專利名稱：抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽、其制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽、其制備方法及其在醫(yī)藥學上的應用，特別是通過計算機模擬設計、人工合成的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，以及用于治療G-細菌感染、人內(nèi)毒素血癥。
革蘭氏陰性(G-)桿菌膿毒癥和休克是導致臨床病人死亡的主要原因之一，特別是伴有嚴重內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide,endotoxin,LPS)血癥的G-桿菌的感染。G-菌菌血癥的病死率為20～30％，而由菌血癥發(fā)展而來的膿毒癥休克其病死率可高達50-80％。而針對內(nèi)毒素血癥的治療，臨床上尚無有效措施，因此導致感染性疾病的治療更為棘手，因此研究其發(fā)病機理并尋找有效的治療措施一直是臨床醫(yī)學關注的焦點。
近年來，隨著對G-桿菌感染研究的深入，存在于G-桿菌外膜上內(nèi)毒素的作用日益受到重視。LPS被認為是膿毒癥休克病人死亡原因——失控性炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome.SIRS)和代償性抗炎癥綜合征(Compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS)的啟動子。進入血中的內(nèi)毒素其主要生物學作用包括以下幾個方面①與巨噬細胞接觸后能誘生、釋放多種炎癥介質如TNF、IL-1等，通過這些介質直接或間接發(fā)揮局部及全身效應。②同時內(nèi)毒素分子亦可與多種組織、實質細胞結合直接導致細胞損傷。③激活凝血、纖溶、補體系統(tǒng)，誘發(fā)DIC。④作用于α-受體，促使腎上腺兒茶酚胺分泌，導致微循環(huán)障礙、血漿外滲，直至發(fā)生休克以及其它如發(fā)熱、白細胞減少，Shwartzman反應等。在復雜的炎癥反應網(wǎng)絡中，分別針對TNF、IL-1等各種炎癥因子的調(diào)控措施也不斷提出，但結果令人失望，其主要原因在于各種不同的炎癥因子相互作用密不可分，僅針對某個或數(shù)個細胞因子并不能解決問題。因此抓住矛盾的主要方面——LPS，尋找解決問題的突破點意義重大。
國內(nèi)外有關內(nèi)毒素的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素存在于G-桿菌的細胞膜上，其主要化學成分為脂多糖。其基本構成為O-特異性側鏈，核心多糖、類脂A三部分。其中類脂A是毒素的活性中心。主要生物學作用為刺激單核-吞噬細胞系統(tǒng)誘生、釋放多種炎癥介質如TNF、IL-1等，通過這些介質啟動炎癥反應網(wǎng)絡并直接或間接發(fā)揮局部及全身效應。
近十余年來，國際上針對G-桿菌感染所伴隨的內(nèi)毒素血癥及SIRS的防治研究，主要有抗內(nèi)毒素核心糖脂(Lipid A)的多抗、單抗、各種抗細胞因子抗體及受體拮抗劑，如抗TNF抗體、抗白細胞介素Ⅰ(IL-1)抗體、抗IL-6抗體以及NO拮抗劑等。在動物實驗研究中，上述制劑對膿毒癥所致的臟器損傷有一定的保護作用，但在臨床試驗中都因療效不確切而未獲美國FDA批準。
殺菌性/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeabilityincreasing protein,BPI)是一種存在于人及哺乳動物PMN嗜天青顆粒中的帶正電荷的陽性蛋白質，分子量約55kDa，由456個氨基酸組成，具有殺滅G-細菌和中和LPS的能力，是目前最有希望成為應用于臨床的制劑，受到國外眾多學者和制藥企業(yè)的關注。目前已證實BPI對許多G-細菌包括大腸桿菌屬、綠膿桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙雷氏菌屬、奈瑟氏菌屬等發(fā)揮殺菌作用；BPI還可與G-細菌胞膜上的LPS特異結合，抑制游離LPS的活性。BPI N-末端1-199個氨基酸殘基片段(BPI23)具有完整BPI的全部生物活性，其變構體BPI21除具有BPI23的生物活性外，對部分G+球菌如耐藥金葡菌、鏈球菌具有殺菌活性，并且結構更穩(wěn)定。由美國研制的重組BPI23/21已進入臨床研究，初步臨床研究表明BPI可明顯降低血內(nèi)細菌數(shù)、改善心臟指數(shù)、動脈氧分壓、血壓、降低血漿內(nèi)毒素水平、提高動物生存率。國外重組BPI23(rBPI23，見1992,Infect.Immun.60:4754-4761)及其突變體(rBPI21)的開發(fā)研究已進入Ⅲ期臨床試驗，初步結果證明，rBPI23和rBPI21對嚴重G-細菌感染有顯著療效。但是rBPI23和rBPI21對G-細菌感染和LPS血癥的治療，存在用藥量大、成本居高不下，難以推廣的問題。
中國專利申請94191894和94194835涉及殺菌性通透性增強蛋白的功能區(qū)的生物活性肽及其應用，其中公開了具有的氨基酸序列為人殺菌/增強通透性蛋白質(BPI)功能區(qū)的氨基酸序列或其亞序列的肽，以及該序列的變異體或其亞序列，它們具有至少一種BPI的生物學活性，如肝素結合、肝素中和、LBS結合、LPS中和或殺菌活性，并提供了用于各種治療用途的肽和該肽的藥用組合物。
盡管對內(nèi)毒素的研究較多，但臨床上尚無一種能夠安全有效地用于治療內(nèi)毒素血癥的藥物。因此，將重點放在中和內(nèi)毒素上從而達到降低感染死亡率的目的具有非常重要的意義。
本發(fā)明的目的在于提供一系列抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，具有殺菌和中和LPS活性。
本發(fā)明的另一個目的在于采用固相多肽化學合成方法，合成上述抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，得到具有生物學活性的多肽分子。
本發(fā)明的再一個目的在于研究抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽用于治療G-細菌感染、人內(nèi)毒素血癥，以便探索既能殺菌又能中和內(nèi)毒素的新藥物。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為通過目前已知在自然界生物體內(nèi)存在的具有結合內(nèi)毒素活性的物質，如BPI、LBP、LAF等，對其進行同源性分析，在BPI三維結構的基礎上，通過計算機模擬研究推測其可能的結構功能關系，并在計算機輔助下進行模擬多肽的分子設計。發(fā)現(xiàn)人和兔的內(nèi)毒素結合蛋白BPI與LBP的同源性最高；對BPI分子的一級序列親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，BPI分子的一級序列主要由疏水性氨基酸組成；對BPI分子的三維結構分析發(fā)現(xiàn)，BPI分子(456 aa)是一個13.5nm×3.5nm×3.5nm大小的回飛棒形(boomerang-shaped)蛋白，其由兩個結構相似的結構域組成，之間由一個脯氨酸富集的21肽連鎖連接，并測定了BPI分子N端LOOP的三維結構圖；另外，本發(fā)明還對BPI分子的表面靜電勢進行了計算分析，發(fā)現(xiàn)N端的3個LOOP區(qū)集中了不少正電氨基酸，其表面靜電勢正電分布更顯著；對其一級結構乃至三級結構進行分析比較，找出與內(nèi)毒素結合的結構域為N端結構域LOOP區(qū)，在計算機輔助下進行模擬多肽的分子設計，模擬設計出具有更強殺菌和中和LPS活性的多肽分子。
