-17與各種表達(dá)MHC II類分子的細(xì)胞系的反應(yīng)性?！?”代表用標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光法檢測的強(qiáng)反應(yīng)性?！?/-”代表弱反應(yīng)性，“-”代表檢測不到抗-HLA-DR抗體片段或IgG與特定細(xì)胞系的反應(yīng)性。
圖3腫瘤細(xì)胞在單價和交聯(lián)抗-HLA-DR抗體片段存在下用臺盼藍(lán)染色評估的存活率。在與抗-HLA-DR抗體片段(MS-GPC-1、6、8和10)與和不與抗-FLAG M2 mAb作為交聯(lián)劑培養(yǎng)4小時后評估的GRANTA-519細(xì)胞的存活率。
圖4表5數(shù)據(jù)的分散繪圖和擬合對數(shù)曲線，顯示本發(fā)明人抗體片段的IgG形式的50nM溶液與200nM小鼠抗體溶液治療相比，殺傷效力提高?？招膱A代表用小鼠抗體L243和8D1治療的細(xì)胞系的數(shù)據(jù)，實(shí)心圓代表人抗體MS-GPC-8、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-6-13的數(shù)據(jù)。人(實(shí)線)和小鼠(短劃線)mAb殺傷數(shù)據(jù)的擬合對數(shù)曲線顯示用50nM人mAb治療比小鼠mAb總體上要好，盡管后者最終治療濃度是200nM。
圖5活化對非活化細(xì)胞的殺傷。用脂多糖。干擾素-γ和植物血凝素活化MHH-PREB-1細(xì)胞，然后與0.07-3300nM抗HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式一起保溫4小時。在對照的非活化MHH-PREB-1細(xì)胞中未見存活率下降。
圖6對照(無抗體、非細(xì)胞毒性小鼠IgG1oF12；淡灰色)和抗-HLA-DR抗體片段的人(MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41；暗灰色)IgG形式針對從病人分離出的CLL細(xì)胞的殺傷效力。左側(cè)，培養(yǎng)4小時(h4)和24小時(h24)后10個病人的休眠細(xì)胞培養(yǎng)物針對抗體的存活率數(shù)據(jù)的條狀圖表示。右側(cè)，培養(yǎng)4小時(h4)和24小時(h24)后6個病人的活化細(xì)胞培養(yǎng)物針對抗體的存活率數(shù)據(jù)的條狀圖表示。
圖7本發(fā)明某些抗-HLA-DR抗體片段的濃度依賴性細(xì)胞存活率。豎線表示對各抗體片段獲得的重復(fù)數(shù)據(jù)對數(shù)非線性回歸估計(jì)的EC50值。a)交聯(lián)二價抗-HLA-DR抗體F(ab)片段二聚物MS-GPC-10(圓圈和實(shí)線)、MS-GPC-8(三角和短劃線)和MS-GPC-1(十字和虛線)的殺傷曲線。b)交聯(lián)二價抗-HLA-DR抗體(Fab)片段二聚物MS-GPC-8-17(圓圈和實(shí)線)、小鼠IgGs 8D1(三角和短劃線)和L243(十字和虛線)的殺傷曲線。c)交聯(lián)二價抗-HLA-DR抗體(Fab)片段二聚物GPC-8-6-2(三角和劃線)、小鼠IgGs 8D1(圓圈和實(shí)線)和L243(十字和短劃線)的殺傷曲線。d)人抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57(十字和短劃線)、MS-GPC-8-27-41(大叉和虛線)、小鼠IgGs 8D1(圓圈和實(shí)線)和L243(三角和劃線)的殺傷曲線。所有濃度以二價制劑(IgG或交聯(lián)(Fab)二聚物)的nM給出。
圖8a.Priess細(xì)胞與抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8(用抗-FLAG M2 mAb交聯(lián))一起培養(yǎng)，顯示比用抗-CD95 mAb誘導(dǎo)的Priess細(xì)胞凋亡培養(yǎng)物更迅速的殺傷。Annexin V/PI染色技術(shù)可鑒定出Annexin V染色陽性的和PI陽性染色的壞死細(xì)胞。
b.Priess細(xì)胞與抗-HLA-DR的抗體片段MS-GPC-8(用抗-FLAG M2 mAb交聯(lián))一起培養(yǎng)，與用抗-CD95 mAb誘導(dǎo)的Priess細(xì)胞凋亡培養(yǎng)物相比顯示幾乎沒有凋亡機(jī)制的證據(jù)。Annexin V/PI染色技術(shù)可鑒定出Annexin V陽性和PI陰性染色的凋亡細(xì)胞。
圖9a.用實(shí)驗(yàn)確定抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-6-13的IgG形式抑制T-雜交瘤細(xì)胞的IL-2分泌的免疫抑制性質(zhì)。
b.用實(shí)驗(yàn)確定抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-27-41、MS-和MS-GPC-8-6-19的單價Fab形式抑制T-雜交瘤細(xì)胞的IL-2分泌的免疫抑制性質(zhì)。
IgG形式(二價)的濃度用濃度表示，雖然Fab形式(單價)的濃度用Fab形式濃度的一半表示，使得能直接與IgG形式的濃度比較。
圖10在確定T細(xì)胞增殖抑制的實(shí)驗(yàn)中抗HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式的免疫抑制性質(zhì)。
圖11
scFv噬菌體的載體作圖和序列顯示載體pMORPH13_scFv載體pMORPH13_scFv是噬菌粒載體，含有編碼絲狀噬菌體的基因III蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域和HuCAL scFV的融合蛋白的基因。在圖11中，顯示了含有模式scFv基因(VH1A和Vλ3(Knappik等，2000))的載體。
原始HuCAL主宰基因(Knappik等(2000)見其中的圖3)是用其真實(shí)N-末端VH1A、VH1B、VH2、VH4和VH6構(gòu)建的，其中Q(＝CAG)是第一個氨基酸。VH3和VH5，其中E(＝GAA)是第一個氨基酸。載體pMORPH13-scFv含有與VH鏈融合的短FLAG肽序列(DYKD)，因此該載體中的，和所有衍生自該載體的HuCAL VH鏈在第一個位置具有E(＝GAA)(例如在pMx7_FS載體中，見圖12)。
圖12scFv表達(dá)載體pMx7_FS_5D2的載體圖和序列當(dāng)VH-CH1與FLAG標(biāo)記(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)和STREP標(biāo)記II(WSHPQFEK)(IBA GmbH，Gttingen，Germany；見Schmidt和Skerra，1993；Schmidt和Skerra，1994；Schmidt等，1996；Voss和Skerra，1997)融合時，表達(dá)載體pMx7_FS_5D2導(dǎo)致HuCAL scFv片段的表達(dá)(在圖12中，載體含有稱為“5D2”的編碼“模擬”抗體片段的基因)。
圖13Fab表達(dá)載體pMx9_Fab_GPC8的載體圖和序列當(dāng)VH-CH1與FLAG標(biāo)記(Hopp等，1988；Knappik和Plückthun，1994)和STREP標(biāo)記II(WSHPQFEK)(IBA GmbH，Gttingen，Germany；見Schmidt和Skerra，1993；Schmidt和Skerra，1994；Schmidt等，1996；Voss和Skerra，1997)的組合融合時，表達(dá)載體pMx9_FS_GPC8導(dǎo)致HuCAL Fab片段的表達(dá)(在圖13中，載體含有Fab片段MS-GPC8)。
在pMx9_Fab載體中，克隆自scFv片段的HuCAL Fab片段(見圖11的圖片說明)不具有與VH鏈融合的短FLAG肽序列(DYKD)，該載體中的和直接衍生自該載體的HuCAL VH鏈在第一個位置都具有Q(＝CAG)。
圖14Fab噬菌體的載體圖和序列顯示載體pMORPH18 Fab GPC8
載體pMORPH18的衍生物是噬菌粒載體，含有編碼絲狀噬菌體的基因III蛋白C-末端結(jié)構(gòu)域和HuCAL抗體的VH-CH1鏈之間的融合的基因。另外，載體含有單獨(dú)編碼的VL-CL鏈。在圖14中，顯示了含有Fab片段MS-GPC-8的載體。
在pMORPH18載體中，克隆自scFv片段的HuCAL Fab片段(見圖11的插圖說明)不具有與VH鏈融合的短FLAG肽序列(DYKD)，該載體中的和直接衍生自該載體的HuCAL VH鏈在第一個位置具有Q(＝CAG)。
圖15MS-GPC-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、15和16，以及MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的VH和VL區(qū)的氨基酸序列。
圖15中的序列顯示原始HuCAL主宰基因結(jié)構(gòu)中的VH的氨基酸1(Knappik等(2000)見其中的圖3)。在scFv構(gòu)建物中，如該申請中所述，VH的氨基酸1總是E(見圖11的插圖說明)，在本申請的Fab構(gòu)建物中，VH的氨基酸1總是Q(見圖13的插圖說明)。
發(fā)明詳述下列實(shí)施例說明了本發(fā)明。
實(shí)施例所有不另外指出的緩沖液、溶液或方法可以在標(biāo)準(zhǔn)教科書檢索，例如CurrentProtocols of Immunology(1997和1999)或Sambrook等，1989(該參考文獻(xiàn)未出版)。除非另外說明，所有材料購自sigma，Deisenhofen，DE或Merck，Darmstadt，DE或引用的文獻(xiàn)中給出了來源。從LGC參考材料，Middlesex，UK中獲得雜交瘤細(xì)胞系LB3.1和L243；抗體8D1的數(shù)據(jù)由Dr.Matyas Sandor，University ofMichigan，Madison，WI，USA慷慨提供。
1.人抗原的制備為了證明我們能鑒定人組合物的細(xì)胞毒性抗原結(jié)合域，我們首先如下制備了人抗原的純化形式，來自PRIESS細(xì)胞(Gorga等，1984；Gorga等，1986；Gorga等，1987；Stern等，1992)的人MHC II類DR蛋白(DRA*0101/DRB*0401)。
首先，在RPMI和10％胎牛血清(FCS)中用標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)PRIESS細(xì)胞(ECACC，Salisbury UK)，在含有1％NP-40(BDH，Poole，UK)、25mM碘代乙酰胺、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和10mg/l的各種蛋白質(zhì)抑制劑(胰凝乳蛋白酶抑制劑、antipain、胃蛋白酶抑制劑A、大豆胰蛋白酶抑制劑和亮抑肽酶)的200毫升磷酸緩沖鹽(PBS)(pH7.5)中裂解1010細(xì)胞。10.000g(30分鐘，4℃)離心裂解物10分鐘，在得到的上清液中補(bǔ)充含有5％脫氧膽酸鈉、5mM碘代乙酰胺和10mg/l的各種蛋白酶抑制劑的40毫升水溶液，100，000g離心2小時(4℃)。為了除去非特異性結(jié)合和內(nèi)源的抗體，用PMSF將上清液稀釋成0.2mM，并過夜(4℃)通過家兔血清affigel-10柱(5毫升；為了制備，家兔血清(Charles River，Wilmington，MA，USA)與Affigel10(BioRad，Munich，DE)以3∶1的體積比培養(yǎng)，根據(jù)廠商指示洗滌)，然后用0.2ml/min的流速通過Protein G Sepharose Fast Flow柱(2毫；Pharmacia)。
第二，溫和混合預(yù)處理的裂解液與5毫升Protein G Sepharose Fast Flow珠，4℃保溫過夜，該珠與小鼠抗-HLA-DR抗體LB3.1(Protein G-SepharoseFF(Pharmacia)親和層析雜交瘤細(xì)胞系LB3.1的上清液)偶聯(lián)，然后轉(zhuǎn)移到小柱中，再用三種溶液充分洗滌(1)100毫升溶液，含有50mM Tris/HCl(pH8.0)，150mMNaCl，0.5％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，10％甘油和0.03％疊氮化鈉，流速為0.6ml/min。(2)25毫升溶液，含有50mM Tris/HCl(pH9.0)、0.5M NaCl、0.5％NP-40、0.5％脫氧膽酸鈉、10％甘油和0.03％疊氮化鈉，流速為0.9ml/min；(3)25毫升溶液，含有2mM Tris/HCl(pH8.0)、1％辛烷基-β-D-吡喃葡糖苷、10％甘油和0.03％疊氮化鈉，流速為0.9ml/min。
