專利名稱：蝦白斑綜合征病毒抗原蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從白斑綜合征病毒中獲得的抗原蛋白、這些蛋白在疫苗中的應(yīng)用、以這些蛋白為基礎(chǔ)的疫苗、抗這些蛋白的抗體、這些抗體在疫苗中的應(yīng)用、編碼它們的核酸序列以及所述蛋白在生產(chǎn)預(yù)防和/或治療甲殼類動(dòng)物白斑綜合征疫苗中的用途；本發(fā)明還涉及載體疫苗和診斷試劑盒。
白斑綜合征病毒(WSSV)是遍及世界的蝦中的一種主要的病毒性疾病。該病毒在甲殼類動(dòng)物中具有廣泛的宿主范圍(Flegel，1997)，同時(shí)各分離株之間幾乎沒有遺傳變異(Lo等，1999)。電子顯微鏡(EM)研究顯示該病毒體有被膜，外形為桿狀到子彈形，長約275nm，寬約120nm，在一端有一尾狀附器。核殼，即病毒失去被膜后，具有網(wǎng)格狀外觀，大小約300nm×70nm(Wongteerasupaya等，1995)。此種病毒體形態(tài)、其核定位及其形態(tài)發(fā)生使人聯(lián)想起昆蟲中的桿狀病毒(Durand等，1997)。最初，WSSV被分類為桿狀病毒科中的未指定成員(Francki等，1991)，因此該病毒曾被稱為系統(tǒng)性外胚層中胚層桿狀病毒(SEMBV)或白斑桿狀病毒(WSBV)?，F(xiàn)在由于缺乏分子信息，WSSV不再被納入此科(Murphy等，1995)。從限制性內(nèi)切核酸酶分析得知，其雙股病毒DNA大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過200kb(Yang等，1997)。
在養(yǎng)殖的蝦中WSSV的爆發(fā)流行引起蝦大量死亡。該疾病的特征是蝦的頭胸甲、附器和外皮出現(xiàn)白斑，肝胰臟顏色變紅。受感染的蝦顯示出昏睡的征象和食物消耗的迅速減少，3至5天之內(nèi)，這些蝦就會(huì)死亡。一次WSSV的爆發(fā)流行導(dǎo)致蝦養(yǎng)殖業(yè)的重大損失，因而非常需要一種疫苗能保護(hù)蝦免受WSSV感染。對(duì)能用于這樣的疫苗的主要的WSSV蛋白的鑒別和表征會(huì)提供開發(fā)此疫苗的方法。
已經(jīng)分離并鑒定了vp19和vp13兩個(gè)基因，分別編碼蛋白VP13(13kDa)和VP19(19kDa)，命名是根據(jù)它們?cè)诳捡R斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠上的遷移率估計(jì)出的分子量。VP19是一種包膜蛋白，而VP13是一種核殼蛋白。Vp19的開放閱讀框架含有366個(gè)核苷酸，如SEQ ID NO1所示，以及推導(dǎo)出的由121個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列(另如SEQ ID NO2所示)。Vp13的開放閱讀框架含有至少186個(gè)核苷酸，如SEQ ID NO3所示。此ORF編碼一種核殼蛋白VP13，含有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。已發(fā)現(xiàn)VP13的兩個(gè)變異體，其中之一的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，而長一些的變異體的氨基酸序列如SEQ ID NO5所示。本發(fā)明提供一種方法制備重組疫苗以保護(hù)甲殼類動(dòng)物免受WSSV的感染。已經(jīng)鑒別并表征的WSSV的包膜蛋白VP19和核殼蛋白VP13被發(fā)現(xiàn)適合用于生產(chǎn)亞單位疫苗以保護(hù)甲殼類動(dòng)物免受WSSV的感染。本發(fā)明的核苷酸序列的克隆和表征提供利用重組技術(shù)生產(chǎn)這些WSSV蛋白。這樣就能得到WSSV蛋白，而基本上不含有其他WSSV蛋白。該分離的WSSV蛋白能用于生產(chǎn)亞單位疫苗以保護(hù)甲殼類動(dòng)物免受WSSV的感染。
本發(fā)明的蛋白在標(biāo)記疫苗中特別有用。此疫苗可含有例如，僅VP13和/或VP19。
或者，編碼WSSV蛋白的核苷酸序列能用于生產(chǎn)載體疫苗以保護(hù)甲殼類動(dòng)物免受WSSV的感染。
此外，本發(fā)明的核苷酸序列能用于診斷目的，如檢測水域內(nèi)WSSV的存在。
另外，本發(fā)明的WSSV蛋白能用于制備WSSV特異性抗體。這些抗體能用于生產(chǎn)WSSV疫苗，用于對(duì)甲殼類動(dòng)物的被動(dòng)免疫。這些抗體還能用于診斷目的，如檢測甲殼類動(dòng)物或水域中的WSSV。
因此，本發(fā)明的首要的實(shí)施方案是提供一種WSSV的抗原蛋白，其適合免疫甲殼類動(dòng)物以對(duì)抗WSSV，該蛋白的氨基酸序列與如SEQID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列以及所述蛋白的免疫原性片段至少70％同源。
以優(yōu)選形式，該實(shí)施方案涉及這樣的WSSV蛋白，其序列與如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列以及所述蛋白的免疫原性片段至少80％同源，優(yōu)選90％同源，更優(yōu)選95％同源。
更優(yōu)選同源程度達(dá)98％，或甚至100％。
蛋白質(zhì)同源程度可用計(jì)算機(jī)程序“BLAST 2 SEQUENCES”確定，通過選擇亞程序“BLASTP”，其可從以下網(wǎng)址找到www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2sea/bl2.html.
