專利名稱：T細(xì)胞調(diào)節(jié)基因及其使用方法
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)令人驚訝的復(fù)雜性是其最大力量所在。1012-1014個(gè)可能的抗體專一性、各種調(diào)節(jié)和效應(yīng)細(xì)胞之間精細(xì)的相互關(guān)系、T細(xì)胞對(duì)MHC抗原的應(yīng)答；所有這些都賦予宿主有效抵抗感染因子和其它外源抗原的能力。但這種多樣性也有其缺點(diǎn)。錯(cuò)誤發(fā)生應(yīng)答目標(biāo)結(jié)果可能是正常的自身蛋白；炎癥反應(yīng)受到錯(cuò)誤調(diào)控；以及正常的應(yīng)答被錯(cuò)誤的導(dǎo)向移植物和移植的細(xì)胞。這些情況下，免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性使得診斷和治療非常困難。
免疫應(yīng)答中CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子決定了免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)展和調(diào)控結(jié)果的效應(yīng)器功能的性質(zhì)。Th1占優(yōu)的應(yīng)答反應(yīng)中IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生與強(qiáng)力細(xì)胞介導(dǎo)免疫力、IgG2a的誘導(dǎo)和IgE合成的抑制、以及對(duì)胞內(nèi)病原體的抵抗力相關(guān)。相反，Th2占優(yōu)的應(yīng)答反應(yīng)中IL-4、IL-5和IL-10的產(chǎn)生與體液免疫和免遭自身免疫病相關(guān)。過敏原特異的CD4+T細(xì)胞過量產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子，可能導(dǎo)致發(fā)生過敏性疾病和哮喘，而Th1細(xì)胞與各種促炎癥疾病相關(guān)。
免疫相關(guān)疾病的一個(gè)進(jìn)展是免疫治療。當(dāng)使用恰當(dāng)時(shí)，免疫治療證明是有效的，且人們希望免疫干預(yù)的進(jìn)展將進(jìn)一步增強(qiáng)其功效。其它的研究試圖用細(xì)胞因子來改變免疫應(yīng)答反應(yīng)。IL-12，一種由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的異二聚體細(xì)胞因子，可有效促進(jìn)原初和記憶性CD4+T細(xì)胞合成Th1細(xì)胞因子。其它的細(xì)胞因子，如IL-13和IL-4，與T細(xì)胞分化成Th2型有關(guān)。
特應(yīng)性，包括哮喘、過敏性鼻炎和特異性皮炎，是一種復(fù)雜的癥狀，它發(fā)生遺傳易感個(gè)體中，是環(huán)境誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)的結(jié)果。過去二十多年，發(fā)達(dá)國家中各種特應(yīng)性疾病的發(fā)病急劇增長。哮喘是兒童最常見的慢性疾病，在美國有1,500萬以上的人患有此病，每年直接用于治療的費(fèi)用超過110億美元。流行病學(xué)研究提出，哮喘發(fā)病率上升的原因是由于工業(yè)化社會(huì)衛(wèi)生狀況的改善和感染(例如，肺結(jié)核或甲型肝炎)頻率的降低。然而，對(duì)導(dǎo)致哮喘發(fā)病率上升的特殊分子途徑和賦予哮喘易感性的基因多態(tài)性還知之甚少。
哮喘的表現(xiàn)受到以非累加性方式相互反應(yīng)的多種環(huán)境和遺傳因子的影響，這使得鑒定哮喘易感基因復(fù)雜化。哮喘易感性與幾個(gè)染色體區(qū)域都有聯(lián)系，但分辨率為5-10cM，其中通常有數(shù)百個(gè)候選基因。此外，由于任一基因中遺傳變異的作用可能對(duì)整個(gè)哮喘致病原因僅僅有最輕微的影響，且基因-基因和基因-環(huán)境之間的相互作用混淆了這一分析，因此，服從于定位克隆的假定的易感性基因在區(qū)域中的位置很難精細(xì)確定。盡管如此，哮喘易感性與第5、6、11、14和12號(hào)染色體有聯(lián)系。其中，染色體5q23-35倍受關(guān)注，因?yàn)樗写罅亢蜻x基因(11、12、13、14、15、16、17、18)，包括IL-9、IL-12p40、β-腎上腺素受體和IL-4細(xì)胞因子簇(它含有IL-4、IL-5和IL-13的基因)。然而，5q相關(guān)區(qū)域之大使其分析復(fù)雜化，同時(shí)此位點(diǎn)的哮喘基因還未最終鑒定。
相關(guān)出版物人甲型肝炎病毒細(xì)胞受體的基因序列可在Genbank中找到登錄號(hào)XM_011327。Genbank提供了相關(guān)序列，登錄號(hào)為BAB55044。Monney等，(2002)Nature 415:436描述了在Th1細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面分子。美國專利5721351、6204371和6288218號(hào)涉及與小鼠TIM-3等位基因相對(duì)應(yīng)的序列。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了編碼與免疫功能和細(xì)胞存活相關(guān)的多肽基因家族的基因序列。這些基因編碼帶有保守性IgV和粘蛋白功能域的細(xì)胞表面分子，這里是指T細(xì)胞免疫球蛋白功能域和粘蛋白功能域(TIM)蛋白。這些包括TIM家族的基因座與免疫機(jī)能障礙(包括哮喘)在遺傳上相關(guān)。此外，TIM基因家族位于人第5條染色體(在惡性腫瘤和骨髓異常增生綜合征中通常缺失)區(qū)域內(nèi)。在TIM-1、TIM-3和TIM-4中鑒定到多態(tài)性，這可能與Th1/Th2的分化和氣道高反應(yīng)性(AHR)相關(guān)。
核酸組合物已被用來制造編碼蛋白，這些蛋白可用于功能性研究(作為治療)并用于研究相關(guān)生理途徑。TIM特異性結(jié)合試劑，包括核酸、抗體等，可用于論斷以測(cè)定對(duì)特應(yīng)性和哮喘的遺傳易感性，和評(píng)估腫瘤對(duì)癌癥治療的抗性。TIM抑制劑被用來治療免疫機(jī)能障礙和細(xì)胞存活疾病，包括惡性腫瘤。
附圖簡(jiǎn)述

圖1a，HBA小鼠產(chǎn)生的IL-4明顯少于BALB/c小鼠。獲得用150μg KLH免疫的小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞，除去B細(xì)胞，培養(yǎng)在含有10μg/ml KLH的cDME中。96小時(shí)后收獲上清并用ELISA估計(jì)IL-4的水平。以方框表示的IL-4水平(每組n＝10)代表了數(shù)據(jù)的完整范圍，盒子包括上弦和下弦，并在各個(gè)盒子中列出了數(shù)據(jù)的中值。BALB/C細(xì)胞和(BALB/c×HBA)F1細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4明顯高于HBA的IL-4水平，P＜0.0001(student t-檢驗(yàn))。b，HBA小鼠產(chǎn)生的IL-13和IL-10明顯低于BALB/c小鼠。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中顯示的數(shù)據(jù)是由十只小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的細(xì)胞因子的平均值，±S.D。HBA IL-13和IL-10水平低于BALB/c或(BALB/c×HBA)F1值，P＜0.0001。HBA IL-5對(duì)BALB/c的P＜0.05。HBA IFN-γ對(duì)BALB/c的P＜0.001。c，BALB/c中過敏原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性明顯高于HBA小鼠。測(cè)量了肺部氣流阻塞，顯示的數(shù)據(jù)代表在不同乙酰甲膽堿濃度時(shí)各組致敏小鼠中的峰升高停止(Penh)的平均值±S.E.M。(BALB×HBA)F1顯示BALB/c表型，而(BALB×DBA)F1小鼠顯示DBA/2樣表型。
圖2。HBA染色體11的區(qū)域遺傳自DBA/2。如SSLP標(biāo)志所描繪，HBA染色體11在hba-α2和es-3之間會(huì)有兩個(gè)來自DBA的區(qū)域。左邊的圖中，帶有DBA/2基因型的HBA染色體11的區(qū)域是高亮的(藍(lán)色)。這種標(biāo)志(左邊)提供了D11Mit230遠(yuǎn)側(cè)2-5cM的分辨率。小鼠染色體11具有與5q23-35同線的高保守性區(qū)域，在BALB/c和DBA/2之間用提供信息的多態(tài)性鑒定到其它標(biāo)志，在這一區(qū)域提供了0.01-2cM的分辨率(右邊的柱標(biāo)記)。綠色表示單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)標(biāo)志以區(qū)別于SSLP標(biāo)志，紅色顯示感興趣的特定基因的位置。我們的標(biāo)志圖與染色體委員會(huì)報(bào)告(Chromosome Committee Reports)和MIT聯(lián)鎖圖不同，我們的圖與以前的聯(lián)鎖圖和物理圖譜相一致。
圖3a。N2小鼠產(chǎn)生的IL-4是雙峰的，分別對(duì)應(yīng)于F1和HBA表型。作為多個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)重組體N2小鼠相關(guān)表型評(píng)價(jià)的平均值，我們采用了指數(shù)函數(shù)，這使得我們能夠綜合多個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。柱狀圖顯示了帶有(BALB×HBA)F1、HBA純合子和重組性單倍型的N2小鼠的IL-4指數(shù)值的雙峰分布。與F1和HBA單倍型有關(guān)的分布是獨(dú)特的(P＜0.0001，配對(duì)student t-檢驗(yàn))。b.IL-4的調(diào)控與Kim1sscp相隔離。按IL-4指數(shù)值將重組性N2單倍型分成與高IL-4表型(指數(shù)＜0.35)和低I1-4表型(指數(shù)＞0.65)相關(guān)的組。每一縱向方格代表一種重組單倍體。根據(jù)基因型用陰影表示這些單倍體在D11Mit269至D11Mit154之間基因座上的等位基因(深色＝F1；淺色＝HBA)。高IL-4產(chǎn)生與四個(gè)單倍形隔離(左)，低IL-4產(chǎn)生也與四個(gè)單倍型(右)隔離。IL-4表型與Kim1sscp有關(guān)。c.N2小鼠的AHR是雙峰的，對(duì)應(yīng)于F1和HBA表型。顯示了自Penh算出的指數(shù)值。柱狀圖顯示N2小鼠AHR指數(shù)值的雙峰分布。標(biāo)明了(BALB×HBA)F1、HBA純合子和重組單倍型。與F1和HBA單倍型相關(guān)的分布是獨(dú)特的(P＜0.0001，配對(duì)student t-檢驗(yàn))。d.AHR調(diào)控基因座與D11Mit22和D11Mit271之間的IL-4調(diào)控基因座共隔離。按AHR指數(shù)值將重組N2單倍型分成與高IL-4表型(指數(shù)＜0.35)和低I1-4表型(指數(shù)＞0.65)相關(guān)的組。每一縱向方格代表一種重組單倍型。根據(jù)基因型用陰影表示這些單倍型在D11Mit269至D11Mit154之間基因座上的等位基因(深色＝F1；淺色＝HBA)。高IL-4與四個(gè)單倍型隔離(左)，低IL-4與三個(gè)單倍型隔離(右)。AHR調(diào)控基因座與D11Mit271和D11Mit22之間的Kim1sscp有相聯(lián)系。
圖4間隔區(qū)含有Tapr的小鼠染色體11與5q33是高度同源的。為構(gòu)建圍繞Tapr基因座的復(fù)合圖譜，我們將可得到的小鼠聯(lián)鎖圖、回交圖和輻射雜交圖信息整合并鑒定了目前的人類基因組圖譜(Human Genome Browser，第三板，UCSC，2001年3月)中一個(gè)高度保守的同線性區(qū)域。以登錄號(hào)標(biāo)出位于小鼠染色體11(左)物理圖譜上的EST，并與人染色體5(右)上的EST相應(yīng)的基因(中)作同源性排列比。顯示了KIAA0171和Sgd之間所有已知的基因。
圖5a、b、c。新TIM基因家族和TIM-1和TIM-3中主要多態(tài)性的鑒定。小鼠TIM-1和小鼠TIM-2的克隆?；蚣易宓某蓡T。顯示了小鼠TIM基因家族成員的序列。陰影部分指出了兩種小鼠TIM基因之間的相同性。用Gibco Superscript II反轉(zhuǎn)錄conA-刺激的脾細(xì)胞中所有的RNA。擴(kuò)增全長Tim-3cDNA的PCR產(chǎn)物，用Qiagen QlAquick PCR純化試劑純化并用Biotech Core(Mountain Vieu，加利福尼亞州)直接測(cè)序。用TOPO-XL克隆試劑(Invitrogen)將Tim-1和Tim-2 cNDA的PCR產(chǎn)物克隆入電感受態(tài)TOP10細(xì)胞中。用標(biāo)準(zhǔn)堿性裂解法純化質(zhì)粒。按所述方法測(cè)序BALB/c和HBA質(zhì)粒。小鼠TIM-1、大鼠KIM-1和HAVcr-1有同源性。用陰影指出與小鼠TIM-1的相同性?？招牡谷潜硎境龃笾碌男盘?hào)位點(diǎn)實(shí)心菱形表示Ig功能域/粘蛋白功能域。邊界劃線部分是預(yù)測(cè)的跨膜域。顯示了在BALB/c和HBATIM-1及TIM-3之間帶有主要多態(tài)性的TIM-1和TIM-3序列。
圖6.Tapr調(diào)節(jié)CD4 T細(xì)胞IL-4和IL-13應(yīng)答反應(yīng)。BALB/c DO11.10小鼠的T細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答中產(chǎn)生的IL-4和IL-13水平高于HBA DO11.10小鼠的T細(xì)胞。用抗CD-4磁珠正選擇分離得到脾CD4+細(xì)胞，然后將其和骨髓衍生的DC和OVA共培養(yǎng)。7天后，再刺激這些細(xì)胞。第二次培養(yǎng)18-24小時(shí)后收獲上清。數(shù)據(jù)代表了在遞增濃度的OVA下測(cè)得的平均細(xì)胞因子水平±S.D。在引發(fā)和分化過程中檢測(cè)TIM-1 mRNA在純化的CD4 T細(xì)胞中的表達(dá)。
圖7.人和小鼠TIM蛋白質(zhì)序列的序列排列對(duì)比。
圖8.人TIM-1的多態(tài)性。
圖9.人TIM-1的SSCP多態(tài)性分析。
實(shí)施方案的詳細(xì)描述提供了與免疫機(jī)能(包括對(duì)哮喘的易感性)相關(guān)的遺傳序列。本文提供了小鼠Tim-1、Tim-2、Tim-3和Tim-4的序列以及人相應(yīng)的序列。還提供了主要多態(tài)性的序列。基因組序列顯示，這些多態(tài)性(包括缺失)是真正的多態(tài)性，而不是剪接變體。TIM-1和TIM-3序列的變體與對(duì)氣道高反應(yīng)性和過敏性T細(xì)胞應(yīng)答的易感性相關(guān)，其它變體與對(duì)抗這些反應(yīng)的保護(hù)作用相關(guān)。
TIM基因家族成員的胞外功能域包括兩個(gè)功能域，一個(gè)IgV功能域和一個(gè)粘蛋白功能域。在MadCam(粘膜地址素細(xì)胞粘附分子)中也發(fā)現(xiàn)了這種Ig/粘蛋白結(jié)構(gòu)，它包括兩個(gè)Ig功能域和一個(gè)粘蛋白功能域；然而，TIM和MadCam之間只有低水平的同源性。TIM-1和TOSO(NP_005440.1 GI4885641)，一種類似于活性T細(xì)胞上表達(dá)的TIM-1的蛋白質(zhì)，它保護(hù)T細(xì)胞免于Fas介導(dǎo)的調(diào)亡，之間也有類似程度的同源性。
T細(xì)胞表達(dá)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)CD4 T細(xì)胞分化的TIM家族基因。Th1細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)TIM-3蛋白，而Th2細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)TIM-1蛋白。TIM-1與氣道高反應(yīng)性有關(guān)而TIM-3與自身免疫性疾病有關(guān)，因此，分化的淋巴樣細(xì)胞的表達(dá)模式和淋巴樣細(xì)胞上TIM-1的表達(dá)的動(dòng)力學(xué)反映了這些分子的功能。
在本發(fā)明的另一方面，提供了通過測(cè)定Tim基因座的基因型確定個(gè)體發(fā)生哮喘和特應(yīng)性疾病易感興的方法。篩選可以分析，例如，本文提供的TIM-1、TIM-3或TIM-4等位基因中任一的多態(tài)性，或者測(cè)定之。提供了篩選這種多態(tài)性的方法，如SSCP分析、大小多態(tài)性等。
本發(fā)明的另一方面，提供了篩選可調(diào)節(jié)Tim基因或多肽功能的生物活性制劑的方法，該方法包括將候選的生物活性制劑與以下任一物質(zhì)結(jié)合(a)Tim多肽；(b)含有編碼Tim多肽核酸的細(xì)胞；或(c)Tim基因功能的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，它包括以下之一(i)敲除Tim基因；(ii)外源性穩(wěn)定遞送的Tim基因序列；或(iii)操作性連接于一報(bào)告基因的Tim起動(dòng)子序列；和確定所述制劑對(duì)Tim功能的作用。
可以調(diào)節(jié)TIM多肽的活性以指導(dǎo)免疫功能。TIM-1優(yōu)先在Th2細(xì)胞上表達(dá)，能調(diào)節(jié)TIM-1活性的制劑可用來治療與Th2有關(guān)的疾病，包括過敏、哮喘等。TIM-3優(yōu)先在Th1細(xì)胞上表達(dá)，能調(diào)節(jié)TIM-1活性的制劑可用來治療促炎性免疫疾病，包括自身免疫性疾病、移植排斥等。
有關(guān)條件特應(yīng)性疾病有復(fù)雜的遺傳性狀，它發(fā)生在有遺傳傾向的個(gè)體是由于環(huán)境(誘導(dǎo)的)免疫應(yīng)答反應(yīng)的結(jié)果。將特應(yīng)性和非特應(yīng)性個(gè)體暴露在同樣的環(huán)境因素中，但是使特應(yīng)性個(gè)體與非特應(yīng)性個(gè)體相區(qū)別的遺傳差異，導(dǎo)致一些個(gè)體中發(fā)生特異性疾病，表現(xiàn)為呼吸道、皮膚或腸胃道的過敏性炎癥，以及血清IgE升高、嗜伊紅細(xì)胞增多和哮喘、打噴嚏或蕁麻疹等癥狀。此外，過敏性炎癥反應(yīng)的特征是存在產(chǎn)生高水平IL-4、IL-5、IL-9和IL-13的Th2淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞因子增強(qiáng)了嗜伊紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞以及產(chǎn)生IgE的B細(xì)胞的生長、分化和/或補(bǔ)充，。
有關(guān)的過敏原包括在食物，如草莓、花生、牛奶蛋白質(zhì)、雞蛋白等中發(fā)現(xiàn)的抗原。其它的有關(guān)過敏原包括各種以空氣為載體的抗原，如菁草花粉、動(dòng)物鱗屑、屋塵螨的糞便等。分子克隆的抗原包括Dermatophagoides pteryonyssinus(DerP1)；黑麥草花粉的Lol pl-V；許多昆蟲的毒液，包括jumper螞蟻Myrmecia pilosula的毒液；Apis mellifera蜂的毒液磷脂酶A2(PLA2和抗原5S；黃色胡蜂Vespulamaculifrons和白面胡蜂Dolichovespula maculat的磷脂酶；許多花粉的蛋白質(zhì)，包括樺樹花粉、豚草花粉、ParoI(Parietaria officinalis的主要過敏原)和交叉反應(yīng)性過敏原ParjI(來自Parietaria judaica)，以及其它空氣中的花粉，包括油橄欖、蒿屬，禾本科等。其它有關(guān)的過敏原是那些造成因吸血節(jié)肢動(dòng)物，如雙翅目，包括蚊子(瘧蚊屬，伊蚊屬、Culiseta、庫蚊屬)；蒼蠅(白蛉屬、庫蠓屬)，尤其是黑蠅、鹿虻和蠓；蜱(Dermacenter sp.、ornithodoros sp.、殘喙蜱屬)；蚤，如order siphonaptera，包括Xenopsylla Pulex和Ctenocephalides felis felis屬，引起的過敏性皮炎的過敏原。具體的過敏原可能是多糖、脂肪酸分子、蛋白質(zhì)等。
許多相互作用/上位特應(yīng)性基因的多態(tài)性被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致對(duì)過敏性疾病的易感性增強(qiáng)。通過將過敏和哮喘的各種參數(shù)與特定基因(通常是DNA(含有兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星)的重復(fù)序列)的多態(tài)性DNA標(biāo)志連接，對(duì)基因組進(jìn)行了廣泛掃描以鑒定負(fù)責(zé)基因。這些研究已經(jīng)鑒定到幾個(gè)可能參與特應(yīng)性發(fā)病機(jī)理的染色體區(qū)域，但分辨率不超過5-10cM，這當(dāng)中通常有幾百個(gè)候選基因。盡管如此，通過對(duì)這些基因組中的兩個(gè)或多個(gè)基因的廣泛掃描研究得知，哮喘易感性與染色體5q23-31、染色體6p21、染色體11q13和染色體12q(9-13)有關(guān)。
本文定義的哮喘是個(gè)體在一定時(shí)期內(nèi)發(fā)生的可逆的氣流阻塞。哮喘的特征是在氣道壁中存在嗜伊紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和CD25+T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞。由于細(xì)胞因子(有各種聯(lián)系和生物效應(yīng)器特性)的活性，這些細(xì)胞之間有近距離的相互作用。趨化因子吸引細(xì)胞到發(fā)炎部位而細(xì)胞因子將它們活化，導(dǎo)致粘膜炎癥和損傷。隨著炎癥的慢性化，發(fā)生繼發(fā)性變化，比如基底膜增厚和纖維變性。這種疾病的特征是氣道對(duì)各種刺激的高反應(yīng)性增加和氣道炎癥。隨著時(shí)間推移，診斷為哮喘的患者通常會(huì)發(fā)生多種癥狀，包括氣喘、哮喘發(fā)作、以及對(duì)乙酰膽堿攻擊的陽性應(yīng)答，即對(duì)低約4mg/ml的乙酰膽堿攻擊PC20。有關(guān)診斷的綜述可以參見，例如，NationalAsthma Education Program Expert Panel Guidelines for Diagnosis andManagement of Asthma，國家衛(wèi)生研究院，1991，Pub.NO.91-3042。
哮喘、過敏性鼻炎(干草熱)、特應(yīng)性皮炎(濕疹)和食物過敏都是同一家族中發(fā)生的疾病，這意味著有共同的遺傳機(jī)制。這些特應(yīng)性疾病非常普遍，整個(gè)人群中有20-40％患病，成為主要的公眾健康問題。治療這些疾病的經(jīng)濟(jì)花費(fèi)十分巨大。僅僅對(duì)哮喘而言，估計(jì)1996年中用于衛(wèi)生保健的費(fèi)用就有140億美元。此外，過去二十年中，工業(yè)化國家所有特應(yīng)性疾病的發(fā)病率顯著增長，原因不清楚。工業(yè)化國家哮喘發(fā)病率的提高最為急劇，自1982年以來增加了一倍，并有可能在2020年以前再增加一倍。
與Th1型T細(xì)胞有關(guān)的促炎性疾病包括自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化后、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病等。(RA)是影響世界人口0.8％的慢性自身免疫性炎性關(guān)節(jié)膜炎。目前對(duì)RA的治療采用非特應(yīng)性抑制或調(diào)節(jié)免疫功能的藥物。此類藥物，包括最近開發(fā)的TNFα拮抗劑，不能根治，且在停止治療后疾病迅速復(fù)發(fā)。臨床上迫切需要可以根治且不會(huì)造成全身性免疫抑制或調(diào)節(jié)的治療劑。
能夠分泌IFN-γ的髓磷脂自身反應(yīng)性T細(xì)胞數(shù)量的增加與MS和EAE的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，提示MS患者外周血中自身免疫性誘導(dǎo)/輔助T淋巴細(xì)胞可能引起和/或調(diào)節(jié)MS患者的脫髓鞘過程。明顯的疾病伴有肌無力、腹部反射消失、視覺缺陷和副交感神經(jīng)病。前兆期，有白細(xì)胞滲入腦脊液、炎癥和脫磷鞘現(xiàn)象。
細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，IDDM是導(dǎo)致胰島素分泌性β細(xì)胞破壞和顯著高血糖癥。T淋巴細(xì)胞侵入胰島，并特異性破壞胰島素產(chǎn)生β細(xì)胞。β細(xì)胞減少導(dǎo)致無法控制血液中葡萄糖的水平。可在通過家族史和遺傳分析診斷為易感性的個(gè)體中監(jiān)測(cè)這種疾病的發(fā)展。用主要組織相容性基因座(IDDM1)基因觀察到了最重要的遺傳效應(yīng)，盡管其它基因座，包括胰島素基因區(qū)(IDDM2)也顯示和這一疾病有關(guān)(參見Davies等，同上，和Kennedy等，(1995)Nature Genetics9293-298)。
