專利名稱：藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物，尤其是前列腺癌等內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病的疼痛緩解藥、緩解成骨性病變的治療藥和/或緩解成骨所伴隨的疼痛的藥物、前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移中的成骨性病變的改善劑和/或緩解前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的疼痛的藥物、前列腺癌的癌細胞增殖抑制劑；或是前列腺癌的進展抑制劑。
背景技術(shù)：
N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其鹽在國際專利出版物97/22595中有記載，其中揭示了它對ET-1與內(nèi)皮素ETA受體的結(jié)合有抑制作用，且對ET-1誘發(fā)的血管收縮和血壓升高有抑制作用，暗示它可用來處理包括心血管疾病在內(nèi)的有內(nèi)皮素參與的各種疾病。
為了創(chuàng)制新的治療藥，本發(fā)明者對N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其鹽對疾病的治療可能性進行了更具體的研究。
發(fā)明揭示本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其鹽能有效地緩解癌癥(尤其是前列腺癌、乳癌、卵巢癌)、關(guān)節(jié)炎、前列腺炎、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、周圍動脈閉塞、月經(jīng)困難、偏頭痛、心絞痛、急性心肌梗塞、腦梗塞、蛛網(wǎng)膜下出血、糖尿病性神經(jīng)障礙、類風濕性關(guān)節(jié)炎、青光眼、消化性潰瘍、生育時的陣痛等內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病的疼痛，從而完成了本發(fā)明。
據(jù)報道，ET-1在人和試驗動物中誘發(fā)疼痛。例如，將ET-1給予人肱動脈引起了肌肉局部缺血疼痛(J.Hypertension，8，811-817，1990)。另外，據(jù)報道，在廣泛采用的疼痛模型小鼠福爾馬林疼痛模型中，ET-1使福爾馬林引起的疼痛的第一階段和第二階段有意義地增強(Can.J.Physiol.Pharmacol.，75，596-600，1997)。在該模型中，第一階段指由于感覺神經(jīng)直接刺激而產(chǎn)生疼痛，第二階段指由于炎癥繼發(fā)反應而產(chǎn)生疼痛(Pain，38，247-352，1989)。
如下述試驗例1所示，本發(fā)明的有效成分在小鼠福爾馬林疼痛模型中對ET-1引起的疼痛增強有抑制作用。
另外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其鹽能有效地改善成骨性病變和/或有效地緩解成骨所伴隨的疼痛，從而完成了本發(fā)明。
由于具有破骨細胞抑制作用且改善骨代謝的雙膦酸鹽類有改善乳癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的骨疼痛效果，因此認為長期骨疾病的改善與骨疼痛的改善相結(jié)合。與乳癌骨轉(zhuǎn)移患者不同，在前列腺癌患者中，觀察到成骨性骨轉(zhuǎn)移病變(Semin.，Oncol.，21，630-656，1996)，作用于成骨細胞來改善骨代謝的藥物預計也具有改善前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的骨疼痛的效果。
據(jù)報道，ET-1對小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1以及來自大鼠頭蓋骨的原代培養(yǎng)的成骨細胞顯示出通過ETA受體使胞內(nèi)Ca2+濃度上升、DNA合成增加和ALP活性降低的作用。(Am.J.Physiol.，257，E797-E803，1989/Biochem.Biophys.Res.Commun.，170(3)，998-1005，1990/Bone，21(2)，143-146，1997)。