本發(fā)明采用Merrifield創(chuàng)建的固相多肽化學合成方法，通過Fmoc保護的氨基酸方法或Tboc保護的氨基酸方法人工合成或通過自動多肽合成儀進行本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的合成，得到一系列本發(fā)明設計的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽。得到的多肽須經(jīng)過高壓液相(HPLC)純化，并經(jīng)質譜鑒定和生物活性鑒定。
本發(fā)明還通過測定本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽的體內(nèi)外殺菌活性、體外拮抗內(nèi)毒素活性、體外抑制內(nèi)毒素誘導的人單核細胞腫瘤壞死因子(TNF-a)和白細胞介素6(IL-6)產(chǎn)生的活性、對內(nèi)毒素攻擊小鼠的死亡保護作用、對大鼠內(nèi)毒素血癥的治療作用、模擬肽對大腸桿菌攻擊小鼠的死亡保護作用、模擬肽對大鼠膿毒癥的治療作用，以便研究其用于治療G-細菌感染和人內(nèi)毒素血癥。
下面結合附圖和具體實施例詳細描述本發(fā)明。


圖1．BPI及其同源蛋白的一級序列的多重序列對比結果圖2．BPI分子的一級序列親疏水性分析圖3．BPI分子的三維結構分析圖4．BPI分子的三維結構分析圖5．BPI分子N和C端LOOP的三維結構分析圖6．BPI分子N端LOOP的三維結構7．BPI分子的表面靜電勢分布圖8．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽BNEP9800892的體外殺菌活性圖9．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對J5大腸桿菌的體外殺菌活性圖10．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽體內(nèi)殺滅大腸桿菌的活性圖11．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽降低體內(nèi)血清TNF-a濃度的活性圖12．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽體外拮抗內(nèi)毒素活性定性實驗圖13．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽體外拮抗內(nèi)毒素活性定量實驗圖14．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對LPS誘導的THP-1細胞TNF-a分泌的影響內(nèi)毒素刺激細胞2小時后不同劑量模擬肽抑制TNF-a分泌情況圖15．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對LPS誘導的THP-1細胞IL-6分泌的影響內(nèi)毒素刺激細胞2小時后不同劑量模擬肽抑制IL-6分泌情況圖16．不同抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對LPS誘導的大鼠TNF-a釋放抑制情況圖17．不同抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對LPS誘導的大鼠IL-6釋放抑制情況圖18．BNEP9801042肽樣品的質譜分析19．BNEP9901537肽樣品的質譜分析20．BNEP9901536肽樣品的質譜分析圖下面是本發(fā)明的詳細描述。
本發(fā)明中計算機模擬所用工作站為SGIIndigo2系列Solid Impact R1000圖形工作站，模擬系統(tǒng)為Biosym/MSI分子模擬系統(tǒng)。所有工作均在INSIGHT Ⅱ工作平臺上進行，靜電勢計算所用軟件為DelPhi。蛋白質一級序列搜索所用軟件為FASIA程序，蛋白序列庫為EMBL(European Molecular Biology Laboratory)的SWISS-PROT蛋白序列庫(Release 34,October 1996)。
本發(fā)明在BPI三維結構的基礎上，通過計算機模擬研究推測其可能的結構功能關系，并在計算機輔助下進行模擬多肽的分子設計。通過同源性分析、BPI分子的一級序列親疏水性分析、BPI分子的三維結構分析、BPI分子的表面靜電勢計算分析等模擬結果表明，BPI的生物學功能區(qū)主要定位在N端的三個LOOP區(qū)，而且其與受體的主要作用方式是靜電作用。因此根據(jù)對BPI N端三個LOOP區(qū)的空間構象分析及物理化學性質分析制定的模擬肽設計方案為1．兩端為強正電勢分布的螺旋結構；2．正電勢分布的轉角螺旋結構；3．正電勢分布的強螺旋折疊傾向結構；4．BPI N端LOOP區(qū)天然肽段的改善型結構。通過計算機模擬得到適合本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽。本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽序列最短者為7個氨基酸多肽，序列最長者為28個氨基酸多肽；類型為氨基酸；拓撲結構為線性；分子類型為肽；分子的序列由氨基酸的一字簡碼組成。如表1所示。