基因家族本發(fā)明所提供的TIM家族基因及其片段，編碼的蛋白質(zhì)、基因調(diào)節(jié)區(qū)域和特異性抗體可用鑒定易于發(fā)生或抵抗哮喘的個(gè)體，并用于體內(nèi)基因活性調(diào)節(jié)以達(dá)到預(yù)防和治療的目的。編碼的蛋白質(zhì)可用作免疫原來誘導(dǎo)特異性抗體，用于對(duì)能模擬或調(diào)節(jié)這些基因和其編碼蛋白的活性或表達(dá)的組合物(包括這些蛋白質(zhì)的改變形式)進(jìn)行藥物篩選，以及作為治療劑。
在人染色體5上，TIM家族基因以TIM-4、TIM-1、TIM-3的順序沒有間插基因彼此緊密毗連。人染色體5的這一區(qū)段在惡性腫瘤和發(fā)育異常的細(xì)胞群體中通常缺失，比如在骨髓異常增生綜合征中(見Boultwood等，(1997)Genomics4588-96)。染色體5、12和19上存在TIM假基因。每個(gè)TIM蛋白，除TIM-4外，都含有一個(gè)預(yù)計(jì)的獨(dú)特的酪氨酸信號(hào)基序。TIM-1的胞質(zhì)區(qū)含有兩個(gè)酪氨酸殘基并包括一個(gè)高度保守的酪氨酸激酶磷酸化基序，READNIY。擴(kuò)展區(qū)，SRAEDNIYIVEDRP，含有預(yù)言的Itk磷酸化和EGF受體磷酸化位點(diǎn)。
小鼠Tim1基因編碼一305個(gè)氨基酸的膜蛋白。TIM-1的胞質(zhì)區(qū)含有兩個(gè)酪氨酸殘基并包括一個(gè)高度保守的酪氨酸激酶磷酸化基序，READNIY。TIM-1的粘蛋白功能域有多個(gè)O-連接糖基化位點(diǎn)，并在免疫球蛋白功能域中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)。
小鼠TIM-2，一種類似305個(gè)氨基酸的膜蛋白，與小鼠TIM-1有64％的相同性，與大鼠KIM-1有60％的相同性，與hHAVcr-1有32％的相同性。和TIM-1一樣，TIM-2有兩個(gè)胞外N-連接的糖基化位點(diǎn)，和一個(gè)富含絲氨酸和蘇氨酸并有許多O-連接的糖基化位點(diǎn)的粘蛋白功能域。TIM-2還有一個(gè)胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化基序，RTRCEDQVY。
TIM3編碼小鼠的一種281個(gè)氨基酸的膜蛋白，在編碼人類的一種301個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，具有類似的完整的帶有多個(gè)胞外糖基化位點(diǎn)和胞內(nèi)酪氨酸磷酸化基序的膜糖蛋白結(jié)構(gòu)。盡管TIM-3中的粘蛋白功能域沒有TIM-1和TIM-2那么顯著，但T細(xì)胞上表達(dá)的TIM-3能與APC的配體反應(yīng)并改變APC的活性。TIM-3有四個(gè)N-連接的和五個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn)，提示TIM-3和TIM-1和TIM-2一樣，是高度糖基化的，并可能和其它細(xì)胞(如抗原呈遞細(xì)胞)中存在的配體反應(yīng)。
TIM4編碼小鼠的一種344個(gè)氨基酸的膜蛋白，編碼人類的一種378個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)的TIM-4還含有其它TIM蛋白的普通膜糖蛋白結(jié)構(gòu)基序、一個(gè)具有高度保守半胱氨酸殘基的IgV樣功能域、一個(gè)富含蘇氨酸的粘蛋白樣功能域和一個(gè)短的胞內(nèi)尾巴。
在序列表中提供了BALB/c和HBA/DBA品系小鼠序列的多態(tài)性。TIM-1中，這些多態(tài)性在HBA/DBA中造成了三個(gè)氨基酸差異和15個(gè)氨基酸缺失。在TIM-3中鑒定到7個(gè)預(yù)計(jì)的氨基酸差異。TIM-1和TIM-4的多態(tài)性位于信號(hào)域和粘蛋白樣功能域中，而在TIM-3中鑒定的多態(tài)性集中在Ig功能域中。
序列表和圖8中提供了人Tim1編碼區(qū)域的改變。改變包括插入(標(biāo)記為多態(tài)性1)，157insMtttvp，在65％的染色體中觀察到了這一現(xiàn)象，和缺失(多態(tài)性5)，187ΔThr，在在65％的染色體中觀察到了這一現(xiàn)象。其它的多態(tài)性是T140A(多態(tài)性7)；V161A(多態(tài)性2)；V167I(多態(tài)性3)、T172A(多態(tài)性4)；N258D(多態(tài)性6)。在40％的染色體中觀察到了多態(tài)性4，并在≤5％的染色體中觀察到了其它的多態(tài)性。這些變化中的大部分(2-6)位于外顯子3(第一個(gè)編碼粘蛋白的外顯子)中，所有的變體都發(fā)生在基因組水平且不是剪接變體。有關(guān)螨敏感性兒童哮喘與D5S820(平均LOD值＝4.8)，(一個(gè)大約含0.5兆Tim1堿基的標(biāo)記)，有明顯聯(lián)系的報(bào)道進(jìn)一步支持Tim1和哮喘易感性之間的關(guān)系。
人類組織中，幾乎所有組織中都存在4.4kb的TIM-1的mRNA，盡管在大多數(shù)組織中很微弱。在結(jié)腸和肝臟中觀察到5.5kb的條帶。脾臟、胸腺和外周血白細(xì)胞中觀察到7.5kb的條帶，在一些器官中觀察到小于4.4kb的條帶。在不同的細(xì)胞群中，TIM-1 mRNA的表達(dá)帶有交替的5’非翻譯區(qū)。缺氧和局部缺血誘導(dǎo)上皮細(xì)胞表達(dá)TIM-1，輻射誘導(dǎo)TIM基因家族mRNA表達(dá)。腫瘤中也有TIM基因表達(dá)。人TIM-4 mRNA在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織有表達(dá)，也在有絲分裂素激活的或照射過的外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到。
一方面，除了自然發(fā)生的含有編碼TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4蛋白的序列的染色體外，本發(fā)明還提供了一種分離的核酸分子，或其同系物或變體，這種變體可能與氣道高反應(yīng)性和過敏性T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的易感性有關(guān)。這種核酸可以操作性連接于載體和/或控制序列在同源或異源的宿主細(xì)胞中表達(dá)。這種宿主細(xì)胞可以用來制造編碼的蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供了TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4蛋白的純化多肽，或其類似物或變體，這種變體可能與氣道高反應(yīng)性和過敏性T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的易感性有關(guān)。另一方面，本發(fā)明提供了能結(jié)合TIM-1、TIM-2、TIM-3或TIM-4多肽的抗體或其它特異性結(jié)合元件。
在序列表中列出了人和小鼠的TIM序列，如下所示
編碼Tim多肽的DNA序列可以是cDNA或基因組DNA或是其片段。用于探針、制造多肽等的有關(guān)片段可以包括一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性殘基。術(shù)語Tim基因指，編碼特定的Tim多肽、內(nèi)含子、以及參與表達(dá)調(diào)節(jié)的毗鄰5’和3’端非編碼核酸序列(高至超出編碼區(qū)1kb，但可能在某一端更長)中任一的開放性閱讀框?？蓪⒃摶蛞胍缓线m的載體中以便在染色體外保持或整合到宿主中。
一些實(shí)施例中，Tim基因序列不是序列表中列出的人TIM-1等位基因1；和/或不是小鼠TIM-3 DBA等位基因。
本文使用的術(shù)語“cDNA”包括與天然成熟的mRNA中發(fā)現(xiàn)的重有共同序列元件排列的所有核酸，其中的序列元件是外顯子和3’和5’非編碼區(qū)域。正常的mRNA有毗連的外顯子，并通過核RNA剪接除去了間插內(nèi)含子，以產(chǎn)生連續(xù)的編碼Tim蛋白的開放性閱讀框。
有關(guān)基因組序列包括如列出的序列中所定義的起始密碼子和終止密碼子之間的核酸，包括所有天然染色體正常存在的內(nèi)含子。它還可以包括成熟mRNA中發(fā)現(xiàn)的3’和5’非翻譯區(qū)域。它還可以包括特定的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，比如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，包括轉(zhuǎn)錄區(qū)5’或3’末端的長約1kb(也可能在更長)的側(cè)接基因組DNA?？蓪⒒蚪MDNA分離成100kbp或更小的片段；且基本上沒有側(cè)接的染色體序列。
5’區(qū)序列以及5’上游序列和3’下游序列可用于啟動(dòng)子元件，包括增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)，以供在表達(dá)Tim基因的組織中進(jìn)行表達(dá)。組織特異性表達(dá)可用于確定表達(dá)模式和提供模擬天然表達(dá)模式的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子區(qū)域中天然發(fā)生的多態(tài)性可用來確定表達(dá)的天然變化，尤其是那些可能與疾病有關(guān)的變化?；蛘?，可以在啟動(dòng)子區(qū)域引入突變以確定改變表達(dá)在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的影響。涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的鑒定特定DNA基序的方法是該領(lǐng)域已知的，例如對(duì)已知結(jié)合基序的序列相似性，凝膠阻滯研究等。例如，可參見Blackwell等，(1995)Mol Med1194-205；Mortlock等，(1996)GenomeRes.6327-33；以及Joulin和Richard-Foy(1995)Eur J Biochem232620-626。
調(diào)控序列可用來鑒定TIM表達(dá)的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控所需的順式作用序列，尤其是在不同組織或發(fā)育的不同階段，并可用來鑒定調(diào)節(jié)或介導(dǎo)TIM表達(dá)的順式作用序列和反式作用因子。這種轉(zhuǎn)錄或翻譯控制區(qū)可以操作性連接于一TIM基因以促進(jìn)野生型或改變的TIM或其它有關(guān)蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中，或胚胎、胎兒或成人組織中的表達(dá)，并可用于基因治療。
本發(fā)明的核酸組合物可以編碼整個(gè)對(duì)象多肽或其一部分。按照常規(guī)方法通過化學(xué)合成寡核苷酸、經(jīng)限制性酶消化、PCR擴(kuò)增等可獲得該DNA序列的片段。很大程度上，DNA片段至少為15nt，通常至少為18nt，更常至少約為50nt。這種小DNA片段可用作PCR、雜交篩選等的引物。較大的DNA片段，即大于100nt的DNA片段可用于制造編碼的多肽。為用于擴(kuò)增反應(yīng)，比如PCR，要使用一對(duì)引物。對(duì)于本發(fā)明，引物序列的精確組成不是嚴(yán)格的，但如該領(lǐng)域所知，對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，引物將在嚴(yán)謹(jǐn)條件下和對(duì)象序列雜交。宜選擇一對(duì)將產(chǎn)生至少約50nt擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，更好的是至少約100nt。選擇引物序列的算法是眾所周知的，并在商品軟件包中可得到。擴(kuò)增引物與DNA的互補(bǔ)鏈雜交，并相互引導(dǎo)。
分離并得到的TIM基因是足夠純的，通常是完整的哺乳動(dòng)物染色體。通常，將得到的DNA基本上沒有TIM序列或其片段以外的其它核酸序列，至少約50％，通常至少約90％純，且一般是“重組體”，即，其側(cè)面連接有一個(gè)或多個(gè)在天然染色體中不與其正常相連的核苷酸。
此DNA序列可用于各種途徑。它們可用作鑒定TIM相關(guān)基因的探針。哺乳類同源生物有與對(duì)象序列基本相似的序列，即，至少有75％，通常至少有90％，更通常至少有95％的核苷酸序列與對(duì)象DNA序列相同。序列相同性是基于參考序列計(jì)算的，參考序列可以是較大序列的亞序列，比如保守性基序、編碼區(qū)域、側(cè)接區(qū)等。參考序列一般至少約有18nt長，更通常至少約30nt長，并可以延伸至被比較的完全序列。序列分析的算法是該領(lǐng)域已知的，如BLAST，見Altschul等描述，(1990)JMol Biol215403-10。
在低嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如，在50℃和10×SSC(0.9M鹽水/0.09M檸檬酸鈉)下通過雜交檢測(cè)具有序列類似性的核酸，并在55℃用1×SSC沖洗以保持結(jié)合。在嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如，在50℃或更高溫度和0.1SSC(9M鹽水/0.9M檸檬酸鈉)下通過雜交測(cè)定序列相同性。通過使用探針，尤其是DNA序列的標(biāo)記探針，我們可以分離出同源或相關(guān)基因。同源基因的來源可以是任何物種，例如，靈長類，尤其是人類；嚙齒類，如大鼠和小鼠，犬，貓，牛，綿羊，馬，酵母，果蠅、Caenhorabditis等。
該DNA可用來鑒定基因在生物樣品中的表達(dá)。文獻(xiàn)中已經(jīng)建立了探測(cè)細(xì)胞中特定核苷酸序列(如基因組DNA或RNA)存在情況的方法，本文無需贅述。從細(xì)胞樣品中分離mRNA，可用反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增mRNA形成互補(bǔ)DNA鏈，然后用對(duì)對(duì)象DNA序列的特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增?；蛘撸ㄟ^凝膠電泳分離mRNA樣品，將其轉(zhuǎn)移到合適的支撐物上，如硝酸纖維素、尼龍等，然后用對(duì)象DNA的片段作為探針進(jìn)行探測(cè)。也可以使用其它的技術(shù)，如寡核苷酸連接試驗(yàn)、原位雜交、和與排列在固體芯片上的DNA探針進(jìn)行雜交。檢測(cè)到mRNA與對(duì)象序列的雜交表明了樣品中有TIM基因的表達(dá)。
出于各種目的可以修飾對(duì)象核酸序列，尤其是細(xì)胞內(nèi)使用它們時(shí)，例如，將其與核酸切割試劑(例如螯合的金屬離子，如鐵或鉻)結(jié)合進(jìn)行基因切割等等。
可以用該領(lǐng)域已知的各種方法使TIM基因座的序列，包括側(cè)接啟動(dòng)子區(qū)和編碼域突變，以在啟動(dòng)子強(qiáng)度、編碼蛋白質(zhì)的序列等中產(chǎn)生靶的改變。此類突變的DNA序列或產(chǎn)物與本文提供的序列基本上類似，即，分別至少有一個(gè)核苷酸或氨基酸的差異，并可以有至少兩個(gè)但不超過10個(gè)核苷酸或氨基酸的差異。序列的變化可以是取代、插入或缺失。缺失可以進(jìn)一步包括較大的變化，如一個(gè)功能域或外顯子缺失。其它有關(guān)的修飾包括表位加尾，例如，帶有FLAG系統(tǒng)，HA，等。為研究亞細(xì)胞定位，可采用帶有綠色熒光蛋白(GFP)的融合蛋白。此類突變基因可用來研究TIM多肽的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，或用來能改變影響其功能或調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的特性。例如，用這種方法可以產(chǎn)生組成型活性轉(zhuǎn)錄因子，或能與TIM DNA目標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合而不激活轉(zhuǎn)錄的顯性陰性活性蛋白。
克隆基因的體外誘變技術(shù)是已知的。掃描突變方法的例子可以在Gustin等，Biotechniques 1422(1993)；Barany，Gene 37111-23(1985)；Colicelli等，Mol Gen Genet 199537-9(1985)；和Prentki等，Gene 29303-13(1984)中找到。位點(diǎn)專一誘變的方法可以在Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，CSH出版社1989，第15.3-15.108頁，Weiner等，Gene 12635-41(1993)；Sayer等，Biotechniques 13592-6(1992)；Jones and Winistorfer，Biotechniques12528-30(1992)；Barton等，Nucleic Acids Res 187349-55(1990)；Marotti和Tomich，Gene Anal Tech 667-70(1989)；以及Zhu Anal Biochem 177 120-4(1989)中找到。
陣列提供了一種高處理量的技術(shù)，它可以測(cè)定一個(gè)樣品中的許許多多核苷酸。本發(fā)明的另一方面，構(gòu)建了含有一個(gè)或多個(gè)TIM基因、蛋白或抗體的陣列，較好的是該陣列含有所有這些序列，這種陣列還可以包括已知在T細(xì)胞、單核細(xì)胞等中受到上調(diào)或下調(diào)的其它序列。這種技術(shù)可用作檢測(cè)差異性表達(dá)或檢測(cè)基因型的工具?？梢詫⒍嗪塑账崽结橖c(diǎn)到結(jié)合了探針的二維基質(zhì)的底層(如，玻璃、硝酸纖維素等)或陣列中上以制得陣列。這些探針可以通過共價(jià)鍵或非共價(jià)反應(yīng)，如疏水反應(yīng)與基質(zhì)結(jié)合。構(gòu)建陣列的技術(shù)和使用陣列的方法參見，例如，Schena等(1996)Proc NatlAcad Sci USA.93(20)10614-9；Schena等，(1995)Science270(5235)467-70；Shalon等，(1996)Genome Res.6(6)639-45，美國專利(USPN)5,807,522，歐洲專利(EP)799 897；民辦專利(WO)97/29212；WO 97/29317；EP 785 280；WO 97/02357；USPN 5,593,839；USPN 5,578,832；EP 728 520；USPN 5,599,695；EP 721 016；USPN 5,556,752；WO 95/22058；和USPN 5,631,734中所述。
陣列中使用的探針可以有各種類型，可包括，例如，相對(duì)長度較短的合成探針(如，20-mer或25-mer)、cDNA(全長基因或基因片段)、擴(kuò)增的DNA、DNA片段(例如，通過限制性酶切產(chǎn)生)和反轉(zhuǎn)錄DNA。定制的陣列和通用陣列都可以用來檢測(cè)差異性表達(dá)水平。采用能與mRNA基因序列的特異性預(yù)選亞序列或用它們制備的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的探針，可以制備定制陣列。
陣列可以用來，例如，檢測(cè)基因的差異性表達(dá)和用于測(cè)定基因功能。例如，陣列可以用來檢測(cè)TIM基因的差異性表達(dá)或多態(tài)性序列的表達(dá)。陣列用途的例子進(jìn)一步描述參見，例如，Pappalarado等(1998)Sem.Radiation Oncol.8217；以及Ramsay(1998)Nature Biotechnol1640。此外，使用陣列的檢測(cè)方法的許多變化是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，與其將探針固定在固體支撐物上，不如待測(cè)樣品固定在固體支撐物上，然后再使其與探針接觸。還可以發(fā)現(xiàn)其它關(guān)于在表達(dá)分析中使用微陣列的論述，例如，Duggan等，Nature GeneticsSupplement 2110-14(1999)；Bowtell，Nature Genetics Supplement 2125-32(1999)；Brown和Botstein，Nature Genetics Supplement 2133-37(1999)；Cole等，Nature Genetics Supplement 2138-41(1999)；Debouck和Goodfellow，Nature Genetics Supplement 2148-50(1999)；Bassett，Jr.等，Nature GeneticsSupplement 2151-55(1999)；以及Chakravarti，Nature Genetics Supplement2156-60(1999)。
藥物遺傳學(xué)是個(gè)體基因型和個(gè)體對(duì)治療藥物代謝或反應(yīng)能力之間的聯(lián)接學(xué)科。通過改變藥物的生物活性劑量和血液濃度之間的關(guān)系，代謝作用或?qū)ぐ徐`敏度的差異可能導(dǎo)致嚴(yán)重的中毒或治療失敗。在過去幾年中，許多研究已經(jīng)建立了代謝酶或藥物靶標(biāo)的多態(tài)性和反應(yīng)與毒性之間的良好關(guān)系。這些關(guān)系可用于給藥治療劑量的個(gè)體化。
多態(tài)性等位基因的基因型可用來估計(jì)個(gè)體是否會(huì)對(duì)特定的治療方案產(chǎn)生良好反應(yīng)。多態(tài)性序列還可用于藥物篩選試驗(yàn)，以確定候選治療制劑的劑量和特異性。通過靶向治療篩選候選的TIM多態(tài)性，以確定是否會(huì)對(duì)治療哮喘的效果產(chǎn)生影響。藥物篩選試驗(yàn)按照上訴方法進(jìn)行。為了知道對(duì)治療的反應(yīng)通常需要檢測(cè)兩個(gè)或多個(gè)不同的序列多態(tài)性。
對(duì)象基因可用來合成完整的TIM蛋白，或其多肽片段，尤其是與功能域相對(duì)應(yīng)的片段，結(jié)合位點(diǎn)等等；并包括對(duì)象多肽與其它蛋白質(zhì)或其一部分的融合。為了表達(dá)，可以對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(可以是可誘導(dǎo)或組成型的)使用表達(dá)盒，這里，在對(duì)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制下，編碼區(qū)操作性相連接?？梢允褂酶鞣N在表達(dá)宿主中有功能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
特別感興趣的多肽是包括TIM多肽特定功能域的TIM多肽的片段，功能域可以包括，例如胞外域，或是胞外域中的功能域粘蛋白域和/或Ig功能域。功能域還可以包括胞質(zhì)域，如，含有酪氨酸激酶磷酸化基序RAEDNIY，或延伸域SRAEDNIYIVEDRP的片段。可溶性剪接變體編碼的多肽也是感興趣的。Ig功能域的序列如下所示人TIM-1 Ig功能域，SEQ ID NO17、19、21、23、25、27，殘基21-126；人TIM-3 Ig功能域，SEQ ID NO29和31，殘基22-131；人TIM-4 Ig功能域，SEQ ID NO33和35，殘基21-129；小鼠TIM-2 Ig功能域，SEQ ID NO7，殘基22-128；小鼠TIM-3 Ig功能域，BALB/c等位基因，SEQ ID NO9，殘基22-132；小鼠TIM-3 Ig功能域，DBA/2等位基因，SEQ ID NO11，殘基22-132；小鼠TIM-4 Ig功能域，SEQ ID NO13和15，殘基25-135。
可以使用功能相等的多肽，這里的等價(jià)多肽包括導(dǎo)致沉默變化的氨基酸殘基的缺失、加入或取代，因此產(chǎn)生了功能相同的基因產(chǎn)物?？梢栽跇O性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或有關(guān)殘基的兩親性性質(zhì)相似的基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸取代?！肮δ芟嗟取敝改軌蝻@示與TIM基因編碼的多肽基本類似的體內(nèi)活性的蛋白質(zhì)。
按照常規(guī)方法，根據(jù)表達(dá)的目的，多肽可以在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)。為大量生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)，可以用單細(xì)胞生物，如大腸桿菌枯草桿菌啤酒酵母菌，或高等生物如脊椎動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如COS 7細(xì)胞，所為表達(dá)的宿主細(xì)胞。許多情況下，可能需要在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中表達(dá)TIM基因，此時(shí)，TIM基因?qū)@益于天然折疊和翻譯后加工。也可以在實(shí)驗(yàn)室合成小肽，包括特定的肽表位、結(jié)構(gòu)域等，肽通常至少約8個(gè)氨基酸長，更通常至少約20個(gè)氨基酸長，以至整個(gè)功能域和全長蛋白質(zhì)。肽可以含有蛋白質(zhì)的多態(tài)性區(qū)域。還包括融合蛋白，整個(gè)TIM蛋白或其部分融合于一異源多肽，如，綠色熒光蛋白、抗體Fc區(qū)域、聚組氨酸等。