此程序的一項(xiàng)參考文獻(xiàn)是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS微生物通訊(FEMS Microbiol.Letters)174247-250(1999)。所用模型“blosum62”，所用參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)開放間隙11，延伸間隙1，間隙x_下降值50。
可以理解，對(duì)于此處包括的特定蛋白，在各WSSV株之間可存在自然變異體。這些變異可顯示為全部序列中的氨基酸差異或所述序列中的氨基酸的缺失、置換、插入、倒置或添加。氨基酸的置換基本上不會(huì)改變生物學(xué)和免疫學(xué)活性，例如已由Neurath等在“The Proteins”Academic Press New York(1979)中所述。相關(guān)氨基酸之間的替代或在進(jìn)化中頻繁發(fā)生的替代，特別是Ser/Ala，Ser/Gly，Asp/Gly，Asp/Asn，Ile/Val(參見Dayhof，M.D.，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜(Atlasof protein sequence and structure)，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，vol.5，suppl.3)。其他氨基酸的置換包括Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Thr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Leu/Ile，Leu/Val和Ala/Glu?；诖诵畔ⅲ琇ipman和Pearson建立了一種比較蛋白質(zhì)的快速而敏感的方法(科學(xué)(Science)，227，1435-1441，1985)，并確定同源蛋白之間的功能相似性。本發(fā)明實(shí)施方案中的此類氨基酸置換，以及具有缺失和/或插入的變異體，只要其結(jié)果蛋白的抗原性或免疫原性特性基本上不受影響，都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
這就解釋了為什么根據(jù)本發(fā)明的WSSV蛋白，當(dāng)分離自不同區(qū)域分離株時(shí)，會(huì)有約70％的同源程度，而仍舊代表同樣的蛋白，具有同樣的免疫學(xué)特征。
根據(jù)本發(fā)明，那些特定蛋白氨基酸序列的變異，其仍舊提供一種能誘導(dǎo)對(duì)WSSV感染或至少對(duì)該感染的臨床表現(xiàn)的免疫反應(yīng)的蛋白，被認(rèn)為是“基本上不影響所述蛋白的抗原性或免疫原性特性”。
當(dāng)一種蛋白用作例如疫苗目的或使抗體產(chǎn)生，其實(shí)并不必要使用完整的蛋白。也有可能使用該蛋白的一個(gè)片段，單獨(dú)或偶聯(lián)至一個(gè)載體，例如KLH，其有能力誘導(dǎo)對(duì)該蛋白的免疫反應(yīng)，即所謂免疫原性片段。一個(gè)“免疫原性片段“被理解為全長蛋白的一個(gè)片段，其仍舊保持在脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力，即包含B-或T-細(xì)胞表位。脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)產(chǎn)生的抗體非常適合于作為蝦的被動(dòng)接種方式?，F(xiàn)在，有多種技術(shù)可以容易地鑒定編碼抗原片段(決定子)的DNA片段。由Geysen等人描述的方法(專利申請(qǐng)WO84/03564，專利申請(qǐng)WO86/06487，美國專利號(hào)4,833,092，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl Acad.Sci.)813998-4002(1984)，免疫學(xué)方法雜志(J.Imm.Meth.)102，259-274(1987))，即所謂PEPSCAN方法是一種易于實(shí)施，快速而行之有效的檢測表位的方法；蛋白的免疫學(xué)關(guān)鍵的區(qū)域。該方法的使用遍及世界，在本領(lǐng)域廣為人知。這一(經(jīng)驗(yàn)性的)方法特別適合于檢測B-細(xì)胞表位。另外，如果給出編碼任何蛋白的基因序列，計(jì)算機(jī)程序就能在其序列和/或結(jié)構(gòu)與現(xiàn)在已知的表位之間的吻合程度的基礎(chǔ)之上，指定特定的蛋白片段作為免疫學(xué)關(guān)鍵的表位。這些區(qū)域的確定是基于結(jié)合根據(jù)Hopp和Woods所述的親水性標(biāo)準(zhǔn)(美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl Acad.Sci.)783824-3828(1981))，和按照Chou和Fasman所述的二級(jí)結(jié)構(gòu)方面(酶學(xué)進(jìn)展(Advances inEnzymology)4745-148(1987)和美國專利4,554,101)。同樣地，T-細(xì)胞表位能在Berzofsky兩親性標(biāo)準(zhǔn)的幫助下通過計(jì)算機(jī)從序列推測(科學(xué)(Science)235，1059-1062(1987)和美國專利申請(qǐng)NTISUS07/005,885)。簡縮的概述見Shan Lu關(guān)于通用原則Tibtech9238-242(1991)，Good等關(guān)于瘧疾表位科學(xué)(Science)2351059-1062(1987)，Lu的綜述疫苗(Vaccine)103-7(1992)，Berzowsky關(guān)于HIV-表位FASEB雜志(The FASEB Journal 52412-2418(1991)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及能保護(hù)蝦免受WSSV感染的疫苗，其含有能與上述根據(jù)本發(fā)明的蛋白或免疫原性片段反應(yīng)的抗體，以及一種藥學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及能保護(hù)蝦免受WSSV感染的疫苗，其含有上述根據(jù)本發(fā)明的蛋白或其免疫原性片段，以及一種藥學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的抗原蛋白或其免疫原性片段的核酸序列。本發(fā)明的此實(shí)施方案更特別涉及編碼含有如SEQ ID NO.2、4或5所示氨基酸序列的抗原蛋白或其免疫原性片段的核酸序列。、優(yōu)選核酸序列具有或含有如SEQ ID NO 1或3所示的序列。各核苷酸序列始于ATG密碼子，編碼推出的氨基酸序列的第一個(gè)M殘基，直到編碼C-末端氨基酸殘基的密碼子。必須明白，為了本發(fā)明的目的，具有與如SEQ ID NO1或SEQ ID NO 3所示序列同源的序列的核酸序列也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的序列同源性被認(rèn)為至少是70％，優(yōu)選75％，更優(yōu)選80％，甚至更優(yōu)選85％。高度優(yōu)選與如SEQID NO1或SEQ ID NO 3所示序列至少90％同源，更優(yōu)選95％的核酸序列。