表1本發(fā)明的66個抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽分子的序列編號序列 理論值 實測值BNEP9600139:KSKAQKRFLK MW:1233.51233BNEP9600257:KIKGGFLFHKK MW:1302.61302.4BNEP9600258:KRPSVTSPRK MW:1155.31356BNEP9600301:KSKVLGK MW:758.9 761BNEP9600307:KSKVLGKAQKRFLK MW:1631.01630.5BNEP9600308:KSKVLGKRFLK MW:1303.61302.8BNEP9700031:KGKVLGKAQKRFLK MW:1600.91602BNEP9700032:KGKVLGKFLK MW:1117.41118.1BNEP9700055:KGKVLGK MW:728.9 728.5BNEP9700145:KTKVLGK MW:773.0 773.0BNEP9700146:KLKVLGK MW:785.0 784.2BNEP9701047:RRAKVFIKMMW:1148.41150.1BNEP9800431:RLKLILKSKMW:1098.41100.1BNEP9800433:KSVLILWKSK MW:1201.51202.5BNEP9800637:KSKVGILLQLVRKR MW:1638.01637.5BNEP9800638:KSKFVILLQLGHKFK MW:1786.21786.4BNEP9800723:KSKVGWLIQLFHKKKTKGGWLIQLFHKK MW:3378.03380BNEP9800892:KIKHLGKKSKVGFLQLLFHKKMW:2478.02482.3BNEP9800895:KIKHLGKKTKGGWLIQLFHKKMW:2489.02490.1BNEP9800993:KKVGWLIQLFHKKIE MW:1876.21875.5BNEP9801013:KSKVGFLQLLFHKKLRGSLTKLKG MW:2727.32728.0BNEP9801042:SKVGWLILLFHKKIE MW:1811.21810.1BNEP9801043:KSKVGWLILLFHKK MW:1697.01696.1BNEP9801047:KIKHLGLFHKK MW:1348.11385.0BNEP9801087:KSKVGFLIQLFHKK MW:1673.01675.1BNEP9801095:KTKVGFLIQLFHKK MW:1687.01685.1BNEP9801161:KGKVGFLIQLFHKK MW:1643.01645.2BNEP9801174:KSKGGWLQLLFHKK MW:1670.01668.4BNEP9801175:KGKGGWLQLLFHKK MW:1639.01642.0BNEP9801286:KTKGGFLQLLFHKK MW:1643.01641.2BNEP9801287:KGKGGFLQLLFHKK MW:1600.91600.5BNEP9801289:KSKGGFLQLLFHKKMW:1630.91629BNEP9901311:KGKGGWLIQLFHKKMW:1639.91641.5BNEP9901312:KSKGGWLIQLFHKKMW:1670.01669.5BNEP9901315:KTKGGWLIQLFHKKMW:1684.01682.8BNEP9901317:KGKVGFLQLLFHKKMW:1643.01643.0BNEP9901318:KTKVGFLQLLFHKKMW:1687.01688.5BNEP9901319:KSKVGWLQLLFHKKMW:1712.01715.8BNEP9901320:KGKVGWLQLLFHKKMW:1682.01688.2BNEP9901321:KTKVGWLQLLFHKKMW:1726.11729.5BNEP9901496:KIKHLGKAQKRFLKMW:1695.11692.5BNEP9901501:KSKSGFLQLLFHKKMW:1661.01661.5BNEP9901534:KSKAAWLLQLFHKKMW:1698.01689.7BNEP9901536:KSKSAFLLQLFGKKMW:1594.91596.4BNEP9901537:KSKAAFLQLAFKSKMW:1566.91568.3BNEP9901538:RSKAAFLQLAFKSKMW:1594.91596.1BNEP9901539:RSKSAFLLQLFGKKMW:1622.91621.4BNEP9901541:RSKSAFLLQLFGKRMW:1650.91653.4BNEP9901595:RSKAAFLQLAFKSRMW:1622.91622.8BNEP9901602:FCKIKHLGKCY MW:1339.61338.5BNEP9901603:FCKIKHLGKCR MW:1332.61335.4BNEP2001606:KCKIKHLGKCR MW:1313.61315.2BNEP2001627:FCKIKHLGKCKK MW:1432.81435.7BNEP2001628:KCKIKHLGKCKK MW:1413.81417.8BNEP2001629:KCKIKHLGKCY MW:1320.61324.7BNEP2001630:FCKIKHLGKCR MW:1332.61332.6BNEP2001671:KCAQKRFLKMCK MW:1483.91485.2BNEP2001677:YCAQKRFLKMCY MW:1553.91552.8BNEP2001678:RCAQKRFLKMCY MW:1546.91548.1BNEP2001681:KCKNLQRPLKLNQKCR MW:1970.31972.5BNEP2001695:KGKGGFLIQLFHKKMW:1600.91602.1BNEP2001708:RRPLIQLVKKMW:1250.51253.4BNEP2001756:KKKILQLLKKMW:1239.61242.1BNEP2001757:RRPILPRR MW:1063.31063.8BNEP2001758:KSKHLGKAQKRFLKMW:1669.01671.8BNEP2001784:KIKVLFHKSKMW:1227.51228.6本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，還可以是上述66個多肽中，至少兩個相同或不同的肽相連組成的多肽。
本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，還可以是端基或側鏈經(jīng)過化學修飾的上述66個多肽，如生物學可接受的上述抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的鹽、酯、酰胺、雜環(huán)、烷基等。
Merrifield創(chuàng)建的固相多肽化學合成方法(Merrifield RB.1963 J Am Chem Soc.85:2149)已發(fā)展成為一種成熟的眾所周知的固相多肽化學合成技術。應用該技術，可以合成本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，具體為1．肽樹脂的合成稱取適量Fmoc-L-Lys-PEG-PS樹脂(或其它多肽合成樹脂)倒入合成柱中，加入溶劑溶脹，按照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的氨基酸序列依次稱取適量的Fmoc-氨基酸于適宜的容器中。按照merrifield發(fā)明的固相化學合成方法依照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的氨基酸序列從C端開始依次進行，在合成柱中加入含20％六氫吡啶的DMF Deblock液脫肽樹脂F(xiàn)moc保護基團、加入適量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分別加入適量二異丙基乙胺(DIPEA)和氮雜苯并三唑甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)的DMF溶液于柱中進行偶連反應、偶連后合成柱中的肽樹脂用DMF洗去殘余的Fmoc-氨基酸、惰性氣體吹干等制備過程，如此循環(huán)完成整個抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的肽鏈形成而得到其肽樹脂；從合成柱中取出合成的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽樹脂，置到冷凍干燥機中凍干，得到肽樹脂備用。