在哺乳類宿主細(xì)胞中，可以使用許多以病毒為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)，包括反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等。如果用腺病毒作為表達(dá)載體，可將有關(guān)編碼序列連接于腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體上，例如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)引導(dǎo)序列。然后可以通過體外或體內(nèi)重組技術(shù)在腺病毒基因組中插入該嵌合基因。插入病毒基因組的非必需區(qū)域(如，E1或E3區(qū)域)將產(chǎn)生活的能在受感染的宿主中表達(dá)差異性表達(dá)的蛋白或通路基因蛋白的重組體病毒。
為有效翻譯基因可能需要特殊的啟動(dòng)信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和毗鄰序列。如果將完整的基因，包括其自身的起始密碼子和毗鄰序列，插入合適的表達(dá)載體中，可能不需要額外的翻譯控制信號(hào)。然而，如果之插入部分基因編碼序列，必需提供外源翻譯控制信號(hào)。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是各種來源的，天然或合成的。加入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等可以提高表達(dá)的效率。
通過使用表達(dá)宿主可以得到大量多肽，可根據(jù)常規(guī)方法分離并純化這些多肽?？梢灾圃毂磉_(dá)宿主的裂解物并用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親合層析或其它純化技術(shù)純化裂解物。純化的多肽通常至少約80％純，較好的約90％純，可高達(dá)100％純。純指沒有其它蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎屑。
多肽可以直接或間接標(biāo)記?？梢允褂萌魏魏线m的標(biāo)記系統(tǒng)，包括但不限于放射性同位素，如125I；當(dāng)接觸底物時(shí)會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色信號(hào)或光的酶標(biāo)記系統(tǒng)；以及熒光標(biāo)記。間接標(biāo)記包括使用蛋白質(zhì)，例如能與有關(guān)多肽特異性結(jié)合的標(biāo)記的抗體。此類抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈抗體、其Fab片段和由Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
特異性結(jié)合元件本文使用的術(shù)語“特異性結(jié)合成員”或“結(jié)合成員”是指特異性結(jié)合對(duì)的成員，即兩個(gè)分子，通常是兩個(gè)不同的分子，其中一個(gè)分子(即，第一特異性結(jié)合成員)通過化學(xué)或物理手段與另一個(gè)分子(即，第二特異性結(jié)合成員)特異性結(jié)合。特異性結(jié)合對(duì)的互補(bǔ)成員有時(shí)被稱為配體和受體；或受體和反受體。對(duì)于本發(fā)明的目的，已知這兩個(gè)結(jié)合成員是相互結(jié)合的，例如，在一個(gè)測(cè)定能干擾已知結(jié)合對(duì)結(jié)合的化合物的試驗(yàn)中?；蛘?，可以使用懷疑為某有關(guān)化合物的結(jié)合伴侶的候選化合物。
有關(guān)的特異性結(jié)合對(duì)，包括碳水化合物和外源凝集素；互補(bǔ)的核苷酸序列；肽配體和受體；效應(yīng)器和受體分子；激素和激素結(jié)合蛋白；酶輔助因子和酶；酶抑制劑和酶；脂類和脂類結(jié)合蛋白等。特異性結(jié)合對(duì)可包括最初的特異性結(jié)合成員的類似物、衍生物和片段。例如，受體和配體對(duì)，可以包括肽片段，化學(xué)合成的肽模擬物，標(biāo)記的蛋白質(zhì)，衍生的蛋白質(zhì)等。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，特異性結(jié)合成員是抗體。術(shù)語“抗體”或“抗體部分”包括適合和識(shí)別其抗原表位的有特定形狀的任何含有多肽鏈的分子結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)或多個(gè)非共價(jià)結(jié)合反應(yīng)穩(wěn)定了該分子結(jié)構(gòu)和此表位之間的復(fù)合物。能與一種TIM蛋白特異性結(jié)合的抗體稱為抗TIM抗體。原始型的抗體分子是免疫球蛋白，所有來源，如人、鼠、兔、牛、羊、豬、狗、其它哺乳動(dòng)物、雞、其它鳥類等，的所有類型的免疫球蛋白，IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等，都被認(rèn)為是“抗體”。用于本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，盡管單克隆抗體是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛赏ㄟ^細(xì)胞培養(yǎng)或重組而產(chǎn)生，并可以被修飾以減弱它們的抗原性。
可以用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過給生產(chǎn)動(dòng)物注射抗原性組合物(可以是多肽或在體內(nèi)表達(dá)的cDNA)以產(chǎn)生多克隆抗體。參見，例如，Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988。當(dāng)使用整個(gè)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)較大的片段時(shí)，用蛋白質(zhì)或合適的佐劑(如，弗氏佐劑、弗氏完全佐劑、水包油型乳劑等)免疫生產(chǎn)動(dòng)物以產(chǎn)生抗體。當(dāng)用較小的肽時(shí)，將肽與大分子偶聯(lián)制備免疫刺激性偶聯(lián)物是有利的。通常采用的偶聯(lián)蛋白可從商業(yè)上獲得，包括牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。為了產(chǎn)生特定表位如多態(tài)性殘基的抗體，可以使用全長序列衍生的肽。給動(dòng)物宿主注射免疫原，最好是按照預(yù)先確定的包括一次或多次加強(qiáng)免疫的流程，并定期給動(dòng)物放血。然后可以通過，例如，親合層析(用與合適的固體支持物交聯(lián)的多肽)從這種抗血清中純化得到多克隆抗體。
或者，對(duì)于單克隆抗體，可以形成雜交瘤，方法是分離激活的免疫細(xì)胞(比如來自接種動(dòng)物脾臟的細(xì)胞)。然后將這些細(xì)胞與能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中無限復(fù)制的永生細(xì)胞，如骨髓瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞融合，如此產(chǎn)生永生的分泌免疫球蛋白的細(xì)胞系。優(yōu)選使用的永生細(xì)胞系在利用某種營養(yǎng)素所必需的酶上有缺陷。許多此類細(xì)胞系(比如骨髓瘤)是該領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的，其中包括，例如胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)。這些缺陷使得能夠按照在(例如)次黃嘌呤氨甲喋呤和胸苷培養(yǎng)基(HAT)上生長的能力對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行選擇。
較好地，所用永生的融合伙伴來自不分泌免疫球蛋白的系細(xì)胞系。將所得融合細(xì)胞，或雜交瘤培養(yǎng)在可使融合細(xì)胞存活(但非融合細(xì)胞不能存活)的條件下，并篩選能產(chǎn)生所需單克隆抗體的克隆。將產(chǎn)生單克隆抗體的群落克隆、擴(kuò)增并培養(yǎng)以得到大量的抗體，見Kohler和Milstern，1975 Nature 256495(在此將其并入以供參考)。
然后將克隆細(xì)胞注射入小鼠的腹膜腔并收獲其中產(chǎn)生的腹水以制造大量雜交瘤分泌的單克隆抗體。小鼠宜用降植烷或其它腫瘤啟動(dòng)子處理并通過化學(xué)手段或照射免疫抑制，可以是該領(lǐng)域已知的任何合適品系。收集小鼠腹水液然后通過，例如，CM瓊脂糖凝膠柱或其它層析法從中純化得到單克隆抗體?；蛘撸梢栽隗w外培養(yǎng)雜交瘤或作懸浮培養(yǎng)?？梢圆捎梅峙囵B(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)或其它合適的培養(yǎng)方法。然后從培養(yǎng)液或上清液中回收單克隆抗體。
此外，可通過基因工程生產(chǎn)抗體或抗原結(jié)合片段。這一技術(shù)中，如標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤程序那樣，使抗體產(chǎn)生細(xì)胞對(duì)所需的抗體或免疫原致敏。分離免疫脾細(xì)胞或雜交瘤中的信使RNA，用作PCR擴(kuò)增的模板制造cDNA。將擴(kuò)增的免疫球蛋白cDNA的合適片段插入表達(dá)載體，產(chǎn)生各自含有保留了最初抗原特異性的一個(gè)重鏈基因和一個(gè)輕鏈基因的載體文庫。將重鏈基因文庫和輕鏈基因文庫合并構(gòu)建組合文庫。得到一個(gè)克隆文庫可共表達(dá)重鏈和輕鏈(類似于抗體分子的Fab片段抗原結(jié)合片段)。將帶有這些基因的載體共轉(zhuǎn)染入一宿主(如細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它合適的產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞)。當(dāng)在轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)抗體基因合成時(shí)，重鏈和輕鏈蛋白自身組裝產(chǎn)生活性抗體，可用抗原或免疫原篩選檢測(cè)。
以重組方法將小鼠(或來自其它動(dòng)物)雜交瘤克隆獲得的小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)(VK和VH)與人輕鏈和重鏈恒定區(qū)相結(jié)合制備嵌合抗體，以產(chǎn)生帶有優(yōu)勢(shì)的人結(jié)構(gòu)域的抗體。制造此類嵌合抗體的方法是該領(lǐng)域熟知的，并可用標(biāo)準(zhǔn)方法(如美國專利5,624,659中所描述的，在此將其并入以供參考)實(shí)現(xiàn)。基因工程改造人源化抗體以含有更多的人免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并只加入動(dòng)物衍生抗體的互補(bǔ)決定域。這可通過仔細(xì)檢查單克隆抗體可變區(qū)的超變環(huán)序列，并使它們適合人抗體鏈的結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)。盡管看起來很復(fù)雜，但此方法已付諸實(shí)施。參見，例如，美國專利6,187,287號(hào)，全文并入以供參考。
或者，可以用遺傳性改變的動(dòng)物生產(chǎn)多克隆或單克隆抗體以生產(chǎn)人免疫球蛋白。產(chǎn)生此類動(dòng)物的技術(shù)以及從中分離抗體的方法在美國專利6,162,963和6,150,584中有描述，全文并入以供參考。
或者，可以用含有人可變區(qū)的噬菌體文庫生產(chǎn)單鏈抗體(Fv，如下所述)。參見美國專利6,174,708號(hào)。已證明在大鼠模型中鞘內(nèi)給予單鏈免疫毒素，LMB-7[B3(Fv)-PE38]，可以治療癌性腦膜炎。Proc Natl Acad Sci USA 92，2765-9，在此將其全文并入以供參考。
除了完整的免疫球蛋白(或它們的重組體對(duì)應(yīng)物)，含有表位結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白片段(如，F(xiàn)ab’、F(ab’)2或其它片段)在本發(fā)明中也可用作抗體部分。此類抗體片段可以通過胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其它蛋白酶切割由完整的免疫球蛋白產(chǎn)生?？梢杂弥亟M免疫球蛋白技術(shù)設(shè)計(jì)“片段”或最小的免疫球蛋白。例如，可以通過肽接頭(例如，聚甘氨酸或其它不形成α螺旋或β片層的序列)將輕鏈的可變區(qū)與重鏈可變區(qū)連接以產(chǎn)生供本發(fā)明使用的“Fv”免疫球蛋白。
Fv片段是重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的異二聚體。在整個(gè)IgG中發(fā)生的重鏈和輕鏈域的異二聚體，例如，通過二硫鍵連接。重組Fvs(其中，VH和VL被肽接頭連接)一般是穩(wěn)定的。已發(fā)現(xiàn)這些單鏈Fvs保留了特異性和親和力，且證明可用于腫瘤攝影以及制造重組體免疫毒素作腫瘤治療。然而，研究者已發(fā)現(xiàn)某些單鏈Fvs的抗原親和力降低而且肽接頭可能干擾結(jié)合。也已制得了改進(jìn)的Fv’s，如美國專利6,147,203所述(在此全文并入以供參考)，它在VH和VL區(qū)之間含有穩(wěn)定的二硫鍵。任何這些最小的抗體都可用于本發(fā)明，宜將它們?nèi)嗽椿员苊釮AMA反應(yīng)，在本發(fā)明的實(shí)施方案中是優(yōu)選使用的。
此外，帶有附加的化學(xué)接頭、可測(cè)部分(如熒光染料、酶、底物、化學(xué)發(fā)光部分等)或特異性結(jié)合部分(如鏈霉親和素、半和素、或生物素等)的衍生的免疫球蛋白可用在本發(fā)明的方法和組合物中。為了簡(jiǎn)便，術(shù)語“抗體”或“抗體部分”將用于全文，它通常是指能與腦腫瘤蛋白靶位的表位特異性結(jié)合的分子，盡管如上所述，這一術(shù)語包括所有的免疫球蛋白、衍生物、片段、重組體或基因工程改造的免疫球蛋白以及修飾過的免疫球蛋白。
可以用任何合適的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)試候選抗體的活性。第一次篩選時(shí)，可以檢查抗體對(duì)免疫原的結(jié)合。第二次篩選時(shí)，可以篩選抗體對(duì)等位基因和TIM家族成員之間的交叉反應(yīng)，并測(cè)定抑制TIM功能的活性。進(jìn)行這些篩選時(shí)，可以標(biāo)記候選抗體以供檢測(cè)?？梢詼y(cè)定能改變功能形式的TIM蛋白生物活性的抗體。
診斷通過對(duì)患者的任何方便的樣品(如，活檢組織材料、血樣、面頰碎屑等)進(jìn)行蛋白質(zhì)、DNA或RNA序列和/或雜交分析進(jìn)行Tim多態(tài)性相關(guān)的哮喘或特應(yīng)性的診斷。分析TIM相關(guān)哮喘患者的核酸樣品中，是否存在TIM易感多態(tài)性。典型患者的基因型中至少在一個(gè)染色體上有至少一個(gè)易感性突變。多態(tài)性TIM序列的存在會(huì)影響基因產(chǎn)物的活性或表達(dá)，并會(huì)增加對(duì)哮喘的易感性，故被認(rèn)為是易感多態(tài)性。通過分析個(gè)體DNA或mRNA中是否存在易感多態(tài)性與哮喘中性序列比較，對(duì)個(gè)體進(jìn)行篩檢。所關(guān)注的特殊序列包括導(dǎo)致慢性支氣管高反應(yīng)性或是哮喘相關(guān)癥狀的任何多態(tài)性，包括但不限于，編碼區(qū)序列中影響剪接的內(nèi)含子序列中、或影響蛋白質(zhì)活性和表達(dá)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列中發(fā)生的插入、取代和缺失。實(shí)施例中提供了特殊TIM多態(tài)性的例子。
篩選可以根據(jù)蛋白質(zhì)的功能或抗原特性。在篩選中可以采用設(shè)計(jì)好免疫試驗(yàn)來測(cè)定TIM蛋白中的易感多態(tài)性。如果存在許多導(dǎo)致特殊的疾病表型的各種突變，則功能性蛋白試驗(yàn)證明是有效的篩選工具。
可以進(jìn)行生化研究以確定TIM編碼區(qū)域或控制區(qū)域中的候選序列多態(tài)性是否與疾病相關(guān)。例如，影響TIM表達(dá)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列中的變化可能導(dǎo)致對(duì)哮喘的易感性。用該領(lǐng)域已知的各種方法將候選變體等位基因的表達(dá)水平與正常等位基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。確定啟動(dòng)子或增強(qiáng)子強(qiáng)度的方法包括對(duì)表達(dá)的天然蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定；將變體控制元件插入帶有報(bào)告基因(如，β-半乳糖苷酶、螢光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等)的載體中以供用于方便的定量測(cè)定；等等?？梢酝ㄟ^與野生型蛋白質(zhì)進(jìn)行比較以確定編碼的TIM蛋白的活性。
有許多方法可分析核酸中是否存在特殊序列。如果可得到大量的DNA，則可以直接使用基因組DNA?；蛘?，將有關(guān)區(qū)域克隆入一合適的載體中并使其生長至足夠量以供分析。表達(dá)TIM基因的細(xì)胞，比如氣管細(xì)胞，可作為mRNA的來源，可以對(duì)它進(jìn)行直接測(cè)定或反轉(zhuǎn)錄成cDNA以供分析。可以通過常規(guī)的方法擴(kuò)增核酸，比如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以提供足夠的量以供分析。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的用法在Saiki等，(1985)Science239487中有描述，并可以在Sambrook等(1985)MolecularCloningA Laboratory Manual，CSH出版社1989，第14.2-14.33頁中找到現(xiàn)有技術(shù)的綜述。通過采用多態(tài)性的特異引物擴(kuò)增，可以用來確定是否存在多態(tài)性。或者，該領(lǐng)域已知各種應(yīng)用寡核苷酸連接作為檢測(cè)多態(tài)性的手段的方法，例子可以參見，Riley等，(1990)N.A.R.182887-2890；以及Delahunty等，(1996)Am.J.Hum.Genet.581239-1246。
在擴(kuò)增反應(yīng)中可以使用可檢測(cè)標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光色素，如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明、得克薩斯紅、藻紅素、別藻藍(lán)素、6-羧基熒光素(6-FAM)，2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、6-羧基-X-羅丹明(ROX)、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯熒光素(HEX)、5-羧基熒光素(5-FAM)或N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)；放射性標(biāo)記，如32P、35S、3H；等。標(biāo)記也可以是兩個(gè)階段系統(tǒng)的，其中擴(kuò)增的DNA與具有高親合力結(jié)合伴侶(如，親合素、特異性抗體等)的生物素、半抗原等偶聯(lián)，而結(jié)合伴侶則與可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)。標(biāo)記可偶聯(lián)于一個(gè)或兩個(gè)引物?；蛘?，標(biāo)記擴(kuò)增時(shí)使用核苷酸池，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物中摻入標(biāo)記。
用該領(lǐng)域已知的許多方法之一分析樣品核酸，例如擴(kuò)增或克隆的片段。可以用雙脫氧法或其它的方法測(cè)定核酸的序列并將堿基序列與天然TIM序列相比較。通過Southern印跡、斑點(diǎn)印跡等，與變體序列的雜交也可用來確定它的存在。固定于固體支持物，(如US 5,445,934或WO95/35505所述)，的寡核苷酸探針陣列的對(duì)照和變體序列的雜交模式也可用來測(cè)定變體序列的存在。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、錯(cuò)配切割檢測(cè)和凝膠基質(zhì)中的異質(zhì)雙鏈體分析可用來測(cè)定電泳遷移中因DNA序列變化而產(chǎn)生的構(gòu)象改變?；蛘?，當(dāng)多態(tài)性產(chǎn)生或破壞了限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)(限制性片段長度多態(tài)性，RFLP)時(shí)，將樣品用內(nèi)切酶消化，并且將產(chǎn)物大小分級(jí)以確定片段是否被消化。通過凝膠電泳或毛細(xì)管電泳進(jìn)行分級(jí)，尤其是丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠。
固定于固體支持物(如US 5,445,934或WO95/35505中所描述的)上的寡核苷酸探針陣列的對(duì)照和變體序列的雜交模式，可用作檢測(cè)變體序列是否存在的工具。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了寡核苷酸的陣列，該陣列上的分隔部位至少與TIM基因座的mRNA或基因組DNA的一部分互補(bǔ)。此類陣列可以含有一系列寡核苷酸，它們各自能與核酸(如TIM基因座的mRNA、cDNA、基因組DNA等)特異性雜交。
TIM多態(tài)性的特異性抗體可用于篩選性免疫試驗(yàn)。天然TIM和/或哮喘相關(guān)多態(tài)性的降低或升高表明哮喘是TIM相關(guān)的。采取懷疑患有TIM相關(guān)哮喘患者的樣品。本文所用的樣品包括生物液體，如氣管灌洗液、血液、腦脊液、眼淚、唾液、淋巴液、透析液等；器官或組織培養(yǎng)物產(chǎn)生的液體；以及此類液體的組分。活檢組織樣品受到了特別的關(guān)注，如器官刮削物。樣品中細(xì)胞的數(shù)目一般至少約為103，通常至少為104，更通常至少約為105。如果是固體組織，則可以將細(xì)胞分離，或分析組織切片?；蛘呖梢灾苽浼?xì)胞裂解物。
可以用許多方法進(jìn)行診斷。不同的方法都要確定懷疑具有TIM易感多態(tài)性的患者細(xì)胞中是否存在正?；虍惓５腡IM或其數(shù)量的改變。例如，可按照常規(guī)方法，采用細(xì)胞或組織切片染色進(jìn)行檢測(cè)。在細(xì)胞樣品中加入有關(guān)抗體，并培育一段時(shí)間使其足以與表位結(jié)合，通常至少約為10分鐘?？贵w標(biāo)記可以用放射性同位素、酶、熒光素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或其它用于直接測(cè)定的標(biāo)記。或者，可以用第二抗體或試劑來放大信號(hào)。此類試劑是該領(lǐng)域熟知的。例如，可將第一抗體和生物素交聯(lián)，加入辣根過氧化物酶交聯(lián)的親和素作為第二試劑。最后檢測(cè)采用在過氧化物酶存在時(shí)顏色會(huì)改變的底物?？梢杂酶鞣N方法確定抗體結(jié)合的存在與否，這些方法包括分離細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，顯微鏡法、射線照相術(shù)、閃爍計(jì)數(shù)法等。
另一種診斷方法取決于對(duì)裂解物中抗體和TIM之間的結(jié)合進(jìn)行體外測(cè)定?？梢酝ㄟ^各種專用試驗(yàn)測(cè)量樣品或其組分中結(jié)合的TIM的濃度?？梢允褂贸Ｒ?guī)的夾心類型試驗(yàn)。例如，一種夾心試驗(yàn)首先使TIM特異性抗體吸附到不可溶的表面或支持物上。結(jié)合的具體方式并不重要，只要它與本發(fā)明的試劑或整個(gè)方法相容即可。它們可以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合到平板上，優(yōu)選非共價(jià)結(jié)合。