同源性達(dá)98％或甚至100％則更優(yōu)選。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，序列同源性通過比較所感興趣的核苷酸序列與如SEQ ID NO1或3所示序列的相應(yīng)部分來確定。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，序列同源性的百分比定義為被比較序列間相同核苷酸的百分比。
核苷酸同源性程度可用計(jì)算機(jī)程序“BLAST 2 SEQUENCES”確定，通過選擇亞程序“BLASTN”，其可從以下網(wǎng)址找到www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.
此程序的一項(xiàng)參考文獻(xiàn)是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS微生物通訊(FEMS Microbiol.Letters)174247-250(1999)。所用參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)匹配賞+1，失配罰-2。開放間隙5，延伸間隙2，間隙x_下降值50。
根據(jù)本發(fā)明具有序列同源性的核酸序列可用如SEQ ID NO 1或3所示序列之一，或用此序列的片段，用常規(guī)克隆和雜交技術(shù)從密切相關(guān)的WSSV株中容易地分離。為實(shí)現(xiàn)此目的，雜交在嚴(yán)格的，優(yōu)選高度嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。嚴(yán)格的雜交條件理解為洗脫條件為1×SSC，0.1％SDS，在65℃下；高度嚴(yán)格的條件指洗脫條件中，SSC的濃度減低至0.3×SSC。為了需要排除錯(cuò)認(rèn)的堿基，該特定信息不應(yīng)被如此狹窄地詮釋。在此公開的特異性的序列能易于用來從其他株中分離同源的核苷酸序列。
與如SEQ ID NO 1或3所示序列之一具有序列同源性的核酸序列編碼具有與如SEQ ID No.2、4或5所示氨基酸序列之一相比包含變更的氨基酸序列的蛋白，其中所述變更基本上不影響所述蛋白的抗原性或免疫原特性。
根據(jù)本發(fā)明的WSSV蛋白能通過標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)分離和純化方法獲得，或通過普通的重組技術(shù)制備。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列特別適合用于WSSV蛋白的重組生產(chǎn)，產(chǎn)物基本上不含其他WSSV蛋白。該核苷酸序列被引入一個(gè)能表達(dá)蛋白的適合的表達(dá)載體，用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞，在適合的介質(zhì)中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。適合的表達(dá)載體特別是質(zhì)粒、粘粒、病毒和YAC(酵母人工染色體)，其包含對(duì)于復(fù)制和表達(dá)必要的控制區(qū)域。表達(dá)載體能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。適合的宿主細(xì)胞是，例如，細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這樣的表達(dá)技術(shù)在本領(lǐng)域廣為人知(Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(Molecular Cloninga Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1989；King andPossee，1992)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列能用于生產(chǎn)載體疫苗以接種甲殼類動(dòng)物對(duì)抗WSSV感染。載體疫苗被理解為是這樣一種疫苗，其中活的、減毒的細(xì)菌或病毒經(jīng)過修飾，以致其含有插入其遺傳物質(zhì)中的一或多個(gè)異源性的核苷酸序列。這些所謂的載體細(xì)菌或病毒能共表達(dá)插入序列編碼的異源性蛋白。因此，在第四方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療甲殼類動(dòng)物中白斑綜合征的載體疫苗，該疫苗含有活的減毒細(xì)菌或病毒和藥學(xué)可接受的載體，其中所述細(xì)菌或病毒經(jīng)過修飾從而在其遺傳物質(zhì)中含有一或多個(gè)本發(fā)明的核苷酸序列。用此LRCs感染的蝦會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，不僅針對(duì)載體的免疫原，而且針對(duì)其遺傳密碼又克隆至LRC內(nèi)的蛋白的免疫原性部分。
作為細(xì)菌LRC的一個(gè)例子，如鰻弧菌(Vibrio anguillarum)之類在本領(lǐng)域已知的細(xì)菌很吸引人使用。(Singer，J.T.等，海洋生物技術(shù)的新發(fā)展(New Developments in Marine Biotechnology)，p.303-306，Eds.Le Gal and Halvorson，Plenum Press，New York，1998)。