2．肽樹脂的裂解取上述肽樹脂于容器中，加入裂解液4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1,2-乙二硫醇，于室溫避光反應2小時，過濾，濾液于室溫濃縮后，加入預先冷凍的無水乙醚中，冰凍過夜，離心，棄上清液，沉淀用適量冰醋酸溶解，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得粗肽。
3．粗肽的純化取BNEP粗肽加入適量無熱源水溶解，得到樣品溶液，過濾并收集樣品濾液；將乙腈及無熱源水用0.45u濾膜過濾，分別加入0.1％的三氟乙酸，混勻，用C18反相柱，流動相A100％H2O+0.1％三氟乙酸；流動相B100％乙晴+0.1％三氟乙酸，0→15min梯度洗脫純化，得BNEP精肽。
本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽也可以采用適合本發(fā)明的其他化學、儀器或生物化學方法合成。
體內(nèi)外試驗表明，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽在體外對E.coli β+-HI、E.coli J5、E.coli V517、MSSA25923、PSPNC49619、PA103等細菌和大腸桿菌均有不同程度的殺菌活性；動物實驗表明，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽可明顯降低血清中TNF-α高峰濃度，具有延長膿毒癥動物生存時間、提高動物生存率的作用；在體外，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對LPS在體外均具有不同程度有中和作用，不同的BNEP對LPS的中和作用存在差異，對內(nèi)毒素誘導的人單核細胞腫瘤TNF-α和IL-6的分泌均具有不同程度的抑制作用；動物試驗表明，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對內(nèi)毒素攻擊小鼠均具有不同程度的保護作用，對內(nèi)毒素介導的大鼠TNF-α和IL-6的產(chǎn)生均具有不同程度的抑制作用，對大鼠內(nèi)毒素血癥具有治療作用?？梢杂糜谥委烥-細菌感染和人內(nèi)毒素血癥。
本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽可以輔以藥用稀釋劑、佐劑及載體制成藥用組合物，如片劑、粉劑、丸劑、溶液或懸浮劑，通過口含、注射或其他方式給藥，用于治療G-細菌感染和內(nèi)毒素血癥；本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽還可以與其他藥物復合，用于治療G-細菌感染和內(nèi)毒素血癥。
本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽作為稀釋劑、佐劑及載體用于治療G-細菌感染和人內(nèi)毒素血癥。
至少兩個相同或不同的本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽相連成一個肽，用于治療G-細菌感染和內(nèi)毒素血癥。
另外，至少兩個相同或不同的本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽相連成一個肽，可以作為稀釋劑、佐劑及載體用于治療G-細菌感染。
下面是本發(fā)明的具體實施例，所述的實施例是用于描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。
實施例11．同源性分析為了更深入理解具有結合內(nèi)毒素活性BPI分子的生物學功能及其與蛋白質三維結構之間的相關性，本發(fā)明以BPI分子的一級序列為探針在PDB庫和SWISS-PROT序列庫中進行同源搜索并對找到的同源蛋白序列進行多重序列對比。結果發(fā)現(xiàn)有6個同源蛋白序列，它們分別是牛的BPI分子，人和鼠的磷脂轉移蛋白(PhospholipidTransfer Protein PLTP)分子，人和兔的內(nèi)毒素結合蛋白(Lipopolysacchride BindingProtein LBP)分子及兔的膽甾醇脂轉移蛋白(Cholesteryl Ester Transfer Protein CETP)分子，如圖1所示，其中BPI與LBP的同源性最高。圖1中列出BPI探針與6種具有明顯同源性的蛋白序列的序列聯(lián)配的結果。
2．BPI分子的一級序列親疏水性分析BPI分子的一級序列親疏水性分析如圖2所示，其中的橫坐標為氨基酸殘基的序列標號，縱坐標為疏水性分值。橫線以上為親水區(qū)域，橫線以下為疏水區(qū)域?？梢夿PI分子的一級序列主要由疏水性氨基酸組成。
3．BPI分子的三維結構分析見圖3-5，根據(jù)測定的BPI三維結構，全長BPI分子(456aa)是一個13.5nm×3.5nm×3.5nm大小的回飛棒形(boomerang-shaped)蛋白。其由兩個結構相似的結構域組成，即N端結構域(1～229)和C端結構域(251～456)，兩個結構域之間由一個脯氨酸富集的21肽linker連接。兩個結構域形成三個結構單元，一個中央β折疊片和N端C端兩個桶狀結構(10～193和260～421)，每個桶狀結構包含三個二級結構單元，一個短α螺旋，一個包含5個折疊股的反向平行的β折疊片和一個長的α螺旋。兩個結構域的結構疊合顯示二者相對方位角度為173°,169個Cα原子的距離均方偏差(RMSD,root-mean-square deviation)為0.3nm，但兩個結構域的LOOP區(qū)的構象相差較大。LOOP區(qū)的構象差異可能反映了兩個結構域功能上的不同，因為N端結構域具有LPS結合能力而C端不具備這種活性。N端結構域LOOP區(qū)由分別位于第17～45,65～99和142～169區(qū)域內(nèi)的部分氨基酸序列呈花瓣狀組成，見圖6。盡管BPI分子N端結構域和C端結構域很相似，但其氨基酸序列的同源性殘基百分比卻不足20％。因此兩個結構域的這種不尋常的結構相似性可能還具有更深一層的意義，即它們很可能共有某種目前還未發(fā)現(xiàn)的生物學功能。