其它的免疫試驗(yàn)法是該領(lǐng)域已知的并可用于診斷。Ouchterlony平板提供了測(cè)定抗體結(jié)合的簡(jiǎn)單方法。采用所述的對(duì)TIM特異的檢測(cè)系統(tǒng)，可在蛋白質(zhì)凝膠上或?yàn)V紙蛋白質(zhì)斑點(diǎn)上進(jìn)行Western印跡，常規(guī)采用的是如夾心試驗(yàn)所描述的標(biāo)記方法。
TIM基因可用于分析TIM表達(dá)，例如用來確定表達(dá)的發(fā)育或組織特異性模式，以及用于調(diào)節(jié)體外和體內(nèi)表達(dá)。用于引入基因的載體包括質(zhì)粒和病毒載體。倍受關(guān)注的是以逆轉(zhuǎn)錄病毒為基礎(chǔ)的載體，如莫落尼鼠白血病病毒和經(jīng)修飾的人免疫缺陷病毒；能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中暫時(shí)或長期保持的腺病毒載體等。各種不同載體都可用于將基因轉(zhuǎn)染和/或整合入細(xì)胞的基因組中。或者，可以使用顯微注射、融合等方法將基因引入合適的宿主細(xì)胞。參見，例如，Dhawan等(1991)Science2541509-1512和Smith等(1990)Molecular and Cellular Biology3268-3271。
表達(dá)載體含有可產(chǎn)生功能性mRNA的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)?？梢允褂锰烊坏霓D(zhuǎn)錄起始區(qū)或外源性轉(zhuǎn)錄起始區(qū)?？梢酝ㄟ^體外重組方法，或?qū)⑿蛄型凑先肴旧w，以引入啟動(dòng)子。許多強(qiáng)啟動(dòng)子是該領(lǐng)域已知的，包括β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR，金屬硫蛋白反應(yīng)元件(MRE)、四環(huán)素可誘導(dǎo)啟動(dòng)子構(gòu)建物等。
表達(dá)載體在啟動(dòng)子序列附近一般有常規(guī)的限制性位點(diǎn)以共插入核酸序列?？梢灾苽浜修D(zhuǎn)錄起始區(qū)、靶基因或其片段以及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的轉(zhuǎn)錄盒。可將轉(zhuǎn)錄盒引入各種載體，例如質(zhì)粒；逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒)；腺病毒等，其中載體能夠暫時(shí)或穩(wěn)定保持在細(xì)胞中，通常至少約為一天，更通常至少為幾天或幾周。
用反義分子下調(diào)TIM在細(xì)胞中的表達(dá)。反義制劑可以是反義寡核苷酸(ODN)，特別是具有天然核酸化學(xué)修飾的合成ODN，或表達(dá)RNA之類反義分子的核酸構(gòu)建物。反義序列與靶基因的mRNA互補(bǔ)，并可抑制靶基因產(chǎn)物的表達(dá)。反義分子可通過各種機(jī)制抑制基因表達(dá)，如通過活化RNA酶或空間妨礙減少翻譯所需的mRNA的量。可以給予一種反義分子或反義分子的組合，這種組合物中可以含有多種不同的序列。
可以通過在合適的載體中表達(dá)所有或部分靶基因序列以制造反義分子，其中使轉(zhuǎn)錄起始正確取向以便產(chǎn)生像RNA分子一樣的反義鏈?；蛘?，反義分子是合成的寡核苷酸。反義寡核苷酸通常至少約有7個(gè)，一般至少約為12個(gè)，更通常的是約有20個(gè)核苷酸的長度，不超過約500個(gè)，通常不超過約50個(gè)，更通常不超過35個(gè)核苷酸長度，這里的長度受抑制效率、特異性，(包括無交叉反應(yīng)性)的控制等等。已發(fā)現(xiàn)7-8個(gè)堿基長度的短寡核苷酸是基因表達(dá)的強(qiáng)效和選擇性抑制劑(參見Wagner等，(1996)Nature Biotechnology14840-844)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)象核酸可用于產(chǎn)生基因修飾的非人動(dòng)物或在細(xì)胞系中產(chǎn)生位點(diǎn)特異的基因修飾?！稗D(zhuǎn)基因”一詞指具有基因修飾的動(dòng)物，包括TIM基因活性的缺失或其它的敲除，具有在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定傳遞的外源TIM基因，或具有與報(bào)告基因操作性連接的外源TIM啟動(dòng)子?？梢酝ㄟ^同源重組制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中TIM基因座被改變了?；蛘撸瑢⒑怂針?gòu)建物隨機(jī)整合入基因組中。供穩(wěn)定整合的載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和其它的動(dòng)物病毒、YAC等。有關(guān)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如牛、豬、羊、馬等，特別是嚙齒動(dòng)物，如大鼠、小鼠等。
“敲除”動(dòng)物是經(jīng)基因操作實(shí)質(zhì)上減少或消除了內(nèi)源性TIM功能。可以用不同的方法實(shí)現(xiàn)“敲除”。可包括全部或部分天然TIM同系物的染色體缺失。非編碼區(qū)，尤其是啟動(dòng)子區(qū)域、3’控制序列、增強(qiáng)子的缺失，或激活TIM基因表達(dá)的基因缺失。通過引入能阻斷天然TIM基因表達(dá)的反義構(gòu)建物可實(shí)現(xiàn)功能性敲除(例如，參見Li和Cohen(1996)Cell 85319-329)。
可以制造含有外源TIM基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。外源基因通常來自動(dòng)物宿主以外的不同種類動(dòng)物，或是其編碼區(qū)或非編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生改變。引入的基因可以是野生型、天然產(chǎn)生的多態(tài)性、或是經(jīng)基因操作的序列，例如前面描述過的編碼或非編碼區(qū)域的缺失、取代或插入。引入的序列可以編碼TIM多肽，或可以利用操作性連接于一報(bào)告基因的TIM啟動(dòng)子。當(dāng)引入的基因是編碼序列時(shí)，它通常操作性連接于一啟動(dòng)子，可以是組成型或可誘導(dǎo)性的，或是在宿主動(dòng)物中表達(dá)所需的其它調(diào)節(jié)序列。
有關(guān)的特殊構(gòu)建物包括(但不限于)反義TIM，它會(huì)阻抑TIM表達(dá)、負(fù)顯性TIM突變的表達(dá)、以及TIM基因的過表達(dá)?？稍赥IM基因座中引入lac Z等可檢測(cè)標(biāo)志，上調(diào)TIM表達(dá)將導(dǎo)致表型出現(xiàn)易檢測(cè)的變化。
經(jīng)修飾的細(xì)胞或動(dòng)物可用于TIM功能和調(diào)控的研究。動(dòng)物可用于功能研究、藥物篩選等，如，用來確定候選藥物對(duì)哮喘的作用。在TIM基因中可以制造一系列小的缺失和/或取代以確定不同外顯子在DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等中的作用。通過提供TIM蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)(其中它沒有正常產(chǎn)生)，人們可以誘導(dǎo)細(xì)胞行為的變化。這些動(dòng)物也可用于探究哮喘遺傳性的模式，如，顯性和隱性；不同等位基因的相對(duì)作用，以及基因組中TIM和其它哮喘基因之間的協(xié)同效應(yīng)。
供同源重組的DNA構(gòu)建物包括帶有所需遺傳修飾的TIM基因的至少一部分，并包括靶基因座的同源區(qū)域。供隨機(jī)整合的DNA構(gòu)建物不需要包括介導(dǎo)重組的同源區(qū)域?？煞奖愕?，包括正選擇和負(fù)選擇標(biāo)志。通過同源重組產(chǎn)生具有靶基因修飾的細(xì)胞的方法是該領(lǐng)域已知的。為了解各種轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的技術(shù)可以參見Keown等，(1990)Methods in Enzymology185527-537。
可與動(dòng)物模型相結(jié)合進(jìn)行藥物篩選。許多哺乳動(dòng)物基因在酵母和低等動(dòng)物中都有同系物。對(duì)此類同系物生理作用和它們與其它蛋白質(zhì)的相互反應(yīng)的研究可能有助于理解它們的生物學(xué)功能。除了以遺傳互補(bǔ)為基礎(chǔ)的模型系統(tǒng)，已知酵母是通過Chien等(1991)P.N.A.S.889578-9582中所描述的雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互的有力工具。為探究TIM蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，雙雜交系統(tǒng)分析倍受關(guān)注。
化合物篩選人們可以鑒定與TIM結(jié)合、調(diào)節(jié)或模擬TIM活性的配體或底物。研究領(lǐng)域是開發(fā)對(duì)免疫疾病、哮喘、癌癥、局部缺血-重灌注性損傷、以及其它與細(xì)胞對(duì)應(yīng)急的應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)疾病的治療方法。藥物篩選可鑒定了在受感染細(xì)胞中使TIM功能受到抑制、替代或增強(qiáng)的藥劑。例如，逆轉(zhuǎn)或抑制TIM功能的制劑可以通過降低Th2細(xì)胞因子的水平而低哮喘中支氣管反應(yīng)性，TIM抑制劑可以通過增強(qiáng)誘導(dǎo)凋亡的放療或化療效果從而提高腫瘤對(duì)癌癥治療的敏感性。倍受關(guān)注的是對(duì)對(duì)人類細(xì)胞低毒性藥劑的篩選試驗(yàn)。各種試驗(yàn)都可用于這一目的，包括體外標(biāo)記的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)、蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合試驗(yàn)、電泳移動(dòng)轉(zhuǎn)變?cè)囼?yàn)、蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫試驗(yàn)等。純化的蛋白質(zhì)也可用于確定三維晶體結(jié)構(gòu)，可用于模擬分子間相互反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等。
本文使用的術(shù)語“制劑”描述了能夠改變或模擬TIM生理功能(如信號(hào)傳導(dǎo)酪氨酸激酶抑制劑或整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的肽抑制劑)的任何分子，如蛋白質(zhì)或藥物。通常，對(duì)多個(gè)試驗(yàn)混合物與不同制劑濃度平行進(jìn)行，以獲得對(duì)各種濃度的不同應(yīng)答。典型的，以其中一種濃度作為陰性對(duì)照，即零濃度或低于檢測(cè)水平的濃度。
候選制劑包括許多化學(xué)物質(zhì)，盡管它們一般都是有機(jī)分子，較好的是分子量高于50和低于2,500道爾頓的較小的有機(jī)化合物。候選制劑包括與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)性反應(yīng)(尤其是氫鍵)所必需的功能性基團(tuán)，典型的包括至少一種氨基、羥基或羧基基團(tuán)，較好的至少兩種功能性化學(xué)基團(tuán)。候選制劑通常包括碳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或被一個(gè)或多個(gè)上這功能基團(tuán)取代的芳香性或聚芳香性結(jié)構(gòu)。在生物分子中發(fā)現(xiàn)的候選制劑包括但不限于肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、它們的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合物。
候選制劑可從各種來源獲得，包括合成或天然化合物庫。例如，有許多隨機(jī)和定向合成各種有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)的寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘?，可得到或不難制備細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物庫?；蛘?，通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生化手段不難修飾天然或合成的庫和化合物，并可用來制造組合性庫。已知藥物制劑可用來進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，比如?；?、烷化、酯化、氨化等，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
當(dāng)篩選試驗(yàn)是一種結(jié)合試驗(yàn)時(shí)，可將一種或多種分子加入標(biāo)記中，其中的標(biāo)記可以直接或間接地提供可測(cè)信號(hào)。各種標(biāo)記包括放射性同位素、熒光素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、酶、特異性結(jié)合分子、顆粒(如磁性粒子)等。特異性結(jié)合分子包括配對(duì)物質(zhì)，如生物素和親和素，異羥基毛地黃毒苷原和抗異羥基毛地黃毒苷原等。對(duì)于特異性結(jié)合成員，可按照已知方法，互補(bǔ)成員通常用一種可檢測(cè)的分子標(biāo)記。
篩選試驗(yàn)中可以包括各種其它試劑。這包括鹽類、中性蛋白質(zhì)(如白蛋白)、去污劑等試劑，它們用來促進(jìn)最佳蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合和/或降低非特異性或背景反應(yīng)。可以使用可促進(jìn)試驗(yàn)效果的試劑，比如蛋白酶抑制劑、核酶抑制劑、抗微生物試劑等。為了提供所需要的結(jié)合，以任何順序加入成分的混合物。在任何合適的溫度下進(jìn)行培育，通常在4-40℃之間。選擇培育時(shí)間以達(dá)到最佳活性，但也可優(yōu)化培育條件以達(dá)到快速高通量篩選。通常0.1-1小時(shí)就足夠了。
其它有關(guān)試驗(yàn)可檢測(cè)模擬TIM功能的制劑。例如，在細(xì)胞中加入缺乏功能性TIM的候選試劑，并在功能性試驗(yàn)中對(duì)復(fù)制TIM的能力進(jìn)行篩選。
治療方法調(diào)節(jié)TIM基因或蛋白質(zhì)活性的制劑提供了治療或預(yù)防的介入點(diǎn)，特別是抑制或下調(diào)該多肽活性或基因表達(dá)的制劑。許多制劑都可用于調(diào)節(jié)這種活性，包括直接調(diào)節(jié)表達(dá)的制劑，如表達(dá)載體，靶多肽的特異性反義物；以及作用于蛋白質(zhì)的制劑，如特異性抗體及其類似物，阻抑催化活性的小有機(jī)分子等。
可以設(shè)計(jì)向某些細(xì)胞選擇性輸送核酸的方法。此類細(xì)胞的例子包括T細(xì)胞等。設(shè)計(jì)了某些治療方法以選擇性表達(dá)有關(guān)細(xì)胞的表達(dá)載體。一種在神經(jīng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)選擇性表達(dá)的技術(shù)是將該編碼序列操作性連接于主要在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子(如，IL-2啟動(dòng)子、T細(xì)胞抗原受體啟動(dòng)子等)?；蛘?，或此外，可以將核酸與能將該核酸靶向有關(guān)細(xì)胞的制劑一起使用。例如，可以將核酸和能特異性結(jié)合細(xì)胞表面抗原的抗體一起施用。當(dāng)采用脂質(zhì)體時(shí)，可將能結(jié)合胞吞作用相關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白的底物吸附在脂質(zhì)體上，以將脂質(zhì)體靶向神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)其攝取。
反義分子可用于下調(diào)細(xì)胞中的表達(dá)。反義制劑可以是反義寡核苷酸(ODN)，尤其是具有天然核酸化學(xué)修飾的合成性O(shè)DN，或是表達(dá)RNA之類反義分子的核酸構(gòu)建物。該反義序列與靶基因的mRNA互補(bǔ)，并抑制靶基因產(chǎn)物的表達(dá)。反義分子抑制基因表達(dá)可通過各種機(jī)制，例如通過活化RNA酶H或空間住礙減少用于翻譯的mRNA的量?？山o予反義分子或其組合物，其中組合物含有多種不同序列。
可以通過在合適的載體中表達(dá)所有或部分靶基因序列以制造反義分子，其中使轉(zhuǎn)錄起始取向以產(chǎn)生像RNA分子一樣的反義鏈。或者，反義分子是合成的寡核苷酸。反義寡核苷酸通常至少約有7個(gè)，一般至少約為12個(gè)，更通常的是約有20個(gè)核苷酸長度，且不超過約500個(gè)，通常不超過約50個(gè)，更通常不超過35個(gè)核苷酸長度，其中長度受到抑制效率，特異性(包括無交叉反應(yīng))的控制等等。已發(fā)現(xiàn)7-8個(gè)堿基長度的短寡核苷酸是基因表達(dá)的強(qiáng)效和選擇性抑制劑(參見Wagner等，(1996)Nature Biotechnology14840-844)。
選出內(nèi)源性有義鏈mRNA序列的一個(gè)特定區(qū)域或幾個(gè)區(qū)域與反義序列互補(bǔ)。可以憑經(jīng)驗(yàn)方法選擇寡核苷酸的特定序列，其中對(duì)幾個(gè)候選序列抑制靶基因在體外或在動(dòng)物模型中的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)定。也可以使用幾個(gè)序列的組合，其中選擇了mRNA序列的幾個(gè)區(qū)域供反義互補(bǔ)。
可以用該領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成反義寡核苷酸(參見Wagner等(1993)同上，和Milligan等，同上)。優(yōu)選的寡核苷酸是由天然磷酸二酯結(jié)構(gòu)經(jīng)化學(xué)修飾的，以增加它們的胞內(nèi)穩(wěn)定性和結(jié)合親和力。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多此類修飾，它們改變了主鏈、糖或雜環(huán)堿基的化學(xué)性質(zhì)。
主鏈化學(xué)性質(zhì)的有用變化是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯(其中兩個(gè)非橋連的氧都被硫取代)；氨基磷酸酯；烷基磷酸三酯和硼代磷酸酯。非手性的磷酸鹽衍生物包括3’-O’-5’-S-硫代磷酸酯、3’-S-5’-O-硫代磷酸酯、3’-CH2-5’-O-磷酸酯和3’-NH-5’-O氨基磷酸酯。肽核酸通過肽鍵取代整個(gè)核糖磷酸二酯主鏈。糖修飾也被用來提高穩(wěn)定性和親和力。可采用脫氧核糖的α端基異構(gòu)體，其中的堿基被轉(zhuǎn)變成天然的β端基異構(gòu)體核糖的2’-OH可以改變形成2’-O-甲基或2’-O-烷基糖，它提供了對(duì)降解的抗性但沒有親和力。對(duì)雜環(huán)堿基的修飾必需保留合適的堿基對(duì)。一些有用的取代包括用脫氧尿苷取代脫氧胸苷；用5-甲基-2’-脫氧胞苷和5-溴-2’-脫氧胞苷取代脫氧胞苷。已證明當(dāng)5-丙基-2’-脫氧尿苷和5-丙基-2’-脫氧胞苷分別取代脫氧胸苷和脫氧胞苷時(shí)可以增加親和力和生物學(xué)活性。
可經(jīng)生理上可接受的載體給予宿主具有所需藥理學(xué)活性的化合物以治療因TIM功能缺陷造成的哮喘。這種化合物也可用來增強(qiáng)TIM功能?？山?jīng)各種途徑給予治療制劑口服、局部施用、腸道外施用(如皮下施用)、腹膜內(nèi)施用、病毒感染、靜脈注射等。吸入治療特別受關(guān)注。根據(jù)用藥方式，可以用各種方法配制這種化合物。制劑中，治療性活性化合物的濃度在0.1-100wt.％之間。
藥物組合物可被制成各種形式，比如顆粒劑、片劑、藥丸、栓劑、膠囊、懸浮劑、軟膏劑、洗劑等?？梢杂眠m合口服和局部施用的藥物級(jí)有機(jī)或無機(jī)運(yùn)載體和/或稀釋劑制造含有治療活性化合物的組合物。該領(lǐng)域已知的稀釋劑包括含水介質(zhì)、植物和動(dòng)物油和脂肪。可將穩(wěn)定劑、保濕劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽或保持合適pH值的緩沖劑、以及皮膚滲透增強(qiáng)劑用作輔助劑。
應(yīng)該理解，本發(fā)明并不限于所述的具體方法學(xué)、規(guī)程、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)佟⒑驮噭?，它們是可以改變的。還應(yīng)該理解，本文使用的術(shù)語僅僅是為了描述具體的實(shí)施方案，而不是要限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅僅由附加權(quán)利要求所限制。
除非有明確的說明，本文使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“和”以及“這個(gè)”包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如，提到“一種細(xì)胞”包括此類細(xì)胞的復(fù)數(shù)，同時(shí)提到的“該陣列”包括該領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的與其等價(jià)的多個(gè)陣列，等等。除非有明確的說明，本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的理解有著同樣的含義。
出于描述和揭示的目的，在此并入本文提到的所有出版物以供參考，例如，出版物中所描述的可能與本發(fā)明結(jié)合使用的細(xì)胞系、結(jié)構(gòu)和方法。以上以及全文僅僅提供了出版日期先于本發(fā)明提交日的出版物。文中，所有一切都不能理解為由于在先發(fā)明而允許發(fā)明者將這一公布提前。
以下實(shí)施例為此領(lǐng)域的一般技術(shù)人員提供了完整的揭示和描述了如何制造和使用本發(fā)明，它們不是要限制本發(fā)明的范圍。我們已經(jīng)做了努力以確保所用數(shù)據(jù)(如，含量、溫度、濃度等)的準(zhǔn)確性，但一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差是允許的。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是平均分子量，溫度是攝氏溫度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)驗(yàn)為分析人5q23-35區(qū)域的哮喘易感性基因，我們采用了小鼠模型，它有一些潛在的優(yōu)點(diǎn)。可以控制環(huán)境變化，可以同種檢測(cè)多個(gè)表型，且近交品系可用過敏原致敏以產(chǎn)生人哮喘的主要特征一氣道高反應(yīng)性(AHR)。我們采用了只有一小段與人染色體5q同源的染色體區(qū)域不同的同類系近交小鼠品系，這使得要研究的這一區(qū)域在此區(qū)域外沒有遺傳性變異。定位克隆揭示存在編碼T細(xì)胞膜蛋白(TIM)的一個(gè)新基因家族，TIM-1、TIM-2、TIM-3、TIM-4、TIM-5、TIM-6和TIM-7，其中，TIM-1、TIM-3和TIM-4的主要序列變體與Tapr完全共隔離。
降低HBA小鼠IL-4的產(chǎn)生和氣道高反應(yīng)性。我們檢查了在BALB/c基因組背景上產(chǎn)生的同類系小鼠具有繼承自DBA/2各個(gè)染色體的不連續(xù)的基因間隔。BALB/c小鼠發(fā)育成Th2偏向性的與特應(yīng)性類似的免疫應(yīng)答體有增強(qiáng)的AHR，而DBA/2小鼠發(fā)育成降低的IL-4反應(yīng)性可保護(hù)小鼠不發(fā)生AHR。通過對(duì)Th2反應(yīng)性降低的若干這些同類系小鼠品系的篩選，我們鑒定到一個(gè)同類系，C.D2 Es-Hba(HBA)，它含有繼承自DBA/2小鼠的第11條染色體(人5q23-35的同系物)的片段。圖1a顯示，正如所料，免疫的對(duì)照BALB/c小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞產(chǎn)生了高水平的IL-4，這證實(shí)了BALB/c小鼠發(fā)育成Th2-偏向性免疫應(yīng)答反應(yīng)的傾向。相反，HBA小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞產(chǎn)生了顯著較低水平的IL-4，這與在DBA/2小鼠中觀察到的情況類似。此外，如圖1b所示，與BALB/c小鼠相比，HBA小鼠產(chǎn)生了明顯少的IL-13和IL-10，以及較低水平的IL-5，而IFN-γ的產(chǎn)量增加了。這些結(jié)果表明，HBA染色體11的DBA/2衍生區(qū)(含有與人5q23-35同線的保守性大區(qū)域)含有可降低抗原特異性IL-4、IL-13和IL-10產(chǎn)生，增加IFN-γ產(chǎn)生，并將BALB/c細(xì)胞因子表型轉(zhuǎn)變?yōu)镈BA/2細(xì)胞因子表型的基因。