LRC還可用作轉(zhuǎn)運(yùn)核酸序列到靶細(xì)胞中的一種途徑。適合此任務(wù)的病毒是，例如黃頭病毒和鰓相關(guān)病毒，兩者均屬于冠狀病毒科。(參見例如Spann，K.M.等，Dis Aquat.，Org.42221-225(2000)，和Cowley，J.A.等，Dis Aquat.Org.36153-157(1999)關(guān)于病毒，或Enjuanes，L.等，p.28-31 of the Proceedings of the ESVV，Brescia，Italia，27-30 August 2000關(guān)于活的重組載體冠狀病毒)。
體內(nèi)同源重組的技術(shù)，在本領(lǐng)域廣為人知，能用于將重組核酸序列引入所選細(xì)菌或病毒的基因組，能誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的插入核酸序列在宿主動(dòng)物中的表達(dá)。
另一種可供選擇的有效的接種方法是直接用編碼有關(guān)抗原的DNA接種。用編碼蛋白的DNA直接接種在許多不同蛋白中取得成功。(綜述于如Donnelly等，The Immunologist 220-26(1993))。這種接種的方法對(duì)于接種蝦免受WSSV感染是有吸引力的。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及疫苗，其含有藥學(xué)可接受載體和編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的核酸序列或其免疫原性片段，或包含該核酸序列的DNA片段，例如質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及將根據(jù)本發(fā)明的蛋白用于疫苗。
本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的蛋白在生產(chǎn)用于對(duì)抗WSSV感染的疫苗中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗能用于保護(hù)甲殼類動(dòng)物，如蝦，包括但不限于對(duì)蝦科(Penaeidae family)的成員，例如P.monodon、P.vannamei、P.chinensis、墨吉對(duì)蝦(P.merguensis)或Metapeaeus spp.；游泳蝦類，包括但不限于長臂蝦科(Palaemonidae family)的成員，例如沼蝦屬(Macrobrachium spp.)、長臂蝦屬(Palaemon spp.)、；龍蝦，包括但不限于龍蝦科(Palinuridae family)和海螯蝦科(Nephropidaefamily)的成員，例如Calinectes spp.、龍蝦屬(Palinurus spp.)、龍蝦屬(Panuliris spp.)、螯龍蝦屬(Homarus spp.)；淡水螯蝦，包括但不限于螯蝦科(Astacidae family)的成員，其例子是螯蝦屬(Astacusspp.)、Procambarus spp.、和Oronectes spp.；和蟹，包括但不限于黃道蟹科(Cancridae family)和梭子蟹科(Portuidae family)的成員，其例子是黃道蟹屬(Cancer spp.)、藍(lán)泳蟹屬(Callinectes spp.)、Carcinusspp.、和梭子蟹屬(Portunus spp.)。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗能用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)和如在Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th版(1990)，eds.A.R.Gennaro等，第72章，pp.1389-1404，Philadelphia College ofPharmacy and Science中描述的技術(shù)制備。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗含有有效量的根據(jù)本發(fā)明的一或多種蛋白、載體細(xì)菌或病毒和藥學(xué)可接受載體。此處所用的術(shù)語“有效”定義為其量足夠誘導(dǎo)甲殼類動(dòng)物的保護(hù)性反應(yīng)。載體或蛋白的量取決于載體或蛋白的類型、給藥途徑、給藥時(shí)間、接種物種以及年齡、一般健康狀況、溫度和飲食。
總的說來，每只動(dòng)物可用0.01至1000μg蛋白的劑量，優(yōu)選0.5至500μg，更優(yōu)選每只動(dòng)物1至100μg蛋白。若是病毒載體疫苗，總的說來，使用每只動(dòng)物10^3至10^8pfu(噬菌斑形成單位)的劑量可非常有效。細(xì)菌載體疫苗可按10^3至10^8個(gè)細(xì)菌的劑量有效給予。
對(duì)于DNA接種，DNA的量在0.1和10μg DNA之間/每只動(dòng)物是非常適用的劑量。
適合用于根據(jù)本發(fā)明疫苗的藥學(xué)可接受載體是無菌的和生理相容的，例如無菌水、生理鹽水、含水緩沖液如堿金屬磷酸鹽(如PBS)、醇類、多羥基化合物類等等。另外根據(jù)本發(fā)明的疫苗可含有其他添加劑，如輔助劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑和其他。
適合的輔助劑包括但不限于鋁鹽或凝膠、卡波姆、非離子嵌斷共聚物、生育酚、單磷酰脂A、胞壁酰二肽、油乳濁液、葡聚糖、細(xì)胞因子、皂苷類如Quil A，以及諸如此類。加入輔助劑的量取決于輔助劑本身的性質(zhì)。
適合用于根據(jù)本發(fā)明疫苗的穩(wěn)定劑包括但不限于碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖)、蛋白質(zhì)(如白蛋白或酪蛋白)和緩沖液(像堿性磷酸鹽)。
適合的防腐劑特別包括乙基汞硫代水楊酸鈉和硫柳汞。
根據(jù)本發(fā)明的疫苗可通過注射、浸漬、浸泡、噴霧或氣霧劑、或經(jīng)口服給藥。優(yōu)選疫苗通過浸漬或口服對(duì)甲殼類動(dòng)物給藥，尤其對(duì)于商業(yè)化的水產(chǎn)養(yǎng)殖場。
為了口服給藥，疫苗優(yōu)選與適合口服給藥的載體混合，即纖維素、食物或可代謝物質(zhì)(如α-纖維素)或各種來源于植物或動(dòng)物的油類。特別優(yōu)選用于口服遞送根據(jù)本發(fā)明的疫苗的食物載體是能包裹疫苗的活飼生物。獲得此目的的一個(gè)非常適合的途徑是用例如昆蟲細(xì)胞(根據(jù)本發(fā)明的蛋白在其中表達(dá))來喂養(yǎng)活飼生物。適合的活飼生物包括但不限于類似浮游生物的非選擇性濾食動(dòng)物，優(yōu)選輪形動(dòng)物成員，Artemia等等。高度優(yōu)選海水蝦Artemia屬。