4．BPI分子的表面靜電勢計算分析靜電勢計算發(fā)現(xiàn)，BPI分子的C端(250～465)的靜電勢分布主要是負電勢，而N端(1～230)則主要為正電勢，見圖7。蛋白之間的相互作用主要通過表面殘基來實現(xiàn)，因此我們著重分析BPI分子的表面靜電勢分布情況，BPI分子的溶劑及表面用Connolly法生成，即用一半徑為0.14nm的探針分子(水分子大小)在BPI分子的表面滾動，滾動中探針分子的中心所形成的表面即為BPI分子的溶劑可及表面，BPI分子的表面靜電勢分布仍然是N端正、C端負。圖中淺色代表正靜電勢區(qū)，深色代表負靜電勢區(qū)，見圖7。特別是N端的3個LOOP區(qū)集中了不少正電氨基酸，其表面靜電勢正電分布更顯著。
實施例2本實施例涉及抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的分子設計及合成方法本發(fā)明在BPI三維結構的基礎上，通過計算機模擬研究推測其可能的結構功能關系，并在計算機輔助下進行模擬多肽的分子設計。模擬結果表明BPI的生物學功能區(qū)主要定位在N端的三個LOOP區(qū)，而且其與受體的主要作用方式是靜電作用。因此根據(jù)對BPI N端三個LOOP區(qū)的空間構象分析及物理化學性質分析制定的模擬肽設計方案為1．兩端為強正電勢分布的螺旋結構；2．正電勢分布的轉角螺旋結構；3．正電勢分布的強螺旋折疊傾向結構；4．BPIN端LOOP區(qū)天然肽段的改善型結構。
通過計算機模擬，本發(fā)明共得到66個抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽分子，序列見表1。
實施例3以BNEP 9901315為例，說明本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽的合成方法。
1.0.05mmolBNEP 9901315肽樹脂的合成稱取Fmoc-L-Lys-PEG-PS樹脂(或其它多肽合成樹脂)0.05mmol倒入合成柱中，加入約15ml精制二甲基甲酰胺(DMF)溶脹30min，另取1.0mmol二異丙基乙胺(DIPEA)50ml(8.7mlDIPEA+41.3ml DMF)、0.5mmol氮雜苯并三唑甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)50ml(9.5g HATU+40.5ml DMF)和含20％六氫吡啶的DMF(Deblock液)適量分別加入試劑瓶中，再按BNEP 9901315氨基酸序列依次稱取2mmol的Fmoc-氨基酸于適宜的容器中。按照merrifield發(fā)明的固相化學合成方法依照BNEP 9901315氨基酸序列從C端開始依次進行在合成柱中加入Deblock液脫肽樹脂F(xiàn)moc保護基團、加入適量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分別加入適量DIPEA、HATU于柱中進行偶連反應、偶連后合成柱中的肽樹脂用DMF洗去殘余的Fmoc-氨基酸、惰性氣體吹干等制備過程，如此循環(huán)完成整個BNEP9901315的肽鏈形成而得到其肽樹脂；從合成柱中取出BNEP 9901315肽樹脂，置到冷凍干燥機中凍干，得到肽樹脂0.391g備用。
2.BNEP9901315肽樹脂的裂解取上述肽樹脂0.391g于適宜的容器中，加入5ml裂解液(4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1,2-乙二硫醇)，于室溫避光反應2小時，過濾，濾液于室溫濃縮至1/2體積后，滴加入10倍量預先冷凍的無水乙醚中，冰凍過夜，離心，棄上清，沉淀用適量冰醋酸溶解，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得粗肽73.9mg，收率為87.97％。
3．BNEP9901315粗肽的純化取BNEP粗肽加入適量無熱源水溶解，得到0.5mg/ml的樣品溶液，用針頭式過濾器過濾樣品液，收集濾液于一小燒杯中；將乙腈及無熱源水用0.45u濾膜過濾，分別加入0.1％的三氟乙酸，混勻，按以下色譜條件進行純化柱C18反相柱流動相A100％H2O+0.1％三氟乙酸流動相B100％乙晴+0.1％三氟乙酸(0→15min梯度洗脫)得BNEP9901315精肽58.85mg，收率為79.63％。
實施例4-70參照實施例3的方法合成表1中列出的其他65種抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽，質譜結果見表1。圖18-20為BNEP9801042、BNEP9901537和BNEP9901536肽樣品的質譜分析圖。
實施例71本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽的體內(nèi)外殺菌活性1．本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽的體外殺菌活性1.1實驗方法將E.coli β+-HI、E.coli J5、E.coli V517、MSSA25923、PSPNC49619、PA103等細菌分別接種于M-H培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18小時，再轉移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時，用M-H培養(yǎng)基調(diào)整細菌濃度至105cfu/ml。
表2抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽樣品倍比稀釋后各管濃度

取試管11支為1組并編號，除第一管加入細菌懸液2ml外，其余每管加入菌液1ml；在第一管內(nèi)加入待測定樣品128μg，混勻后用菌液等倍稀釋至第11管，每管樣品濃度見表2。37℃孵育30分鐘后各取10μl均勻涂布于M-H固體培養(yǎng)基上37℃，培養(yǎng)18～24小時后進行菌落計數(shù)。
1.2實驗結果結果表明，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對所用細菌均有不同程度的殺菌活性，不同細菌對BNEP的敏感性存在較大差異；不同的BNEP對大腸桿菌J5的殺菌活性也存在差異(見圖8-9)。
2．本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽的體內(nèi)殺菌活性2.1實驗方法2.1.1大白鼠稱重后肌肉注射1％戊巴比妥鈉(0.5ml/kg體重)，待動物完全麻醉后，消毒大鼠尾靜脈，靜脈注射大腸桿菌J5，給予量為2×108cfu/kg體重，該大腸桿菌菌液總體積為1ml，5分鐘內(nèi)注射完畢。隨機將250只大白鼠分為5組(1)單純膿毒癥組(簡稱對照組)僅給予大腸桿菌和生理鹽水；(2)膿毒癥模擬肽治療組除給予大腸桿菌外，同時給予抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽20mg/kg體重。分別在給予細菌或細菌+模擬肽后0、1、2、3、4、5小時觀察動物生存率，幸存大鼠活殺取下腔靜脈血。