檢查了HBA小鼠發(fā)育成抗原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性(AHR)(與Th2偏向性免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān))的能力。當(dāng)用過敏原致敏和攻擊時(shí)，對(duì)照BALB/c小鼠發(fā)生了高AHR，而同樣免疫的HBA同類系小鼠，像DBA/2小鼠一樣，在對(duì)乙酰甲膽堿的應(yīng)答反應(yīng)中表達(dá)了正常的氣道反應(yīng)性(圖1c)。總之，這些結(jié)果強(qiáng)烈提示，染色體11上的一個(gè)基因座中發(fā)生的基因變異調(diào)節(jié)了Th2細(xì)胞因子和AHR的產(chǎn)生；因此，我們嘗試性地的將HBA小鼠的有關(guān)基因決定簇稱為一基因座T細(xì)胞和氣道表型調(diào)節(jié)基因(Tapr)。
我們還檢測(cè)了(BALB/c×HBA)F1小鼠，它和BALB/c小鼠一樣，產(chǎn)生了高水平的IL-4、IL-13和IL-10(圖1a和1b)并發(fā)生了提高的抗原誘導(dǎo)的AHR(圖1c)。這些結(jié)果表明，染色體11上的DBA/2等位基因，與調(diào)節(jié)IL-4合成的其它基因是隔離的，以隱性方式降低了IL-4的產(chǎn)生和AHR。相反，(BALB/c×DBA/2)F1小鼠產(chǎn)生了低水平的IL-4并對(duì)免疫接種有正常的氣道反應(yīng)性(圖1)，表明DBA基因組的其它區(qū)域基因座也調(diào)節(jié)IL-4產(chǎn)生和抗原誘導(dǎo)的AHR，DBA/2等位基因，總體上，以顯性方式起作用限制IL-4產(chǎn)生和AHR。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了特應(yīng)性癥狀的多基因性和復(fù)雜性，并證明了用同類系品系小鼠分離和特性分析單一基因座不受個(gè)多個(gè)上位基因(它也影響哮喘表型)干擾的潛在優(yōu)點(diǎn)。
制作控制AHR和IL-4應(yīng)答性的基因座Tapr的基因圖。以前，HBA小鼠中的同類系區(qū)域是用36個(gè)分布泛基因組標(biāo)志，包括兩個(gè)染色體11標(biāo)志，血紅蛋白-α2(hba-α2)和酯酶-3(es-3)基因座描述的。染色體11以外的HBA基因組繼承自BALB/c。用已知為DBA/2和BALB/c小鼠之間有多態(tài)性的25單一序列長度多態(tài)性(SSLP)標(biāo)志進(jìn)行更加精細(xì)的分析顯示，HBA小鼠繼承了DBA/2染色體11的兩個(gè)節(jié)段(圖2，左欄)。近端區(qū)域含有一20cM的與染色體5q23-35同源的節(jié)段，這提供了一種可能性，即可以在哮喘小鼠模型中鑒定涉及人類哮喘連續(xù)研究的遺傳基因座。
為了以高分辨率制作TH2-AHR控制基因座Tapr的圖譜，將(BALB/c×HBA)F1小鼠與HBA小鼠回交以產(chǎn)生N2動(dòng)物。通過回交，HBA親代提供的一組等位基因被預(yù)先確定了，同時(shí)F1親代提供的一組等位基因可以通過基因分型評(píng)估。因此，可以在N2小鼠中檢測(cè)同類系區(qū)域中產(chǎn)生提供信息的單倍體的重組過程，并可用來評(píng)估Tapr與同類系間隔中的基因座的連鎖情況。由于Tapr的隱性性質(zhì)，我們檢測(cè)了這些回交N2小鼠以鑒定HBA衍生基因的足以使HBA具有Tapr表型的最小純合區(qū)。產(chǎn)生了2,000多個(gè)N2動(dòng)物并進(jìn)行基因分型。采用SSLP標(biāo)志，我們選出了那些帶有可提供信息重組活動(dòng)的N2小鼠，并按照對(duì)匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)免疫接種的應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生IL-4的能力確定它們的表型。在這一主要的分析中，我們確定了有關(guān)基因座位于D11Mit135和D11Mit260之間的近端同類系區(qū)域中。為了以更高分辨率制作Tapr圖譜，鑒定到22個(gè)其他標(biāo)志并用于在有關(guān)區(qū)域中提供0.1-1cM的分辨率。
為精確比較幾個(gè)月時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的IL-4細(xì)胞因子分析的結(jié)果，對(duì)各個(gè)N2小鼠產(chǎn)生了各個(gè)實(shí)驗(yàn)的IL-4指數(shù)， 其中B＝BALB/c小鼠細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4，H＝HBA小鼠的細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4，x＝N2小鼠細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4。指數(shù)值接近0代表了高濃度的IL-4(像BALB/c)，指數(shù)值接近1.0代表了低濃度的IL-4(像HBA)。在3-5個(gè)對(duì)照小鼠中建立了“B”和“H”值，每組測(cè)試3-6攜帶可提供信息的重組N2小鼠。指數(shù)值呈雙峰分布(圖3a)，其中具有非重組HBA基因型的N2小鼠相關(guān)的表型指數(shù)，明顯高于(P＜0.0001，配對(duì)Student t-檢驗(yàn))與具有非重組(BALB/c×HBA)F1基因型的N2小鼠相關(guān)的表型指數(shù)。
對(duì)于具有獨(dú)特基因型的小鼠，我們用幾種方法確保對(duì)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和AHR進(jìn)行充分的單一測(cè)量，因?yàn)檫@在連鎖分析中是關(guān)鍵性的。首先，我們測(cè)試了各個(gè)攜帶著有關(guān)重組體的N2小鼠，同時(shí)還測(cè)試了各個(gè)“重組N2”的“非重組”同胞，它們?cè)诨蛐蜕鲜菄?yán)格的HBA或F1(BALB/c×HBA)。此外，我們通過將攜帶著有關(guān)重組體的某些N2小鼠與HBA小鼠雜交繁殖了另一種N3小鼠，以得到更多的帶有特殊N2基因型的個(gè)體小鼠。所有的值都是用所給定基因型測(cè)定的個(gè)體小鼠值的平均值。用這種方法，我們肯定了對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生和AHR的測(cè)定(是正確的)，并且我們克服了因生物系統(tǒng)固有的變異造成的試驗(yàn)變異。
由于IL-4值與N2小鼠相關(guān)，而N2小鼠繼承了雙峰分布(如3a)隔離的重組單倍型，故能夠證明，控制高IL-4應(yīng)答的遺傳基因座位于標(biāo)志D11Mit271和D11Mit22之間(圖3b)。此外，在Kim1sscp上存在等位基因的所有BALB/c小鼠中都觀察到了高水平的IL-4產(chǎn)生，并且在Kim1sscp上存在純合性HBA基因型的所有小鼠中都觀察到了低水平的IL-4產(chǎn)生。因此，Trap具Kim1sscp(Rattus Norvegicus，腎損傷分子(Kim-1)的小鼠同系物中的一種內(nèi)含子標(biāo)記)的非重組體。相反，Tapr與所有的其它標(biāo)志至少隔開一個(gè)重組體。Tapr和Kim1sscp一起隔開的事實(shí)表明，Tapr基因座位置與Kim1sscp非常接近或無法與Kim1sscp分辨。根據(jù)D11Mit271和D11Mit22之間單倍體的重組頻率，我們計(jì)算出重組頻率為0.0039，這表明Tapr基因座位于在一個(gè)小的，0.3-0.5cM的區(qū)域內(nèi)。我們還計(jì)算出Tapr和IL-4之間的重組頻率為0.08。因此，Tapr位于距離IL-4細(xì)胞因子簇5-10cM的地方，但位于與5q23-35區(qū)域(與人特應(yīng)性和哮喘有關(guān))高度保守同線的小鼠染色體區(qū)域內(nèi)。
采用一種分析方法，我們檢測(cè)了具有可提供信息的重組單倍體的小鼠中過敏原誘導(dǎo)的AHR表型的分離情況。通過將AHR值指數(shù)化，N2小鼠清楚地顯示了親代的表型，在致敏N2小鼠組AHR指數(shù)值的柱狀圖中產(chǎn)生了雙峰分布(圖3c)。通過分析與1,000多只N2小鼠相關(guān)的AHR表型分離情況，我們證明，控制AHR應(yīng)答反應(yīng)的遺傳基因座也位于標(biāo)志D11Mit271和D11Mit22之間(圖3d)，以及AHR表型與Kim1sscp是非重組的。因此，我們證明，IL-4應(yīng)答反應(yīng)和AHR都和Tapr基因座共分離，提示相同的基因座調(diào)節(jié)了IL-4應(yīng)答反應(yīng)和AHR(圖3)。
這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)，Tapr基因座朝著絲粒方向距離IL-4細(xì)胞因子簇5cM以上，該簇中的細(xì)胞因子基團(tuán)以前認(rèn)為是‘候選’的特應(yīng)性或哮喘易感性基因。我們的作圖結(jié)果還說明，Tapr與IL-20p40基因和小鼠染色體11的區(qū)域(包括TH1-IL12調(diào)控基因座Tpm)都是遺傳可分離的。
小鼠和人同系物將Tapr錨定到人5q33上。為構(gòu)建Tapr基因座周圍的組成圖，我們?nèi)诤狭说米孕∈蠡蚪M數(shù)據(jù)庫(MGD)的連鎖、回交和放射雜交圖的信息，并鑒定了人類基因組圖譜中一個(gè)保守同線性區(qū)域?，F(xiàn)有的放射雜交圖將D11Mit271和D11Mit22附近的標(biāo)志(包括幾個(gè)與已知基因或單基因簇有廣泛同源性的已表達(dá)序列標(biāo)記(EST))放在小鼠基因組的物理圖譜上。我們進(jìn)一步檢測(cè)了這些標(biāo)志以及與它們相關(guān)的EST以了解以前沒有鑒定的與已知基因簇的類似性。我們將這些標(biāo)志組裝在一個(gè)支架上以將它們與人類基因組比較。采用這種方法，我們發(fā)現(xiàn)特定的放射雜交標(biāo)志和以下人類基因KIAA0171、Adam-19、Sox-30、Pir-121、Crsp9(Crsp33)和hHAVcr-1(hHAVcr-1)之間有顯著的類似性。圖4證明，一旦我們將這些基因錨定到位于我們的旁側(cè)標(biāo)志之間的小鼠基因組物理圖譜上，我們就能夠?qū)⒛切┗蚨ㄎ坏饺祟惢蚪M瀏覽器(Human Genome Browser)中。
小鼠和人類基因組之間在這一區(qū)域內(nèi)高度保守，表明Tapr基因座與人5q33.2連鎖。如圖4所示，我們鑒定了人類圖譜這一區(qū)域中所有的已知基因和EST。已知人hHAV-cr和Kim-1的小鼠同系物附近倍受關(guān)注的基因，包括IL-2可誘導(dǎo)的T細(xì)胞激酶(Itk)和SP-1轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)節(jié)基因(Crsp9)，都涉及T細(xì)胞分化。我們給這些候選基因的編碼區(qū)測(cè)序，在ITK或CRSP-9中都沒有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。
一個(gè)新的T細(xì)胞表面蛋白家族位于到Tapr區(qū)域。由于大鼠Kim1的小鼠類似物位于Tapr的0.4cM區(qū)域內(nèi)并與Tapr緊密連鎖，我們檢測(cè)了公眾可以獲得的數(shù)據(jù)庫并發(fā)現(xiàn)EST簇具有僅提供部分覆蓋的某些序列類似性以及含有大的變異節(jié)段。Kim-1最接近的人類類似物是人甲型肝炎病毒細(xì)胞受體hHAV-cr，人類基因組的tBLAST檢索提示，另外兩個(gè)Kim-1類似物，可能是某基因家族的成員，也位于人染色體5和小鼠染色體11上。
用conA-激活脾細(xì)胞的cDNA，我們鑒定并克隆了兩個(gè)Kim-1的小鼠直向同源基因，我們稱其為Tim1和Tim2，如圖5A所示，它們定位在Tapr區(qū)域。Tim-3是KIM-1的第三個(gè)關(guān)系更遠(yuǎn)的直向同源基因。
這一基因家族的所有三個(gè)成員激活T細(xì)胞都有表達(dá)，且都組成小鼠染色體11/人染色體5的Tapr區(qū)域圖譜，其中它們編碼具有共同結(jié)構(gòu)基序的細(xì)胞表面糖蛋白，包括免疫球蛋白(Ig)功能域、粘蛋白功能域和帶有磷酸化位點(diǎn)的胞內(nèi)尾巴。因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)的細(xì)胞功能未知，我們將這些基因稱為T細(xì)胞、免疫球蛋白功能域、粘蛋白功能域(Tim)基因家族的成員。小鼠Tim1是大鼠Kim1和在非洲綠猴及人中發(fā)現(xiàn)的HAVcr-1的小鼠同系物。Tim2是以前未知的基因，本研究之前，它沒有在任何生物中鑒定到。
小鼠Tim基因編碼一305個(gè)氨基酸的膜蛋白，它和大鼠KIM-1有78％的相同性，與人HAVcr-1有35％的相同性。如圖5B所示，將有缺口的多個(gè)序列與小鼠TIM-1、大鼠KIM-1、人HAVcr-1和非洲綠猴HAVcr-1排列對(duì)比，顯示了這些動(dòng)物中TIM-1/KIM-1/HAVcr-1蛋白之間的同源程度。TIM-1的胞質(zhì)區(qū)含有兩個(gè)酪氨酸殘基并包括一個(gè)高度保守的酪氨酸激酶磷酸化基序RAEDNIY，它整合于TIM-1預(yù)計(jì)的Itk和EGFR激酶位點(diǎn)，SRAEDNIYIVEDRP。TIM-1的粘蛋白功能域有多個(gè)0-連接糖蛋白位點(diǎn)，并在免疫球蛋白功能域中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)N-連接糖蛋白位點(diǎn)。
TIM-2，一種類似的含有305個(gè)氨基酸的膜蛋白，和小鼠TIM-1有64％的相同性，與大鼠KIM-1有60％的相同性，與hHAVcr-1有32％的相同性(圖5A、B)。像TIM-1一樣，TIM-2有兩個(gè)胞外N連接的糖蛋白位點(diǎn)，和一個(gè)富含絲氨酸、蘇氨酸的帶有許多O-連接糖蛋白位點(diǎn)的粘蛋白功能域。TIM-2也含有胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化基序，RTRCEDQVY。
Tim3編碼一281個(gè)氨基酸的膜蛋白，它有類似的帶有多個(gè)胞外糖蛋白位點(diǎn)和一個(gè)胞內(nèi)酪氨酸磷酸化基序的膜內(nèi)在糖蛋白結(jié)構(gòu)。盡管TIM-3的粘蛋白功能域不如TIM-1和TIM-2那么顯著(圖5A)，T細(xì)胞上表達(dá)的TIM-3可能和APC的配體反應(yīng)并改變APC的活性。TIM-3有四個(gè)N-連接的和五個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn)，提示TIM-3象TIM-1和TIM-2一樣，是高度糖基化的，并可能與其它細(xì)胞(如抗原呈遞細(xì)胞)中存在的配體反應(yīng)。
Tim4編碼小鼠一344個(gè)氨基酸的膜蛋白，在編碼人的378個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)的TIM-4含有其它TIM蛋白的普通膜糖蛋白結(jié)構(gòu)基序、一個(gè)具有高度保守的半胱氨酸殘基的IgV樣功能域、一個(gè)富含蘇氨酸的粘蛋白樣功能域和一個(gè)短的胞內(nèi)尾巴。然而，TIM-4缺乏存在于其它TIM蛋白質(zhì)中的磷酸酪氨酸基序，因此可能調(diào)節(jié)其它TIM蛋白質(zhì)的功能。
每個(gè)TIM Ig功能域都有一個(gè)預(yù)計(jì)與骨橋蛋白中發(fā)現(xiàn)的SVVYGLR基序類似的整聯(lián)蛋白-結(jié)合基序，骨橋蛋白是一種像TIM一樣的跨膜蛋白，它參與細(xì)胞粘附、存活和瘤形成的調(diào)節(jié)，以及輔助T細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。這種整聯(lián)蛋白基序顯示了α(9)和α(4)的特異性。
比較了三種Tim基因的BALB/c和HBA/DBA編碼區(qū)的序列，揭示TIM-1、TIM-3和TIM-4中的主要多態(tài)性，但TIM-2中無多態(tài)性。在TIM-1中，這些多態(tài)性編碼HBA/DBA中的三個(gè)氨基酸差異和15個(gè)氨基酸缺失。在TIM-3中鑒定到7個(gè)預(yù)計(jì)的氨基酸差異(圖5c)?；蚪M序列證實(shí)這些多態(tài)性，包括缺失，是直正的多態(tài)性，而不是剪接變體。在其它的小鼠品系中進(jìn)一步測(cè)定TIM-1和TIM3基因組節(jié)段的序列，我們發(fā)現(xiàn)C57/BL6(傾向發(fā)生減弱的TH2和AHR應(yīng)答反應(yīng)，與DBA/2相類似的品系)也有Tim1和Tim3的HBA/DBA等位基因。TIM-1和TIM-4中的多態(tài)性位于信號(hào)域和粘蛋白樣功能域中，而在TIM-3中鑒定到的多態(tài)性集中在Ig功能域(圖5c)。如MAdCAM-1所示，在帶有Ig和粘蛋白功能域的糖蛋白中，任一功能域中發(fā)生的變化都可能影響受體-配體相互反應(yīng)。盡管預(yù)計(jì)的TIM-1和TIM-4的切割位點(diǎn)不會(huì)用信號(hào)序列的多態(tài)性而改變，但這種多態(tài)性可能會(huì)影響切割的效率和/或受體向細(xì)胞表面的移動(dòng)。這些Tim序列和多態(tài)性對(duì)于人類免疫應(yīng)答反應(yīng)和HAV病毒的發(fā)病機(jī)理是重要的。
分析我們的N2回交小鼠的DNA樣品(圖3)，證明，TIM-1和TIM-3多態(tài)性與Tapr完全共分離。雖然這些觀察沒能區(qū)TIM-1、TIM-3或這兩者(都負(fù)責(zé)AHR和TH2介導(dǎo)的炎癥的變化)變化的程度，但我們認(rèn)為人TIM-1(hHAVcr-1)和/或TIM-3的多態(tài)性支持哮喘易感性和人染色體5q之間強(qiáng)烈相關(guān)。在檢測(cè)人基因組和EST數(shù)據(jù)庫時(shí)，證明了人TIM1編碼區(qū)中的主要變異，這個(gè)事實(shí)支持這一想法。將這些人cDNA變體(且有以前描述過的猴HAVcr-1的變體)和本文鑒定到的鼠cDNA變體進(jìn)行比較證實(shí)，在預(yù)計(jì)的TIM-1蛋白質(zhì)序列中存在廣泛的差異(圖5b、c)。這種高度差異將TIM-1及其家族成員與許多其它的候選基因(如曾經(jīng)作為哮喘易感性候選基因而仔細(xì)研究過的細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體)區(qū)分開。此外，有關(guān)螨過敏性兒童哮喘與D5S820(平均LOD評(píng)分＝4.8)，一種距離Tim1和Tim3大約0.5Mb的標(biāo)志(圖4)，之間顯著相關(guān)聯(lián)的報(bào)道，也進(jìn)一步支持了Tim1和哮喘易感性之間的關(guān)系。
除了上述遺傳多態(tài)性，由于交替剪接在TIM基因中產(chǎn)生了幾種表達(dá)多態(tài)性。TIM-1、TIM-2和TIM-4 mRNA的交替剪接產(chǎn)生了幾種TIM變體，其中有一些是TIM受體的可溶性分泌形式。這些剪接變體，與具有可變5’非翻譯區(qū)的TIM剪接變體一起，可能會(huì)造成TIM蛋白質(zhì)的細(xì)胞特異性和條件特異性表達(dá)模式。
T細(xì)胞賦予Tapr效應(yīng)。為更好了解Tapr基因座的功能，我們測(cè)定了Tapr的等位變異是否會(huì)影響T細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞(APC)的功能。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，我們制造了具有HBA背景(HBA DO11.10)的卵清蛋白(OVA)特異的T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg)，我們將其與具有BALB/c背景(BALB/c DO11.10)的TCR-Tg小鼠進(jìn)行比較。將這二種品系之一的純化的CD4+T細(xì)胞和OVA以及BALB/c或HBA骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞(DC)共培養(yǎng)，并評(píng)價(jià)產(chǎn)生的細(xì)胞因子。經(jīng)過照射的脾細(xì)胞不用作這一實(shí)驗(yàn)的APC，因?yàn)閾?jù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過照射的脾細(xì)胞和其它組織表達(dá)高水平的TIM基因。
與HBA DO11.10T細(xì)胞相比，BALB/c DO11.10T細(xì)胞以不依賴于抗原呈遞細(xì)胞來源的方式產(chǎn)生了較高水平的IL-4和IL-13(圖6A)。此外，CD4 T細(xì)胞來源決定了在各個(gè)抗原濃度下產(chǎn)生的IL-4/IL-13的量，而不論第一次刺激或第二次刺激時(shí)APC的來源。在各種細(xì)胞類型組合的培養(yǎng)上清液中測(cè)得了同等水平的IL-12，這進(jìn)一步證明，BALB/c和HBA DC的功能是可比的。此外，BALB DO11.10和HBA DO11.10T細(xì)胞產(chǎn)生了相等水平的IL-2，并證明次級(jí)培養(yǎng)物對(duì)OVA的應(yīng)答反應(yīng)時(shí)有可比水平的增殖，表明HBA和BALB/c T細(xì)胞被類似地激活，盡管它們產(chǎn)生的Th2細(xì)胞因子的水平截然不同。
我們?cè)趫D6B中顯示，我們的DO11.10/DC系統(tǒng)在初級(jí)培養(yǎng)的前12小時(shí)中，我們發(fā)現(xiàn)BALB/c和HBA CD4+T細(xì)胞的表達(dá)了TIM-1的mRNA。第一次刺激4天內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)BALB/c DO11.10的上清液中有顯著水平的IL-13，而在HBA DO11.10上清液中沒有檢出IL-13。這種差異在36小時(shí)時(shí)可檢測(cè)到mRNA水平(圖6B)。在12-36小時(shí)之間，HBA CD4 T細(xì)胞IL-13 mRNA的表達(dá)降低了，而BALB/c CD4 T細(xì)胞保持了IL-13的表達(dá)水平。因此，在對(duì)抗原的初次應(yīng)答反應(yīng)中，BALB/c CD4 T細(xì)胞產(chǎn)生了較HBA CD4 T細(xì)胞更強(qiáng)的Th2應(yīng)答。我們的發(fā)現(xiàn)證實(shí)，在初次抗原特異應(yīng)答反應(yīng)中Tapr調(diào)節(jié)了輔助T細(xì)胞的分化，而且我們?cè)谶@些應(yīng)答的最早階段中檢測(cè)到CD4T細(xì)胞的TIM-1表達(dá)。
在分化為成熟Th1和Th2亞群后，RT-PCR顯示輔助T細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)TIM，即Th1細(xì)胞表達(dá)TIM-3，而Th2細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)TIM-1。所有的T細(xì)胞群顯示弱的TIM-4表達(dá)。雖然Itk信號(hào)通過TIM-1可能促進(jìn)Th2分化，但EGFR信號(hào)通過TIM蛋白可能提高效應(yīng)器中細(xì)胞的存在尤其是記憶性T細(xì)胞群的存活。由于Itk僅在T細(xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá)，TIM-1上的Itk激酶活性局限于免疫細(xì)胞，特別是參與哮喘和特應(yīng)性的細(xì)胞。然而，其它的蛋白酪氨酸激酶，如EGFR，涉及到其它組織(包括局部缺血的上皮細(xì)胞、經(jīng)照射的脾細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)表達(dá)的TIM蛋白功能。
在這些研究中，我們繪制了Tapr(調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的發(fā)育和抗原誘導(dǎo)的AHR，哮喘的主要特征的基因座)圖譜。我們利用攜帶有與人染色體5q同源的一個(gè)染色體節(jié)段的間隔特異性同類系小鼠(HBA)將Tapr定位于(與特應(yīng)性和哮喘反復(fù)關(guān)聯(lián)的人類基因組的一個(gè)區(qū)域)。這一區(qū)域還與脊髓發(fā)育不良和致瘤性細(xì)胞形成異常相關(guān)的5q綜合征反復(fù)關(guān)聯(lián)。采用這種同類系小鼠的策略(它可以將復(fù)雜的癥狀轉(zhuǎn)變成比較簡(jiǎn)單的，可能是單基因的癥狀)，我們將Tapr的間隔縮小到0.4cM，并測(cè)定了此區(qū)域中幾個(gè)候選基因的序列，并原位克隆了TIM基因家族。