第三，用15毫升含有50mM二乙胺/HCl(pH11.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1％辛烷基-β-D-吡喃葡糖苷(Alexis Corp.，Lausen，CH)、10％甘油、10mM碘代乙酰胺和0.03％疊氮化鈉的溶液洗脫MHC II類DR蛋白(DRA*0101/DRB*0401)，流速為0.4ml/min。立即用100微升1M Tris/HCl(pH6.8)、150mM NaCl和1％辛烷基-β-D-吡喃葡糖苷中和800微升組分。重復(fù)孵育裂解液和LB3.1Protein GSepharose Fast Flow珠，直到裂解液中沒有MHC蛋白。合并MHC II類DR蛋白的純化洗脫組分(如SDS-PAGE分析)，用Vivaspin濃縮劑濃縮到1.0-1.3g/l(Greiner，Solingen，DE)和截留30kDa分子量。用相同的Vivaspin濃縮劑含有1％辛烷基-β-D-吡喃葡糖苷的PBS重新緩沖約1毫克MHC II類DR制劑，使得蛋白質(zhì)與BIAcore CM5芯片直接偶聯(lián)。
2.HuCAL的篩選2.1.介紹我們根據(jù)最新產(chǎn)生的概念(Knappik等，2000)鑒定了某些的人抗體文庫中針對人抗原(DRA*0101/DRB1*0401)的人組合物的抗原結(jié)合性抗體片段(MS-GPC-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、15和16)。在此得到總共49個不同框架的共有框架代表用于人免疫應(yīng)答的VH-和VL-亞類。設(shè)計(jì)這些主宰基因考慮并消除了蛋白質(zhì)凝聚的不良?xì)埢徒?dǎo)致基因分子組合物的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。在HuCAL-scFv中，隨機(jī)排列編碼49個主宰基因區(qū)域的VH-和CL-CDR3。
2.2.噬菌粒拯救，噬菌體擴(kuò)增和純化在大腸桿菌TG-1中克隆入基于噬菌粒的噬菌體顯示載體pMORPH13_scFv(見圖11)的HuCAL-scFv(Knappik等，2000)文庫，在含有34微克/毫升氯霉素和1％葡萄糖的2x TY培養(yǎng)基(2xTV-CG)中擴(kuò)增。在約0.5 OD60037℃進(jìn)行輔助噬菌體感染(VCSM13)，離心并重懸浮在2 x TY/34微克/毫升氯霉素/50微克/毫升卡那霉素/0.1mM IPTG中后，細(xì)胞在30℃生長過夜。從上清液中PEG-沉淀噬菌體(Ausubel等，1998)，重新懸浮在PBS/20％甘油中，儲藏在-80℃。兩輪淘洗之間的噬菌體擴(kuò)增如下進(jìn)行用洗脫噬菌體感染對數(shù)期中期的TG1-細(xì)胞，接種到補(bǔ)充了1％葡萄糖和34微克/毫升的氯霉素的LB-瓊脂糖中。30℃過夜培養(yǎng)后，刮下菌落，調(diào)節(jié)到0.5 OD600，如上法加入輔助性噬菌體。
2.3.手工固相淘洗用溶于PBS的MHC II類DRA*0101/DRB1*0401(如上制備)包裹MaxiSorpTM微量滴定板(Nunc，Roskikde，DK)的孔(2微克/孔)。用5％脫脂奶粉的PBS液中封閉后，在20℃下經(jīng)1小時加入1-5×1012如上純化的HuCAL-scFv噬菌體。幾次洗滌步驟后，用100mM三乙胺pH-洗脫結(jié)合的噬菌體，隨后用1M TRIS-Cl，pH7.0中和。如上所述在各輪之間通過噬菌體擴(kuò)增進(jìn)行三輪淘洗。
2.4.混合的固相/全細(xì)胞淘洗如2.3和2.2中所述，進(jìn)行三輪淘洗和噬菌體擴(kuò)增，除了在第二輪中，10毫升Falcon管中使用1毫升PBS/10％FCS的1×107到5×107PRIESS細(xì)胞，以進(jìn)行全細(xì)胞淘洗。20℃與噬菌體制備物培養(yǎng)1小時后，離心細(xì)胞懸液(2000rpm3分鐘)除去非結(jié)合的噬菌體，用10毫升PBS洗滌細(xì)胞三次，每次后如所述進(jìn)行離心。用100mMHCl通過pH-洗脫法洗脫出與細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體。另外，可以直接在三乙胺處理(100mM)和隨后中和后在懸液中加入大腸桿菌擴(kuò)增結(jié)合的噬菌體。
2.5.HLA-DR結(jié)合的scFv片段的鑒定用FACS分析在PRIESS細(xì)胞上篩選經(jīng)三輪固相淘洗(2.3)或混合固相/全細(xì)胞淘洗(2.4)后獲得的克隆與細(xì)胞表面HLA-DR的結(jié)合。為了表達(dá)，通過XbaI/EcoRI將scFv片段克隆到作為表達(dá)載體的pMX7_FS中(見圖12)。在下文實(shí)施例3.2中顯示了表達(dá)條件。
在4℃將106Priess細(xì)胞等分轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板中。經(jīng)60分鐘加入scFv的封閉緩沖液(PBS/5％FCS)溶液，用抗-FLAG M2抗體(Kodak)(1∶5000稀釋)，然后用多克隆山羊抗小鼠IgG抗體-R-藻紅素復(fù)合物(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA，USA，目錄號115-116-146，F(xiàn)(ab’)2片段)(1∶200稀釋液)檢測。將細(xì)胞固定在4％聚甲醛中，4℃儲藏。每個試驗(yàn)在FACS-Calibur(BD ImmunocytometrySystems，San Jose，CA，USA)上收集104個細(xì)胞。
在500個推定結(jié)合物中僅15個被鑒定為與Priess細(xì)胞特異性結(jié)合。如下所述進(jìn)一步分析這些克隆的免疫調(diào)節(jié)能力及其殺傷能力。表1包含由此鑒定的克隆MS-GPC-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、15和16。列出的VH和VL家族以及CDR3指所述的基于HuCAL共有的抗體基因(Knappik等，2000)；VH和VL CDR的序列如表1所示，VH和VL區(qū)的全序列如圖15所示。
3.Fab片段的產(chǎn)生3.1.scFv轉(zhuǎn)化為Fab從相應(yīng)的scFv片段如下產(chǎn)生了Fab-片段抗原結(jié)合多肽MS-GPC-1-Fab、MS-GPC-6-Fab、MS-GPC-8-Fab和MS-GPC-10-Fab。將scFv片段的重鏈和輕鏈可變區(qū)克隆入pMx9_Fab(圖13)，重鏈可變區(qū)作為MfeI/StyI片段，κ輕鏈的可變區(qū)作為EcoRV/BsiWI片段。λ鏈?zhǔn)紫葟南鄳?yīng)的作為模板的pMORPH13-scFv載體用PCR引物CRT(5’引物)和CRT6(3’引物)擴(kuò)增出來，其中CRT6引入獨(dú)特的DraIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
CRT55’GTGGTGGTTCCGATATC3’CRT65’AGCGTCACA CTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGGTTA3’用EcoRV/DraIII切割PCR產(chǎn)物，克隆入pMx9_Fab(見圖13)?？捎枚嗫寺∩窖蚩谷薎gG抗體-R-藻紅素復(fù)合物(Jackson ImmnoResearch，West Grove，PA，USA，目錄號109-116-088，F(xiàn)(ab’)2片段)(1∶200稀釋)檢測Fab輕鏈。
3.2.HuCAL-抗體片段在大腸桿菌中的表達(dá)和純化在補(bǔ)充有34微克/毫升氯霉素的1升2x TY-培養(yǎng)基中分別在大腸桿菌細(xì)胞(JM83)中從pMX7_FS或pMx9_Fab表達(dá)scFv和Fab片段。用0.5mM IPTG(scFv)或0.1mM IPTG(Fab)誘導(dǎo)后，在22℃培養(yǎng)細(xì)胞12小時。在弗式壓碎器(ThermoSpectronic，Rochester，NY，USA)中在20mM磷酸鈉、0.5M NaCl和10mM咪唑(pH7.4)中裂解細(xì)胞沉淀。離心除去細(xì)胞碎片，用Streptactin基質(zhì)進(jìn)行STREP標(biāo)記純化前，使澄清上清液通過0.2微米孔，純化條件根據(jù)供應(yīng)商(IBA GmbH，Gttingen，Germany)。尺寸排阻層析(SEC)純化如Rheinnecker等進(jìn)行(1996)。通過SEC用標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)確定表觀分子量，在某些情況下用液相層析-質(zhì)分光計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證(TopLabGmbH，Matinsried，Germany)。
4.抗體片段的優(yōu)化為了優(yōu)化HLA-DR結(jié)合性抗體片段的某些生物學(xué)特征，用Fab片段之一MS-GPC-8-Fab通過隨機(jī)用所有λ鏈λ1-3庫替換HuCAL文庫的CDR3中的親本VLλ1，構(gòu)建Fab抗體片段文庫(Knippak等，2000)。
通過XbaI/EcoRI從pMx9_Fab_GPC-8將Fab片段MS-GPC-8-Fab(見3.1)克隆入pMORPH18_Fab，噬菌體顯示的Fab片段基于噬菌粒的載體，來產(chǎn)生pMORPH18_Fab_GPC-8(見圖14)。含有獨(dú)特DraIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的λ鏈庫(Knappik等，2000)用NsiI和DraIII切割，被克隆入pMORPH18_fab_GPC-8(見圖14pMORPH18_Fab_GPC-8的載體圖)。
如2.3中所述，進(jìn)行兩輪針對MHC II類DRA*0101/DRB1*0401(如上制備)的淘洗篩選得到Fab優(yōu)化文庫，除了在第二輪中包裹的抗原濃度降到12納克/孔。如2.5中所述，F(xiàn)ACS鑒定出優(yōu)化的克隆。這些克隆中有6個MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18和MS-GPC-8-27進(jìn)一步確定特征，都顯示如起始片段MS-GPC-8發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞殺傷作用。表1列出了MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18和MS-GPC-8-27的序列特征。列出的VH和VL家族和CDR3指所述的HuCAL基于共有的抗體基因(Knappik等，2000)，圖15顯示了MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17和MS-GPC-8-27的VH和VL區(qū)的全序列。
抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-6和MS-GPC-8-17的優(yōu)化Fab形式顯示對于起始MS-GPC-8改善的特征。例如，優(yōu)化抗體的EC50是15-20和5-20nM(與MS-GPC-8的20-40nM比較，其中濃度以二價交聯(lián)Fab二聚物的濃度給出)，對于MS-GPC-8-6和MS-GPC-8-17對MHH-Call 4細(xì)胞的最大殺傷能力分別確定為76％和78％(與MS-GPC-8的65％比較)。
為了進(jìn)一步優(yōu)化，通過盒式誘變用三核苷酸定向的誘變(Virneks等，1994)優(yōu)化衍生自MS-GPC-8(包括MS-GPC-8-10和MS-GPC-8-27)的一組抗-HLA-DR抗體片段的VL CDR1區(qū)域。簡單說，合成了一個VI1 CDR1文庫盒，它含有6個隨機(jī)位點(diǎn)(總可變性7.43×106)，克隆入VI1框架。用EcoRV和BbsI消化CDR1文庫，含有CDR1文庫的片段連接入pMORPH18_Fab中MS-GPC-8衍生的Fab抗體的λ輕鏈中(如上所述)，用EcoRV和BbsI消化。如上所述篩選得到的文庫。通過與HLA DR特異性結(jié)合鑒定了10個克隆(MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41)，顯示起始片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-10和MS-GPC-8-27所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞殺傷活性。表1包含MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的序列特征。列出的VH和VL家族和CDR3指所述的HuCAL基于共有的抗體基因(Knappik等，2000)，圖15顯示了MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57、和MS-GPC-8-27-41的VH和VL區(qū)的全序列。
如實(shí)施例10中所述，從10個克隆中細(xì)胞殺傷EC50有顯著提高，可選出4個Fab片段(MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41)。表1顯示在CDR1區(qū)域優(yōu)化的克隆的序列。