2.1.2血液標本的處理(1)10μl新鮮血液用生理鹽水稀釋一定倍數(shù)后，均勻涂布于M-H固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24小時后作細菌菌落計數(shù)。
(2)不抗凝血立即離心，2000rpm，15分鐘，取血清，放置-70℃冰箱中待測。
(3)抗凝血待血凝固后，2000rpm，15分鐘，取血漿，置-70℃冰箱中待測。
2.1.3實驗指標(1)動物存活率的觀察觀察各時相點各組動物存活情況。
(2)全血細菌計數(shù)取新鮮血液10μl，用生理鹽水梯度稀釋后，吸取10μl，均勻涂布于M-H平板上，37℃孵育18～24小時，作菌落計數(shù)。
(3)血清TNF-α濃度的測定按大鼠TNF-α酶聯(lián)試劑盒說明操作(TNF-α試美國Biosource公司產(chǎn)品)。。
2.2實驗結果(1)本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽對大鼠膿毒癥動物生存率的影響本實驗中給予大鼠的大腸桿菌J5菌量為2×108cfu/kg體重，菌量很大，一般大鼠4～5小時即全部死亡，給予模擬肽量為20mg/kg體重。從表3中可見，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽具有延長動物生存時間、提高動物生存率的作用。
表3本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對大鼠膿毒癥動物生存率的影響

(2)．全血大腸桿菌計數(shù)大劑量大腸桿菌J5注入大鼠靜脈后，大鼠全血細菌計數(shù)很快達到峰值，隨即下降，抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽治療組動物全血中細菌計數(shù)僅為對照組的1/4，說明抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對降低全血細菌數(shù)量有很強的作用見圖10。
3．血清TNF-α濃度的測定血清TNF-α濃度在注射大腸桿菌J5 2小時后達到高峰，而本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽可明顯降低TNF-α高峰濃度，并使TNF-α濃度一直處于較低的水平(圖11)。
實施例72本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽的體內(nèi)外中和LPS活性1本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬多肽的體外中和LPS活性1.1實驗方法將LPS 0111:B4 1000pg加入去熱原的10支玻璃試管中，再分別加入待鑒定的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽樣品100μg，加入無熱原生理鹽水至終體積1ml，另設試劑對照和空白對照管，37℃孵育30分鐘后按定量基質顯色法鱟試劑盒(日本生化學工業(yè)株式會社)說明書進行操作，反應結束后用DU-7 Beckman紫外分光光度計545nm比色測定OD值。
同期進行標準曲線的制作取LPS 1000pg于第一管，以等倍梯度稀釋10管，LPS測定同上。
1.2．實驗結果結果表明，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對LPS在體外均具有不同程度有中和作用，不同的BNEP對LPS的中和作用存在差異(圖例12-13)。
2．模擬肽體外抑制內(nèi)毒素誘導的人單核細胞腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)產(chǎn)生的能力2.1實驗方法采用RPMI1640培養(yǎng)人單核細胞株(THp-1)，實驗前一天調(diào)整細胞濃度為2×105/ml，接種于48孔培養(yǎng)板，分別設(1)對照組采用LPS 0111:B4 2ng/ml刺激細胞；(2)處理組取試管11支并編號，分別加入等倍稀釋的待測樣品，濃度從128μg/ml至0.125μg/ml；然后每管中再分別加入LPS 0111:B4，使其終濃度為lng/ml；37℃孵育30分鐘后分別加于48孔培養(yǎng)板中，37℃,5％CO2下培養(yǎng)；分別于培養(yǎng)后0、1、2、4、6、8、12小時取上清測定TNF-α和IL-6濃度(TNF-α和IL-6試劑盒分別為法國Diaclone公司、美國Biosource公司產(chǎn)品)。
2.2結果本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對內(nèi)毒素誘導的人單核細胞腫瘤TNF-α和IL-6的分泌均具有不同程度的抑制作用(圖例14-15)。
3．本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對內(nèi)毒素攻擊小鼠死亡的保護作用3.1實驗方法清潔級昆明種小鼠100只，雌雄各半，體重18-22g，隨機分為10組分別為對照組、地塞米松處理組和7個模擬肽處理組。對照組單純尾靜脈注射LPS O111:B4 20mg/kg；地塞米松處理組尾靜脈注射LPSO111:B4 20mg/kg后注射地塞米松10mg/kg；模擬肽處理組尾靜脈注射LPS 20mg/kg后注射模擬肽5mg/kg。所有動物給藥體積均為0.2ml/20g，共給藥一次。
觀察指標為動物7天死亡率。
3.2結果本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對內(nèi)毒素攻擊小鼠均具有不同程度的保護作用，見表例4。
表4本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對內(nèi)毒素攻擊小鼠的保護作用

4．本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對大鼠內(nèi)毒素血癥的治療作用4.1實驗方法采用大鼠留置心導管術進行給藥和取血A大鼠留置心導管術動物經(jīng)1％戊巴比妥鈉4mg/100g體重腹腔麻醉后，每只動物先測量頸部切口至心臟的距離，以確定插管長度，頸部皮膚經(jīng)常規(guī)備皮、消毒后，于頸外側下頜至心臟的中點作一長約0.5cm的橫切口，暴露頸外靜脈后行靜脈插管，導管固定后經(jīng)皮下遂道至頸后引出并固定，管內(nèi)注射12500u/100ml肝素0.2ml抗凝。
B給藥和取血已置心導管24小時的Wistar大鼠28只，清潔級，雌雄各半，體重220-260g，隨機分為7組，每組動物4只。對照組經(jīng)心導管注射LPS O111:B4 10mg/kg；模擬肽處理組先經(jīng)心導管注射LPS O111:B4 10mg/kg，后注射模擬肽10mg/kg。所有動物均共給藥一次。于注射藥物后0、1、2、4、6、12、24、48小時采血測TNF-α、IL-6(TNF-a和IL-6試劑盒分別為法國Diaclone公司、美國Biosource公司產(chǎn)品)。