前面已經(jīng)描述了TIM基因家族。我們鑒定并克隆了整個(gè)cDNA序列，與HBA小鼠相比，發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠TIM-1蛋白中存在顯著的多態(tài)性。我們發(fā)現(xiàn)BALB/c的TIM-1和TIM-3序列與AHR易感性和過敏性T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)，而HBA序列與對(duì)這些應(yīng)答的保護(hù)力相關(guān)。分化的TH1優(yōu)先表達(dá)TIM-3。多態(tài)性Tim3變體與Tapr相關(guān)提示，TIM-3可能調(diào)節(jié)TH1和TH2細(xì)胞的功能。然而，Tim3的差異也可能歸因于與Tim4或Tim1緊密聯(lián)鎖的單倍型。
我們認(rèn)為TIM-1在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)(尤其是哮喘和特應(yīng)性疾病)和在對(duì)應(yīng)激(缺氧、營養(yǎng)不良、輻射、化學(xué)治療等)的反應(yīng)中上皮細(xì)胞和造血細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)過著非常重要的作用，有幾點(diǎn)原因。首先，像Tim3一樣Tim1，在第一次抗原刺激中在CD4 T細(xì)胞中表達(dá)，這很可能是Tapr作用發(fā)生的時(shí)候。T細(xì)胞在AHR發(fā)展和哮喘的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用，我們的結(jié)果提示，Tapr通過增加早期CD4細(xì)胞投入Th2應(yīng)答反應(yīng)(通過控制IL-13的產(chǎn)生和隨后的T細(xì)胞分化)而影響哮喘。其次，嬰兒或兒童時(shí)期的HAV感染與哮喘和過敏性的發(fā)展負(fù)相關(guān)。我們認(rèn)為，HAV與TIM-1/HAVcr-1相反反應(yīng)可能會(huì)改變T細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可能會(huì)在傾向發(fā)生特應(yīng)性和哮喘的個(gè)體中，逆轉(zhuǎn)或防止偏離的Th1/Th2平衡。SLAM(麻疹病毒受體)是另一種(以可能被病毒反應(yīng)改變的方式)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的T細(xì)胞表面糖蛋白的例子。因?yàn)橐恍┎《臼荏w(如麻疹病毒的SLAM或CD4、CCR5和HIV的CXCR4)是宿主自身免疫系統(tǒng)的受體，甚至當(dāng)感染不成功時(shí)，病毒受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)也能導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放和疾病的發(fā)展。
第三，TIM-1中的多態(tài)性與我們觀察到的不同類型的輔助T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。因此，TIM-1的變體本身可能造成遺傳性Th1/Th2傾向，這種傾向在缺乏任何已知的造成免疫偏差的環(huán)境因素時(shí)也可發(fā)生。已知靈長類動(dòng)物中的HAV受體是高度可變的，同時(shí)，我們提出，人TIM-1/hHAVcr-1的多態(tài)性等位基因，如我們已經(jīng)在小鼠中鑒定到的那些一樣，可能與Th2偏向和哮喘易感性的差異相關(guān)。對(duì)作為病毒受體的細(xì)胞表面分子和對(duì)感染的易感性改變而言該基因中的突變是不常見的，因此，TIM-1和TIM基因家族的其它成員中顯著的遺傳性差異較之在其它基因中(如細(xì)胞因子基因中)發(fā)生的變化更可能被觀察到。還不清楚為什么哮喘易感性等位基因在人類基因庫中是普遍的，但Tapr與HAVcr相關(guān)為哮喘易感性等位基因的持續(xù)存在提供了令人感到興趣的解釋。在人類進(jìn)化過程中，Tim基因家族的某些等位基因可能使人類能夠抵抗特應(yīng)性疾病和其它的免疫疾病，但對(duì)那些抗性等位基因的選擇可能被賦予抗病毒致病抵抗力的替代等位基因的選擇所抵消。
總之，我們的研究代表了第一次地利用同類系小鼠策略來定位候選的強(qiáng)哮喘易感性基因，和克服這種復(fù)雜的遺傳性癥狀檢查中遇到的固有困難。我們?cè)谌祟惾旧w5q同源的區(qū)域中鑒定到一個(gè)以前未知的基因家族，它在Th細(xì)胞發(fā)育和哮喘易感性中起著主要作用。雖然以前人類研究鑒定了人染色體5q上的幾個(gè)候選基因，但我們的研究鑒定的Tim1基因產(chǎn)物也為HAV感染和哮喘易感性降低之間的相反關(guān)系提供了解釋。
CD4+T細(xì)胞(Th)亞群產(chǎn)生了不同模式的細(xì)胞因子，這導(dǎo)致Th細(xì)胞功能不均一的概念。1型Th細(xì)胞(Th1)產(chǎn)生白細(xì)胞介素2(IL-2)和/或干擾素γ，誘發(fā)遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)和激活巨噬細(xì)胞。另一方面，2型Th細(xì)胞(Th2)產(chǎn)生了IL-4、IL-5和IL-10，特別重要的是產(chǎn)生IgE和嗜曙紅細(xì)胞性炎癥，并可能抑制細(xì)胞介導(dǎo)免疫力。認(rèn)為Th2細(xì)胞在特應(yīng)性的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用。幾個(gè)因素決定了在具體免疫應(yīng)答中T輔助細(xì)胞是分化成Th1還是Th2，因素包括但不限于，細(xì)胞因子微環(huán)境、TCR信號(hào)的強(qiáng)度和/或抗原密度、和協(xié)同刺激途徑。CD4+T輔助細(xì)胞分化成Th1或Th2亞群對(duì)特應(yīng)性、自身免疫性疾病、傳染病和移植排斥等的結(jié)局有深遠(yuǎn)的影響。
對(duì)保護(hù)非特應(yīng)性個(gè)體免遭過敏性疾病和抑制特異性個(gè)體過敏反應(yīng)的免疫應(yīng)答的具體特征了解得很少。因?yàn)橐恍┭芯肯到y(tǒng)中Th1細(xì)胞交叉調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞，過敏原特異的Th1細(xì)胞被認(rèn)為能夠調(diào)節(jié)過敏性疾病和哮喘。Th1細(xì)胞抑制Th2細(xì)胞的發(fā)育和增殖，而IgE的產(chǎn)生受到IL-4和IFN-γ的交互調(diào)節(jié)。這提示保護(hù)個(gè)體免遭過敏是由于產(chǎn)生了過敏原特異性抑制Th1細(xì)胞。已證明過敏原特異性T細(xì)胞克隆衍生自能產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子的非過敏性個(gè)體的外周血。這些觀察結(jié)果還支持哮喘的衛(wèi)生學(xué)假設(shè)，該假設(shè)認(rèn)為，改善公共健康設(shè)施和使用疫苗及抗菌素降低了西方社會(huì)傳染病的流行，特別是能誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的傳染病的流行。其結(jié)果是，在缺乏Th1介導(dǎo)的應(yīng)答時(shí)，Th2應(yīng)答和特應(yīng)性發(fā)展得更加劇烈和迅速。
本文鑒定的TIM基因也是候選的致癌基因。用TIM基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可以抵抗細(xì)胞死亡。在TIM-1中預(yù)計(jì)的EGFR激酶基序提供了一種可能的機(jī)制，這一機(jī)制控制下細(xì)胞的存活。此外，TIM-1證明與TOSO有顯著程度的序列相同性(大約20％)和結(jié)構(gòu)相似性(一種具有IgV域、粘蛋白/多配體蛋白聚糖域、跨膜域、和帶有類似的磷酸酪氨酸基序的胞內(nèi)域的跨膜糖蛋白)，TOSO是一種保護(hù)細(xì)胞免遭Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)。像TIM基因一樣，TOSO也可能是致癌基因，它位于在血液惡性腫瘤和實(shí)體瘤頻繁變化的基因組區(qū)域中。
方法動(dòng)物將DBA/2N漸滲回交進(jìn)BALB/cAnPt背景中以產(chǎn)生同類系，包括C.D2Es-HBA。從Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbn，緬因州)獲得BALB/cBy、DBA/2J和(BALB/c×DBA/2)F1小鼠(CByD2F1/J)，并從Taconic實(shí)驗(yàn)室得到了BALB/cAn和DBA/2N。(BALB/c×DBA/2)F1小鼠是將BALB/cByJ和HBA雜交產(chǎn)生的。N2小鼠通過(BALB/c×HBA)F1與HBA回交產(chǎn)生。在我們對(duì)重組N2動(dòng)物的分析中，每當(dāng)可能時(shí)，只用非重組同胞測(cè)試重組小鼠。為在多種試驗(yàn)中檢測(cè)個(gè)體的N2基因型，我們將選出的N2小鼠與HBA回交以產(chǎn)生N3小鼠，分析其基因型以選出攜帶重組N2單倍型的小鼠，從而保留了所選的重組單倍型。Dennis Loh博士友好的提供了DO11.10小鼠，它是轉(zhuǎn)基因小鼠供TCR識(shí)別OVA肽323-339(pOVA323-339)并與BALB/c(43)回交，這種小鼠飼養(yǎng)在我們的設(shè)施中。HBA DO11.10小鼠是將DO11.10與HBA回交而產(chǎn)生。DO11.10小鼠是通過對(duì)TCR-Tg進(jìn)行FACS分析而選出的，并分析其基因型以對(duì)D11Mit135和D11Mit168之間的HBa等位基因進(jìn)行選擇。斯坦福大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)(Stanford University Committee on Animal Welfare)批準(zhǔn)了所有的動(dòng)物方案。
確定基因型。測(cè)試出現(xiàn)在D11Mit140和D11Mit269之間的所有存在的“D11Mit-”標(biāo)志和D11Mit271和D11Mit22附近所有的放射雜交標(biāo)記，以了解DBA/c和BALB/c之間的多態(tài)性，這樣可鑒定Tapr基因座周圍的其它標(biāo)志。由ResearchGenetics(亨茨維爾，阿拉巴馬州)得到了MITMapPair引物，并在蛋白質(zhì)和核酸設(shè)施(斯坦福，加利福尼亞州)中合成了所有其它的引物。按前述方法進(jìn)行PCR，并用4-5％的Metaphor瓊脂糖(Biowhittaker，Walkersville，馬里蘭州)分辨SSLP多態(tài)性。用33P-dCTP擴(kuò)增供SSCP分析的產(chǎn)物并在40W和4℃下用Sequi-Gen GT系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，加利福尼亞州)將其在變性丙烯酰胺凝膠上分離。
免疫方法。用在完全弗氏佐劑(CFA)中的KLH(Calbiochem，拉霍亞，加利福尼亞州)免疫在細(xì)胞因子產(chǎn)生試驗(yàn)中研究的小鼠(DeKruyff等，J Immunol 149，3468-76(1992))。為測(cè)定氣道高反應(yīng)性，在第0天用混有硫酸鋁鉀(alum)的OVA腹膜內(nèi)(i.p.，50μg)免疫接種小鼠，并于第7、8和9天輕度麻醉后鼻內(nèi)接種(i.n.50μgOVA，溶于50μlPBS)。對(duì)照小鼠單用alum i.p.注射和鼻內(nèi)施用的PBS。在最后一次OVA鼻內(nèi)劑量24小時(shí)后(第10天)測(cè)量吸入乙酰甲膽堿的氣道高反應(yīng)性。
測(cè)量道反應(yīng)性。如前所述，通過測(cè)量放在體積描記儀(Buxco Electronics有限公司，特洛伊，紐約州)中的有知覺小鼠因乙酰甲膽堿誘導(dǎo)造成的氣流阻塞評(píng)估氣道反應(yīng)(Hansen等，J Chin Invest 103，175-83(1999))。
細(xì)胞培養(yǎng)。按前述方法由制備用KLH免疫接種小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞(Yeung等，JImmunol 161，4146-52(1998))。與抗CD4的磁珠(Miltenyi Biotech，德國)一起培育后用MACS柱正選擇轉(zhuǎn)基因的DO11.10 CD4 T細(xì)胞。在96孔圓底板上與250μg/mlOVA和1×104骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞/孔一起培養(yǎng)2×104細(xì)胞/孔。7天后，洗滌DO11.10 T細(xì)胞并用新鮮的抗原呈遞細(xì)胞和所示濃度的抗原再次刺激。再次刺激時(shí)，對(duì)原初DO11.10培養(yǎng)物的抗原濃度進(jìn)行滴定。用前述方法產(chǎn)生了帶有一些修飾的骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞；在直徑為9厘米的組織培養(yǎng)皿上用10ml含有20-25U/mlGM-CSF的培養(yǎng)基培養(yǎng)5×106骨髓細(xì)胞。在培養(yǎng)的第六天將松散粘附的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到第二個(gè)平皿上；四天內(nèi)，以這些轉(zhuǎn)移的細(xì)胞作為樹突狀細(xì)胞的來源。
細(xì)胞因子ELISA。按Macaulay等，J Immunol 160，1694-700(1998)；和Macaulay等，J Immunol 158，4171-9(1997)描述的方法進(jìn)行ELISA。
單克隆抗體。通過硫酸銨沉淀和離子交換層析從腹水液中純化得到供ELISA和FACS分析的單克隆抗體。Philippa Marrack，National Jewish Medical Center慷慨的提供了抗克隆型抗體KJ1-26.1，并且，在FACS之前按標(biāo)準(zhǔn)方法將這種抗體交聯(lián)FITC。
實(shí)施例2鑒定人Tim序列在基因座內(nèi)原位克隆TIM基因家族產(chǎn)生抵抗Th2應(yīng)答發(fā)展的保護(hù)力，而且抗原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性為促進(jìn)我們了解Th2驅(qū)動(dòng)的應(yīng)答反應(yīng)和特應(yīng)性疾病的調(diào)控提供了機(jī)會(huì)。此外，TIM-3在小鼠Th1細(xì)胞上特異性表達(dá)和抗TIM-3mAb導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)嚴(yán)重程度加深。這強(qiáng)調(diào)了此基因家族在T輔助細(xì)胞亞群調(diào)控中的重要性。
通過PCR克隆了人Tim cDNA，它是小鼠Tim-3和Tim-4的直向同源基因。克隆了TIM-1的人直向同源基因，稱其為HAVcr-1，它是甲型肝炎病毒的細(xì)胞受體。人染色體5上，TIM家族的基因以TIM-4、TIM-1、TIM-3的順序相互緊密毗鄰，沒有間隔基因。染色體12和19上有TIM假基因。此基因家族的成員僅僅是中等相關(guān)的。圖7顯示了Tim基因家族中的蛋白質(zhì)序列和相互關(guān)系。
TIM基因家族成員的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域是小鼠和人直向同源基因之間最保守的結(jié)構(gòu)域，例如，人和小鼠TIM-3胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間有77％的相同性。相反，整個(gè)TIM-3在人和小鼠之間的相同性只有63％。每個(gè)TIM基因含有不同的預(yù)計(jì)酪氨酸信號(hào)基序。TIM-1的胞質(zhì)域含有兩個(gè)酪氨酸殘基并包括一個(gè)高度保守的酪氨酸激酶磷酸化基序，RAEDNIY。擴(kuò)展域，SRAEDNIYIVEDRP，含有一個(gè)預(yù)計(jì)的Itk和EGF受體磷酸化位點(diǎn)。已知Itk能磷酸化磷脂酶C-γ(PLC-γ)并因此觸發(fā)涉及T細(xì)胞活化和輔助T細(xì)胞分化的信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外，Itk信號(hào)還影響Th1/Th2分化，且Itk-/-小鼠不產(chǎn)生強(qiáng)Th2應(yīng)答。EGF受體激酶的活性與細(xì)胞存活和對(duì)細(xì)胞死亡的抗性相關(guān)。類似的，TIM-3在胞質(zhì)域中含有不同的、保守的酪氨酸磷酸化和SH2結(jié)合基序，這提示TIM與其配體的相互反應(yīng)會(huì)啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)傳遞途徑，且各個(gè)TIM在信號(hào)傳遞上是不同的。
TIM蛋白的胞外IgV功能域也含有與骨橋蛋白的SVVYGIR基序相類似的預(yù)計(jì)的整聯(lián)蛋白結(jié)合基序，它通過α(9)β(1)、α(4)β(1)和α(4)β(7)整聯(lián)蛋白參與粘附。與未轉(zhuǎn)染的300.19細(xì)胞相比，TIM-1轉(zhuǎn)染的300.19細(xì)胞系的前B細(xì)胞顯示高度粘附性和在細(xì)胞培養(yǎng)中存活率增加。與未轉(zhuǎn)染的CHO相比，TIM-1和TIM-2轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞也顯示存活率提高。這些結(jié)果證明，TIM蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和死亡。
人Tim1和Tim3基因的遺傳多態(tài)性。鑒定了SNP或核苷酸多態(tài)性以及人Tim1基因中的缺失/插入。因?yàn)镾NP在基因組中極常見，每300-600個(gè)堿基對(duì)就會(huì)發(fā)生一次，故只分析了Tim1的編碼區(qū)。此外，常見的遺傳性變異可能也是重要的。先測(cè)定了來自30-40名個(gè)體(60-80條染色體)的T細(xì)胞的cDNA序列。冪計(jì)算顯示，60條染色體編碼區(qū)中靶序列的調(diào)查將以高于1％的人口頻率容易地檢測(cè)出SNP，并有90％以上的機(jī)會(huì)以5％或更高的人口頻率檢測(cè)到等位基因。因此，篩選30-40名個(gè)體的序列變異就捕捉到大部分在人群中常見的、功能相關(guān)的、非保守性的DNA變異。
由于DNA變異/SNP在物理上緊密相鄰常常顯示強(qiáng)的依賴關(guān)系(即，聯(lián)鎖不平衡)，它決定了一組DNA變異(SNP單倍體)是否是一起遺傳，并決定了只對(duì)這些SNP的一部分篩選是否足以鑒定單倍型。對(duì)各種染色體大區(qū)域的分析表明，不連續(xù)的單倍型模塊(數(shù)百個(gè)kb中約有10個(gè))通常是存在的，每個(gè)都具有被重組出現(xiàn)的位點(diǎn)所打斷的有限的多樣性。為發(fā)現(xiàn)單倍型，對(duì)cDNA測(cè)序和檢索是否有在許多個(gè)體中反復(fù)觀察到的序列變異的組合。
獲得38名獻(xiàn)血員的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，并在體外用PHA(7.5μg/ml)刺激24-72小時(shí)，或用伴刀豆球蛋白A(2μg/ml)刺激24小時(shí)。在刺激的最后6個(gè)小時(shí)中加入PMA(20ng/ml)和洛諾霉素(1μM)。然后收獲細(xì)胞并用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA。為獲得測(cè)序用的cDNA模板，用Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)按照制造商的方法反轉(zhuǎn)錄RNA。cDNA用于PCR擴(kuò)增全長的Tim cDNA。采用Herculase Hot Starttm高保真度聚合酶(Stratagene)PCR引物是(SEQ IDNO37)GTGTCTGACAGTGGCGTA(正向)，(SEQ ID NO38)TTTGCCCAGGCAGAACCA(正向)，CCACCCAAGGTCACGACT(反向)，(SEQ ID NO39)ATGCCACGGACTAAGACC(反向)。用Qiagen QIAquick凝膠提取試劑純化PCR產(chǎn)物，并用四個(gè)內(nèi)部測(cè)序引物測(cè)序有無Tim1，用兩個(gè)內(nèi)部測(cè)序引物測(cè)序有無Tim3。
取得活化T細(xì)胞的總RNA并用Superscript II和寡dT轉(zhuǎn)錄以克隆這些個(gè)體全長Tim1 RT-PCR產(chǎn)物。用Expand高保真度聚合酶(Roche)擴(kuò)增Tim1 cDNA產(chǎn)生橫跨Tim1編碼區(qū)的1kb產(chǎn)物，用PCR純化試劑盒(Invitrogen)將其純化。然后將純化的產(chǎn)物克隆入TOPO pEF6載體(Invitrogen)，然后轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)菌。使細(xì)菌菌落生長在氨基芐青霉素選擇的LB平板上。挑選出單個(gè)菌落并用Qiagen miniprep預(yù)備試劑盒制造質(zhì)粒制品。用Hind III消化的限制性圖譜用于挑選含有正確取向插入物的質(zhì)粒。然后用三個(gè)不同的引物，正向(T7)、內(nèi)部和反向(BGH)，給這些質(zhì)粒測(cè)序，并以SeqMan程序?qū)⑦@些序列與NCBI人類TIM參考序列排列對(duì)比。
測(cè)定35名個(gè)體染色體(70條染色體)的Tim序列后，鑒定了Tim1中的幾種多態(tài)性，顯示在圖8中。這些多態(tài)性編號(hào)為1-7(左欄)。圖8中提供了作為參考點(diǎn)的NCBI數(shù)據(jù)庫(NM_012206)列出的人TIM-1的全長序列。由于該編碼區(qū)中存在多個(gè)常規(guī)的序列多態(tài)性，我們測(cè)定了不到20％的染色體中存在的序列。鑒定到6個(gè)額外的序列變異(顯示在圖8中)，并在粘蛋白胞外域中觀察到了所有的多態(tài)性，這對(duì)小鼠是直的，盡管具體的變異不同于小鼠中觀察到的。重要的是，這些變異之間以各種組合方式的相關(guān)程度有限。最顯著的變異是標(biāo)記為多態(tài)性1的插入，157insMTTTVP，見于65％的染色體中。以及多態(tài)性5中的缺失，187ΔThr，見于65％的染色體中。在40％的染色體中觀察到了多態(tài)性4，并在≤5％的染色體中觀察到了其它的多態(tài)性。值得注意的是，這些變異中的大多數(shù)(2-6)位于外顯子3(第一個(gè)編碼粘蛋白的外顯子)中，且所有的變異都發(fā)生在基因組水平且不是剪接變體。
根據(jù)mRNA的這種序列分析，已開發(fā)了更加快速地分析大量患者/對(duì)照者的基因組DNA的方法。為篩檢個(gè)體是否有圖8所示序列中所見的變異，先檢測(cè)該DNA在150個(gè)PCR產(chǎn)物中有無單一序列長度多態(tài)性(SSLP)，此法可以檢測(cè)主要的插入(多態(tài)性1)和缺失(多態(tài)性5)。
此外，為確定其它多態(tài)性(2-4、6和7)的基因型并鑒定新的多態(tài)性，開發(fā)了用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析PCR產(chǎn)物的相對(duì)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)方法。在最優(yōu)化條件下，SSCP分析檢查到了多于90％的單個(gè)核苷酸取代和所有長度的多態(tài)性。在這一分析中，鑒定了擴(kuò)增Tim基因各個(gè)外顯子的PCR引物，并可以用標(biāo)準(zhǔn)非變性SSCP凝膠電泳法區(qū)分變體(圖9)。采用了非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與ABI 377 DNA序列對(duì)各個(gè)外顯子進(jìn)行高分辨率SSCP分析。合成并純化了末端熒光素標(biāo)記的引物。在高通量基因型測(cè)定過程中檢出的新的SSCP模式可以鑒定新的變體。用這種方法，快速分析了患者和對(duì)照者的基因型。
用基本上相同的方法分析了Tim3基因。測(cè)定了活化T細(xì)胞的mRNA序列以鑒定Tim3多態(tài)性，以及Tim1和Tim3之間的長范圍單倍型。測(cè)定代表60條染色體的Tim3 cDNA序列后，發(fā)現(xiàn)Tim3是多態(tài)性的，如同小鼠基因組中那樣。然而，只有一個(gè)多態(tài)性，Leu140Arg，是常見的，見于大約12％的代表性染色體中。