優(yōu)化過程不僅提高了優(yōu)化過程產(chǎn)生的抗-HLA-DR抗體片段的生物效力，還顯著改善了對HLA DR蛋白質(zhì)的抗體片段的親和力這一物理特征。例如，用表面等離子共振儀器(Biacore，Upsala Sweden)根據(jù)實(shí)施例7測量了MS-GPC-8及其優(yōu)化子代的Fab形式的親和力。MS-GPC-8親本Fab的親和力在VLCDR3優(yōu)化后提高了100倍，從346nM到約60nM，VLCDR3+1優(yōu)化后進(jìn)一步改進(jìn)成一位數(shù)納摩爾親和力(范圍3-9nM)(表2)。
5.IgG的產(chǎn)生5.1 HuCAL-免疫球蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建如下克隆重鏈。除去pcDNA3.1+(Invitrogen)(NheI/ApaI)的多克隆位點(diǎn)，插入用于HuCAL設(shè)計(jì)的與限制性位點(diǎn)相容的填充片段，用于連接前導(dǎo)序列(NheI/EcoRI)、VH-結(jié)構(gòu)域(EcoRI/BlpI)和免疫球蛋白恒定區(qū)(BlpI/ApaI)。前導(dǎo)序列(EMBL M83133)具有Kozak序列(Kozak，1987)。人IgG1(PIR J00228)、IgG4(EMBL K01316)和血清IgA1(EMBL J00220)的恒定區(qū)分隔成長約70個堿基的重疊寡核苷酸。引入沉默突變除去與HuCAL設(shè)計(jì)不相容的限制性位點(diǎn)。用重疊延伸-PCR剪接寡核苷酸。
如下克隆輕鏈。用兩種不同的填充片段替換pcDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的多重克隆位點(diǎn)。κ-填充片段提供插入κ-前導(dǎo)序列(NheI/EcoRV)、HuCAL-scFv Vκ-結(jié)構(gòu)域(EcoRV/BsiWI)和κ-鏈恒定區(qū)(BsiWI/ApaI)的限制性位點(diǎn)。λ-填充片段中的相應(yīng)限制性位點(diǎn)是NheI/EcoRV(λ-前導(dǎo)序列)、EcoRV/HpaI(Vλ-結(jié)構(gòu)域)和HpaI/ApaI(λ鏈恒定區(qū))。κ-前導(dǎo)序列(EMBL Z00022)和λ-前導(dǎo)序列(EMBL L27692)都具有Kozak序列。人κ-(EMBL J00241)和λ-鏈(EMBL M18645)中的恒定區(qū)通過上述重疊延伸-PCR裝配。
5.2表達(dá)IgG的CHO細(xì)胞的產(chǎn)生所有細(xì)胞維持在37℃，含有5％CO2的濕潤大氣下，供應(yīng)商推薦的培養(yǎng)基中。CHO-K1(CRL-9618)來自ATCC，用等摩爾的IgG重鏈和輕鏈表達(dá)載體混合物共轉(zhuǎn)染。用600微克/毫升G418和300微克/毫升Zeocin(Invitrogen)選擇雙抗性的轉(zhuǎn)染子，然后極限稀釋。用捕獲-ELISA評估單克隆上清液的IgG表達(dá)。陽性克隆在補(bǔ)充有10％超低IgG-FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基(Life Technologies)中擴(kuò)大。將上清液pH調(diào)節(jié)到8.0和無菌過濾后，溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)A柱層析(Poros 20A，PEBiosystems)。
抗-HLA-DR抗原結(jié)合域的IgG形式顯示對抗體片段改進(jìn)的特征，這些改進(jìn)的特征包括親和力(實(shí)施例7)和殺傷效力(實(shí)施例9、10和14)。
6.HLA-DR特異性實(shí)驗(yàn)和表位作圖為了證明選自HuCAL文庫的抗原結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的與人MHC II受體N-末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，該受體在等位基因之間是大部分保守的，迄今在細(xì)胞殺傷領(lǐng)域中通過受體交聯(lián)是未知的，我們對其結(jié)合特異性進(jìn)行了評估，嘗試確定結(jié)合表位的特征。
Fab抗體片段MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6顯示與HLA-DR蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性，但沒有與非HLA-DR蛋白的特異性。用下列抗原測試了選自HuCAL文庫的Fab片段的反應(yīng)性HLA-DR蛋白(DRA*0101/DRB1*0401實(shí)施例1中制備，和一組無關(guān)的非-HLA-DR蛋白質(zhì)，包括BSA、睪丸酮-BSA、溶菌酶和人脫氧鐵運(yùn)鐵蛋白)。用空孔(塑料的)作為陰性對照。以1微克/孔PBS(Nunc-MaxiSorpTM)包裹抗原MHC II過夜，而對于其它抗原(BSA、睪丸酮-BSA、溶菌酶、脫氧鐵運(yùn)鐵蛋白)用10微克/孔。翌日用5％脫脂牛奶封閉1小時，然后與各抗體(抗-MHCII-Fab和無關(guān)Fab(Mac1-8A))以100納克/孔孵育1小時。抗人-IgG F(ab’)2-過氧化物酶-偶聯(lián)物在PBS中洗滌后(1∶10000在TBS(補(bǔ)充了5％w/v脫脂奶粉/0.05％v/v Tween 20)中的稀釋度)。加入底物POD(Roche)后，最終洗滌在PBS中進(jìn)行。用ELISA讀數(shù)儀在370nM檢查顯色情況。
所有抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8和MS-GPC-8-6都顯示對HLA-DR的高度特異性，如同將這些抗體片段與HLA-DR衍生的抗原培養(yǎng)時與對照比較證明可得到更高的熒光強(qiáng)度(圖1a)。在類似的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Fab片段MS-GPC-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、15和16同時與DRA*0101/DRB1*0401(如上制備)和含有DRA*0101和DRB1*0401的N-末端結(jié)構(gòu)域與衍生自小鼠II類同源物IEd(Ito等，1996)剩余的分子的嵌合DR-IE結(jié)合(圖1b)。
為了證明本發(fā)明的抗-HLA-DR抗體片段和IgG的廣泛DR反應(yīng)性，測試了MS-GPC-1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、15和16的scFv形式，測試了和MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-51和MS-GPC-8-6-13的IgG形式的針對從ECACC獲得的一類愛潑斯坦-巴爾病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系(Salisbury UK)的反應(yīng)性，分別對各人群中最常見的DR等位基因之一具有同源性(圖2顯示了細(xì)胞系和等位基因的表)還測試了抗體片段針對一系列轉(zhuǎn)染表達(dá)人MHCII類同型抗原的L細(xì)胞的反應(yīng)性(除了分別表達(dá)分子DRB3*0101、DRB4*0101、DP0103/0402、DP0202/0201和DQ0201、0602的DRB1L105.1、L257.6、L25.4、L256.12和L21.3(Klohe等，1988))。
用例如Otten等(1997)所述的免疫熒光法證明了抗原結(jié)合片段與一類表達(dá)各種MHC-II類分子的細(xì)胞系的反應(yīng)性。在2×105個細(xì)胞上用抗-FLAG M2抗體作為針對各抗-HLA-DR抗體片段攜帶的M2標(biāo)記的第二試劑和熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig(BD Pharmingen，Torrey Pine，CA，USA)作為染色劑進(jìn)行染色。將細(xì)胞在4℃與200nM抗-HLA-DR抗體片段孵育60分鐘，然后與廠商確定濃度的二抗和三抗一起孵育。對于IgG形式，省略二抗，用FITC標(biāo)記的小鼠抗人IgG4(Serotec，Oxford，UK)檢測IgG。在孵育步驟之間洗滌細(xì)胞。最后洗滌細(xì)胞并用FACS Calibur(BDImmunocytometry Systems，San Jose，CA，USA)分析。
圖2顯示scFv片段MS-GPC-1、2、5、6、7、8、10、11、14、15和16，以及MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-51和MS-GPC-8-6-13的IgG形式與所有測試的DRB1同型抗原反應(yīng)，而MS-GPC-3和4與測試的3種DRB1同型抗原反應(yīng)。該觀察結(jié)果以及所有HLA-DR抗體片段與嵌合DR-IE反應(yīng)的觀察結(jié)果合起來，提示所有所選的抗-HLA-DR抗體片段識別單形DRα鏈的胞外第一個結(jié)構(gòu)域或DRβ鏈胞外第一個結(jié)構(gòu)域上的單形表位。
然后我們嘗試進(jìn)一步通過檢測與小鼠抗體的競爭性結(jié)合定位MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的結(jié)合域，其中HLA-DR上的結(jié)構(gòu)域是已知的。已知小鼠抗體L243和LB3.1與α1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，1-1C4和8D1與β1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，10F12與β2結(jié)構(gòu)域結(jié)合(Vidovic等，1995b)。為此，開發(fā)了一種實(shí)驗(yàn)，其中首先將表達(dá)DR的細(xì)胞系(LG-2)與MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的IgG4形式，MS-GPC-8-10-57的Fab形式或GPC 8的Fab形式以及不相關(guān)的對照抗體一起孵育。然后加入各種小鼠抗體，并進(jìn)行檢測。如果MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的結(jié)合位點(diǎn)與小鼠抗體的結(jié)合重疊，那么預(yù)期小鼠抗體的檢測結(jié)果減少。
GPC-8-27-41和MS-GPC-8-10-57的IgG4形式和MS-GPC-8-10-57的Fab形式的結(jié)合基本上抑制(平均熒光強(qiáng)度降低＞90％)了1-1C4和8D1的結(jié)合，而L243、LB3.1和10F12和對照僅稍有影響。MS-GPC-8的Fab形式減少了1-1C4約50％的結(jié)合(平均熒光從244降到118)，終止8D1結(jié)合，僅稍微影響L243、LB3.1和10F12或?qū)φ盏慕Y(jié)合。無關(guān)的對照抗體不影響結(jié)合。因此，MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41看來識別等位HLA-DR分子中高度保守的β1結(jié)構(gòu)域表位。
在冰上進(jìn)行全染色過程。預(yù)先在含有2％FCS和35微克/毫升豚鼠IgG的PBS(“FACS-緩沖液”)中預(yù)封閉1×107個人B-淋巴母細(xì)胞系LG-2。這些細(xì)胞分成3等份A、B和C，各約3.3×106個細(xì)胞，其中加入A)35微克MS-GPC-8-10-57或MS-GPC-8-27-41 IgG4，B)35微克MS-GPC-8-10-57Fab或MS-GPC-8Fab，C)35微克不相關(guān)的IgG4作為陰性對照，孵育90分鐘。然后將A、B、C各分成6等份，每份含有5.5×105個細(xì)胞，將下列各2微克小鼠抗體加到指管中，孵育30分鐘1.)純化的mIgG；2.)L243；3.)LB3.1；4.)1-1 C4；5.)8D1；6.)10F12。然后，在各指管中加入4毫升PBS，指管300g離心8分鐘，細(xì)胞沉淀重懸浮在50微升含有稀釋1-25倍的山羊-抗-小鼠Ig-FITC復(fù)合物(最終濃度20微克/毫升)(BDPharmingen，Torrey Pines，CA，USA)的FACS緩沖液中。細(xì)胞避光培育30分鐘。然后，用4毫升PBS洗滌細(xì)胞，如上離心，重新懸浮在500微升PBS中，用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析(FACS Calibur，BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA，USA)。
用PepSpot技術(shù)(US 6040423；Heiskanen等，1999)進(jìn)一步鑒定MS-GPC 8-10-57的結(jié)合表位。簡單說，在纖維素膜上用固相肽合成點(diǎn)樣法(WO 00/12757)合成73條重疊15-聚肽陣列。這些肽序列分別衍生自HLA-DR4Dw14、HLA-DRA1*0101(殘基1-81)和HLA-DRB1*0401(殘基2-92)的α1和β1結(jié)構(gòu)域，有2個氨基酸的重疊。第二，將該陣列浸沒在0.1％Tween-20/PBS(PBS-T)中，用5％BSA在PBS-T中室溫封閉3小時，然后用PBS-T洗滌3次。第三，制備的陣列在室溫下和50毫升5mg/lGPC-8-10-57的IgG形式的1％BSA/PBS-T溶液孵育90分鐘。第四，結(jié)合后，用PBS-T洗滌膜三次，隨后在室溫下與偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的山羊抗人輕鏈抗體(在1％BSA/PBS-T中稀釋5000倍)孵育1小時。最后，用PBS-T洗滌膜3次，用化學(xué)發(fā)光檢測法在X光膠片上確定有無結(jié)合。對于山羊抗人輕鏈抗體非特異性結(jié)合的對照，用下列獨(dú)立洗滌步驟剝離肽陣列，各在室溫下進(jìn)行30分鐘PBS-T(2次)，水，DMF，水，含有8M尿素的水溶液，1％SDS，0.5％DTT，50％乙醇，10％乙酸的水溶液(各3次)，最后甲醇(2次)。再次封閉膜，洗滌，與偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的山羊抗人輕鏈抗體一起孵育，如上所述顯色。
7.抗HLA-DR抗體和抗體片段的親和力為了證明本發(fā)明抗HLA抗體片段的卓越結(jié)合性能，我們用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備，使用等離子體共振原理測量了它們與人MHC II形DR蛋白(DRA*0101/DRB1*0401)的親和力。我們意外在本發(fā)明一些抗HLA-DR抗體片段IgG形式亞納摩爾水平實(shí)現(xiàn)了親和力。例如，測量MS-GPC-8-27-41、MS-GPC-8-6-13和MS-GPC-8-10-57的IgG形式的親和力分別為0.3、0.5和0.6nM(表3a)。另外，我們觀察到在CDR1和CDR3輕鏈區(qū)成熟的Fab片段的親和力達(dá)到2-8nM范圍的高親和力(表3b)。僅在CDR3輕鏈區(qū)成熟的Fab片段親和力顯示40-100nM范圍內(nèi)的親和力(表3c)，甚至未優(yōu)化的HuCAL抗原結(jié)合域的Fab片段也顯示在亞微摩爾范圍內(nèi)的親和力(表3d)。我們驚奇的觀察到雖然CDR3優(yōu)化后Kon僅有中等程度的增加(2倍)，但Kon仍然在抗體優(yōu)化過程中在1×105M-1s-1的數(shù)量級中大致保持恒定，而Koff顯著下降是優(yōu)化過程的特征-對于本發(fā)明中未優(yōu)化的Fab、CDR3優(yōu)化的Fab、CDR3/CDR1優(yōu)化的Fab和抗HLA-DR抗體的IgG形式是亞100s-1、亞10s-1、亞1s-1和亞0.1s-1。
如下測量本發(fā)明抗HLA抗體片段的親和力。所有測量都用BIAcore3000型儀器(Biacore AB，Sweden)在HBS緩沖液(20mM HEPES、150mM NaCl，pH7.4)中，在25℃，以20微升/分鐘的流速進(jìn)行。MHC II類DR蛋白(在實(shí)施例1中制備)稀釋在100mMpH4.5的乙酸鈉中，至濃度50-100mg/ml，與CM5芯片(Biacore AB)用標(biāo)準(zhǔn)EDC-NHS偶聯(lián)化學(xué)偶聯(lián)，然后如廠商指示用乙醇胺處理。MHCII的包裹密度調(diào)節(jié)到500-4000RU之間。注射5個不同濃度的不同抗體，用Biacore Instrument的標(biāo)準(zhǔn)軟件測量親和力。用10mM甘氨酸pH2.3和7.5mM NaOH再生偶聯(lián)的表面。
8.抗HLA-DR抗體和抗體片段的多價殺傷作用為了證明不同效價對細(xì)胞殺傷的影響，用本發(fā)明針對GRANTA-519細(xì)胞的抗HLA-DR抗體片段單價、二價和多價的組合物進(jìn)行細(xì)胞殺傷試驗(yàn)。來自HuCAL文庫的抗-HLA-DR抗體片段當(dāng)與抗-FLAG M2 mAb共同孵育，交聯(lián)形成二價組合物時，與單價形式(抗體片段濃度200nM時5-30％殺傷)比較，顯示更高的細(xì)胞殺傷活性(抗體片段濃度200nM時60-90％殺傷)(圖3)。單獨(dú)或僅在抗-FLAG M2 mAb存在下，不和抗-HLA-DR抗體片段共同孵育細(xì)胞，不引起用細(xì)胞存活率測量的細(xì)胞毒性。如上處理細(xì)胞，但使用50nM抗體片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG4形式(天然二價)，而不加入抗FLAG M2 mAb，在孵育4小時后顯示76％、78％、78％和73％的殺傷效力。
另外，我們觀察到抗-HLA-DR抗體片段的更高等級的效價可進(jìn)一步顯著降低細(xì)胞存活率。在含有抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式的孵育復(fù)合物中加入蛋白質(zhì)G后，形成的多價復(fù)合物與抗HLA-DR抗體片段僅與二價IgG形式孵育后形成的二價組合物比較，進(jìn)一步降低細(xì)胞存活率。
在HLA-DR陽性腫瘤細(xì)胞系GRANTA-519(DSMZ，Germany)上測試選自HuCAL文庫的抗HLA-DR抗體片段的殺傷效力。37℃在6％CO2下，2×105個細(xì)胞與200nM抗HLA-DR抗體片段在補(bǔ)充有2.5％熱滅活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，Germany)中孵育4小時。測試各抗HLA-DR抗體片段作為單價抗HLA-DR抗體片段或通過加入100nM二價交聯(lián)抗-FLAG M2 mAb，作為二價組合物殺傷活化腫瘤細(xì)胞的作用。37℃在6％CO2下孵育4小時后，用臺盼藍(lán)染色，隨后對剩余存活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(Current Protocols in Immunology，1997)，確定細(xì)胞存活率。
用針對與系列稀釋的細(xì)菌蛋白質(zhì)蛋白G預(yù)先孵育，制備的MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式的多價形式的KARPAS-422細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。蛋白G具有IgG抗體的高親和力和兩個結(jié)合位點(diǎn)，有效將其交聯(lián)得到高結(jié)合價4。在單獨(dú)使用IgG，而沒有與蛋白質(zhì)G的預(yù)孵育的對照中，約殺死了55％的細(xì)胞，而用與蛋白質(zhì)G預(yù)孵育的IgG的細(xì)胞殺傷在IgG抗體/蛋白質(zhì)G摩爾比為約6(基于蛋白質(zhì)G分子量28.5kD)時達(dá)到最大的75％左右。更高或更低的IgG抗體/蛋白質(zhì)G摩爾比達(dá)到純IgG抗體的細(xì)胞殺傷效力。
9.抗-HLA-DR抗體片段的殺傷效力。
類似實(shí)施例8進(jìn)行抗HLA-DR交聯(lián)抗體片段針對其它表達(dá)HLA-DR分子的腫瘤細(xì)胞系的殺傷效力的實(shí)驗(yàn)。在4小時孵育后，腫瘤細(xì)胞顯示細(xì)胞殺傷比MS-GPC-8的交聯(lián)Fab形式大50％的細(xì)胞殺傷，這些腫瘤細(xì)胞包括MHH-CALL4、MN60、BJAB、BONNA-12，其分別代表疾病B細(xì)胞急性淋巴組織性白血病、Burkitt淋巴瘤和毛發(fā)細(xì)胞淋巴瘤。當(dāng)用交聯(lián)抗-FLAG M2 mAb作為二價抗體用抗HLA-DR抗體片段MS-GPC-1、6和10的交聯(lián)Fab形式還顯示了對于上述腫瘤細(xì)胞系類似的細(xì)胞毒性。
用實(shí)施例8中的方法確定針對Priess細(xì)胞的各交聯(lián)二價抗HLA-DR抗體片段的最大殺傷能力。測定MS-GPC-1、MS-GPC-6、MS-GPC-8和MS-GPC-10的最大殺傷能力分別是83％、88％、84％和88％。根據(jù)實(shí)施例4產(chǎn)生的抗體片段當(dāng)用上述抗FLAGM2的Ab交聯(lián)時，也顯示針對GRANTA和Priess細(xì)胞的殺傷作用改善(表4)。
10.人組合物抗HLA-DR IgG抗體的殺傷效力與對應(yīng)的小鼠抗體(Vidovic等，1995b；Nagy和Vidovic，1996；Vidovic和Toral，1998)比較，我們驚奇的觀察到本發(fā)明的某些抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式的殺傷效力顯著改善(表5)。根據(jù)實(shí)施例8和9所述的方法，但用50nM，重復(fù)測定本發(fā)明某些抗體片段的IgG形式(3-5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中細(xì)胞數(shù)每次實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)兩次)。當(dāng)最終濃度僅用50nM時，MS-GPC-8、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的抗體片段的IgG，對24個人腫瘤細(xì)胞系中的16、22、19和20個細(xì)胞系分別殺傷50％以上的細(xì)胞。這些細(xì)胞系以高于實(shí)施例11所測定的10個熒光單位的水平表達(dá)HLA-DR抗原。用兩種小鼠抗-HLA-DR抗體L243(Vidovic等，1995b)和8D1(Vidovic和Toral；1988)以顯著高的mAb最終濃度(200nM)處理細(xì)胞，分別在24個表達(dá)HLA-DR的細(xì)胞系中僅13和12兩個中的細(xì)胞存活率降低到50％存活細(xì)胞以下。單獨(dú)挑出細(xì)胞系MHH-PREB-1，不算作24個細(xì)胞系組內(nèi)，盡管它以高于10個熒光單位的水平表達(dá)HLA-DR抗原，但是任何上述抗體都不能誘導(dǎo)其細(xì)胞存活率的顯著下降。在實(shí)施例12中進(jìn)一步解釋了該現(xiàn)象。
事實(shí)上，即使在顯著提高的濃度下，200nM處理的兩種小鼠抗體與本發(fā)明的抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式比較，顯示顯著有效的殺傷。不僅本發(fā)明人抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式與小鼠抗體比較，顯示細(xì)胞殺傷的整體提高，而且它們顯示在不同的細(xì)胞系之間殺傷效率少有變動。該實(shí)施例中殺傷人抗體的變動系數(shù)是32％(指％殺傷＝68+/-22％(SD))，與小鼠抗體的62％(指％殺傷＝49+/-31％(SD))相比。通過將平均殺傷百分?jǐn)?shù)對log(平均HLA DR表達(dá))擬合成對數(shù)回歸模型，統(tǒng)計(jì)學(xué)控制HLA表達(dá)對殺傷效力的影響，支持該觀察結(jié)果(圖4)。不僅小鼠抗體的擬合曲線比人通常低，而且與人抗體數(shù)據(jù)(16％)的殘數(shù)相比，在小鼠抗體數(shù)據(jù)(SD＝28％)的殘數(shù)中有更大的變動。
11.針對人抗原的抗原結(jié)合域?qū)罨头腔罨?xì)胞的殺傷選擇性用人外周B細(xì)胞證明，人抗-HLA-DR mAb-介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷依賴于細(xì)胞活化。從HLA-DR型健康捐獻(xiàn)者取出50毫升肝素化的靜脈血，用Ficoll-Hypaque梯度離心(Histopaque-1077；Sigma)如Current Protocols in Immunology(John Wiley&Sons，Inc.，1999)中所述分離新鮮外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用B-細(xì)胞分離試劑盒和MACS LS+/VS+柱(Miltenyi Biotec，Germany)根據(jù)廠商說明書從約5×107PBMC中獲得純化的B細(xì)胞(約5％外周血白細(xì)胞)。用FACS分析等份的分離的B細(xì)胞(HLA-DR陽性和CD19陽性)證實(shí)了非B細(xì)胞的成功除去。用市售的抗體(DBImmunocytometry Systems，San jose，CA，USA)用在Current Protocols inImmunology(John Wiley&Sons，Inc.，1999)中所舉例的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行雙重染色和分析。用在補(bǔ)充了10％FCS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸類、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，Germany)中進(jìn)行1∶25稀釋的商陸分裂原(PWM)(Gibco BRL，目錄號15360-019)中，測試等份的分離的B細(xì)胞在6％CO2下孵育3天，細(xì)胞通過刺激活化的能力。通過FACS分析細(xì)胞表面上的HLA-DR表達(dá)證實(shí)了成功活化(Current Protocols inImmunology(John Wiley&Sons，Inc.，1999))。