4.2結果本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽對內(nèi)毒素介導的大鼠TNF-α和IL-6的產(chǎn)生均具有不同程度的抑制作用(圖例16-17)。
本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，是分子量小、可以穩(wěn)定重復生產(chǎn)的BPI模擬肽，本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，是活性多肽分子，具有全部或部分BPI的生物功能，如殺菌和中和內(nèi)毒性等活性，是一種及有前途的治療G-細菌感染、人內(nèi)毒素血癥的藥物，填補了該領域的空白。
權利要求
1．抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，其多肽序列為7-28個氨基酸多肽；類型為氨基酸；拓撲結構為線性；分子類型為肽；分子的序列由氨基酸的一字簡碼組成，66個模擬肽表示如下BNEP9600139:KSKAQKRFLK MW:1233.5BNEP9600257:KIKGGFLFHKK MW:1302.6BNEP9600258:KRPSVTSPRK MW:1155.3BNEP9600301:KSKVLGK MW:758.9BNEP9600307:KSKVLGKAQKRFLK MW:1631.0BNEP9600308:KSKVLGKRFLK MW:1303.6BNEP9700031:KGKVLGKAQKRFLK MW:1600.9BNEP9700032:KGKVLGKFLK MW:1117.4BNEP9700055:KGKVLGK MW:728.9BNEP9700145:KTKVLGK MW:773.0BNEP9700146:KLKVLGK MW:785.0BNEP9701047:RRAKVFIKM MW:1148.4BNEP9800431:RLKLILKSK MW:1098.4BNEP9800433:KSVLILWKSK MW:1201.5BNEP9800637:KSKVGILLQLVRKR MW:1638.0BNEP9800638:KSKFVILLQLGHKFK MW:1786.2BNEP9800723:KSKVGWLIQLFHKKKTKGGWLIQLFHKKMW:3378.0BNEP9800892:KIKHLGKKSKVGFLQLLFHKK MW:2478.0BNEP9800895:KIKHLGKKTKGGWLIQLFHKK MW:2489.0BNEP9800993:KKVGWLIQLFHKKIE MW:1876.2BNEP9801013:KSKVGFLQLLFHKKLRGSLTKLKGMW:2727.3BNEP9801042:SKVGWLILLFHKKIE MW:1811.2BNEP9801043:KSKVGWLILLFHKK MW:1697.0BNEP9801047:KIKHLGLFHKK MW:1348.1BNEP9801087:KSKVGFLIQLFHKK MW:1673.0BNEP9801095:KTKVGFLIQLFHKK MW:1687.0BNEP9801161:KGKVGFLIQLFHKK MW:1643.0BNEP9801174:KSKGGWLQLLFHKK MW:1670.0BNEP9801175:KGKGGWLQLLFHKK MW:1639.0BNEP9801286:KTKGGFLQLLFHKK MW:1643.0BNEP9801287:KGKGGFLQLLFHKK MW:1600.9BNEP9801289:KSKGGFLQLLFHKK MW:1630.9BNEP9901311:KGKGGWLIQLFHKK MW:1639.9BNEP9901312:KSKGGWLIQLFHKK MW:1670.0BNEP9901315:KTKGGWLIQLFHKK MW:1684.0BNEP9901317:KGKVGFLQLLFHKK MW:1643.0BNEP9901318:KTKVGFLQLLFHKK MW:1687.0BNEP9901319:KSKVGWLQLLFHKK MW:1712.0BNEP9901320:KGKVGWLQLLFHKK MW:1682.0BNEP9901321:KTKVGWLQLLFHKK MW:1726.1BNEP9901496:KIKHLGKAQKRFLK MW:1695.1BNEP9901501:KSKSGFLQLLFHKK MW:1661.0BNEP9901534:KSKAAWLLQLFHKK MW:1698.0BNEP9901536:KSKSAFLLQLFGKK MW:1594.9BNEP9901537:KSKAAFLQLAFKSK MW:1566.9BNEP9901538:RSKAAFLQLAFKSK MW:1594.9BNEP9901539:RSKSAFLLQLFGKK MW:1622.9BNEP9901541:RSKSAFLLQLFGKR MW:1650.9BNEP9901595:RSKAAFLQLAFKSR MW:1622.9BNEP9901602:FCKIKHLGKCY MW:1339.6BNEP9901603:FCKIKHLGKCR MW:1332.6BNEP2001606:KCKIKHLGKCR MW:1313.6BNEP2001627:FCKIKHLGKCKKMW:1432.8BNEP2001628:KCKIKHLGKCKKMW:1413.8BNEP2001629:KCKIKHLGKCY MW:1320.6BNEP2001630:FCKIKHLGKCR MW:1332.6BNEP2001671:KCAQKRFLKMCKMW:1483.9BNEP2001677:YCAQKRFLKMCYMW:1553.9BNEP2001678:RCAQKRFLKMCYMW:1546.9BNEP2001681:KCKNLQRPLKLNQKCRMW:1970.3BNEP2001695:KGKGGFLIQLFHKK MW:1600.9BNEP2001708:RRPLIQLVKK MW:1250.5BNEP2001756:KKKILQLLKK MW:1239.6BNEP2001757:RRPILPRRMW:1063.3BNEP2001758:KSKHLGKAQKRFLK MW:1669.0或BNEP2001784:KIKVLFHKSK MW:1227.5。