實(shí)施例3Tim序列的表達(dá)小鼠TIM-3蛋白在Th1克隆上表達(dá)，但不在原初T細(xì)胞或Th2細(xì)胞上表達(dá)。采用TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞，在一或兩輪Th1定向分化后，TIM-3蛋白不在Th1細(xì)胞上表達(dá)，但在三輪或更多輪次的Th1刺激后表達(dá)。TIM-3 mRNA的表達(dá)檢出略早。為確定TIM-3基因表達(dá)在人中是否是一樣的，采用IL-12和抗IL-4 mAb存在時(shí)抗原刺激產(chǎn)生的破傷風(fēng)類毒素特異性T細(xì)胞，檢測(cè)了TIM-3和TIM-1 mRNA在人Th1細(xì)胞中的表達(dá)。鑒于TIM-1與哮喘相關(guān)，測(cè)定了TIM-1和TIM-3 mRNA在人Th2細(xì)胞中的表達(dá)。通過體外用過敏原、IL-4和抗IL-12 mAb刺激，從過敏性獻(xiàn)向只產(chǎn)生了Th2細(xì)胞系。用PCR分析了RNA的TIM基因。
TIM-3一般在Th1分化后表達(dá)，而TIM-1卻丟失了。相反，TIM-3在任何Th2中都不表達(dá)，但TIM-1在所有的Th2細(xì)胞中都表達(dá)。TIM-1和TIM-3在單核細(xì)胞缺失(monocyte-depleted)的未受刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞(這種細(xì)胞得自用來產(chǎn)生Th1和Th2細(xì)胞系的獻(xiàn)血員)中表達(dá)，假定這是因?yàn)檫@細(xì)胞混合的種群含有Th1和Th2記憶細(xì)胞。這些結(jié)果提示Th2表達(dá)的TIM-1和Th1表達(dá)的TIM-3之間存在著相互關(guān)系。在小鼠中也觀察到了TIM-1和TIM-3之間的這種關(guān)系。
在人組織中，4.4kb的TIM-1 mRNA在腎臟和睪丸中有非常強(qiáng)烈的表達(dá)。這種4.4kb的mRNA出現(xiàn)在幾乎所有的組織中，盡管大多數(shù)是微弱的。在結(jié)腸和肝臟中觀察到了5.5kb的條帶。在脾臟、胸腺和外周血白細(xì)胞中觀察到了7.5kb的條帶，并在一些器官中觀察到了小于4.4kb的條帶。這些結(jié)果提示，hTIM-1以某種水平在大多數(shù)人組織中表達(dá)，同時(shí)，7.5kb的信息可能編碼免疫有關(guān)組織中的hTIM-1。然而，Kim-1(腎臟損傷分子-1，TIM-1的大鼠類似物)的表達(dá)在腎臟局部缺血時(shí)提高了。由于在表達(dá)分析中使用的MTN印跡是從尸體提取的mRNA制備的，重新分析了腎臟中TIM-1表達(dá)的提高。在由正常腎臟活檢組織獲得的腎臟RNA中沒有發(fā)現(xiàn)TIM-1過度表達(dá)。因此，在腎臟和睪丸中觀察到的高水平的TIM-1表達(dá)可能是由于組織損傷所致的TIM-1表達(dá)上調(diào)造成的。受傷的腎臟可能表達(dá)的蛋白質(zhì)能將滲入的炎性細(xì)胞導(dǎo)向更具保護(hù)性的Th2應(yīng)答而不是破壞性的Th1應(yīng)答。
實(shí)施例4TIM配體和抗體抗體的產(chǎn)生?？故骉IM-1單克隆抗體的產(chǎn)生使我們可以檢測(cè)不同組織、細(xì)胞系和小鼠品系中TIM-1在細(xì)胞表面的表達(dá)。將小鼠TIM-1的兩個(gè)等位基因克隆入一載體以得到高的蛋白質(zhì)表達(dá)(Invitrogen，pEF6-TOPO)。大鼠用Tim1 cDNA構(gòu)建物免疫接種和強(qiáng)化以迅速產(chǎn)生抗細(xì)胞表面分子的抗體。這種用cDNA免疫接種的方法有利于產(chǎn)生抗細(xì)胞表面表位的mAb，因?yàn)門im1 cDNA會(huì)被APC攝取，而APC將以TIM-1作為細(xì)胞表面分子表達(dá)。為了產(chǎn)生和BALLB/c和HBA TIM-1都能良好結(jié)合的mAb(通過與TIM-1的保守性區(qū)域，如TIM-1的免疫球蛋白域，結(jié)合)，給每只大鼠注射BALB/c和HBA Tim1 cDNA(pEF6-mTIMbalb和pEF6-mTIMhba)。
用pEF6-mTIM-1-GFP表達(dá)構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞加強(qiáng)接種Tim1 cDNA免疫的大鼠。以FACS挑棟出表達(dá)高水平小鼠TIM-1的CHO轉(zhuǎn)染子，并注射到大鼠中。用pEF6-mTIM-1表達(dá)構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的前B細(xì)胞系300.19，產(chǎn)生了另一種表達(dá)mTIM-1的細(xì)胞。用該細(xì)胞株以流式細(xì)胞法篩檢融合后大鼠血清和雜交瘤有無抗TIM-1的抗體。與未免疫大鼠的對(duì)照血清相比，大鼠產(chǎn)生了抗TIM-1高效價(jià)多克隆抗體，這是通過將大鼠血清(以及次級(jí)FITC-羊抗大鼠Ig)與pEF6-mTIM1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的300.19細(xì)胞結(jié)合而測(cè)定的。這種染色是對(duì)TIM-1特異的，因?yàn)槲崔D(zhuǎn)染細(xì)胞或TIM-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞沒有反應(yīng)性。
取出大鼠脾臟并將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系(SP/2)融合以產(chǎn)生雜交瘤。用TIM-1轉(zhuǎn)染的300.19細(xì)胞系篩選雜交瘤上清以鑒定可產(chǎn)生單克隆抗TIM-1抗體的雜交瘤克隆。用TIM-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和mTIM-3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或TIM-3融合蛋白證實(shí)mAb對(duì)TIM-1(而不是其它的TIM代表性)的特異性。
抗體染色。從BALB/c和HBA DO11.10脾細(xì)胞產(chǎn)生了Th1和Th2細(xì)胞系。TIM-1mRNA表達(dá)的RT-PCR證實(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)極化條件下用抗原再刺激兩輪后，TIM-1在Th2細(xì)胞系中表達(dá)，但不在Th1系中表達(dá)。在Th2極化條件下用抗原/APC刺激兩輪后，用多克隆大鼠抗TIM-1抗血清染色DO11.10 T細(xì)胞。這些Th2細(xì)胞表達(dá)了高水平的TIM-1。
這些實(shí)驗(yàn)顯示，TIM-1在Th2系中的優(yōu)先表達(dá)是用抗Tim-1mAb和Northern印跡法定量測(cè)定和證實(shí)的。BALB和HBA的DO11.10細(xì)胞與抗原和APC一起培養(yǎng)，并在標(biāo)準(zhǔn)極化條件下再刺激1、2和3周(抗IL-12加IL-4，或抗IL-4加IL-12)。每周刺激后都用抗TIM-1 mAb染色細(xì)胞。在不同的時(shí)間點(diǎn)收獲激活的細(xì)胞，測(cè)定在分化成Th1或Th2亞群的T細(xì)胞上TIM-1表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。為了確定T細(xì)胞活化后Tim-1表面表達(dá)是否有變化，我們還用PMA和離子霉素刺激一些細(xì)胞，比較每輪抗原刺激一周后，休眠T細(xì)胞和活化T細(xì)胞上TIM-1的表達(dá)?；蛘撸枯喆碳ず?，采用定量RT-PCR或northern印跡法(使用由PMA加離子霉素活化的T細(xì)胞所得的mRNA)來確定mRNA產(chǎn)生的相對(duì)水平。
TIM-1-Ig融合蛋白制備了BALB/c TIM-1-mIgG2a，這是TIM-1多肽和小鼠免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白。基因工程發(fā)行其載體使其在小鼠FgG2aFc區(qū)中含有一突變從而使其與Fc受體的結(jié)合最小。利用TIM-1融合蛋對(duì)TIM-1的功能作特性分析。希望TIM-1 Ig融合蛋白通過與TIM-1配體的結(jié)合能夠阻抑TIM-1的功能并阻礙TIM-1/TIM-1配體相互反應(yīng)。
將純化的D1muc-Fc融合蛋白跑凝膠，這種融合蛋白含有富含半胱氨酸的免疫球蛋白域和融合于人IgG1(IgVmuc-hIg)絞鏈區(qū)和Fc片段的TIM-1的2/3粘蛋白域。這種蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中表達(dá)，并用蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱從CHO上清中純化得到IgVmuc-hIg蛋白。純化的IgVmuc-hIg融合蛋白中和了約2log的HAV傳染性。此外，用IgVmuc-hIg處理HAV在HAV顆粒的沉淀中造成了主要的變化，這表明IgVmuc-hIg誘導(dǎo)了病毒基因組脫殼，而僅僅含有Ig樣域而沒有粘蛋白功能域的融合蛋白(IgV-hlg)則不能。這種HAV中和的系統(tǒng)和IgVmuc-hIg融合蛋白將用來分析TIM-1/HAV受體等位基因的功能。
根據(jù)抗TIM-3 mAb對(duì)巨噬細(xì)胞擴(kuò)展和活化的體內(nèi)效應(yīng)，我們假定TIM-3配體將在髓譜系的細(xì)胞上表達(dá)。按照已有方法，用1000U/ml IL-4和800U/ml GM-CSF從血液?jiǎn)魏思?xì)胞中制備了樹突狀細(xì)胞(DC)。將細(xì)胞置入添加有IL-1β(10ng/ml)、TNF-α(10ng/ml)、IL-6(1000U/ml)和PGE2(1μg/ml)的IL-4(1000U/ml)和GM-CSF(800U/ml)中2天以使DC成熟。盡管獻(xiàn)血員不斷變動(dòng)，但成熟的DC為hTIM-3-Ig陽性染色，這提示成熟的DC表達(dá)了TIM-3IgV功能域的配體。用TIM-3-Ig每周能染色骨髓衍生的內(nèi)皮細(xì)胞，但不能染色B細(xì)胞系。
雖然Tim1/huhavcr-1的胞質(zhì)內(nèi)尾巴較短，但它含有在小鼠、大鼠、人和猴之間高度保守的序列(RAEDNIYI)，這一序列可以被磷酸化，并通過與其它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子反應(yīng)而產(chǎn)生信號(hào)。T細(xì)胞中，可結(jié)合RAEDNIYI基序的最可能的候選分子是酪氨酸激酶Itk。白細(xì)胞介素-2可誘導(dǎo)的酪氨酸激酶、Itk，是Tec家族的非受體蛋白酪氨酸激酶，它參與導(dǎo)致T細(xì)胞活化的胞內(nèi)信號(hào)活動(dòng)。Tec家族成員含有許多激酶家族共同的保守的SH3、SH2和催化功能域，但可以通過這一區(qū)域以外的獨(dú)特序列將其區(qū)別。已知Itk可使磷脂酶C-γ(PLC-γ)磷酸化，并引發(fā)涉及T細(xì)胞活化和輔助T細(xì)胞分化的信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)缺乏Itk信號(hào)時(shí)，Th2細(xì)胞不發(fā)育。這些結(jié)果說明，TIM-1/huhavcr-1可以通過Itk產(chǎn)生信號(hào)，因此可以改變CD4 T細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
實(shí)施例5TIM敲除小鼠敲除結(jié)構(gòu)可用來產(chǎn)生Tim1缺的小鼠，使得我們能夠分析缺乏TIM-1分子時(shí)免疫應(yīng)答反應(yīng)的發(fā)展。在另一個(gè)方法中，采用TIM-1-Ig融合蛋白或抗TIM-1單克隆抗體來阻抑TIM1+/+(野生型)小鼠中TIM-1的功能。敲除Tim1的小鼠和抗TIM-1 mAb方法是評(píng)價(jià)TIM-1在T細(xì)胞分化和哮喘發(fā)病機(jī)理中的作用的補(bǔ)充。
與BALB/c序列相比，Tim1的HBA小鼠基因組序列中外顯子4缺失，這是由于在外顯子4上整合了L1逆轉(zhuǎn)錄病毒元件。如果截短一個(gè)外顯子降低了TIM-1的功能，則因產(chǎn)生Tim1敲除小鼠而使TIM-1功能完全喪失，這會(huì)嚴(yán)重限制此類小鼠產(chǎn)生Th2應(yīng)答反應(yīng)的能力。用cre-lox技術(shù)和BALB/c ES細(xì)胞使TIM-1外顯子1和2缺失可產(chǎn)生TIM-1 KO小鼠，這將消除TIM-1的細(xì)胞表面表達(dá)，由此證明TIM-1功能在Th2細(xì)胞和AHR發(fā)展中的重要性。
為產(chǎn)生合適的靶構(gòu)建物，用高密度過濾裝置篩選C57/B16 BAC文庫(RPCI-23)，鑒定到含有TIM基因家族成員的特定的BAC。這些BAC克隆用來構(gòu)建500kB的重疊群和覆蓋了大約350kb基因組區(qū)域(包含Tim基因家族)的物理圖譜。選出一種含有完整Tim1基因的特殊的BAC，RPCI-23-222F8，以產(chǎn)生TIM靶向構(gòu)建物。通過與這一區(qū)域5’和3’旁側(cè)臂的同源重組，這種靶向構(gòu)建物缺失了包括啟動(dòng)子區(qū)、信號(hào)外顯子和IgV外顯子(外顯子1和2)的一段4kb區(qū)域。這種靶向載體可用在C57BI/6或BALB/c ES細(xì)胞中，因?yàn)榇税邢驑?gòu)建物的同源臂與BALB/c和HBA(C57BI/6)的DNA是同源的。將這種構(gòu)建物引入ES細(xì)胞，通過PCR和Southern印跡法篩選ES細(xì)胞有無靶的等位基因。
靶向載體，pLOX，含有三個(gè)loxP位點(diǎn)，并通過在靶的ES細(xì)胞中表達(dá)cre重組酶，重組將產(chǎn)生三種形式的標(biāo)區(qū)域，其中兩個(gè)等位基因，A和B，可用來產(chǎn)生Tim1KO小鼠。將選出的ES細(xì)胞克隆引入胚泡以產(chǎn)生嵌合小鼠，并飼養(yǎng)以進(jìn)行敲除的種系傳遞。分析了尾巴DNA的CD4 T細(xì)胞中。先使用等位基因A，其中cre/lox重組使用了最外的loxP位點(diǎn)以除去TK和新霉素選擇盒，除了TIM-1外顯子1和2。去除TIM-1基因組靶區(qū)域的整個(gè)neo和TK盒防止與人工制品混淆，這種人工制品可以引發(fā)同一家族其它基因附近的neo的二次轉(zhuǎn)錄?；蛘?，如果等位基因A產(chǎn)生了致死表型或混淆的表型，就用靶的等位基因B產(chǎn)生小鼠，等位基因B中neo和TK盒缺失，且TIM-1區(qū)側(cè)接有l(wèi)ox-p位點(diǎn)。使用這種條件性靶向方法，應(yīng)在T細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制下表達(dá)cre-重組酶的小鼠中T細(xì)胞特異性缺失Tim-1。
序列表<110>J.J.麥金太爾(McIntire，Jennifer Jones)D.T.尤梅祖(Umetsu，Dale T.)R.德克魯耶夫(Dekruyff，Rosemarie)V.庫奇羅(Kuchroo，Vijay)G.J.弗里曼(Freeman，Gordon J.)<120>T細(xì)胞調(diào)節(jié)基因及其使用方法<130>STAN-235WO<140>Unassigned<141>2002-07-01<150>60/302,344<151>2001-06-29<160>36<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>305<212>PRT<213>小家鼠(M.musculus)<220>
<221>VARIANT<222>(1)…(305)<223>TIM-1 BALB/c等位基因<400>1Met Asn Gln Ile Gln Val Phe Ile Ser Gly Leu Ile Leu Leu Leu Pro1 5 10 15Gly Thr Val Asp Ser Tyr Val Glu Val Lys Gly Val Val Gly His Pro20 25 30Val Thr Leu Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Tyr Arg Gly Ile Thr Thr Thr35 40 45Cys Trp Gly Arg Gly Gln Cys Pro Ser Ser Ala Cys Gln Asn Thr Leu50 55 60Ile Trp Thr Asn Gly His Arg Val Thr Tyr Gln Lys Ser Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Leu Lys Gly His Ile Ser Glu Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu85 90 95Asn Ser Val Glu Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile100 105 110Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gln Lys Val Thr Phe Ser Leu Gln Val Lys115 120 125
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cttgcctcca ggagggttgg caaatgcagg agcagtcagg attcgctctg aggaaaatat 780ctacaccatc gaggagaacg tatatgaagt ggagaattca aatgagtact actgctacgt 840caacagccag cagccatcct ga 862<210>13<211>345<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>VARIANT<222>(1)…(345)<223>TIM-4，BALB/c等位基因<400>13Met Ser Lys Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Val Thr Glu Leu Trp Trp1 5 10 15Leu Tyr Leu Ser Lys Ser Pro Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly20 25 30Phe Leu Gly Gln Pro Val Thr Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser35 40 45Gln Ser Arg Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser50 55 60Lys Cys Asn Ala Glu Leu Leu Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser65 70 75 80Arg Lys Ser Thr Lys Tyr Thr Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu85 90 95Val Ser Leu Thr Ile Ser Asn Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr100 105 110Cys Cys Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn115 120 125Val Arg Leu Glu Leu Arg Arg Ala Thr Thr Thr Lys Lys Pro Thr Thr130 135 140Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Pro Tyr Val Thr Thr Thr Thr Pro Glu145 150 155 160Leu Leu Pro Thr Thr Val Met Thr Thr Ser Val Leu Pro Thr Thr Thr165 170 175Pro Pro Gln Thr Leu Ala Thr Thr Ala Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr180 185 190Cys Pro Ser Thr Thr Pro Gly Ser Phe Ser Gln Glu Thr Thr Lys Gly195 200 205Ser Ala Ile Thr Thr Glu Ser Glu Thr Leu Pro Ala Ser Asn His Ser210 215 220Gln Arg Ser Met Met Thr Ile Ser Thr Asp Ile Ala Val Leu Arg Pro225 230 235 240Thr Gly Ser Asn Pro Gly Ile Leu Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Thr245 250 255Gln Lys Thr Thr Leu Thr Thr Ser Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Lys260 265 270
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<221>VARIANT<222>(1)…(345)<223>C.D2 ES-HBA和DBA/2J等位基因<400>15Met Ser Lys Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Val Met Glu Leu Trp Trp
1 5 10 15Leu Tyr Leu Ser Lys Ser Pro Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly20 25 30Phe Leu Gly Gln Pro Val Thr Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser35 40 45Gln Ser Arg Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser50 55 60Lys Cys Asn Ala Glu Leu Leu Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser65 70 75 80Arg Lys Ser Thr Lys Tyr Thr Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu85 90 95Val Ser Leu Thr Ile Ser Asn Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr100 105 110Cys Cys Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn115 120 125Val Arg Leu Glu Leu Arg Arg Ala Thr Thr Thr Lys Lys Pro Thr Thr130 135 140Thr Thr Arg Pro Thr Thr Thr Pro Tyr Val Thr Thr Thr Thr Pro Glu145 150 155 160Leu Leu Pro Thr Thr Val Met Thr Thr Ser Val Leu Pro Thr Thr Thr165 170 175Pro Pro Gln Thr Leu Ala Thr Thr Ala Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr180 185 190Cys Pro Ser Thr Thr Pro Gly Ser Phe Ser Gln Glu Thr Thr Lys Gly195 200 205Ser Ala Phe Thr Thr Glu Ser Glu Thr Leu Pro Ala Ser Asn His Ser210 215 220Gln Arg Ser Met Met Thr Ile Ser Thr Asp Ile Ala Val Leu Arg Pro225 230 235 240Thr Gly Ser Asn Pro Gly Ile Leu Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Thr245 250 255Gln Lys Thr Thr Leu Thr Thr Ser Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Lys260 265 270Ser His Gln Ile Asn Ser Arg Gln Thr Ile Leu Ile Ile Ala Cys Cys275 280 285Val Gly Phe Val Leu Met Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Leu Leu Arg290 295 300Gly Lys Val Thr Gly Ala Asn Cys Leu Gln Arg His Lys Arg Pro Asp305 310 315 320Asn Thr Glu Val Ser Asp Ser Phe Leu Asn Asp Ile Ser His Gly Arg325 330 335Asp Asp Glu Asp Gly Ile Phe Thr Leu340 345<210>16<211>1032<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>16atgtccaagg ggcttctcct cctctggctg gtgatggagc tctggtggct ttatctgaca 60ccagctgcct cagaggatac aataataggg tttttgggcc agccggtgac tttgccttgt 120cattacctct cgtggtccca gagccgcaac agtatgtgct ggggcaaagg ttcatgtccc 180aattccaagt gcaatgcaga gcttctccgt acagatggaa caagaatcat ctccaggaag 240tcaacaaaat atacactttt ggggaaggtc cagtttggtg aagtgtcctt gaccatctca 300aacaccaatc gaggtgacag tggggtgtac tgctgccgta tagaggtgcc tggctggttc 360aatgatgtca agaagaatgt gcgcttggag ctgaggagag ccacaacaac caaaaaacca 420acaacaacca cccggccaac caccacccct tatgtaacca ccaccacccc agagctgctt 480ccaacaacag tcatgaccac atctgttctt ccaaccacca caccacccca gacactagcc 540accactgcct tcagtacagc agtgaccacg tgcccctcaa caacacctgg ctccttctca 600caagaaacca caaaagggtc cgccttcact acagaatcag aaactctgcc tgcatccaat 660cactctcaaa gaagcatgat gaccatatct acagacatag ccgtactcag gcccacaggc 720tctaaccctg ggattctccc atccacttca cagctgacga cacagaaaac aacattaaca 780acaagtgagt ctttgcagaa gacaactaaa tcacatcaga tcaacagcag acagaccatc 840ttgatcattg cctgctgtgt gggatttgtg ctaatggtgt tattgtttct ggcgtttctc 900cttcgaggga aagtcacagg agccaactgt ttgcagagac acaagaggcc agacaacact 960gaagatagtg acagcgtcct caatgacatg tcacacggga gggatgatga agacgggatc 1020ttcactctct ga 1032<210>17<211>359<212>PRT<213>智人(H.sapiens)<220>