通過在上述培養(yǎng)液，除了補(bǔ)充2.5％熱滅活的FCS，以替代10％或單獨(dú)用培養(yǎng)液，分別孵育如上所述的活化的1×106/毫升B細(xì)胞，與非活化細(xì)胞作比較，證實(shí)了50nM的MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41的IgG形式或小鼠IgG 10F12，對活化的細(xì)胞和非活化細(xì)胞的殺傷作用的選擇性(Vidovic等，1995b)。在6％CO2下，37℃孵育1或4小時后，用二乙酸熒光素(FDA)染色活細(xì)胞和用碘化丙錠(PI)染色死細(xì)胞，隨后用熒光顯微鏡(Leica，Germany)用標(biāo)準(zhǔn)程序(Current Protocolsin Immunology，1997)計(jì)數(shù)綠色(FDA)和紅色(PI)的熒光細(xì)胞，以確定細(xì)胞存活率。
據(jù)證實(shí)B細(xì)胞活化過程是細(xì)胞殺傷作用必需的。在非活化細(xì)胞中，與抗HLA-DR抗體孵育1小時后，對于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單獨(dú)用培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中的活細(xì)胞數(shù)分別為預(yù)孵育細(xì)胞密度的81％、117％、126％和96％。相反，在MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單用培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中活的活化B細(xì)胞數(shù)在孵育1小時后分別為預(yù)孵育細(xì)胞密度的23％、42％、83％和66％。在孵育4小時后，在MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單用培養(yǎng)液時，發(fā)現(xiàn)在非活化細(xì)胞中有預(yù)孵育細(xì)胞密度的78％、83％、95％和97％是活的，而在活化細(xì)胞中對于MS-GPC-8-10-57(IgG)、MS-GPC-8-27-41(IgG)、10F12和單獨(dú)用培養(yǎng)液，細(xì)胞密度則分別下降到了23％、24％、53％和67％。
12.抗-HLA抗體片段針對細(xì)胞系MHH PreB1的殺傷活性如表5證明的，我們觀察到我們的交聯(lián)抗-HLA-DR抗體片段或igG不輕易在顯著水平殺傷表達(dá)HLA-DR的特定腫瘤細(xì)胞系。我們猜想雖然已建立成穩(wěn)定的細(xì)胞系，但該培養(yǎng)物中的細(xì)胞未充分活化。因此，我進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，如下用提高的HLA-DR分子作為活化標(biāo)記在細(xì)胞表面表達(dá)來刺激MHH preB1細(xì)胞系的活性。
非附著生長的MHH preB1細(xì)胞在含有下列添加劑的RPMI培養(yǎng)液中培養(yǎng)(全部來自Gibco BRL和Bio Whittaker)10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸類、1mM丙酮酸鈉和1×卡那霉素。以若干等份通過與脂多糖(LPS，10微克/ml)、干擾素-γ(IFN-γ，Roche，40ng/ml)和植物凝血素(PHA，5微克/ml)孵育1天活化，來提高HLA-DR分子的表達(dá)。通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，用FITC偶聯(lián)的mAb L243(BDImmunocytometry Systems，San Jose，CA，USA)監(jiān)測HLA-DR分子在細(xì)胞表面的表達(dá)。在LPS、IFN-γ和PHA的存在下孵育MHH preB1 1天，導(dǎo)致HLA-DR的表面密度2倍增加(平均熒光漂移從190-390)。在上述培養(yǎng)基(但含有降低的FCS濃度(2.5％))中進(jìn)行細(xì)胞殺傷4小時。使用MS-GPC-8-27-41和MS-GPC-8-10-57的IgG形式的濃度系列，各等份的非活化和活化的細(xì)胞上含有最終抗體濃度為3300、550、92、15、2.5、0.42和0.07nm。用顯微鏡以臺盼藍(lán)活細(xì)胞排除法鑒定。雖然未活化的細(xì)胞存活率在達(dá)到最大抗體濃度下也保持不受抗體影響，但在活化的MHHpreB1細(xì)胞中，細(xì)胞存活率隨著抗體濃度顯著下降(圖5)。
13.人組合物的抗-HLA-DR對體外慢性淋巴組織白血病細(xì)胞的殺傷效率用從10個患有慢性淋巴組織白血病(CLL)的病人分離和純化的B細(xì)胞，我們用體外試驗(yàn)證明了本發(fā)明的抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式顯示臨床相關(guān)細(xì)胞的殺傷效率。從10個無關(guān)的患CLL的病人中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Scandinavian J.ofImmunology，1968，將于周1獲得)分離和純化B-細(xì)胞(樣品由Prof Hallek，Ludwigmaximillian university，Munich慷慨提供)。用100nM抗HLA-DR的各種抗體片段MS-GPC-8、MS-GPc-8-10-57或MS-GPC-8-27-41的IgG形式處理2×105個細(xì)胞，類似實(shí)施例8和9孵育4或24小時。建立了復(fù)制的細(xì)胞培養(yǎng)物，通過在用抗體處理3天前與在其表面表達(dá)CD40配體的HeLa細(xì)胞一起孵育活化(Buhmann等，1999)。作為對照，使用小鼠IgG 10F12(Vidovic等，1995b)或不用抗體。如實(shí)施例12中所述測定各實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞存活率。
驚人的是，本發(fā)明抗-HLA-DR抗體片段的IgG形式顯示了高度有效和一致的殺傷作用-甚至包含了各組完全不同的病人材料。在處理僅4小時后，所有三種人IgG使得細(xì)胞存活率與對照相比顯著下降，在24小時后僅有33％細(xì)胞仍然活著(圖6)。我們發(fā)現(xiàn)，在根據(jù)Buhmann等(1999)的方法進(jìn)一步刺激體細(xì)胞時，其殺傷作用速率可加快，僅在與人抗體培養(yǎng)4小時后，本發(fā)明的所有人樣品和抗體片段中，僅剩余24％細(xì)胞存活。
14.測定抗-HLA-DR的各種抗體片段的EC50我們證明細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中選自HuCAL庫的一些抗-HLA-DR抗體片段形式，與細(xì)胞毒性小鼠抗-HLA-DR抗體相比，在50％有效的(EC50)有很高的有效濃度(表6)。
用HLA-DR陽性細(xì)胞系PRIESS或LG2(ECACC，Salisbury，UK)估計(jì)選自HuCAL的抗-HLA-DR抗體片段的EC50。將2×105個細(xì)胞在6％CO2，37℃下，在補(bǔ)充了2.5％熱滅活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素和系列稀釋的二價抗-HLA-DR抗體片段的RPMI1640(PAA，Germany)中孵育4小時。對于Fab抗體片段的稀釋系列，與相應(yīng)濃度的Fab片段和抗FLAG M2抗體一起預(yù)先混合，來產(chǎn)生抗-HLA-DR抗體片段的二價組合物。所述的濃度指二價組合物的濃度，因此可比較IgG和Fab EC50值。
在與二價抗體片段37℃在6％CO2下保溫4小時后，用二乙酸熒光素染色，隨后計(jì)算剩余活細(xì)胞數(shù)測定細(xì)胞存活率(Current Protocols in Immunology，1997)。用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(R；http//cran.r-object.org)、非線性對數(shù)回歸曲線擬合重復(fù)數(shù)據(jù)點(diǎn)，對于各抗體估計(jì)EC50。
當(dāng)用抗-FLAG-M2抗體交聯(lián)時，選自HuCAL文庫(實(shí)施例4)的Fab片段MS-GPC-1、MS-GPC-8和MS-GPC-10顯示小于120nM的EC50，如用單價片段的濃度表達(dá)的，對應(yīng)于二價交聯(lián)的(Fab)二聚-抗-Flag M2偶聯(lián)物的60nM EC50(圖7a)。當(dāng)用抗-FLAG M2抗體的交聯(lián)時，優(yōu)化了CDR3區(qū)域內(nèi)的親和力(實(shí)施例4)的抗-HLA-DR抗體片段顯示進(jìn)一步改進(jìn)的EC50小于50nM，或?qū)τ诙r交聯(lián)片段則為25nM(圖7b)，在CDR1區(qū)中親和力額外優(yōu)化的那些抗體片段顯示EC50小于30nM(對于二價片段是15nM)。比較而言，同一試驗(yàn)內(nèi)細(xì)胞毒性小鼠抗-HLa-DR抗體8D1(Vidovic&Toral；1988)和L243(Vidovic等，1995b)的EC50顯示分別大于30和40nM(圖7c)。
令人驚奇的是，本發(fā)明的一些抗體片段的IgG形式顯示與小鼠抗體相比，EC50約增加了1.5個數(shù)量級(圖7d)。例如，MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式顯示分別為1.2和1.2nM的EC50。另外，盡管未在親和力方面優(yōu)化，MS-GPC-8的IgG形式顯示小于10nM的EC50。
如實(shí)施例11和12所示，殺死未活化細(xì)胞(分別是正常外周B和MHH PreB細(xì)胞)的效力很小。在用50nM MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式處理時，分別在4小時后有78％和83％正常的外周B細(xì)胞存活。另外，在僅50nM濃度IgG處理時，幾乎100％的MHH PreB1細(xì)胞存活。事實(shí)上，用這些未活化的細(xì)胞，使用合理的濃度范圍(0.1-300nM)的本發(fā)明的抗-HLA DR抗體片段的IgG或二價交聯(lián)的Fab形式，不能實(shí)現(xiàn)存活率水平下降到50％以下。因此，這些未活化細(xì)胞類型的EC50可以估計(jì)成至少比未優(yōu)化的Fab形式所示的EC50高5倍(對于交聯(lián)的二價片段EC50約60nM)，比VHCDR3優(yōu)化的Fab和MS-GPC-8-10-57(約1.2nM)與MS-GPC-8-27-41(約1.2nM)的IgG形式的EC50分別高至少10倍和100倍(對于交聯(lián)的二價片段約25nM)。
15.細(xì)胞殺傷機(jī)制上述實(shí)施例顯示細(xì)胞死亡發(fā)生-僅需要一些多價抗-HLA-DR抗體片段導(dǎo)致殺死活化的細(xì)胞。不需要進(jìn)一步的細(xì)胞毒性或免疫學(xué)機(jī)制來導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此證明細(xì)胞死亡是通過活化細(xì)胞的天然的程序化機(jī)制介導(dǎo)的。壞死的機(jī)制是預(yù)先程序化死亡的受到廣泛理解的過程。令我們驚奇的是我們觀察到一些細(xì)胞殺傷的特征提示，當(dāng)與我們的人抗-HLA-DR抗體片段接觸時，活化細(xì)胞殺傷的機(jī)制不是本領(lǐng)域通常理解的“凋亡”。例如，觀察到的細(xì)胞殺傷的速率似乎比凋亡報(bào)道的明顯高得多(參考文獻(xiàn)；我仍需要在星期一從Zoltan處得到)。進(jìn)行了兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，來證明細(xì)胞殺傷機(jī)制不是凋亡機(jī)制。
首先，我們用膜聯(lián)蛋白-V-FITC和碘化丙錠(PI)染色技術(shù)來辨別凋亡和非凋亡細(xì)胞死亡-經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞“凋亡細(xì)胞”(膜聯(lián)蛋白-V陽性/PI陰性)可以與壞死的(“死亡的”)細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白-V陽性/PI陽性)和完全功能性的細(xì)胞(膜聯(lián)蛋白-V陰性/PI陰性)區(qū)分開。用膜聯(lián)蛋白V和PI試驗(yàn)的廠商推薦的方法，在6％CO2，37℃下，用或不用200nM抗-HLa-DR抗體片段MS-GPC-8，以及100nM交聯(lián)抗-FLAG M2mAb在補(bǔ)充了2.5％熱滅活的FCS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，DE)中培養(yǎng)1×106/ml Priess細(xì)胞。為了提供作為對照的凋亡細(xì)胞培養(yǎng)物，通過在上述培養(yǎng)液中在6％CO2下，37℃，用50微克/ml的與10微克/ml蛋白質(zhì)-G交聯(lián)的凋亡誘導(dǎo)性抗-CD95 mAb DX2(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)誘導(dǎo)1×106/mlPriess細(xì)胞進(jìn)入凋亡。在各孵育時間(1，15和60分鐘，3和5小時)，收集200微升樣品，洗滌2次并用膜聯(lián)蛋白-V-FITC(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)和PI，用膜聯(lián)蛋白-V結(jié)合緩沖液根據(jù)廠商的方法染色。用FACS Calibur(BDImmunocytometry Systems，San Jose，Ca，USA)分析膜聯(lián)蛋白-V-FITC和PI對于每組細(xì)胞染色的量。
通過交聯(lián)的抗-HLA-DR抗體片段誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡顯示，與抗-CD95凋亡誘導(dǎo)性抗體或單獨(dú)與抗-FLAG M2 mAb孵育的細(xì)胞培養(yǎng)物顯著不同的細(xì)胞死亡模式?？?HLA-DR抗體片段/抗-FLAG M2 mAb處理過的細(xì)胞的死亡細(xì)胞(用膜聯(lián)蛋白-V陽性/PI陽性染色測定的)的百分?jǐn)?shù)，比抗-CD95或?qū)φ占?xì)胞增加迅速得多(圖8a)。相反，凋亡細(xì)胞(用膜聯(lián)蛋白-V陽性/PI陰性染色測定的)百分?jǐn)?shù)對于抗-CD95處理的細(xì)胞比交聯(lián)抗-HLA-DR的各種抗體片段或?qū)φ占?xì)胞增加快速得多(圖8b)。
其次，我們用zDEVD-fmk，一種不可逆天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3抑制劑和zVAD-fmk，一種廣譜天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑(都來自BioRad，Munich，DE)抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性。凋亡的機(jī)制的特征是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的活性，我們假設(shè)如果天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶不是抗-HLA-DR介導(dǎo)的細(xì)胞死亡必需的，我們在這些天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑存在下應(yīng)該觀察不到(與不存在比較，)經(jīng)歷細(xì)胞死亡的細(xì)胞存活率的改變。將2×105Priess細(xì)胞在37℃，6％CO2下與系列稀釋的兩種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑(范圍是180μM-10μM)在補(bǔ)充有2.5％熱滅活FBS(Biowhittaker Europe，BE)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1mg/ml卡那霉素的RPMI 1640(PAA，DE)中預(yù)培養(yǎng)3小時。通過加入200nM人抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8和100nm交聯(lián)的抗-M2 mAb誘導(dǎo)HLA-DR介導(dǎo)的細(xì)胞死亡?？?CD95誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞培養(yǎng)物作為抑制劑活性的對照(Drenou等，1999)。在進(jìn)一步在37℃，6％CO2下孵育后，4和24小時后用臺盼藍(lán)染色隨后對未染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，測定細(xì)胞存活率。如我們所料，抗-HLA-DR處理的細(xì)胞培養(yǎng)物不受天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑存在的顯著影響，而通過抗CD-95處理誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡由于細(xì)胞培養(yǎng)物與天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑預(yù)培養(yǎng)顯著下降。該觀察結(jié)果支持我們的假設(shè)，即HLA-DR介導(dǎo)的細(xì)胞死亡通過不依賴于可被zDEVD-fmk或zVAD-fmk抑制的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶蛋白酶的非凋亡機(jī)制作用。
16.用HLA-DR特異性抗體體內(nèi)治療癌癥我們證明人組合物的抗原結(jié)合域可成功的用作癌癥治療的治療劑。用感興趣的DR+人淋巴瘤或白血病細(xì)胞系接種免疫妥協(xié)的小鼠，例如scid、裸鼠或Rag-1敲除的小鼠。對于測試和皮下(s.c.)或靜脈內(nèi)(i.v.)給藥，各腫瘤建立腫瘤細(xì)胞劑量通常是1×106-1×107/小鼠。用本發(fā)明的抗-HLA-DR抗體片段MS-GPC-8、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-41的IgG形式或其它材料如上制備，用1-25mg/kg的劑量經(jīng)5天靜脈內(nèi)或皮下注射處理小鼠。在持續(xù)處理后監(jiān)測抗-HLA-DR處理或?qū)φ盏奈刺幚淼男∈蟠婊钸_(dá)8周。另外通過測量腫瘤表面積對皮下接種的小鼠的腫瘤進(jìn)程進(jìn)行定量測定。在實(shí)驗(yàn)中觀察到抗-HLA-DR處理的小鼠的存活率達(dá)80％，顯著延長，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)有達(dá)50％的小鼠存活。在皮下接種和未處理的小鼠中，腫瘤達(dá)到表面積2-3平方厘米，而抗-HLA-DR處理的動物腫瘤表面積明顯縮小。
17.用IL-2分泌的減少來測量利用抗-HLA-DR抗體片段免疫抑制本發(fā)明的抗-HLA-DR抗體片段在測量不死化的T-細(xì)胞IL-2分泌的試驗(yàn)中顯示充分的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。該抗體片段MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式在該試驗(yàn)中顯示非常強(qiáng)的免疫抑制性質(zhì)，和亞納摩爾的IC50值，和事實(shí)上100％最大抑制(圖9a)。令人驚奇的是，甚至本發(fā)明的抗體片段單價組合物能強(qiáng)烈抑制該相同試驗(yàn)中的IL-2分泌。例如VHCDR3選擇的和VLCDR3/VLCDR1優(yōu)化的抗體片段的Fab形式顯示低一位數(shù)的nM的IC50，和幾乎100％最大抑制(圖9b)。本發(fā)明的其它單價抗-HLA DR抗體片段在該試驗(yàn)中與對照IgG和Fab片段相比顯示顯著的免疫抑制性(表7)。
通過在半-最大抗原刺激條件下，測定用DR-轉(zhuǎn)基因抗原遞呈細(xì)胞(APC)刺激的雜交瘤細(xì)胞系T-Hyb1的I1-2分泌，調(diào)查抗-HLA DR抗體片段的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。用Pharmingen(Torre Pine，CA，USA)的OptiEIA小鼠IL-2試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法檢測IL-2分泌。從未免疫的嵌合0401-IE轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法分離APC(Ito等，1996)。在96孔板的含有下列添加劑(全部來自Gibco BRL和PAA)10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉和0.1g/l卡那霉素的RPMI培養(yǎng)基中加入0.2ml/孔的1.5×105APC。加入最終體積為100微升上述培養(yǎng)液中的200微克/ml最終濃度的雞蛋卵清蛋白，細(xì)胞與該抗原在6％CO2下在37℃培育30分鐘。在各孔中以各種濃度(通常為0.1-200nM)加入抗-HLA DR抗體片段，平板在37℃/6％CO2下孵育1小時，加入2×105T-Hyb 1細(xì)胞，在上述培養(yǎng)基中最終體積為200微升。在孵育24小時后，將100微升上清液轉(zhuǎn)移到先前用IL-2捕獲抗體(BD Pharmingen，Torrey Pine，Ca，USA)包裹的ELISA平板(Nunc-Immuno Plate MaxiSorp表面，Nunc，Roskilde，DK)上，根據(jù)廠商指示，用OptiEIA小鼠IL-2試劑盒定量IL-2，并用Victor V讀數(shù)儀(Wallac，F(xiàn)inland)閱讀平板。用試劑盒提供的IL-2標(biāo)準(zhǔn)將分泌的IL-2標(biāo)定為pg/ml。
通過將胸腺瘤BW 5147(ATCC)的T-細(xì)胞受體陰性變體和來自先前用雞蛋卵清蛋白(Ito等，1996)接種的嵌合0401-IL轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞融合，建立T-細(xì)胞雜交瘤系T-Hyb1。選擇克隆T-Hyb1進(jìn)行試驗(yàn)，因?yàn)樗鼞?yīng)答具有高IL-2分泌的抗原特異性刺激。
18.用T-細(xì)胞增殖測定的利用HLA-DR特異性抗體的免疫抑制過程用測定T-細(xì)胞增殖的第二個試驗(yàn)確定了抗-HLA DR抗體片段的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。MS-GPC-8-10-57和MS-GPC-8-27-41的IgG形式抑制T細(xì)胞增殖的IC50值分別是11和20nM(圖10)。如下測試抗-HLA-DR抗體片段，對攜帶具有RA-相關(guān)肽結(jié)合位點(diǎn)，并缺乏小鼠II類分子的嵌合型小鼠-人II類轉(zhuǎn)基因(Muller等，1990；Woods等，1994；Current Protocols in Immunology，卷2，7.21；Ito等，1996)的小鼠的抗原引發(fā)的淋巴結(jié)細(xì)胞增殖的T細(xì)胞應(yīng)答的抑制作用。在此，免疫在體內(nèi)發(fā)生，但是抑制和讀數(shù)在體外進(jìn)行。先前產(chǎn)生了表達(dá)帶有RA相關(guān)分子結(jié)合位點(diǎn)的DRB1*0401的MHC II類分子的轉(zhuǎn)基因小鼠(Ito等，1996)。這些小鼠缺乏小鼠MHC II類，因此所有Th應(yīng)答都是定向通過一個人RA-相關(guān)的MHC II類分子(Ito等，1996)。這些轉(zhuǎn)基因小鼠代表了測試人II類拮抗劑的模型。
用嵌合T-細(xì)胞和從用標(biāo)準(zhǔn)方法先前接種了雞蛋卵清蛋白(Ito等，1996)嵌合的0401-IE轉(zhuǎn)基因小鼠(Taconic，USA)的淋巴結(jié)分離的嵌合型細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞測量的T-細(xì)胞增殖，測試抗-HLA-DR抗體片段及其IgG形式的抑制效果。在卵清蛋白(30微克/孔-半最大刺激濃度)和系列稀釋的抗-HLA-DR抗體片段或IgG形式存在下，在含有2mM L-谷氨酰胺和0.1g/l卡那霉素的無血清HL-1培養(yǎng)液中測試(0.1nM-200nM)，在96孔組織培養(yǎng)板的0.2毫升孔中培養(yǎng)1.5×105細(xì)胞3天。在培養(yǎng)的最后16個小時，用3H-甲基-胸腺嘧啶(1μCi/孔)摻入測定抗原特異性增殖(Falcioni等，1999)。收集細(xì)胞，用閃爍計(jì)數(shù)器(TopCount，Wallac，F(xiàn)inland)測定3H結(jié)合量。比較含有抗原的對照孔，可以觀察用抗-HLA-DR抗體片段及其IgG形式處理T-細(xì)胞的增殖。
19.選擇有用的多肽用于治療癌癥為了選擇最合適的蛋白質(zhì)/肽，以進(jìn)行其它一系列實(shí)驗(yàn)，并評估其用于治療癌癥的治療組合物的適用性，收集其它數(shù)據(jù)。這些針對抗-HLA抗原抗體片段的IgG形式的數(shù)據(jù)可以包括結(jié)合親和力，用EC50測定的體外殺傷效力，和跨越一套腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，體外估計(jì)的最大細(xì)胞殺傷百分?jǐn)?shù)，和來自動物模型的體內(nèi)腫瘤減少數(shù)據(jù)和小鼠存活數(shù)據(jù)。
可選擇顯示最高親和力、最低殺傷的EC50、細(xì)胞殺傷最高的最大百分?jǐn)?shù)和跨越各種腫瘤細(xì)胞系最廣泛，最佳腫瘤減少數(shù)據(jù)和/或最佳小鼠存活數(shù)據(jù)的抗HLA-抗原抗體片段的IgG形式進(jìn)入進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)可包括例如動物中的治療方案和毒物學(xué)和對人的I期臨床試驗(yàn)。
20.選擇有用的多肽用于治療免疫系統(tǒng)疾病為了選擇最合適的蛋白/多肽進(jìn)而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，和評估其用于治療免疫系統(tǒng)疾病的治療組合物的適合性，收集了其它數(shù)據(jù)。對于抗-HLA抗原抗體片段的各種單價抗體片段或IgG形式的這些數(shù)據(jù)如體外用EC50和最大百分?jǐn)?shù)細(xì)胞殺傷估計(jì)的，和移植排斥和移植物抗宿主疾病的DR-轉(zhuǎn)基因模型可包括親和力、反應(yīng)性、特異性、IC50-值，用于抑制IL-2分泌和T-細(xì)胞增殖，或體外殺傷效力。
可選擇顯示最低EC50，最高親和力，最高殺傷作用，最佳特異性和/或最大抑制T-細(xì)胞增殖或IL-2分泌，和在合適模型中的抑制移植排斥和/或移植物對宿主疾病的高效力的抗HLA-抗原的抗體片段的IgG形式進(jìn)入進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)可包括例如動物中的治療方案和毒物學(xué)和對人的I期臨床試驗(yàn)。
表1HLA-DR-特異性多肽的VH和VL家族、VL CDR1和VH/VL CDR3序列
表2
a)MS-GPC-8的親和力數(shù)據(jù)是基于8種不同的Fab制備物，在4種不同的芯片上測定的(2×500，1000，4000RU)b)顯示了對于MS-GPC-8-6，3種不同芯片上3種不同制備物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(500，4000，3000RU)。
c)將3000RU MHCII固定在CM5芯片上。在表面注射1μM-16nM的7種不同濃度。分離時間15秒、用6微升10mM的甘氨酸，pH2.3，然后用8微升7.5mM NaOH實(shí)現(xiàn)再生。顯示4種制備物對于MS-GPC-8-6-19平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差，而對于其它顯示3種不同的制備物的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
d)在3種不同芯片上測定了一種蛋白制備物(3000，2800和6500RU)。
e)成熟的MHCII結(jié)合物在4000RU密度的芯片上的親和力測定；一次測定。
分子量在尺寸排阻層析后測定，發(fā)現(xiàn)100％單體具有45-48kDa之間的正常分子量。
表3a從Fab’選擇的IgG4單克隆抗體的親和力。誤差代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表3bCDR3重鏈優(yōu)化后通過CDR1輕鏈優(yōu)化的親和力成熟獲得的結(jié)合物親和力。誤差代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表3cGPC8隨CDR3輕鏈優(yōu)化的親和力成熟獲得的結(jié)合物
芯片密度4000RU MHCIIa)對于MS-GPC-8，顯示了3種不同芯片(500，4000，3000RU)上3種不同制備物的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表3d在scFv形式及其轉(zhuǎn)化的Fab中HuCAL獲得的結(jié)合物。
芯片密度500RU MHCIIa)MS-GPC-8的親和力數(shù)據(jù)基于8種不同F(xiàn)ab制備物，它們在4種不同芯片(2×500，4000，3000RU)上測定，與標(biāo)準(zhǔn)偏差一起顯示。
表4細(xì)胞與交聯(lián)抗-HLA-DR抗體片段孵育4小時后的殺傷效力，以及孵育24小時后的最大殺傷。
表5人組合物的抗-HLA-DR的IgG抗體與小鼠抗-HLA-DR抗體針對一組淋巴組織腫瘤細(xì)胞系的殺傷效率的比較
％殺傷用200nM小鼠或50nM人mAb37℃處理4小時后的100-％存活細(xì)胞。
表6本發(fā)明的一些抗-HLA-DR抗體片段在針對淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中的EC50值。所有EC50指二價因子(IgG或交聯(lián)的Fab)的納摩爾濃度交聯(lián)的Fab和IgG形式的值是可比較。
表7在測定T-Hyb1細(xì)胞的抗原特異性刺激后IL-2分泌的試驗(yàn)中，本發(fā)明的一些抗-HLA-DR抗體片段的IC50值。IgG形式(二價)的IC50表示成摩爾濃度，而為了提供方便的比較，F(xiàn)ab形式(單價)的IC50表示成Fab濃度的一半，使得能直接與IgG形式比較。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，其含有多肽，該多肽包含基于至少一種抗體對細(xì)胞表面上表達(dá)的一種抗原的結(jié)合特異性的人組合物的抗原結(jié)合域，其中用一種或多種所述多肽處理表達(dá)所述抗原的細(xì)胞，導(dǎo)致或引導(dǎo)免疫應(yīng)答的抑制，其中所述免疫應(yīng)答抑制的IC50是1μM或以下。
2.一種組合物，其含有多肽，該多肽包含基于至少一種抗體的、對人HLA DR抗原具有結(jié)合特異性的抗原結(jié)合域，其中用所述多肽處理表達(dá)HLA DR的細(xì)胞導(dǎo)致或引導(dǎo)免疫應(yīng)答的抑制，所述基于抗體的抗原結(jié)合域包括VH區(qū)和VL區(qū)的組合，其中所述組合可在選自MS-GPC-1、MS-GPC-2、MS-GPC-3、MS-GPC-4、MS-GPC-5、MS-GPC-6、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-14、MS-GPC-15、MS-GPC-16、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，在所述細(xì)胞表面表達(dá)的所述抗原是人MHC II類抗原。
4.一種組合物，其含有一種多肽，該多肽含有至少一種基于抗體的、對人MHCII類抗原具有1μM或以下的Kd的結(jié)合特異性的抗原結(jié)合域，其中用所述多肽處理表達(dá)所述抗原的細(xì)胞導(dǎo)致或引導(dǎo)免疫應(yīng)答的抑制。
5.一種組合物，其含有一種多肽，該多肽含有至少一種基于抗體的、對人MHCII類抗原具有1μM或以下的Kd的結(jié)合特異性的抗原結(jié)合域，所述基于抗體的抗原結(jié)合域是通過一種方法分離的，其中包括從重組抗體文庫通過與人MHC II類抗原結(jié)合的能力分離人組合物的VL和VH區(qū)，其中用所述多肽處理表達(dá)MHC II類的細(xì)胞會導(dǎo)致或引導(dǎo)免疫應(yīng)答的抑制。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，分離基于抗體的抗原結(jié)合域的方法還包括步驟a.產(chǎn)生VL和VH區(qū)之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一個的變體文庫，和b.根據(jù)與人MHC II類抗原的Kd以1μM或以下結(jié)合的能力，從變體文庫中分離出VL和VH區(qū)。
7.如權(quán)利要求3-6任一所述的組合物，其特征在于，基于抗體的抗原結(jié)合域與HLA-DR結(jié)合。
8.如權(quán)利要求2-7任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域與HLA-DR的β鏈結(jié)合。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域與HLA-DR的β鏈的第一個結(jié)構(gòu)域的表位結(jié)合。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是淋巴樣細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1-9任一所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是非淋巴樣細(xì)胞，并表達(dá)MHC II類抗原。
12.如權(quán)利要求1-11任一所述的組合物，其特征在于，該組合物具有1μM或以下的抑制免疫應(yīng)答的IC50。
13.如權(quán)利要求1-11任一所述的組合物，其特征在于，該組合物具有1μM或以下的抑制IL-2分泌的IC50。
14.如權(quán)利要求1-11任一所述的組合物，其特征在于，該組合物具有1μM或以下的抑制免T細(xì)胞增殖的IC50。
15.如權(quán)利要求1-14任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域可與一種或多種選自DR1-0101、DR2-15021、DR3-0301、DR4Dw4-0401、DR4Dw10-0402、DR4Dw14-0404、DR6-1302、DR6-1401、DR8-8031、DR9-9012、DRw53-B4*0101和DRw52-B3*0101的HLA-DR型結(jié)合。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域與至少3種不同的所述HLA-DR型結(jié)合，優(yōu)選至少5種不同的所述HLA-DR型結(jié)合，和更優(yōu)選至少7種不同的所述HLA-DR型結(jié)合。
17.如權(quán)利要求3-16任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域包括VH和VL區(qū)的組合，其中所述組合可在MS-GPC-1、MS-GPC-2、MS-GPC-3、MS-GPC-4、MS-GPC-5、MS-GPC-6、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-14、MS-GPC-15、MS-GPC-16、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發(fā)現(xiàn)。
18.如權(quán)利要求3-16任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3、VL CDR1和VL CDR3在選自MS-GPC-1、MS-GPC-4、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中發(fā)現(xiàn)。
19.如權(quán)利要求3-16任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1的組合，其中VH CDR3序列選自共有的CDR3序列nnnnRGnFDn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或其中VL CDR3選自共有的CDR3序列QSYDnnnn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
20.如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，所述VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
21.如權(quán)利要求3-16任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域與包括HuCAL VH2和HuCAL Vλ1組合的抗體競爭抗原結(jié)合，其中VH CDR3序列選自共有CDR3序列nnnnRGnFDn每個n分別代表任何氨基酸殘基；和/或VL CDR3選自共有CDR3序列QSYDnnnn每個n分別代表任何氨基酸殘基。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其特征在于，VH CDR3序列是SPRYGAFDY和/或VL CDR3序列是QSYDLIRH或QSYDMNVH。
23.如權(quán)利要求3-22任一所述的組合物，其特征在于，所述基于抗體的抗原結(jié)合域可包括用下列通式代表的VL CDR1序列SGSnnNIGnNYVn其中每個n分別代表任何氨基酸殘基。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述CDR1序列是SGSESNIGNNYVQ。
25.如權(quán)利要求1-24任一所述的組合物，其特征在于，所述免疫應(yīng)答的抑制是由在所述細(xì)胞表面表達(dá)的所述抗原表達(dá)的下調(diào)引起或表現(xiàn)的。
26.如權(quán)利要求1-24任一所述的組合物，其特征在于，所述免疫應(yīng)答的抑制是由抑制所述細(xì)胞和其它細(xì)胞之間的相互作用引起或表現(xiàn)，其中所述的作用通常導(dǎo)致免疫應(yīng)答。
27.如權(quán)利要求1-24任一所述的組合物，其特征在于，所述免疫應(yīng)答的抑制由殺傷所述細(xì)胞引起或表現(xiàn)的。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其特征在于，所述殺傷是通過多種基于抗體的抗原結(jié)合域處理表達(dá)抗原的細(xì)胞來介導(dǎo)的，其中所述的基于抗體的抗原結(jié)合域是至少一種多價多肽的部分，其中，不需要細(xì)胞毒性物質(zhì)或免疫學(xué)機(jī)制來導(dǎo)致或引起所述殺傷。
29.如權(quán)利要求27或28所述的組合物，其特征在于，所述殺傷影響至少50％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％的活化細(xì)胞，相比非活化細(xì)胞的低于30％，優(yōu)選低于20％，更優(yōu)選低于10％的殺傷作用。
30.如權(quán)利要求27-29所述的組合物，其特征在于，所述殺傷是由所述細(xì)胞的固有的預(yù)編程的過程介導(dǎo)的。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述殺傷是非凋亡性的。
32.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述殺傷依賴于(僅？)不是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶。
33.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述殺傷不依賴于可被zVAD-fmk或zDEVD-fmk抑制的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。
34.如權(quán)利要求1-33任一所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有選自Fv、scFv、dsFv、Fab片段的抗體片段。
35.如權(quán)利要求1-33任一所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有F(ab’)2抗體片段或小抗體片段。
36.如權(quán)利要求1-33任一所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有至少一種選自IgG1、2a、2b、3、4、IgA和IgM類的抗體的完整抗體。
37.如權(quán)利要求34-36任一所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有交聯(lián)基團(tuán)。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其特征在于，抗原結(jié)合位點(diǎn)與聚合物交聯(lián)。
39.如權(quán)利要求1-38任一所述的組合物，其特征在于，該組合物配制在藥物可接受的載體和/或稀釋劑中。
40.一種藥物制劑，其含有量足夠抑制動物的免疫應(yīng)答的權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述動物是人。
41.一種藥物制劑，其含有量足夠抑制動物中IL-2分泌的權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述動物是人。
42.一種藥物制劑，其含有量足夠抑制動物中T細(xì)胞增殖的權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述動物是人。
43.一種診斷組合物，其包括權(quán)利要求1-38任一所述的組合物。
44.權(quán)利要求1-38任一所述的組合物用于制備治療動物的藥物制劑的用途，其中所述動物是人。
45.一種核酸，其含有權(quán)利要求1-38任一所述的組合物的多肽的蛋白質(zhì)(需要檢查定義)編碼序列。
46.一種載體，其含有權(quán)利要求45所述的核酸和與其可操縱性連接的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。
47.一種攜帶權(quán)利要求45所述的核酸和權(quán)利要求46所述的載體的宿主細(xì)胞。
48.一種產(chǎn)生免疫抑制組合物的方法，該方法包括在表達(dá)核酸的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求47所述的細(xì)胞。
49.一種抑制免疫系統(tǒng)的細(xì)胞活化的方法，其包括用權(quán)利要求1-39任一所述的組合物處理細(xì)胞。
50.一種抑制免疫系統(tǒng)的細(xì)胞增殖的方法，其包括用權(quán)利要求1-39任一所述的組合物處理細(xì)胞。
51.一種抑制免疫系統(tǒng)的細(xì)胞分泌IL-2的方法，其包括用權(quán)利要求1-39任一所述的組合物處理細(xì)胞。
52.一種抑制免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和另一種細(xì)胞相互作用的方法，其包括使細(xì)胞接觸權(quán)利要求1-39任一所述的組合物。
53.一種免疫抑制病人的方法，其包括對病人施用權(quán)利要求1-39任一所述的有效量的組合物。
54.一種殺死在所述細(xì)胞表面表達(dá)抗原的細(xì)胞的方法，其包括步驟用含有權(quán)利要求1-39任一所述組合物處理細(xì)胞，該組合物含有多種基于抗體的抗原結(jié)合域，其中所述基于抗體的抗原結(jié)合域是至少一種多價多肽的一部分，其中不需要細(xì)胞毒性物質(zhì)或免疫學(xué)機(jī)制導(dǎo)致或引導(dǎo)所述殺傷。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述抗原是HLA DR。
56.如權(quán)利要求44所述的組合物，其特征在于，所述治療是治療選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年期關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、Grave氏病、胰島素依賴性糖尿病、發(fā)作性睡眠病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎、移植排斥，移植物抗宿主病、Hashimoto氏病、重癥肌無力、尋常天皰瘡、腎小球性腎炎、甲狀腺炎、胰腺炎、胰島炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、過敏性腸病和Sjogren綜合征的疾病。
57.如權(quán)利要求44所述的用途，其特征在于，所述治療是治療選自重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、移植排斥和移植物抗宿主病的疾病。
58.一種鑒定能用配制在藥物學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑中的權(quán)利要求1-38任一所述的組合物治療的病人的方法，包括步驟a.從病人分離細(xì)胞；b.使所述細(xì)胞與權(quán)利要求1-39任一所述的組合物接觸c.測定所述細(xì)胞殺傷、免疫抑制、IL-2分泌或增殖的程度。
59.一種鑒定可用配制在藥物學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑的權(quán)利要求1-38任一所述的組合物治療的病人的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有d.權(quán)利要求1-39任一所述的組合物；e.測定所述細(xì)胞殺傷或免疫抑制、IL-2分泌或增殖的程度的工具。
60.一種試劑盒，其中含有f.權(quán)利要求1-39任一所述的組合物，和g.交聯(lián)分子。
61.一種試劑盒，其中含有h.權(quán)利要求1-39任一所述的組合物或權(quán)利要求43所述的診斷組合物，和i.可檢測分子或基團(tuán)，和j.影響和/或檢測(i)與抗原結(jié)合的試劑和/或溶液。
62.一種細(xì)胞毒性組合物，其含有與細(xì)胞毒性劑可操縱性連接的權(quán)利要求1-38任一所述的組合物。
63.一種免疫學(xué)組合物，其含有與免疫原性劑可操縱性連接的權(quán)利要求1-38任一所述的組合物。
64.一種殺傷在所述細(xì)胞表面表達(dá)抗原的細(xì)胞的方法，其包括使所述細(xì)胞接觸與細(xì)胞毒性劑或免疫原性劑可操縱性連接的權(quán)利要求1-38任一所述的組合物。
65.與細(xì)胞毒性或免疫原性劑可操縱性連接的權(quán)利要求1-38任一所述的組合物的用途，其特征在于，該組合物用于制備治療動物的藥物組合物。
66.一種進(jìn)行藥物商業(yè)活動的方法，其特征在于(i)分離一種或多種基于抗體的抗原結(jié)合域，這些抗原結(jié)合域與人細(xì)胞表面表達(dá)的MHC II類以1μM或以下的Kd結(jié)合；(ii)產(chǎn)生含有所述基于抗體的抗原結(jié)合域的組合物，該組合物具有100nM或以下的IC50的免疫抑制性；(iii)進(jìn)行所述組合物在動物中效力和毒性的測量；(iv)制備描述所述組合物免疫抑制治療用途的包裝插頁；和(v)出售所述組合物用作免疫調(diào)節(jié)劑。
67.一種進(jìn)行生命科學(xué)商業(yè)活動的方法，其包括(i)分離一種或多種基于抗體的抗原結(jié)合域，這些抗原結(jié)合域以1μM或以下的Kd與人細(xì)胞表面的MHC II類結(jié)合；(ii)產(chǎn)生含有所述基于抗體的抗原結(jié)合域的組合物，組合物是免疫抑制性的，具有100nM或以下的IC50；(iii)對第三方許可，與第三方共同開發(fā)或出售給第三方銷售所述組合物的權(quán)利。
68.如權(quán)利要求66或67所述的方法，其特征在于，用以下方法分離基于抗體的抗原結(jié)合域，包括a.根據(jù)與HLA DR結(jié)合的能力，從重組抗體文庫分離人組合物的VL和VH區(qū)，b.產(chǎn)生VL和VH區(qū)之一或兩者的CDR1、CDR2和CDR3序列中至少一個的變體文庫，和c.根據(jù)用與HLA DR以1μM或以下的Kd結(jié)合的能力，從變體文庫分離VL和VH區(qū)。
69.如權(quán)利要求66-68任一所述的方法，其特征在于，基于抗體的抗原結(jié)合域包括VH區(qū)和VL區(qū)的組合，其中所述組合選自MS-GPC-1、MS-GPC-2、MS-GPC-3、MS-GPC-4、MS-GPC-5、MS-GPC-6、MS-GPC-7、MS-GPC-8、MS-GPC-10、MS-GPC-11、MS-GPC-14、MS-GPC-15、MS-GPC-16、MS-GPC-8-1、MS-GPC-8-6、MS-GPC-8-9、MS-GPC-8-10、MS-GPC-8-17、MS-GPC-8-18、MS-GPC-8-27、MS-GPC-8-6-2、MS-GPC-8-6-19、MS-GPC-8-6-27、MS-GPC-8-6-45、MS-GPC-8-6-13、MS-GPC-8-6-47、MS-GPC-8-10-57、MS-GPC-8-27-7、MS-GPC-8-27-10和MS-GPC-8-27-41的克隆之一中找到。
全文摘要
本發(fā)明涉及引起或?qū)е旅庖呦到y(tǒng)調(diào)節(jié)的人多肽。本發(fā)明還涉及編碼多肽的核酸、產(chǎn)生多肽的方法、免疫抑制的方法、含有多肽的藥物和診斷組合物和試劑盒，以及多肽的用途。
文檔編號A61K39/00GK1460025SQ01809333
公開日2003年12月3日 申請日期2001年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月12日
發(fā)明者Z·納吉, M·特薩日, E·托馬森-沃爾夫 申請人:Gpc生物技術(shù)股份公司, 莫弗西斯股份公司