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，優(yōu)選BNEP9800892:KIKHLGKKSKVGFLQLLFHKK MW:2478.0BNEP9700031:KGKVLGKAQKRFLK MW:1600.9BNEP9801013:KSKVGFLQLLFHKKLRGSLTKLKGMW:2727.3BNEP9801087:KSKVGFLIQLFHKK MW:1673.0BNEP9801095:KTKVGFLIQLFHKK MW:1687.0BNEP9801286:KTKGGFLQLLFHKK MW:1643.0BNEP9801287:KGKGGFLQLLFHKK MW:1600.9BNEP9801289:KSKGGFLQLLFHKK MW:1630.9BNEP9901311:KGKGGWLIQLFHKK MW:1639.9BNEP9901312:KSKGGWLIQLFHKK MW:1670.0BNEP9901315:KTKGGWLIQLFHKK MW:1684.0BNEP9901317:KGKVGFLQLLFHKK MW:1643.0BNEP9901318:KTKVGFLQLLFHKK MW:1687.0BNEP9901321:KTKVGWLQLLFHKK MW:1726.1BNEP9901318:KTKVGFLQLLFHKK MW:1687.0BNEP9901319:KSKVGWLQLLFHKK MW:1712.0BNEP9901501:KSKSGFLQLLFHKK MW:1661.0BNEP2001695:KGKGGFLIQLFHKK MW:1600.9或BNEP2001758:KSKHLGKAQKRFLK MW:1669.0。
3．根據(jù)權利要求1所述的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，還可以是66個多肽中，至少兩個相同或不同的肽相連組成的多肽。
4．根據(jù)權利要求1所述的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽，還可以是端基或側鏈經(jīng)過化學修飾的66個多肽。
5．制備權利要求1所述抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的方法，通過目前已知在自然界生物體內(nèi)存在的具有結合內(nèi)毒素活性的物質，進行同源性對BPI，對BPI分子的一級序列親疏水性、三維結構和表面靜電勢分布情況進行分析，模擬結果表明BPI的生物學功能區(qū)主要定位在N端的三個LOOP區(qū)，確定與內(nèi)毒素結合的結構域為N端結構域LOOP區(qū)，而且其與受體的主要作用方式是靜電作用，制定的模擬肽設計方案為a．兩端為強正電勢分布的螺旋結構；b．正電勢分布的轉角螺旋結構；c．正電勢分布的強螺旋折疊傾向結構；d．BPI N端LOOP區(qū)天然肽段的改善型結構；在計算機輔助下進行模擬多肽的分子設計，模擬設計出具有更強殺菌和中和LPS活性的多肽分子，用Merrifield固相多肽化學合成方法合成抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽。
6．權利要求5所述的制備抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的方法，其特征在于計算機模擬所用工作站為SGI Indigo2系列Solid Impact R1000圖形工作站，模擬系統(tǒng)為Biosym/MSI分子模擬系統(tǒng)，所有工作均在INSIGHT Ⅱ工作平臺上進行，靜電勢計算所用軟件為DelPhi，蛋白質一級序列搜索所用軟件為FASIA程序，蛋白序列庫為EMBL。
7．根據(jù)權利要求5所述的制備抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的方法，其特征在于Merrifield固相多肽化學合成方法為a．肽樹脂的合成稱取適量Fmoc-L-Lys-PEG-PS樹脂(或其它多肽合成樹脂)倒入合成柱中，加入溶劑溶脹，按照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的氨基酸序列依次稱取適量的Fmoc-氨基酸于適宜的容器中；按照merrifield發(fā)明的固相化學合成方法依照本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的氨基酸序列從C端開始依次進行，在合成柱中加入含20％六氫吡啶的DMFDeblock液脫肽樹脂F(xiàn)moc保護基團、加入適量DMF溶解Fmoc-氨基酸后加入合成柱中、再分別加入適量二異丙基乙胺(DIPEA)和氮雜苯并三唑甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)的DMF溶液于柱中進行偶連反應、偶連后合成柱中的肽樹脂用DMF洗去殘余的Fmoc-氨基酸、惰性氣體吹干等制備過程，如此循環(huán)完成整個抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽的肽鏈形成而得到其肽樹脂；從合成柱中取出合成的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽樹脂，置到冷凍干燥機中凍干，得到肽樹脂備用；b．肽樹脂的裂解取上述肽樹脂于容器中，加入裂解液4.5ml三氟乙酸+0.25ml硫代苯甲醚+0.1ml苯甲醚+0.15ml 1,2-乙二硫醇，于室溫避光反應2小時，過濾，濾液于室溫濃縮后，加入預先冷凍的無水乙醚中，冰凍過夜，離心，棄上清液，沉淀用適量冰醋酸溶解，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得粗肽；c．粗肽的純化取BNEP粗肽加入適量無熱源水溶解，得到樣品溶液，過濾并收集樣品濾液；將乙腈及無熱源水用0.45u濾膜過濾，分別加入0.1％的三氟乙酸，混勻，用C18反相柱，流動相A100％H2O+0.1％三氟乙酸；流動相B100％乙晴+0.1％三氟乙酸，0→15min梯度洗脫純化，得BNEP精肽。
8．權利要求1所述的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽在殺滅細菌上的應用。
9．權利要求1所述的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽用于治療內(nèi)毒素血癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過計算機模擬設計、人工合成的66個抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽,根據(jù)對BPIN端三個LOOP區(qū)的空間構象分析及物理化學性質分析,在計算機輔助下進行模擬多肽的分子設計,設計出具有中和LPS活性的多肽分子,用固相多肽化學合成方法合成抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽,本發(fā)明的抗菌/抗內(nèi)毒素模擬肽具有全部或部分BPI的生物功能,可以用于治療G
文檔編號A61K38/16GK1308086SQ0110459
公開日2001年8月15日 申請日期2001年2月14日 優(yōu)先權日2001年2月14日
發(fā)明者鄭江, 周紅 申請人:鄭江, 周紅