<221>VARIANT<222>(1)…(360)<223>TIM-1等位基因1<400>17Met His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp1 5 10 15Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val20 25 30Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn35 40 45Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr50 55 60Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu65 70 75 80Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala85 90 95Val Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp100 105 110Phe Asn Asp Met Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys115 120 125Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val
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ataaggagag aacccaccag ctcaccattg tactcttaca caacagatgg gaatgacacc 780gtgacagagt cttcagatgg cctttggaat aacaatcaaa ctcaactgtt cctagaacat 840agtctactga cggccaatac cactaaagga atctatgctg gagtctgtat ttctgtcttg 900gtgcttcttg ctcttttggg tgtcatcatt gccaaaaagt atttcttcaa aaaggaggtt 960caacaactaa gtgtttcatt tagcagcctt caaattaaag ctttgcaaaa tgcagttgaa 1020aaggaagtcc aagcagaaga caatatctac attgagaata gtctttatgc cacggactaa 1080<210>19<211>359<212>PRT<213>智人(H.sapiens)<220>
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<220>
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<221>VARIANT<222>(1)…(359)<223>TIM-1，等位基因4<400>23Met His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp1 5 10 15Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val20 25 30Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn35 40 45Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr
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gctgtcacat caatgtgctg gaatagaggc tcatgttctc tattcacatg ccaaaatggc 180attgtctgga ccaatggaac ccacgtcacc tatcggaagg acacacgcta taagctattg 240ggggaccttt caagaaggga tgtctctttg accatagaaa atacagctgt gtctgacagt 300ggcgtatatt gttgccgtgt tgagcaccgt gggtggttca atgacatgaa aatcaccgta 360tcattggaga ttgtgccacc caaggtcacg actactccaa ttgtcacaac tgttccaacc 420gtcacgactg ttcgaacgag caccactgtt ccaacgacaa cgactgttcc aacgacaact 480gttccaacaa caatgagcat tccaacgaca acggactgtt ccgacgacaa tgactgtttc 540aacgacaacg agcgttccaa cgacaacgag cattccaaca acaacaagtg ttccagtgac 600aacatgtctc tacctttgtt cctccaatgc ctttgcccag gcagaaccat gaaccagtag 660ccacttcacc atcttcacct cagccagcag aaacccaccc tacgacactg cagggagcaa 720taaggagaga acccaccagc tcaccattgt actcttacac aacagatggg aatgacaccg 780tgacagagtc ttcagatggc ctttggarta acaatcaaac tcaactgttc ctagaacata 840gtctactgac ggccaatacc actaaaggaa tctatgctgg agtctgtatt tctgtcttgg 900tgcttcttgc tcttttgggt gtcatcattg ccaaaaagta tttcttcaaa aaggaggttc 960aacaactaag tgtttcattt agcagccttc aaattaaagc tttgcaaaat gcagttgaaa 1020aggaagtcca agcagaagac aatatctaca ttgagaatag tctttatgcc acggactaa 1079<210>25<211>364<212>PRT<213>智人(H.sapiens)<220>
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ttcaaaaagg aggttcaaca actaagtgtt tcatttagca gccttcaaat taaagctttg 1020caaaatgcag ttgaaaagga agtccaagca gaagacaata tctacattga gaatagtctt 1080tatgccacgg actaa 1095<210>27<211>364<212>PRT<213>智人(H.sapiens)<220>
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<221>VARIANT<222>(1)…(378)<223>TIM-4，等位基因2<400>35Met Ser Lys Glu Pro Leu Ile Leu Trp Leu Met Ile Glu Phe Trp Trp
1 5 10 15Leu Tyr Leu Thr Pro Val Thr Ser Glu Thr Val Val Thr Glu Val Leu20 25 30Gly His Arg Val Thr Leu Pro Cys Leu Tyr Ser Ser Trp Ser His Asn35 40 45Ser Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys Asp Gln Cys Pro Tyr Ser Gly Cys50 55 60Lys Glu Ala Leu Ile Arg Thr Asp Gly Met Arg Val Thr Ser Arg Lys65 70 75 80Ser Ala Lys Tyr Arg Leu Gln Gly Thr Ile Pro Arg Gly Asp Val Ser85 90 95Leu Thr Ile Leu Asn Pro Ser Glu Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys100 105 110Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Ile Asn Val Arg115 120 125Leu Asn Leu Gln Arg Ala Ser Thr Thr Thr His Arg Thr Ala Thr Thr130 135 140Thr Thr Arg Arg Thr Thr Thr Thr Ser Pro Thr Thr Thr Arg Gln Met145 150 155 160Thr Thr Thr Pro Ala Ala Leu Pro Thr Thr Val Val Thr Thr Pro Asp165 170 175Leu Thr Thr Gly Thr Pro Leu Gln Met Thr Thr Ile Ala Val Phe Thr180 185 190Thr Ala Asn Thr Cys Leu Ser Leu Thr Pro Ser Thr Leu Pro Glu Glu195 200 205Ala Thr Gly Leu Leu Thr Pro Glu Pro Ser Lys Glu Gly Pro Ile Leu210 215 220Thr Ala Glu Ser Glu Thr Val Leu Pro Ser Asp Ser Trp Ser Ser Val225 230 235 240Glu Ser Thr Ser Ala Asp Thr Val Leu Leu Thr Ser Lys Glu Ser Lys245 250 255Val Trp Asp Leu Pro Ser Thr Ser His Val Ser Met Trp Lys Thr Ser260 265 270Asp Ser Val Ser Ser Pro Gln Pro Gly Ala Ser Asp Thr Ala Val Pro275 280 285Glu Gln Asn Lys Thr Thr Lys Thr Gly Gln Met Asp Gly Ile Pro Met290 295 300Ser Met Lys Asn Glu Met Pro Ile Ser Gln Leu Leu Met Ile Ile Ala305 310 315 320Pro Ser Leu Gly Phe Val Leu Phe Ala Leu Phe Val Ala Phe Leu Leu325 330 335Arg Gly Lys Leu Met Glu Thr Tyr Cys Ser Gln Lys His Thr Arg Leu340 345 350Asp Tyr Ile Gly Asp Ser Lys Asn Val Leu Asn Asp Val Gln His Gly355 360 365Arg Glu Asp Glu Asp Gly Leu Phe Thr Leu370 375
<210>36<211>1156<212>DNA<213>智人(H.sapiens)<400>36atgtccaaag aacctctcat tctctggctg atgattgagt tttggtggct ttacctgaca 60ccagtcactt cagagactgt tgtgacggag gttttgggtc accgggtgac tttgccctgt 120ctgtactcat cctggtctca caacagcaac agcatgtgct gggggaaaga ccagtgcccc 180tactccggtt gcaaggaggc gctcatccgc actgatggaa tgagggtgac ctcaagaaag 240tcagcaaaat atagacttca ggggactatc ccgagaggtg atgtctcctt gaccatctta 300aaccccagtg aaagtgacag cggtgtgtac tgctgccgca tagaagtgcc tggctggttc 360aacgatgtaa agataaacgt gcgcctgaat ctacagagag cctcaacaac cacgcacaga 420acagcaacca ccaccacacg cagaacaaca acaacaagcc ccaccaccac ccgacaaatg 480acaacaaccc cagctgcact tccaacaaca gtcgtgacca cacccgatct cacaaccgga 540acaccactcc agatgacaac cattgccgtc ttcacaacag caaacacgtg cctttcacta 600accccaagca cccttccgga ggaagccaca ggtcttctga ctcccgagcc ttctaaggaa 660gggcccatcc tcactgcaga atcagaaact gtcctcccca gtgattcctg gagtagtgtt 720gagtctactt ctgctgacac tgtcctgctg acatccaaag agtccaaagt ttgggatctc 780ccatcaacat cccacgtgtc aatgtggaaa acgagtgatt ctgtgtcttc tcctcagcct 840ggagcatctg atacagcagt tcctgagcag aacaaaacaa caaaaacagg acagatggat 900ggaataccca tgtcaatgaa gaatgaaatg cccatctccc aactactgat gatcatcgcc 960ccctccttgg gatttgtgct cttcgcattg tttgtggcgt ttctcctgag agggaaactc 1020atggaaacct attgttcgca gaaacacaca aggctagact acattggaga tagtaaaaat 1080gtcctcaatg acgtgcagca tggaagggaa gacgaagacg gcctttttac cctctaacaa 1140cgcagtagca tgttag 115權(quán)利要求
1.一種含有哺乳類TIM基因序列的分離的核酸分子。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述哺乳類TIM基因序列是選自TIM-1、TIM-3和TIM-4的等位基因2、3、4、5和6的人序列。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述哺乳類TIM基因序列是選自TIM-1、TIM-2、TIM-3和TIM-4的小鼠序列。
4.一種含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所列任一序列中至少20個(gè)核苷酸毗連序列的分離的核酸。
5.一種含有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所列任一序列的分離的核酸。
6.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有供檢測(cè)TIM基因多態(tài)性的探針。
7.一種寡核苷酸陣列，其特征在于，該陣列含有兩個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求6所述的探針。
8.一種細(xì)胞，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的核酸組分。
9.一種純化的多肽組合物，其特征在于所述組合物含有至少50重％的，作為權(quán)利要求1所述核酸的產(chǎn)物的蛋白質(zhì)或其片段。
10.如權(quán)利要求9所述的純化的多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33和35所列的序列。
11.一種哺乳類TIM多肽的特異性抗體。
12.一種測(cè)定個(gè)體哮喘易感性的方法，其特征在于，該方法包括分析所述個(gè)體是否存在至少一種易感的TIM多態(tài)性；其中，所述易感多態(tài)性的存在表明個(gè)體對(duì)哮喘的易感性提高。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述分析步驟包括測(cè)定所述個(gè)體的基因組DNA或mRNA與權(quán)利要求6所述的一個(gè)探針或多個(gè)探針之間的特異性結(jié)合。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述分析步驟包括測(cè)定所述個(gè)體的細(xì)胞和蛋白質(zhì)與權(quán)利要求11所述抗體之間的特異性結(jié)合。
15.一種用于分析TIM基因功能的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，其特征在于，它包括敲除TIM基因。
16.一種篩選可調(diào)節(jié)TIM功能的生物活性制劑的方法，其特征在于，該方法包括將候選的生物活性制劑與以下任一結(jié)合(a)哺乳動(dòng)物TIM多肽；(b)含有編碼哺乳動(dòng)物TIM多肽的核酸的細(xì)胞；(c)用來分析TIM基因功能的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型；以及測(cè)定所述制劑對(duì)TIM功能的作用。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述生物活性試劑可下調(diào)或上調(diào)TIM的表達(dá)。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述生物活性試劑可抑制或提高所述TIM多肽的活性。
19.一種診斷或分級(jí)個(gè)體免疫機(jī)能不全的方法，其特征在于，該方法包括分析所述個(gè)體是否存在至少一種易感的TIM多態(tài)性；其中，易感多態(tài)性的存在表明個(gè)體對(duì)所述免疫機(jī)能不全的易感性提高。
20.一種診斷或分級(jí)個(gè)體癌癥的方法，其特征在于，該方法包括分析所述個(gè)體是否存在至少一種易感的TIM多態(tài)性；其中，易感多態(tài)性的存在表明個(gè)體對(duì)癌癥治療的抗性提高。
21.一種診斷或分級(jí)個(gè)體癌癥的方法，其特征在于，該方法包括分析所述個(gè)體是否存在至少一種易感TIM-1表達(dá)特征；其中，TIM-1表達(dá)特征表明個(gè)體對(duì)癌癥治療的抗性提高。
22.一種診斷或分級(jí)個(gè)體癌癥的方法，其特征在于，該方法包括分析所述個(gè)體是否存在至少一種易感性TIM-4表達(dá)特征；其中，TIM-4表達(dá)特征表明個(gè)體對(duì)癌癥治療的抗性提高。
23.一種治療個(gè)體免疫性疾病的方法，其特征在于，該方法包括給予所述個(gè)體調(diào)節(jié)TIM多肽功能的試劑。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述TIM多肽是TIM-1或TIM-4。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述制劑是TIM-1的特異性抗體或抗體片段。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述制劑是抑制TIM-1功能的化合物。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述免疫性疾病是哮喘。
28.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述免疫性疾病是過敏反應(yīng)。
29.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述免疫性疾病是濕疹。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述免疫性疾病是自身免疫性疾病。
31.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述制劑是TIM-4的特異性抗體或抗體片段。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述制劑是抑制TIM-4功能的化合物。
33.一種治療個(gè)體惡性腫瘤的方法，其特征在于，該方法包括給予所述個(gè)體調(diào)節(jié)TIM多肽功能的制劑。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述TIM多肽是TIM-1。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述制劑是TIM-1的特異性抗體或抗體片段。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述制劑是抑制TIM-1功能并強(qiáng)化化學(xué)治療制劑或放射治療效果的化合物。
37.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述TIM多肽是TIM-4。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述制劑是TIM-4的特異性抗體或抗體片段。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述制劑是抑制TIM-4功能并強(qiáng)化化學(xué)治療制劑或放射治療效果的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了與免疫功能和細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)相關(guān)的基因座和相應(yīng)的蛋白質(zhì)家族。這些基因編碼帶有保守性IgV和粘蛋白功能域的細(xì)胞表面分子。這些包含TIM家族的基因座與免疫機(jī)能障礙(包括哮喘)遺傳學(xué)上相關(guān)。此外，TIM基因家族位于人第5條染色體的一個(gè)區(qū)域(在惡性腫瘤和骨髓異常增生綜合征中通常缺失)內(nèi)。此基因序列的多態(tài)性與氣道高反應(yīng)性和過敏性炎癥的發(fā)生以及T細(xì)胞產(chǎn)生IL－4和IL－13相關(guān)。這些蛋白質(zhì)包括人甲型肝炎細(xì)胞受體，hHAVcr－1。
文檔編號(hào)A61P37/08GK1538853SQ02813015
公開日2004年10月20日 申請(qǐng)日期2002年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月29日
發(fā)明者J·J·麥因太爾, R·H·德克魯耶夫, D·T·尤梅祖, G·J·弗里曼, V·庫奇羅, J J 麥因太爾, 媛, 尤梅祖, 弗里曼, 德克魯耶夫 申請(qǐng)人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì), 利蘭 斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì)