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人類胱氨酸結(jié)多肽的制作方法

文檔序號:1147736閱讀:248來源:國知局
專利名稱:人類胱氨酸結(jié)多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種編碼新型多肽的多核苷酸、由該多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)以及表達該蛋白質(zhì)的重組細胞。
來源于腦垂體的促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)和促甲狀腺素以及來源于胎盤的人絨毛膜促性腺激素(hCG)屬于糖蛋白激素家族。這些激素具有異二聚體結(jié)構(gòu)并且含有兩個非共價連接的α和β亞基。所述α亞基的氨基酸序列相同,而β亞基的氨基酸序列不同而且賦予各促性腺激素以生物學(xué)特異性(Ulloa-Aquirre,1988,1995)。二聚體被證實具有生物學(xué)活性。α和β亞基都被糖基化并且含有N-連接的糖鏈。HCG在C-末端肽上含有四個附加的O-連接的糖。
FSH,LH和TSH存在于大多數(shù)脊椎動物體內(nèi)并且通過腦垂體進行合成和分泌。目前只在包括人在內(nèi)的靈長類和馬中發(fā)現(xiàn)有CG存在并且CG是通過胎盤組織合成的。
在一個物種內(nèi),糖蛋白激素家族中的每個成員的α亞基基本相同;從種到種之間,α亞基也是高度保守的。每個成員,即CG,F(xiàn)SH,TSH和LH的β亞基不相同,但卻顯示出相當高的結(jié)構(gòu)同源性。而且,從種到種之間,β亞基也是高度保守的。在人體中,成熟的α亞基由92個氨基酸殘基組成,而每個成員的β亞基大小不同在hFSH中,由111個殘基組成,在hLH中,由121個殘基組成,在hTSH中,由118個殘基組成以及在hCG中,由145個殘基組成(Combarnous,Y.(1992),內(nèi)分泌綜述(Endocrine Reviews),13,670-691,Lustbader,J.W.等(1993),內(nèi)分泌綜述(Endocrine Reviews),14,291-311)。hCG的β亞基比其它β亞基大的多,其在C-末端具有被本文稱作羧基末端蛋白(CTP)的34個附加氨基酸。
異二聚體的兩個亞基具有多個保守的亞基內(nèi)二硫鍵在α亞基內(nèi)具有五個二硫鍵,而在β亞基內(nèi)具有六個二硫鍵。促性腺激素家族的所有成員中,相應(yīng)的半胱氨酸殘基是完全保守的。在hCG的β亞基內(nèi),二硫鍵在9-57;23-72,26-110,34-88,38-90和93-100位點上的半胱氨酸之間形成。hCG的X-射線結(jié)構(gòu)表明這些二硫鍵與被稱作二硫結(jié)(knots)的典型三維模式相關(guān)聯(lián)。所述激素具有三個或四個能被N-糖基化的天冬酰胺殘基。另外,hCG的C-末端肽(CTP)可以在四個絲氨酸位點被O-糖基化。
所述糖蛋白激素在包括新陳代謝、體溫調(diào)節(jié)和生殖過程在內(nèi)的多種身體功能中起著重要的作用。例如腦垂體促性腺激素FSH在刺激卵泡發(fā)育和成熟的過程中起著關(guān)鍵的作用,而LH誘導(dǎo)排卵(Sharp,R.M.(1990),臨床內(nèi)分泌學(xué)(Clin Endocrinol.),33,787-807;Dorrington和Armstrong(1979),激素研究的最新進展(Recent Prog.Horm.Res.),35,301-342)。目前,F(xiàn)SH在臨床上已單獨或與LH活性聯(lián)合用于刺激卵巢,即對卵巢進行過度刺激以進行體外受精(IVF)和在不育無排卵婦女中誘導(dǎo)體內(nèi)排卵(Insler,V.(1988),國際生育雜志(Int.J.Fertility),33,85-97,Navot和Rosenwaks(1988),體外受精胚胎轉(zhuǎn)移雜志(J.Vitro Fert.Embryo Transfer),5,3-13),以及用于雄性性腺機能減退。受控制的超排卵的目的在于增加可收回的成熟卵母細胞的數(shù)目以用于IVF以及隨后的胚胎轉(zhuǎn)移(ET)。通常,每次轉(zhuǎn)移多達三個胚胎被替換。由于通常必須進行多于一次的處理,所以在大多數(shù)不育癥診所中將多余的胚胎或受精的卵母細胞冷凍并在后來的循環(huán)中進行轉(zhuǎn)移。
TSH可用于需要補充甲狀腺素的患者,例如用于甲狀腺部分或全部切除了的甲狀腺癌病人。
已經(jīng)制備出所有亞基的基因組和cDNA克隆并且已經(jīng)解析出它們的初級結(jié)構(gòu)。而且,已經(jīng)用人促性腺激素亞基基因轉(zhuǎn)染了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞并且已經(jīng)證實了這些細胞能夠分泌完整的二聚體(例如Keene等(1989),生物學(xué)化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),264,4769-4775;Van Wezenbeek等(1990),從克隆到臨床(From clone to Clinic)(eds Crommelin D.J.A.和Schellekens H.,245-251))。
原則上,受精的調(diào)控可在幾個階段受到影響,例如卵泡募集,卵泡形成,植入和維持妊娠。
由于選擇性機制,離開原始庫的卵泡中只有一個卵泡到達排卵前期,即優(yōu)勢卵泡,并提供一個健康的、可受精的卵母細胞。其它卵泡則閉鎖和退化。控制優(yōu)勢卵泡選擇的機制還不完全清楚,但是已經(jīng)假設(shè)對FSH最敏感的卵泡就成為優(yōu)勢卵泡。已經(jīng)知道,除了促性腺激素,最佳卵泡和卵母細胞的發(fā)育還需要其它因子。卵泡的生長受到生長因子如IGF-1和GDF-9的調(diào)控,在后期其生長受到促性腺激素FSH和LH的調(diào)控,以及受到雌激素的調(diào)控。調(diào)節(jié)因子還涉及卵泡停滯(arrest),早期卵泡募集,卵泡生長,anthral形成和排卵過程的調(diào)控。并且這些調(diào)節(jié)因子影響胚胎在子宮中的植入并涉及雄性體內(nèi)精子發(fā)生的調(diào)控。
需要識別涉及雌性和雄性生育不同階段的因子。這種因子可用于體內(nèi)或體外治療方案。
本發(fā)明提供了這種因子。更具體地說,本發(fā)明提供了一種含有SEQID NO1編碼序列的多核苷酸序列。
全長的基因序列可用于制備在合適宿主細胞中表達所述蛋白因子的載體分子。全長基因或其變異體可以從天然來源的cDNA或基因組DNA中提取或利用已知方法合成。
本發(fā)明還包括如SEQ ID NO1所示的全長mRNA序列。該mRNA含有一個對應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸序列101-490的可讀框。該序列編碼具有130個氨基酸的前體蛋白(SEQ ID NO2)。并且,為了適應(yīng)密碼子的可變性,本發(fā)明還包括編碼與本文公開的序列相同的氨基酸序列的序列。編碼功能性多肽的部分編碼序列及其等位基因和種變異也屬于本發(fā)明的一部分。有時,一個基因在特定組織中表達為剪接變異體,導(dǎo)致產(chǎn)生改變的5’或3’mRNA或者包含或除外一個或多個外顯子序列。預(yù)測這些序列以及由這些序列編碼的蛋白質(zhì)都具有相同或相似的功能并且也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
具體地,SEQ ID NO3代表一種特殊的剪接變異體,該剪接變異體與SEQ ID NO1的不同點在于插入了128個核苷酸。該剪接變異體進行翻譯的結(jié)果產(chǎn)生了SEQ ID NO2所示蛋白質(zhì)的截短型,如SEQ ID NO4所示。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些序列特異性地在腦垂體和子宮內(nèi)膜中表達。
本文提供的序列信息不應(yīng)僅僅被解釋為需要除外錯誤識別的堿基。本文公開的特定序列可方便地用于分離幾個物種的全長基因。
因此,一方面,本發(fā)明提供了編碼一種新型蛋白激素的分離的多核苷酸。
術(shù)語“分離的”表示所述多核苷酸已從其天然環(huán)境中取出并由此處于一種適用于遺傳工程蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的形式。
本發(fā)明的DNA可以從cDNA獲得。所述組織優(yōu)選來源于人。優(yōu)選從腦垂體、胎盤或子宮內(nèi)膜分離核糖核酸。或者,所述編碼序列可以是基因組DNA,或是利用DNA合成技術(shù)制備的。所述多核苷酸還可以是RNA的形式。如果多核苷酸是DNA,那么其可以是單鏈的或雙鏈的形式。所述單鏈可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。
本發(fā)明的多肽能夠作為單體存在。然而,二聚體形式的肽也屬于本發(fā)明的一部分。這種二聚體是由兩個相同多肽組成的同源二聚體,或者作為一種選擇,是異二聚體復(fù)合物。優(yōu)選這種二聚體由本發(fā)明的多肽與促性腺激素家族的共同α亞基聯(lián)合組成。作為一種選擇,還可構(gòu)想含有本發(fā)明多肽序列的功能性部分的嵌合蛋白。這種嵌合構(gòu)建體可以通過連接編碼異二聚體復(fù)合物的亞基的DNA而方便地制得,其中通過一個PCT申請WO96/05224中記載的接頭連接。類似地,可以制備雙功能的糖蛋白,其中本發(fā)明的亞基通過接頭共價連接到糖蛋白激素家族的其它成員上。這種構(gòu)建體的實例在PCT申請WO99/25849中描述。
本發(fā)明還涉及具有微小變異或具有多態(tài)位點的多核苷酸。具有微小變異的多核苷酸編碼保留與天然成熟蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。多態(tài)位點用于診斷目的。
這種多核苷酸可以通過在優(yōu)選高度嚴格條件下的雜交來進行鑒定。根據(jù)本發(fā)明,術(shù)語“嚴格”是指在65℃的溫度下1×SSC,0.1%SDS的洗滌條件;高度嚴格條件指的是SSC降低至0.3×SSC,更優(yōu)選至0.1×SSC。優(yōu)選頭兩次沖洗相繼進行兩次,每次15-30分鐘。如果需要在高度嚴格條件下洗滌,那么用0.1×SSC再進行一次洗滌15分鐘。雜交可以在例如65℃下0.5M磷酸緩沖液pH7.5/7%SDS中進行過夜。
因此,本發(fā)明還包括序列發(fā)生了變異卻仍保留了功能特征的含有SEQ ID NO1的多肽或其部分的功能等同物。
本發(fā)明的DNA對于體內(nèi)或體外大量地且以基本純的形式表達本發(fā)明的新型多肽非常有用。
一個序列中發(fā)生的變異可以表現(xiàn)為全長序列中的氨基酸差異或所述序列中氨基酸的缺失、替換、插入、倒置或增加。預(yù)計基本上不改變生物學(xué)和免疫學(xué)活性的氨基酸替換已經(jīng)被記載。相關(guān)氨基酸間的氨基酸替換或在進化過程中經(jīng)常發(fā)生的替換具體地是Ser/Ala,Ser/Gly,Asp/Gly,Asp/Asn,Ile/Val(參見Dayhof,M.D.,蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖譜(Atlas of protein sequence and structure),國家生物醫(yī)學(xué)研究基金(Nat.Biomed.Res.Found.),華盛頓D.C.,1978,第5卷,增刊3)?;谶@些知識,Lipman和Pearson研究出了一種用于快速和靈敏地進行蛋白比較的方法(科學(xué)(Science),1985,227,1435-1441)以確定同源多肽間的功能類似性。非常明顯,編碼這種變異體的多核苷酸也屬于本發(fā)明的一部分。
因此,另一方面,本發(fā)明提供了含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽以及具有70%,優(yōu)選90%,更優(yōu)選95%,甚至更優(yōu)選98%相似性的多肽。
使用NCBI-BLASTX 2.0.4[Feb-24-1998](Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,ZhengZhang,Webb Miller,和Dayid J.Lipman(1997),″缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白數(shù)據(jù)庫檢索程序(Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of prote in database search programs)″,核酸研究(Nucleic Acids Res).253389-3402)用默認設(shè)置查尋序列對比。對于氨基酸對比用BLOSUM62矩陣作為默認而相似性表示為陽性數(shù)。低組成復(fù)雜度過濾(filtering of low compositionalcomplexity)沒有被包括在內(nèi)。
優(yōu)選地,所述多肽在與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸位點36,50,60和64對應(yīng)的位點上含有半胱氨酸殘基。甚至更優(yōu)選地,半胱氨酸殘基存在于與SEQ ID NO2的氨基酸位點84,99,115,117,120和12 7對應(yīng)的位點上。與某一位點對應(yīng)表示當序列被最佳排列時,與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的對照序列成一線的第二個序列中的位點。因此,與糖蛋白激素家族的β亞基相比,所述多肽能夠在相應(yīng)的位點上形成除所謂的安全帶二硫鍵(在βhCG的相應(yīng)位點26-110上)之外的全部二硫鍵。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的蛋白是一種前體蛋白并且在分泌過程中受到蛋白酶剪切。所述成熟蛋白也屬于本發(fā)明的一部分。SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的蛋白以及所述成熟蛋白可以進行翻譯后的修飾,例如糖基化。這種經(jīng)修飾的蛋白也屬于本發(fā)明的一部分。
應(yīng)當理解本發(fā)明還包括了仍然能夠帶來生物學(xué)效應(yīng)的這種多肽的部分。特別是仍然與靶向物結(jié)合的部分也屬于本發(fā)明的一部分。這種蛋白或其功能性部分本身可以是功能性的,例如以溶解的形式,或者通過已知的生物技術(shù)方法或通過化學(xué)合成可以將其與其它多肽連接(例如,CTP,WO90/09800)從而獲得嵌合蛋白。這種蛋白還可通過阻止靶向物與體內(nèi)天然蛋白相互作用而用作治療劑。因此,這種經(jīng)改變的蛋白可被用作其天然功能的興奮劑或拮抗劑。出于這方面的考慮,抗本發(fā)明蛋白的抗體也屬于本發(fā)明的一部分。這種抗體可以通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)或重組DNA技術(shù)來制備(抗體,實驗室指南(Antibodies,Alaboratory manual),1988,冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory))。
或者,可通過利用反義核酸形成三股螺旋(Cooney等,1988,科學(xué)(Science),241,456-459)或通過與mRNA結(jié)合達到蛋白表達水平的下調(diào)。這本身還能產(chǎn)生對生育的調(diào)節(jié)即避孕或治療不育。
本發(fā)明包括其編碼序列中含有上文所示多肽的所有分離的多核苷酸。許多種類的宿主細胞和克隆載體組合可以被有效地用于克隆編碼本發(fā)明多肽的核酸序列。
合適的表達載體是例如細菌質(zhì)?;蚪湍纲|(zhì)粒、寬宿主范圍的質(zhì)粒和由質(zhì)粒和噬菌體或病毒DNA組合得到的載體。還包括來源于染色體DNA的載體。而且本發(fā)明的載體中可含有一個復(fù)制起點和/或顯性選擇標記。本發(fā)明的載體適合于轉(zhuǎn)化宿主細胞。
如果是二聚體蛋白,可以使用類似的克隆載體將第二個亞基插入到宿主細胞中。亞基可以由不同的載體編碼也可以由單一載體編碼。
用于表達本發(fā)明的蛋白或其部分的載體還含有可操作性連接至編碼所述蛋白的核酸序列的控制序列。這種控制序列通常含有一個啟動子序列和調(diào)節(jié)和/或增強表達水平的序列。當然控制序列和其它序列可以根據(jù)所選擇的宿主細胞而不同。
含有本發(fā)明的DNA的重組表達載體以及用所述DNA或所述表達載體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞也屬于本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的合適宿主細胞是細菌宿主細胞、酵母菌和其它真菌、植物或動物宿主如中國倉鼠卵巢細胞或猴細胞。因此,含有本發(fā)明的DNA或表達載體的宿主細胞也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?;蚬こ趟拗骷毎梢栽诔R?guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng),可以對該培養(yǎng)基進行改變以用作例如合適的選擇、擴增或轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。培養(yǎng)條件如溫度、pH、營養(yǎng)成分等對于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的。
用于制備本發(fā)明的DNA或載體以及用所述DNA或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域中標準的和熟知的技術(shù),參見例如Sambrook等,分子克隆實驗室指南(Molecular CloningAlaboratory Manual).第二版,冷泉港實驗室(Cold Spring HarborLaboratory),紐約州,冷泉港(Cold Spring Harbor,NY),1989。
按照已知方法培養(yǎng)含有編碼所述多肽的載體的宿主細胞并且回收目的多肽能夠生產(chǎn)出本發(fā)明的多肽。二聚體蛋白可以類似地從用編碼第二種蛋白的附加載體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細胞中分離得到或通過培養(yǎng)用編碼兩種亞基的單一載體轉(zhuǎn)染的細胞而分離得到。
本發(fā)明的多肽可以通過普通的生物化學(xué)純化方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收純化,所述生物化學(xué)純化方法在以下著作中記載蛋白質(zhì)純化指南(Guide to Protein purification),Murray P.Deutscher編輯(1990),酶學(xué)方法(Methods in Enzymology).第182卷,AcademicPress,inc.San Diego CA 92101.Harcourt Brace Jovanovich出版社,所述生物化學(xué)純化方法包括硫酸銨沉淀、提取、層析如疏水作用層析、陽離子或陰離子交換層析或親和層析和高效液相層析。如果需要,還可包括蛋白重折疊步驟?;蛘咚龅鞍卓勺鳛橐环N含有可用于親和純化的(″標記物″)的融合蛋白被表達和純化。
本發(fā)明的多肽可用于調(diào)控卵泡停滯和募集。募集的抑制可用以延遲(過早的)絕經(jīng)或作為一種避孕方法。另外,這種多肽可用于例如來自冷凍卵巢組織的卵泡的體外成熟和生長過程。
本發(fā)明的多肽還可用于檢測和純化與蛋白結(jié)合的受體。例如,所述多肽可被偶聯(lián)到固相支持體上從而用于受體或抗激素抗體的親和層析制備過程中。在篩選治療候選藥物的試驗中所述受體本身可用于對候選藥物評價激素活性。這種候選藥物可以作為本發(fā)明多肽的激動劑或拮抗劑并因此可能提高胚胎的植入效率或阻止植入。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物的配制,其包括將本發(fā)明的蛋白與藥學(xué)上可接受載體混合。
藥學(xué)上可接受載體是本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的,包括例如無菌生理鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和水。
而且本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種或多種穩(wěn)定劑如包括山梨醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖糊精和葡萄糖在內(nèi)的碳水化合物,蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白,和緩沖劑如堿性磷酸鹽。制備制劑和靜脈內(nèi)混合物的方法在Remingtons藥物科學(xué)(Remingtons’s PharmaceuticalSciences),1463-1497頁(第16版.1980,Mack Publ.Co of Easton,Pa,美國)中記載。治療劑量通常在0.1-100μg/kg體重/天的范圍內(nèi),優(yōu)選0.5-20μg/kg/天。
因此,本發(fā)明的蛋白可用于制備一種藥物。所述藥物將用于與生育相關(guān)的疾病或者用于避孕。
圖2SEQ ID NO2分別與來源于猴、豬和兔的部分序列的序列對比。破折號表示沒有獲得序列信息。
圖3用H & E(蘇木精-伊紅)染色的人組織系列切片的概觀。
圖4原位雜交a.與反義探針雜交的子宮內(nèi)膜(分泌期)切片b.與有義探針雜交的子宮內(nèi)膜(分泌期)切片c.與反義探針雜交的腦垂體(分泌期)切片d.與有義探針雜交的腦垂體(分泌期)切片為了獲得對應(yīng)所述新型基因的DNA片段,利用引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6在人類基因組DNA上進行PCR。獲得一個具有預(yù)期大小142個堿基對的片段,將其克隆到PCR2.1載體中并進行測序。所述序列與基因組克隆的部分相同并且對應(yīng)于SEQ ID NO1中337至478位核苷酸。
為了克隆包括完整可讀框(ORF)的全長cDNA,我們進行了5’和3’RACE(cDNA末端的快速擴增)PCR試驗。我們采用來源于人腦垂體的馬拉松備用cDNA(Marathon-ready cDNA)(Clontech目錄號7424-1)作模板。為了進行5’RACE,在第一個PCR中,使用了試劑盒中的AP1引物(SEQ ID NO7)和基因-特異性引物SEQ ID NO6并且以5微升腦垂體cDNA作為模板。為了進行3’RACE,類似地用引物SEQ IDNO7和SEQ ID NO5進行第一個反應(yīng)。PCR方案如下94℃5分鐘;5個循環(huán)94℃5秒鐘/72℃4分鐘;5個循環(huán)94℃5秒鐘/70℃4分鐘;25個循環(huán)94℃5秒鐘/68℃4分鐘;72℃5分鐘;4℃下貯存。
接下來,利用第一次PCR體積的1%作為模板進行嵌套式PCR反應(yīng)。這里使用了所述試劑盒中的引物AP2(SEQ ID NO8)和引物SEQ ID NO9進行5’RACE。使用引物SEQ ID NO8和SEQ ID NO10進行3’RACE。所述嵌套式反應(yīng)利用Advantage 2 cDNA聚合酶試劑盒(C1ontech)按照以下方案進行94℃5分鐘;20個循環(huán)94℃5秒鐘/68℃4分鐘;68℃5分鐘;4℃下貯存。
在1.2%瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物并在20×SSC中將該凝膠過夜印跡到Hybond N+硝酸纖維素膜上。在80℃下烘干2小時進行DNA交聯(lián)。將印跡與上述142堿基對基因-特異性PCR片段雜交(在65℃下,于0.5M磷酸緩沖液pH7.5/7%SDS中過夜)。在65℃下在0.3×SSC/0.1%SDS中洗滌濾膜,然后在65℃下在0.1×SSC/0.1%SDS中洗滌。從所述凝膠上切下由5’RACE反應(yīng)得到的大約480個堿基對的雜交片段,并利用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)按照廠家提供的說明書進行純化。類似地,從3’片段RACE反應(yīng)中分離出大約650個堿基對的雜交帶。將兩個片段克隆到pCR2.1載體中并進行測序。產(chǎn)生的5’和3’RACE片段具有所期望的重疊序列。5’片段序列對應(yīng)SEQ ID NO1中的1至449位核苷酸。3’片段序列對應(yīng)SEQ ID NO1中的377至917位核苷酸,接著是一段A-殘基。SEQ ID NO1中未包括AP2序列以及大多數(shù)的聚腺苷酸片段。
為了證實得到的序列,利用兩個引物一個在ATG翻譯起始密碼子的上游(SEQ ID NO11)而另一個在終止密碼子的下游(SEQ ID NO12)進行PCR來擴增含有ORF的區(qū)域。以腦垂體cDNA為模板獲得了作為主帶的大約530個堿基對的預(yù)期片段(參見

圖1)。該片段的序列對應(yīng)SEQ ID NO1的第23至548位核苷酸并且與組合的RACE片段(的部分)的序列相同。
SEQ ID NO1含有一個編碼130個氨基酸的可讀框(第101至490位核苷酸)。ATG翻譯起始密碼子的上游存在一個框內(nèi)終止密碼子(第44至46位核苷酸)。一個多腺苷酸化信號(ATTAAA,第894至899位核苷酸)下游接著一個聚腺苷酸片段,其只是部分包含在SEQ ID NO1中。所述可讀框含有10個半胱氨酸殘基,其間隔與在βFSH、βLH、βhCG和βTSH中的間隔極其類似。所述讀框中的氨基末端可能對應(yīng)一個信號序列。能夠注意到一些特征例如存在一段疏水殘基以及在氨基末端的甲硫氨酸后面存在一個堿性氨基酸。
對SEQ ID NO1的完整序列與人基因組DNA序列的比較顯示所述新型基因由三個外顯子組成。外顯子1對應(yīng)于第1至99位核苷酸,外顯子2對應(yīng)于第100至304位核苷酸,外顯子對應(yīng)于第305至911位核苷酸。
圖1顯示除了預(yù)計的約530個堿基對的片段外,還得到了一個更長的第二個片段(約660個堿基對)。將該片段進行克隆并測序,結(jié)果證實該片段對應(yīng)一個含有內(nèi)含子的序列的剪接變體(對應(yīng)于SEQ IDNO3)。其編碼的蛋白如SEQ ID NO4所示。
為了證實所述新型基因在進化中是否保守,利用來源于豬、猴和兔的基因組DNA以及利用引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6進行PCR反應(yīng)。獲得了預(yù)期大小的片段并通過將純化片段克隆到pCR2.1中并進行核苷酸測序來進行分析。所有三種序列與人類序列極度同源。當忽略用于PCR的引物序列時,所推測的氨基酸序列的對比顯示出高度的序列保守性(參見圖2)。
由500ng的模板起始,在DIG標記混合物(DIG-UTP,未標記的核苷酸,封閉試劑)、轉(zhuǎn)錄緩沖液、10mM DTT,1U/μl核糖核酸酶抑制劑和2-4U/μl合適的RNA聚合酶的存在下制備RNA探針(按照廠家提供的方案,Boehringer-Roche)。在37℃下溫育2小時后加入約25mMEDTA(pH8.0)、400mM LiCl和過量的100%乙醇終止反應(yīng)。將被標記的產(chǎn)物沉淀過夜,離心,用70%乙醇洗,然后重懸在含有核糖核酸酶抑制劑的H2O中。體外轉(zhuǎn)錄后,取少量探針在1.5%的瓊脂糖凝膠上分析以確定體外轉(zhuǎn)錄成功。按照Boehringer-Roche方案并利用所推薦的試劑估算探針濃度。將一系列稀釋度的被標記探針和已知濃度(10-0.01ng/ul)的對照DIG-RNA點在Hybond N+(Amersham)膜上。將該膜微波輻射2分鐘。非特異結(jié)合被封閉后,將所述膜與抗-DIG堿性磷酸酶Fab’片段(anti-DIG-AP)一起溫育30分鐘。通過加入NBT/BCIP底物來啟動染色并且染色持續(xù)至最低濃度的對照系被充分染色為止。通過比較探針與對照系的斑點強度來估測新標記的探針的濃度。原位雜交將組織切片在60℃下烘干2小時,在二甲苯中脫蠟并在遞減濃度的乙醇中再水化。然后,將所述切片用0.2M HCl處理20分鐘,用DEPC處理的Milli Q沖洗并在消化緩沖液(100mM Tris,50mM EDTA pH8)中于37℃下用蛋白酶K(1μg/ml)消化30分鐘。在室溫下(RT)將切片置于預(yù)冷的含0.2%甘氨酸的PBS中10分鐘以終止消化反應(yīng)。在0.1M三乙醇胺緩沖液中用0.25%的乙酸酐將所述切片乙酰化5分鐘,然后用DEPC處理的Milli Q沖洗兩次。在濕盒中于雜交溫度下將切片與含有52%的甲酰胺、21mM Tris、1mM EDTA、0.33M NaCl、10%的葡聚糖硫酸脂、1×Denhardt溶液、100μg/ml鮭精DNA、100μg/ml tRNA和250μg/ml酵母總RNA的預(yù)雜交混合物進行預(yù)雜交。用一個玻璃蓋玻片將所述切片蓋住。兩小時后,用含有預(yù)雜交混合物及下列添加物的探針雜交混合物替代預(yù)雜交混合物0.1mM DTT,0.1%的硫代硫酸鈉,0.1%SDS和不同量的DIG-標記的探針。所述雜交在濕盒中于50℃下進行過夜(16小時)。
然后用2×SSC將所述切片沖洗15分鐘,接著在雜交溫度下用2×SSC,l×SSC和0.1×SSC各洗15分鐘。在核糖核酸酶緩沖液(0.6MNaCl,20mM Tris,10mM EDTA)中于37℃下用核糖核酸酶A(20μg/ml)處理切片1小時。用預(yù)冷的PBS洗兩次(5分鐘,室溫)和用緩沖液1(100mM馬來酸,150mM NaCl)洗一次后,將所述切片與封閉液(含有1g/ml封閉劑的緩沖液1)一起溫育30分鐘。然后將所述切片與用封閉液按1∶500稀釋的抗-DIG-AP(Boehringer/Roche)一起在室溫下溫育1小時。用緩沖液1洗兩次(15分鐘,室溫)后,將所述切片的組織周圍小心拭干,并用DAKO-pen(DAKO)將所述切片圈住。用NBT/BCIP顯色劑(Boehringer/Roche)覆蓋所述切片并在濕盒內(nèi)于室溫下溫育。兩小時后,用水漂洗所述切片,然后任選地用0.1%甲基綠復(fù)染30秒鐘。用Kaiser甘油-明膠封固切片。
在所有試驗中,使用了不同濃度(200和1000ng/ml)的反義和有義探針。所采用的雜交溫度為50℃。顯微鏡評價原位雜交分析結(jié)果表明,與有義探針相比,用反義探針兩種組織顯示出顯著染色。這兩種組織是子宮內(nèi)膜(參見圖4a和4b)和腦垂體(參見圖4c和4d)。所有其它組織都呈陰性。
序 列 表序列表<110>Akzo Nobel N.V.<120>新垂體激素<130>2000527<140><141><160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>917<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gacatttacc cagggcaaac ttctaccatt cattgtgact tcctgaaatc ttagtgcaag 60tttcagctct aaaagaagag tgggctcctg caagattagc atgaagctgg cattcctctt 120ccttggcccc atggccctcc tccttctggc tggctatggc tgtgtcctcg gtgcctccag 180tgggaacctg cgcacctttg tgggctgtgc cgtgagggag tttactttcc tggccaagaa 240gccaggctgc aggggccttc ggatcaccac ggatgcctgc tggggtcgct gtgagacctg 300ggagaaaccc attctggaac ccccctatat tgaagcccat catcgagtct gtacctacaa 360cgagaccaaa caggtgactg tcaagctgcc caactgtgcc ccgggagtcg accccttcta 420cacctatccc gtggccatcc gctgtgactg cggagcctgc tccactgcca ccacggagtg 480tgagaccatc tgaggccgct agctgctctc tgcagacccg cctgtgtgag cagcacatgc 540agttatactt cctggatgca agactgttta atttcgacca cacccatgga ggaggttacc 600tgtcgcccct taggtccagc tcaggcaaaa ggcccaaatg cagcctactt atgctaaaag 660ttcaaaacaa tattcgtgcc ttcaccaaaa taatttctcc agctcacata cctgcaaatt 720aatttttctt tgccttgagt cttggaacat aatttgtgta tcacaatcct cccccaattt 780ggacttataa tatgctaatg atttaaacac atgggatgta attaggatat ggggctggaa 840agtctttaaa ttctcatgtt ctatttaacc tctgatctcc aaccggattt atgattaaag 900ggctagaaat gaaaaaa 917<210>2<211>130<212>PRT<213>智人<400>2Met Lys Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Gly Tyr Gly Cys Val Leu Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr20 25 30Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro
35 40 45Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys50 55 60Glu Thr Trp Glu Lys Pro Ile Leu Glu Pro Pro Tyr Ile Glu Ala His65 70 75 80His Arg Val Cys Thr Tyr Asn Glu Thr Lys Gln Val Thr Val Lys Leu85 90 95Pro Asn Cys Ala Pro Gly Val Asp Pro Phe Tyr Thr Tyr Pro Val Ala100 105 110Ile Arg Cys Asp Cys Gly Ala Cys Ser Thr Ala Thr Thr Glu Cys Glu115 120 125Thr Ile130<210>3<211>1045<212>DNA<213>智人<400>3gacatttacc cagggcaaac ttctaccatt cattgtgact tcctgaaatc ttagtgcaag 60tttcagctct aaaagaagag tgggctcctg caagattagc atgaagctgg cattcctctt 120ccttggcccc atggccctcc tccttctggc tggctatggc tgtgtcctcg gtgcctccag 180tgggaacctg cgcacctttg tgggctgtgc cgtgagggag tttactttcc tggccaagaa 240gccaggctgc aggggccttc ggatcaccac ggatgcctgc tggggtcgct gtgagacctg 300ggagcttttg tcaagatgtc gtgtatgaac aaggcattca atacacattt gttggttgac 360tgggatggac ctccccctgg agctgtagat cctccagcct aatggaaggc catttagaat 420cacacttgca ctaaacccat tctggaaccc ccctatattg aagcccatca tcgagtctgt 480acctacaacg agaccaaaca ggtgactgtc aagctgccca actgtgcccc gggagtcgac 540cccttctaca cctatcccgt ggccatccgc tgtgactgcg gagcctgctc cactgccacc 600acggagtgtg agaccatctg aggccgctag ctgctctctg cagacccgcc tgtgtgagca 660gcacatgcag ttatacttcc tggatgcaag actgtttaat ttcgaccaca cccatggagg 720aggttacctg tcgcccctta ggtccagctc aggcaaaagg cccaaatgca gcctacttat 780gctaaaagtt caaaacaata ttcgtgcctt caccaaaata atttctccag ctcacatacc 840tgcaaattaa tttttctttg ccttgagtct tggaacataa tttgtgtatc acaatcctcc 900cccaatttgg acttataata tgctaatgat ttaaacacat gggatgtaat taggatatgg 960ggctggaaag tctttaaatt ctcatgttct atttaacctc tgatctccaa ccggatttat 1020gattaaaggg ctagaaatga aaaaa1045<210>4<211>75<212>PRT<213>智人<400>4Met Lys Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Pro Met Ala Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Ala Gly Tyr Gly Cys Val Leu Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu Arg Thr20 25 30Phe Val Gly Cys Ala Val Arg Glu Phe Thr Phe Leu Ala Lys Lys Pro35 40 45Gly Cys Arg Gly Leu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Cys Trp Gly Arg Cys50 55 60Glu Thr Trp Glu Leu Leu Ser Arg Cys Arg Val65 70 75<210>5<211>26<212>DNA<213>智人<400>5ccatcatcga gtctgtacct acaacg 26<210>6<211>23<212>DNA<213>智人<400>6ctccgtggtg gcagtggagc agg 23<210>7<211>27<212>DNA<213>智人<400>7ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>8<211>23<212>DNA<213>智人<400>8actcactata gggctcgagc ggc 23<210>9<211>25<212>DNA<213>智人<400>9agtcacagcg gatggccacg ggata25<210>10<211>25<212>DNA<213>智人<400>10actgtcaagc tgcccaactg tgccc25<210>11<211>23<212>DNA<213>智人<400>11ctaccattca ttgtgacttc ctg 23<210>12<211>23<212>DNA<213>智人<400>12gtataactgc atgtgctgct cac 23<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>13cgatttaggt gacactatag gcatgaagct ggcattcctc40<210>14<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>14cgtaatacga ctcactatag gggtctgcag agagcagcta gc 4權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸,其編碼與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4具有至少70%相似性的多肽。
2.一種分離的多核苷酸,其編碼與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的成熟多肽部分具有至少70%相似性的成熟多肽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸,其與SEQ ID NO2或SEQ IDNO4具有至少90%,優(yōu)選95%的相似性。
4.如權(quán)利要求1至3所述的多核苷酸,其中所述多肽在對應(yīng)SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的36,50,60和64氨基酸位點的位置上含有氨基酸Cys。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸,其中所述多肽在對應(yīng)SEQ IDNO2的84,99,115,117,120和127氨基酸位點的位置上含有氨基酸Cys。
6.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸,所述多核苷酸含有序列SEQ IDNO1或從SEQ ID NO1的101位核苷酸延伸到490位核苷酸的序列。
7.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸,所述多核苷酸含有序列SEQ IDNO3或從SEQ ID NO3的101位核苷酸延伸到325位核苷酸的序列。
8.一種重組表達載體,其含有權(quán)利要求1至7所述的DNA。
9.由權(quán)利要求1至7所述的多核苷酸或權(quán)利要求8所述的表達載體編碼的多肽。
10.一種用權(quán)利要求1至7所述的DNA或權(quán)利要求8所述的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞。
11.如權(quán)利要求10所述的細胞,其為表達權(quán)利要求9所述蛋白的轉(zhuǎn)染細胞。
12.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求9所述的多肽的方法,該方法包括在產(chǎn)生所述蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的細胞,并且從培養(yǎng)物中回收所述蛋白。
13.一種藥物組合物,該組合物含有與藥學(xué)上可接受的載體相混合的權(quán)利要求9所述的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及新鑒定的編碼一種新型胱氨酸結(jié)多肽的DNA序列以及其編碼的蛋白。本發(fā)明可用于生育領(lǐng)域。
文檔編號A61P15/12GK1395580SQ01803827
公開日2003年2月5日 申請日期2001年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月18日
發(fā)明者S·莫塞爾曼, P·J·斯派克范德爾 申請人:阿克佐諾貝爾公司
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