使用本領(lǐng)域從業(yè)者可用的普通技術(shù)可將根據(jù)本發(fā)明的蛋白用于抗體的產(chǎn)生。優(yōu)選該蛋白用于產(chǎn)生特異性單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體能按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。用蛋白免疫動(dòng)物(如小鼠)的方法以及篩選產(chǎn)生蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤的方法在本領(lǐng)域廣為人知(參見，例如Cligan等(eds)，免疫學(xué)當(dāng)前的方案(Current protocolsin Immunology)1992；Kohler和Milstein，自然(Nature)256，pp.495-497，1975；Steenbakkers等，分子生物學(xué)報(bào)告(Mol.Biol.Rep.)19，pp.125-134，1994)。獲得的抗體可在診斷學(xué)中應(yīng)用，以檢測水域中的WSSV或檢測甲殼類動(dòng)物中WSSV的存在。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列也適用于診斷學(xué)。所述序列或其片段能用在如PCR技術(shù)中，以檢測水域，或甲殼類動(dòng)物中WSSV的存在。
檢測WSSV的診斷性試驗(yàn)是，例如基于從所要測試動(dòng)物分離的DNA與特異性探針的反應(yīng)，或者是例如PCR試驗(yàn)，該試驗(yàn)基于根據(jù)本發(fā)明蛋白的編碼序列，或基于與那些編碼序列互補(bǔ)的核酸序列。如果對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的WSSV蛋白特異性的核酸分子存在于該動(dòng)物，這些核酸分子會(huì)，例如與特異性的PCR引物特異性地結(jié)合，隨后在PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增。該P(yáng)CR反應(yīng)產(chǎn)物繼而可容易地在DNA凝膠電泳中檢出。PCR反應(yīng)在本領(lǐng)域廣為人知(參見下面參考文獻(xiàn))。核酸分子最容易從所要測試動(dòng)物的肝胰臟中分離。標(biāo)準(zhǔn)的PCR教科書給出了方法以確定與根據(jù)本發(fā)明的蛋白特異性的核酸分子進(jìn)行的選擇性的PCR反應(yīng)中所用引物的長度。經(jīng)常使用含有至少12個(gè)核苷酸的核苷酸序列的引物，但含超過15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選18個(gè)核苷酸的引物更有選擇性。尤其是長度至少20個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少30個(gè)核苷酸的引物是非常通用的。PCR技術(shù)被廣泛描述于(Dieffenbach & Dreksler；PCR引物，實(shí)驗(yàn)室指南(PCR primers，a laboratory manual.)ISBN0-87969-447-5(1995))。
因此編碼根據(jù)本發(fā)明WSSV蛋白的核酸分子或那些核酸分子的部分結(jié)構(gòu)也是本發(fā)明的一部分，這些核酸分子部分的長度至少為12、優(yōu)選15、更優(yōu)選18、甚至更優(yōu)選20、22、25、30、35或40個(gè)核苷酸(按照上述優(yōu)選次序)，其中核酸分子或其部分與如SEQ ID NO1或3所示的核酸序列，或與如SEQ ID NO1或3所示的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列有至少70％的同源性。這樣的核酸分子能，例如用作PCR反應(yīng)中的引物，以提高編碼根據(jù)本發(fā)明蛋白的核酸的量。這使得特異性核苷酸序列的快速擴(kuò)增作為診斷工具，用于例如如上指出的檢測組織中的WSSV。
另一項(xiàng)以核酸為基礎(chǔ)的試驗(yàn)是基于用放射性標(biāo)記或顏色標(biāo)記的蛋白特異性的cDNA片段進(jìn)行的經(jīng)典雜交。PCR反應(yīng)和雜交反應(yīng)均在本領(lǐng)域廣為人知，例如描述于Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(Molecular cloninga laboratory manual.)ISBN 0-87969-309-6)。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于檢測WSSV的診斷試劑盒，其中，試驗(yàn)含有與如SEQ ID NO1或3所示的核酸序列至少70％同源的核酸序列，或與該核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或其片段，長度為至少12、優(yōu)選15、更優(yōu)選18個(gè)核苷酸。
基于檢測WSSV蛋白的抗原物質(zhì)因而適合于檢測WSSV感染的診斷試驗(yàn)也可以是，例如標(biāo)準(zhǔn)的夾心式(三明治)-ELISA試驗(yàn)。在此試驗(yàn)的一個(gè)例子中，ELISA板孔的壁用針對(duì)根據(jù)本發(fā)明蛋白或其免疫原性片段的抗體包被，與待測物質(zhì)共溫育后，將標(biāo)記的抗-WSSV抗體加入孔中。繼而一種呈色反應(yīng)顯示源自WSSV的抗原物質(zhì)的存在。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及檢測WSSV的診斷試驗(yàn)，其特征在于所述試驗(yàn)包含對(duì)抗根據(jù)本發(fā)明蛋白或其免疫原性片段的抗體。
因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種診斷試劑盒，它包含根據(jù)本發(fā)明的一或多個(gè)核苷酸序列或抗體。針對(duì)根據(jù)本發(fā)明蛋白產(chǎn)生的抗體能進(jìn)一步用于生產(chǎn)抗體疫苗，對(duì)甲殼類動(dòng)物作被動(dòng)免疫。因此，在進(jìn)一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于對(duì)抗WSSV的被動(dòng)免疫的疫苗，其中疫苗含有針對(duì)包含如SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白產(chǎn)生的抗體。如上所述，這樣一種疫苗能用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。優(yōu)選制備口服給藥的抗體疫苗，其中抗體與一種可食用的載體如魚食混合。更優(yōu)選，疫苗由在雞蛋中制備的抗體(IgY抗體)制備。
大規(guī)模生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗體的方法在本領(lǐng)域也是熟知的。此類方法依賴在絲狀噬菌體中克隆編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的遺傳信息(的片段)，作噬菌體展示。此類技術(shù)在http//aximt1.imt.uni-marburg.de/～rek/aepphage.html.中“絲狀噬菌體展示”下的“抗體工程頁”和由Cortese，R.等，(1994)在生物技術(shù)趨勢(Trends Biotechn.)12262-267，Clackson，T.& Wells，J.A.(1994)在生物技術(shù)趨勢(Trends Biotechn.)12173-183，Marks，J.D.等，(1992)在生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26716007-16010，Winter，G.等，(1994)在免疫學(xué)年鑒(Annu.Rev.Immunol.)12433-455，以及Little，M.等(1994)在生物技術(shù)進(jìn)展(Biotechn.Adv.)12539-555發(fā)表的綜述文章中(缺席)描述。隨后用噬菌體篩選表達(dá)camelid重鏈抗體的camelid表達(dá)文庫。(Muyldermans，S.和Lauwereys，M.，Journ.分子識(shí)別(Molec.Recogn.)12131-140(1999)和Ghahroudi，M.A.等，F(xiàn)EBS通訊(FEBS Letters)414512-526(1997))。來自表達(dá)所需抗體文庫的細(xì)胞被復(fù)制，隨后用于抗體的大規(guī)模表達(dá)。
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實(shí)施例實(shí)施例1用WSSV蛋白VP19接種Penaeus monodon。
病毒原種的產(chǎn)生在螯蝦Procambarus clarkii中通過肌肉注射純化的WSSV產(chǎn)生WSSV病毒原種。為了確定導(dǎo)致黑虎蝦P.monodon 90-100％死亡率的稀釋度，用大約1克重的動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)的病毒滴定。在330mM NaCl中按步驟稀釋病毒原種，從1×105至5×1011倍，對(duì)每一稀釋度，取10μl肌肉注射至10只蝦。用330mM NaCl注射的蝦，作為感染的陰性對(duì)照。所有作為陰性對(duì)照的蝦(未顯示)和那些接受了5×1011病毒稀釋度的蝦存活，而在所有用較低病毒稀釋度注射的組中都出現(xiàn)病毒感染引起的死亡。。給予1×105和1×107病毒稀釋度，結(jié)果是在20天內(nèi)幾乎100％的死亡率。當(dāng)用1×108和5×109的病毒稀釋度時(shí)，觀察到死亡的延遲。1×108稀釋度導(dǎo)致90％最終死亡率，但死亡時(shí)間延遲，歷經(jīng)40天。用1×107、1×108和5×109稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生相同的結(jié)果。選擇1×108稀釋度作為下一步實(shí)驗(yàn)的病毒劑量，因?yàn)轭A(yù)計(jì)這一條件在降低死亡率方面會(huì)對(duì)中和作用產(chǎn)生最佳反應(yīng)。
WSSV蛋白VP19和VP13在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)用桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)VP19和VP13 ORF。用Bac-to-Bac體系(GIBCO BRL)在昆蟲細(xì)胞中從桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子生成重組桿狀病毒(AcMNPV)，表達(dá)推定的WSSV病毒體蛋白VP19和VP13。從p10啟動(dòng)子產(chǎn)生重組病毒，表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，從桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子產(chǎn)生各個(gè)WSSV蛋白。
用AcMNPV-WSSVvp19，和AcMNPV-WSSVvp13感染Sf21昆蟲細(xì)胞，MOI為5，感染后72小時(shí)收集細(xì)胞。在15％SDS-PAGE凝膠中分析受感染Sf21細(xì)胞的提取液(圖1)。可觀察到VP13的清晰的表達(dá)產(chǎn)物(圖1，泳道5，此處標(biāo)為VP15)，其具有與其在WSSV病毒體中真正的相應(yīng)物(圖1，泳道2)相同的電泳遷移率?？捎^察到VP19的表達(dá)產(chǎn)物(不太清晰，但清楚可見)(圖1，泳道3)。因此，用針對(duì)純化WSSV產(chǎn)生的多克隆抗血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。這一分析顯示，VP19在預(yù)期位置表達(dá)(圖1，泳道4)，因此vp19 ORF編碼一種WSSV病毒體蛋白。
接種和攻擊按照表1的計(jì)劃建立實(shí)驗(yàn)。使用四個(gè)實(shí)驗(yàn)組；兩個(gè)對(duì)照組，陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，一組接受VP19，一組接受GFP。在GFP組，蝦接受與給予VP19組相同的混合物，但VP19除外。
表1.接種實(shí)驗(yàn)的組設(shè)計(jì)
所有的組注射20μl它們各自的溶液。對(duì)于VP19組和GFP組，接種和加強(qiáng)均給予總量15μg的蛋白。使用330mM NaCl溶液以稀釋蛋白溶液，以及病毒對(duì)照。GFP是綠色熒光蛋白。在GFP組，蝦接受與給予VP19組相同的混合物，但VP19除外。
接種后5天，給予蝦一次加強(qiáng)注射，2天后再注射WSSV。
攻擊后，對(duì)蝦進(jìn)行一周監(jiān)測，用ELISA試驗(yàn)和電子顯微鏡檢查死蝦中WSSV的存在。組1，陰性對(duì)照中，沒有蝦死于WSSV。組2中的蝦在一天半后開始死于WSSV感染，5天后達(dá)到100％的死亡率。接種組3中首批動(dòng)物在一天半后死亡，但與組2相比持續(xù)較慢。組3在攻擊后6天達(dá)到100％的死亡率，顯示了與陽性對(duì)照相比，死亡率的明顯延遲。這證明用WSSV蛋白VP19接種P.monodon蝦，對(duì)用WSSV攻擊后蝦的存活率具有正效應(yīng)。


圖1.泳道1LMW標(biāo)記(Amersham pharmacia biotech)，2純化WSSV的SDS-PAGE凝膠，3超表達(dá)VP19的SDS-PAGE凝膠，4超表達(dá)VP19用抗-WSSV進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡，5超表達(dá)VP13的SDS-PAGE凝膠(此處標(biāo)為VP15)。
圖2.這一附圖顯示接種對(duì)于用WSSV攻擊后蝦的死亡率的效應(yīng)水平-*-＝VP19疫苗，-◆-＝陰性對(duì)照，-□-＝陽性對(duì)照，-▲-＝GFP對(duì)照。
序列表<110>Akzo Nobel N.V.<120>蝦白斑綜合征病毒抗原蛋白及其用途<130>2000558ep/pd<140><141><160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>366<212>DNA<213>白斑綜合征病毒<220><221>CDS<222>(1)..(366)<400>1atg gcc acc acg act aac act ctt cct ttc ggc agg acc gga gcc cag 48Met Ala Thr Thr Thr Asn Thr Leu Pro Phe G1y Arg Thr Gly Ala Gln1 5 10 15gcc gct ggc cct tct tac acc atg gaa gat ctt gaa ggc tcc atg tct 96Ala Ala Gly Pro Ser Tyr Thr Met Glu Asp Leu Glu Gly Ser Met Ser20 25 30atg gct cgc atg ggt ctc ttt ttg atc gtt gct atc tca att ggt atc 144Met Ala Arg Met Gly Leu Phe Leu Ile Val Ala Ile Ser Ile Gly Ile35 40 45ctc gtc ctg gcc gtc atg aat gta tgg atg gga cca aag aag gac agc 192Leu Val Leu Ala Val Met Asn Val Trp Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser50 55 60gat tct gac act gat aag gac acc gtt gat gat gac gac act gcc aac 240Asp Ser Asp Thr Asp Lys Asp Thr Val Asp Asp Asp Asp Thr A1a Asn65 70 75 80gat aac gat gat gag gac aaa tat aag aac agg acc agg gat atg atg 288Asp Asn Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Arg Asp Met Met85 90 95ctt ctg gct ggg tcc gct ctt ctg ttc ctc gtt tcc gcc gcc acc gtt 336Leu Leu Ala Gly Ser Ala Leu Leu Phe Leu Val Ser Ala Ala Thr Val100 105 110ttt atg tct tac ccc aag agg agg cag taa 366Phe Met Ser Tyr Pro Lys Arg Arg Gln115 120<210>2<211>121<212>PRT<213>白斑綜合征病毒<400>2Met Ala Thr Thr Thr Asn Thr Leu Pro Phe Gly Arg Thr Gly Ala Gln1 5 10 15Ala Ala Gly Pro Ser Tyr Thr Met Glu Asp Leu Glu Gly Ser Met Ser20 25 30Met Ala Arg Met Gly Leu Phe Leu Ile Val Ala Ile Ser Ile Gly Ile35 40 45Leu Val Leu Ala Val Met Asn Val Trp Met Gly Pro Lys Lys Asp Ser50 55 60Asp Ser Asp Thr Asp Lys Asp Thr Val Asp Asp Asp Asp Thr Ala Asn65 70 75 80Asp Asn Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Arg Asp Met Met85 90 95Leu Leu Ala Gly Ser Ala Leu Leu Phe Leu Val Ser Ala Ala Thr Val100 105 110Phe Met Ser Tyr Pro Lys Arg Arg Gln115 120<210>3<211>186<212>DNA<213>白斑綜合征病毒<220><221>CDS<222>(1)..(186)<400>3atg gtt gcc cga agc tcc aag acc aaa tcc cgc cgt gga agc aag aag 48Met Val Ala Arg Ser Ser Lys Thr Lys Ser Arg Arg Gly Ser Lys Lys1 5 10 15agg tcc acc act gct gga cgc atc tcc aag cgg agg agc cca tca atg 96Arg Ser Thr Thr Ala Gly Arg Ile Ser Lys Arg Arg Ser Pro Ser Met20 25 30aag aag cgt gca gga aag aag agc tcc act gtc cgt cgc cgt tcc tca 144Lys Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ser Ser Thr Val Arg Arg Arg Ser Ser35 40 45aag agc gga aag aag tct gga gcc cgc aag tca agg cgt taa 186Lys Ser Gly Lys Lys Ser Gly Ala Arg Lys Ser Arg Arg50 55 60<210>4<211>61<212>PRT<213>白斑綜合征病毒<400>4Met Val Ala Arg Ser Ser Lys Thr Lys Ser Arg Arg Gly Ser Lys Lys1 5 10 15Arg Ser Thr Thr Ala Gly Arg Ile Ser Lys Arg Arg Ser Pro Ser Met20 25 30Lys Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ser Ser Thr Val Arg Arg Arg Ser Ser35 40 45Lys Ser Gly Lys Lys Ser Gly Ala Arg Lys Ser Arg Arg50 55 60<210>5<211>80<212>PRT<213>白斑綜合征病毒<400>5Met Thr Lys Tyr Pro Glu Asn Lys Arg Leu Leu Ser Arg Asn Lys Glu1 5 10 15Thr Leu Lys Met Val Ala Arg Ser Ser Lys Thr Lys Ser Arg Arg Gly20 25 30Ser Lys Lys Arg Ser Thr Thr Ala Gly Arg Ile Ser Lys Arg Arg Ser35 40 45Pro Ser Met Lys Lys Arg Ala Gly Lys Lys Ser Ser Thr Val Arg Arg50 55 60Arg Ser Ser Lys Ser Gly Lys Lys Ser Gly Ala Arg Lys Ser Arg Arg65 70 75 80
權(quán)利要求
1.適合免疫甲殼類動(dòng)物對(duì)抗WSSV的WSSV抗原蛋白，或所述抗原蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述抗原蛋白具有與如SEQ IDNO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗原蛋白，或所述抗原蛋白的免疫原性片段，其特征在于其具有與如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ IDNO5所示的氨基酸序列至少80％，優(yōu)選90％，更優(yōu)選95％同源的序列。
3.能保護(hù)蝦免受WSSV感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白或其免疫原性片段，和藥學(xué)可接受載體。
4.編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗原蛋白，或所述蛋白的免疫原性片段的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的核酸序列，其特征在于所述核酸序列包含如SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示的序列。
6.用于預(yù)防或治療甲殼類動(dòng)物中白斑綜合征的載體疫苗，其特征在于所述疫苗包含活的減毒細(xì)菌或活的減毒病毒，所述細(xì)菌或病毒在其基因組中包含根據(jù)權(quán)利要求4或5的異源核酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗原蛋白用于疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗原蛋白在生產(chǎn)對(duì)抗WSSV感染的疫苗中的用途。
9.針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白產(chǎn)生的抗體。
10.包含藥學(xué)可接受載體和至少一種根據(jù)權(quán)利要求9的抗體的疫苗。
11.包含藥學(xué)可接受載體和根據(jù)權(quán)利要求4或5的核酸序列的疫苗。
12.檢測WSSV的診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含與如SEQ ID NO1或3所示核酸序列至少70％同源的核酸序列，或與該核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或其片段，片段長度為至少12，優(yōu)選15，更優(yōu)選18個(gè)核苷酸；根據(jù)權(quán)利要求1或2的抗原蛋白，或其免疫原性片段；或根據(jù)權(quán)利要求9的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生自白斑綜合征病毒的抗原蛋白，大小約為19kDa(VP19)或13Kda(13)；這些蛋白在疫苗中的應(yīng)用；和以這些蛋白為基礎(chǔ)的疫苗。此外，本發(fā)明涉及針對(duì)這些蛋白的抗體和抗體在疫苗中的應(yīng)用；編碼這些蛋白的核酸序列及其在疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述蛋白在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療甲殼類動(dòng)物中白斑綜合征的疫苗中的用途；載體疫苗；和包含所述核酸或抗體的診斷試劑盒。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1437654SQ01802989
公開日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2001年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月15日
發(fā)明者J·M·弗拉克, M·C·W·范胡爾敦 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司