如下述試驗例2所示，本發(fā)明的有效成分對ET-1誘發(fā)的小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1的細胞應答顯示出抑制作用。
另外，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其鹽能有效緩解前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的疼痛，或能有效改善前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移引起的成骨性病變，從而完成了本發(fā)明。
據(jù)報道，人前列腺癌細胞株具有產(chǎn)生ET-1的能力(Nat.Med.1(9)，944-949，1995)并通過ETA受體顯示出增殖的能力(Cancer Res，56，663-668，1996)，與沒有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者相比，有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的血漿中ET-1濃度上升(Nat.Med.，1(9)，944-949，1995)，將這些報告與試驗例1和2的結(jié)果結(jié)合考慮，強烈暗示本發(fā)明的有效成分能有效地改善前列腺癌患者的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的疼痛或能有效地改善前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所引起的成骨性病變。另外，如下述試驗例5所示，本發(fā)明的有效成分使前列腺癌患者的疼痛評分和鎮(zhèn)痛藥用量降低，使骨代謝標志減少。
另外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其鹽能有效地抑制前列腺癌的癌細胞增殖，從而完成了本發(fā)明。
如下述試驗例3和4所示，本發(fā)明的有效成分顯示出對ET-1引起的激素非依賴性前列腺癌細胞的細胞增殖有抑制效果。
另外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其鹽能有效地抑制前列腺癌的進展，從而完成了本發(fā)明。
如下述試驗例5所示，本發(fā)明的有效成分抑制或減少了前列腺癌患者的前列腺癌標志的增大。
即，本發(fā)明涉及用來緩解癌癥(尤其是前列腺癌、乳癌、卵巢癌)、關(guān)節(jié)炎、前列腺炎、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、周圍動脈閉塞、月經(jīng)困難、偏頭痛、心絞痛、急性心肌梗塞、腦梗塞、蛛網(wǎng)膜下出血、糖尿病性神經(jīng)障礙、類風濕性關(guān)節(jié)炎、青光眼、消化性潰瘍、生育時陣痛等內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病的疼痛的藥物組合物、用來改善成骨性病變的藥物組合物、和/或緩解成骨所伴隨疼痛的藥物組合物；尤其是，用來改善前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移引起的成骨性病變的藥物組合物；和/或用來緩解前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的疼痛的藥物組合物，這些藥物組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
另外，本發(fā)明涉及N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽在制造前列腺癌等內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病的疼痛緩解藥、成骨性病變的改善藥和或成骨所伴隨疼痛的緩解藥，尤其是改善前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移引起的成骨性病變的藥物和/或緩解前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的疼痛的藥物中的用途。
另外，本發(fā)明還涉及一種緩解前列腺癌等內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病的疼痛和/或成骨伴隨的疼痛，尤其是前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移伴隨的疼痛的方法，該方法包括將治療有效量的N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽給予患者。另外，本發(fā)明還涉及一種改善成骨性病變、尤其是前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移引起的成骨性病變的方法，該方法包括將治療有效量的N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽給予患者。
另外，本發(fā)明還涉及用來抑制前列腺癌的癌細胞增殖的藥物組合物和/或用來抑制前列腺癌進展的藥物組合物，該藥物組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
另外，本發(fā)明還涉及N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽在制造前列腺癌癌細胞增殖抑制藥和/或前列腺癌進展抑制藥中的用途。
另外，本發(fā)明還涉及一種抑制前列腺癌癌細胞增殖和/或前列腺癌進展的方法，該方法包括將治療有效量的N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽給予患者。
另外，由于本發(fā)明的有效成分的經(jīng)口吸收性特別好，所以可制成優(yōu)秀的口服治療藥。如下述試驗例6所示，本發(fā)明的有效成分在給人口服給藥時，以現(xiàn)有ETA受體拮抗藥ABT-627[1-(N，N-二丁基氨基甲酰甲基)-2(R)-(4-甲氧基苯基)-4(S)-(3，4-亞甲基二氧苯基)吡咯烷-3(R)-甲酸]的1/2的用量，血漿中的濃度明顯較高，AUC約為18倍。
下面將詳細地描述本發(fā)明。
本發(fā)明藥物的有效成分是N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽。所述鹽可列舉上述國際出版物97/22595中記載的鹽，具體可列舉鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、天冬氨酸和谷氨酸等有機酸的酸加成鹽，以及與鈉、鉀、鎂、鈣和鋁等無機堿，與甲胺、乙胺、乙醇胺、賴氨酸和鳥氨酸等有機堿的鹽以及銨鹽。特別佳的列舉鉀鹽。
另外，各種異構(gòu)體的混合物及分離的異構(gòu)體、有效成分的水合物、溶劑化物均包括在本發(fā)明的有效成分中。另外，本發(fā)明的有效成分有時是具有多晶型化合物，這些結(jié)晶形式也全部包括在內(nèi)。
這些化合物可用上述國際出版物97/22595中記載的制法或根據(jù)這些制法不難制得。
本發(fā)明的藥物可用適合經(jīng)口或非經(jīng)口給藥的有機或無機載體、賦形劑、其它添加劑根據(jù)常規(guī)方法來配制出口服固體制劑、口服液體制劑或注射劑。由于本發(fā)明藥物的有效成分具有優(yōu)秀的口服吸收性，因此，本發(fā)明的藥物適合用作經(jīng)口制劑。最佳的是可由患者自己服用且保存和攜帶方便的經(jīng)口固體制劑。
作為經(jīng)口固體制劑，可采用片劑、粉末劑、細顆粒劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋劑等。在這樣的固體制劑中，可將一種或多種活性物質(zhì)與至少一種無活性的稀釋劑(例如乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、微晶纖維素、淀粉、玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和硅酸鋁鎂)混合。根據(jù)常規(guī)方法，組合物還可含有無活性的稀釋劑以外的添加劑，例如諸如羥丙基纖維素和羥丙基甲基纖維素(HPMC)等粘合劑；諸如硬脂酸鎂、聚乙二醇、淀粉和滑石粉等潤滑劑；諸如纖維素乙醇酸鈣和羧甲基纖維素鈣等崩解劑；諸如乳糖等穩(wěn)定劑；諸如谷氨酸或天冬氨酸等溶解助劑；諸如聚乙二醇等增塑劑；和諸如氧化鈦、滑石和黃色氧化鐵等著色劑。片劑或丸劑可根據(jù)需要用蔗糖、明膠、瓊脂、果膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二酸酯等的糖衣或胃溶性或腸溶性物質(zhì)的薄膜包衣。
經(jīng)口液體制劑包括制藥學上容許的乳劑、液劑、懸浮劑、糖漿劑、酏劑等，并含有一般采用的無活性稀釋劑如純化水、乙醇等。除無活性稀釋劑外，該組合物還可含有潤濕劑、懸浮劑那樣的助劑、增甜劑、調(diào)味劑、芳香劑、防腐劑。
作為靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射等的注射劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸浮劑、乳劑。水性溶液、懸浮劑的稀釋劑例如包括注射用蒸餾水和生理鹽水。非水性溶液、懸浮劑的稀釋劑例如有丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等植物油、乙醇等醇類、聚山梨酯80等。該組合物中還可含有防腐劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑(例如乳糖)、溶解助劑(例如谷氨酸、天冬氨酸)等助劑。這些組合物可例如通過除菌濾膜過濾、與殺菌劑混合或輻照等方式來滅菌。另外，它們可以制成無菌固體組合物，在使用前用無菌水或無菌注射用溶劑溶解使用。
本發(fā)明的有效成分化合物的給藥量宜考慮給藥途徑、疾病癥狀、給藥對象的年齡、性別等對個別場合作適當決定，但是通常在經(jīng)口給藥的場合，每個成人1日給予有效成分為0.1-500毫克/日，較佳地為1-250毫克/日，可分1-2次給藥。
另外，本發(fā)明的藥物能與其它疼痛緩解藥同時或分開合用。例如，對于前列腺癌、乳癌等癌性疼痛，可列舉WHO癌性疼痛治療法中使用的嗎啡等強阿片樣鎮(zhèn)痛藥、噴他佐辛和丁丙諾啡等弱阿片樣鎮(zhèn)痛藥、以及吲哚美辛和布洛芬等非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥。
另外，本發(fā)明的藥物能與用來治療內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病的其它藥物同時或分開合用。例如，作為能與本發(fā)明藥物合用的前列腺癌治療藥，可列舉異環(huán)磷酰胺、喃氟啶·尿嘧啶等抗惡性腫瘤藥、炔雌醇等雌激素、氫化可的松、潑尼松龍和貝美它宗(bemethazone)等腎上腺皮質(zhì)激素，乙酸氯地孕酮等孕激素，乙酸亮丙瑞林等LH-RH衍生物，乙酸戈舌瑞林等LH-RH激動劑，順鉑等抗惡性腫瘤鉑復合物，氟他胺等抗雄激素劑，磷雌酚和雌莫司汀磷酸鈉等前列腺癌治療藥，以及硫酸培洛霉素等抗腫瘤性抗生素。
圖面的簡單說明

圖1顯示了ET-1引起的對福爾馬林疼痛的增強作用(A.第一階段，B.第二階段，C.水腫)。
圖2顯示了化合物1對于ET-1引起的福爾馬林疼痛增強作用的抑制作用(A.第一階段，B.第二階段，C.水腫)。
圖3顯示了化合物1對于ET-1誘發(fā)的小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1的胞內(nèi)Ca2+濃度上升的抑制效果。
圖4顯示了化合物1對于ET-1誘發(fā)的小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1的細胞增殖([3H]-胸苷合并(摻入))的抑制效果。
圖5顯示了化合物1對于ET-1誘發(fā)的小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1的細胞增殖(細胞數(shù))的抑制效果。
圖6顯示了化合物1對于ET-1誘發(fā)的激素非依賴性人前列腺癌細胞PPC-1的細胞增殖的抑制效果。
實施發(fā)明的最佳方式下面將根據(jù)實施例和試驗例更詳細地說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不局限于這些實施例。另外，下面的實施例中所用的化合物1指N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺的鉀鹽。
實施例1 膠囊劑表1

混合上述成分，填入膠囊，制得膠囊劑。
試驗例1 化合物1在小鼠福爾馬林疼痛模型中對于ET-1引起的疼痛增強作用的抑制作用化合物1的抑制效果(方法)(1)使用的動物在試驗中使用雄性ICR小鼠(5周齡，日本SLC)。
(2)疼痛反應的測定將小鼠放入觀察用籠子5分鐘以上，使其適應環(huán)境。然后將20微升生理鹽水皮下注入小鼠左后腿足跖中，將20微升含0.7％福爾馬林的生理鹽水注入右后腿足跖中。每5分鐘測定此后立即出現(xiàn)的舔舐和咬的反應的持續(xù)時間，共40分鐘。計時終了后，切下兩個腳踝測定重量。以緊接給予福爾馬林后的5分鐘內(nèi)的反應時間作為第一階段，以給藥后10分鐘開始到40分鐘為止的30分鐘內(nèi)的反應時間總量為第二階段，將它們作為疼痛指標。另外，根據(jù)右足重量-左足重量(毫克)算出的水腫作為炎癥反應的指標。
另外，舔舐的反應時間的計時全部均在1000至1800之間進行。
(3)測試藥物將含ET-1和0.7％福爾馬林的生理鹽水以3，10，30皮摩爾/足跖的用量皮下給予右后腿足跖內(nèi)，檢查ET-1對于福爾馬林疼痛以及水腫的增強作用。
將化合物1(0.3-3毫克/千克)以1毫升/100克的容量經(jīng)口給藥，給藥后60分鐘將含ET-1(10皮摩爾/足跖)和0.7％福爾馬林的生理鹽水皮下給予右后腿足跖內(nèi)，檢查化合物1對于ET-1誘發(fā)的福爾馬林疼痛以及水腫增強作用的效果。
(4)統(tǒng)計處理結(jié)果用平均值±標準誤差表示。檢查兩者間差別顯著性，用不成對的司徒登特t檢驗算出p值。多組間的差別顯著性可用單因素方差分析來解析，用Dunnett的多組比較算出p值。p值在5％以下的場合認為是有意義的。
(結(jié)果)(1)ET-1引起的福爾馬林疼痛和水腫增強的作用通過將0.7％福爾馬林溶液皮下給予小鼠后腿足跖內(nèi)，觀察2相疼痛反應。發(fā)現(xiàn)接近給藥后5分鐘內(nèi)出現(xiàn)的暫時的疼痛反應(有舔舐反應和咬反應，第一階段)，在福爾馬林溶液給藥后20分鐘前后達到峰值水平的持續(xù)性疼痛反應(第二階段)。(圖1A，1B)。另外，通過給予0.7％福爾馬林溶液，引起后腿水腫(圖1C)。
當福爾馬林溶液和ET-1(3，10，30皮摩爾/足跖)同時給藥后，第一階段、第二階段和水腫以依賴于劑量的方式顯著增強(圖1A，1B，1C)。
(2)測試藥對ET-1引起的福爾馬林疼痛增強作用的效果化合物1(0.3，1，3毫克/千克，p.o.)對于ET-1(10皮摩爾/足跖)誘發(fā)的福爾馬林疼痛(第一階段、第二階段)和水腫的增強作用被顯著抑制(圖2A，2B，2C)。
試驗例2抑制ET-1誘發(fā)的成骨細胞樣細胞MC3T3-E1的細胞增殖的試驗(方法)(1)使用的細胞試驗中采用小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1(Journal of Cell Biology，96(1)，191-198，1983)。
(2)胞內(nèi)Ca2+濃度的測定將細胞培養(yǎng)在細胞平皿(直徑為13.5毫米)上，至鋪滿后，在不存在血清下培養(yǎng)約12小時以上后，用于試驗。向在Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)(140mM NaCl，4mM KCl，1mM K2HPO4，1mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM葡萄糖，20mM Hepes，pH＝7.4)中的細胞，加入Fura 2-AM(4μM)后在37℃下培養(yǎng)1小時。將細胞平皿固定在加入了HBSS的石英池中，將該石英池裝入胞內(nèi)Ca2+測定裝置(CAF-110)中，在37℃、攪拌子攪拌的恒定條件下開始實驗。胞內(nèi)Ca2+濃度的測定如下用340/380納米的激發(fā)波長，測定500納米的熒光強度之比，從所得熒光強度比根據(jù)計算式算出胞內(nèi)Ca2+濃度(J.Biol.Chem.，260，3440-3450，1985)。
(3)DNA合成量的測定DNA合成量是測定[3H]標記的胸苷的摻入量。將細胞以1.5×104細胞/孔的比例接種到96孔板中，用FCS 0.2％培養(yǎng)基培養(yǎng)2日。然后加入溶劑和ET-1，培養(yǎng)24小時。然后在培養(yǎng)液中添加[3H-甲基]-胸苷(0.5μCi/孔)，脈沖標記6小時。然后添加SDS溶液使最終濃度為0.2％，細胞溶解后，用液體閃爍計數(shù)器測定DNA合成中被使用的[3H-甲基]-胸苷的放射活性。作為對照以添加溶劑的測定值為100％，算出DNA合成的增加率。
(4)細胞數(shù)的測定細胞數(shù)用細胞計數(shù)試劑盒(DOJINDO)的試劑溶液來測定。將細胞以1.0×104細胞/孔的比例接種到24孔板中，用FCS 0.5％培養(yǎng)基培養(yǎng)1日。然后加入溶劑和ET-1，培養(yǎng)72小時。然后在培養(yǎng)液中添加100微升/孔的試劑溶液，在37℃下培育3小時。反應后，從24孔板的各孔中各移取200微升轉(zhuǎn)移到96孔板中，在平板讀數(shù)儀下測定吸光度(波長為405納米，參照波長為650納米)。作為對照以加入了溶劑的測定值為100％，算出細胞數(shù)增加率。
(5)測試藥物在各個實驗中，以ET-1在10-13至10-6M，化合物1在10-12至10-4M的濃度范圍(均是10倍稀釋比)作為最終濃度進行實驗。在胞內(nèi)Ca2+濃度測定中，化合物1在ET-1添加約2分鐘前添加，在其它的實驗中，化合物1在ET-1添加的約2小時前添加。
(6)統(tǒng)計處理結(jié)果用平均值±標準誤差表示。組間差別的顯著性用單因素方差分析來解析，用Dunnett的多組比較算出p值。p值在5％以下的場合認為是有意義的。各實驗的ET-1的EC50值和化合物的IC50值根據(jù)Logistic回歸法來算出。
(結(jié)果)(1)化合物1對于ET-1誘發(fā)的MC3T3-E1的胞內(nèi)Ca2+濃度上升的抑制效果在小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1中，ET-1(10-12至10-6M)使胞內(nèi)Ca2+濃度以濃度依賴性方式上升(圖3A)。ET-1的EC50值是7.39×10-9M?；衔?(10-12至10-4M)濃度依賴性地抑制ET-1(10-8M)誘發(fā)的胞內(nèi)Ca2+濃度上升作用(圖3B)?；衔?的IC50值是1.02×10-8M。
(2)化合物1對于ET-1誘發(fā)的MC3T3-E1的細胞增殖的抑制效果在小鼠成骨細胞樣細胞MC3T3-E1中，ET-1(10-13至10-6M)使[3H]-胸苷摻入量以依賴于濃度的方式有意義地上升，使DNA合成增加(圖4A)。ET-1的EC50值是9.84×10-12M?；衔?(10-12至10-6M)濃度依賴性地抑制ET-1(10-10M)誘發(fā)的[3H]-胸苷摻入上升作用(圖4B)?；衔?的IC50值是1.15×10-8M。
同樣，在通過WST-1測定細胞數(shù)的實驗中，ET-1(10-12至10-6M)使MC3T3-E1的細胞數(shù)以依賴于濃度的方式有意義地上升(圖5A)。ET-1的EC50值是2.20×10-11M?；衔?(10-11至10-6M)濃度依賴性地抑制ET-1(10-9M)誘發(fā)的細胞數(shù)上升作用(圖5B)?；衔?的IC50值是9.54×10-9M。
試驗例3對ET-1誘發(fā)的激素非依賴性人前列腺癌細胞的細胞增殖的抑制試驗(1)(方法)(1)使用的細胞本實驗中使用激素非依賴性人前列腺癌細胞株P(guān)PC-1(International Journal ofCancer，44，898-903，1989)。
(2)ET-1對于PPC-1細胞增殖的作用以及測試藥對該增殖的抑制效果的檢查測定DNA合成量作為細胞增殖的指標。DNA合成量是測定[3H]標記的胸苷的摻入量。將細胞以1×104細胞/孔的比例接種到96孔板中，用不含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基培養(yǎng)5日。然后加入溶劑和ET-1，培養(yǎng)24小時。然后在培養(yǎng)液中添加[3H-甲基]-胸苷(0.5μCi/孔)，脈沖標記6小時。然后添加SDS溶液使最終濃度為0.2％，細胞溶解后，用液體閃爍計數(shù)器測定DNA合成中被使用的[3H-甲基]-胸苷的放射活性。作為對照以添加溶劑的測定值為100％，算出DNA合成的增加率。
(3)測試藥物在本實驗中，以ET-1在10-13至10-6M(10倍稀釋比)，化合物1在10-10至3×10-6M的濃度范圍(3倍稀釋比)作為最終濃度進行實驗?；衔?在ET-1添加的約2小時前添加。
(4)統(tǒng)計處理結(jié)果用平均值±標準誤差表示。組間差別的顯著性用單因素方差分析來解析，用Dunnett的多組比較算出p值。p值在5％以下的場合認為是有意義的?；衔?的IC50值根據(jù)Logistic回歸法來算出。
(結(jié)果)如圖6A所示，在激素非敏感性人前列腺癌細胞株P(guān)PC-1中，ET-1(10-13至10-6M)使[3H]-胸苷摻入量以依賴于濃度的方式有意義地上升，顯示出細胞增殖促進作用。ET-1的作用在10-8M以上有意義。
化合物1(10-10至3×10-6M)濃度依賴性地抑制ET-1(10-8M)誘發(fā)的PPC-1細胞增殖促進作用，其IC50值是28±9.8nM(圖6B)?；衔?的抑制作用在3×10-7M以上有意義。
試驗例4 對ET-1誘發(fā)的激素非依賴性人前列腺癌細胞的細胞增殖的抑制試驗(2)(方法)(1)使用的細胞本實驗中使用激素非依賴性人前列腺癌細胞株P(guān)PC-1(International Journal ofCancer，44，898-903，1989)。
(2)ET-1引起的增殖反應以及測試藥對ET-1誘發(fā)的增殖的抑制效果的檢查用alamar blue的試驗溶液測定細胞數(shù)。將細胞以2×104細胞/孔的密度接種到24孔板中，附著后，將培養(yǎng)基改為不含F(xiàn)CS的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時。然后添加溶劑和ET-1(10-11至10-6M)，培養(yǎng)96小時。使培養(yǎng)基的最終容量為500微升，在培養(yǎng)液中添加50微升alamar blue，培育4小時。反應后，從24孔板的各孔中取出100微升反應液，轉(zhuǎn)移加入96孔板中，在平板讀數(shù)儀下測定吸光度(波長405納米，參照波長650納米)。作為對照以添加溶劑的測定值作為100％，算出細胞數(shù)的增加率。
在測試化合物的抑制效果時，化合物1的最終濃度為10-9至10-5M，在10-7M的ET-1添加之前30分鐘添加。
另外，在本實驗中，由于ET-1可能會分解，所以在刺激后48小時換成新的ET-1培養(yǎng)基。
(結(jié)果)
如下表2所示，ET-1從10-11M開始觀察到有ET-1引起的PPC-1的細胞增殖作用。
表2

(n＝7)另外，如表3所示，觀察到化合物1從10-6M開始對10-7M的ET-1引起的PPC-1細胞增殖有抑制作用。
表3

(n＝7)試驗例5 對前列腺癌患者的臨床試驗(方法)在下列條件下對前列腺癌患者進行臨床試驗。
對象激素非依賴性的或抗雄激素療法后復發(fā)的D2期前列腺癌患者18名(45歲以上)測試藥化合物1劑型2，10和40毫克片劑用量2、4、10、20、60、120和240毫克/日(1日1或2次給藥)給藥期間4周(28日)評價指標在給藥前后測定以下項目。
(1)前列腺特異性抗原(PSA)
(2)骨標志物(骨堿性磷酸酶或脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline))(3)骨疼痛(疼痛評分VAS(直觀類比尺度法)的變化/鎮(zhèn)痛藥的用量變化)(結(jié)果)發(fā)現(xiàn)化合物1從2毫克/日的用量起改善了各效果指標?；衔?使18名患者中的9名的疼痛評分VAS得到改善?；衔?使18名患者中4名的鎮(zhèn)痛藥用量降低?；衔?改善了10名患者的前列腺癌標志PSA，維持了2名患者的PSA。化合物1使18名患者中11人的骨代謝標志骨堿性磷酸酶減少，使18名患者中14人的骨代謝標志脫氧吡啶啉/肌酸酐之比改善大約40％。
試驗例6 經(jīng)口給予人時的血漿中濃度(方法)為了評價化合物1的經(jīng)口給藥時的藥物動力學、耐受性和安全性，以3名進行了前列腺切除手術(shù)的進行性前列腺癌患者為對象，一次給藥10毫克化合物1。為了測定血漿中完整化合物1的濃度，在給藥前和給藥后30分鐘、1小時、1小時30分鐘、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、12小時、24小時、36小時和48小時的各時間點將6毫升血液采集到含肝素鋰的聚乙烯管內(nèi)，迅速離心分離(4℃，10分鐘，3500rpm)，得到血漿。血漿樣品-70℃冷凍保藏直至測定濃度。血漿中的濃度用LC-MS/MS法測定。
(結(jié)果)如表4所示，與20毫克ABT-627給藥時相比，10毫克化合物1單次經(jīng)口給藥時的Cmax和AUC顯示出分別為約11倍和約18倍的高數(shù)值。
表4

*)第6屆內(nèi)皮素國際研討會，1999年10月10-13日，第219號摘要根據(jù)試驗例1的結(jié)果，確認化合物1可用作內(nèi)皮素誘發(fā)性疾病的疼痛緩解藥。
根據(jù)試驗例2的結(jié)果，確認化合物1可用作改善成骨性骨疾病和緩解成骨伴隨的疼痛的藥物。
另外，在試驗例2中，ET-1從1×10-11M的非常低的濃度開始顯示出引起成骨細胞樣細胞應答。在關(guān)于人前列腺癌細胞株產(chǎn)生ET-1的能力的報告中，報道106細胞在24小時內(nèi)產(chǎn)生了約數(shù)十pg/ml的ET-1(Nat.Med.，1(9)，944-949，1995)。該濃度為對應于1×10-11M。試驗例2的結(jié)果強烈暗示，在前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移患者的骨轉(zhuǎn)移部位中，前列腺癌細胞產(chǎn)生的ET-1很可能形成成骨性骨病變。在試驗例2中，約10nM的低濃度化合物1顯示出對由ET-1引起的成骨細胞樣細胞應答有抑制作用。因此，強烈暗示化合物1對于有ET-1參與的前列腺癌患者的成骨性骨病變有改善效果。另外，與試驗例1的結(jié)果綜合考慮，強烈暗示化合物1可用作緩解前列腺癌骨轉(zhuǎn)移伴隨的疼痛的藥物。
另外，根據(jù)試驗例5的結(jié)果，也能確認化合物1可用作緩解前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的疼痛的藥物。
根據(jù)試驗例3和4的結(jié)果，確認化合物1可用作對激素有抗性的前列腺癌的癌細胞增殖抑制劑，強烈暗示化合物1具有前列腺癌進展抑制效果。
另外，根據(jù)試驗例5，也能確認化合物1是有效的前列腺癌進展抑制劑。
還有，在試驗例6中，化合物1以已知ETA受體拮抗劑ABT-627的1/2用量獲得了高大約18倍的AUC，顯示出化合物1經(jīng)口給藥時的經(jīng)口吸收性和藥物動力學特別優(yōu)異?；衔?對人ETA受體的親和性(Ki值)為0.697nM(WO97/22595)，ABT-627為0.48nM(J.Pharmacol.Exp.Ther.，276，473-481，1996)，雖然大致相同，但是預計化合物1是比ABT-627更好的經(jīng)口治療藥。
另外，在試驗例5中，化合物1從2毫克用量開始顯示出有效性，該用量是據(jù)報道從10毫克用量開始對前列腺癌患者能顯著改善疼痛的ABT-627(Proceedings ofASCO，Vol.19，1314，2000)的1/5用量，確認化合物1是優(yōu)良的前列腺癌經(jīng)口治療藥。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性根據(jù)本發(fā)明能提供臨床中有效的優(yōu)良的前列腺癌經(jīng)口治療藥。即，能提供癌癥(尤其是前列腺癌、乳癌)、關(guān)節(jié)炎、前列腺炎、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、周圍動脈閉塞、月經(jīng)困難、偏頭痛、心絞痛、急性心肌梗塞、腦梗塞、蛛網(wǎng)膜下出血、糖尿病性神經(jīng)障礙、類風濕性關(guān)節(jié)炎、青光眼、消化性潰瘍、生育時的陣痛等內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病的疼痛緩解藥。另外，還能提供成骨性病變的改善藥和/或成骨伴隨的疼痛緩解藥，尤其是前列腺癌骨轉(zhuǎn)移引起的成骨性病變改善藥和/或前列腺癌骨轉(zhuǎn)移伴隨的疼痛緩解藥。另外，本發(fā)明還能提供前列腺癌癌細胞增殖抑制藥和/或前列腺癌的進展抑制藥。
權(quán)利要求
1.一種用來緩解內(nèi)皮素誘導的疾病疼痛的藥物組合物，其特征在于，該組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，內(nèi)皮素誘發(fā)的疾病是前列腺癌。
3.一種用來改善成骨性病變的藥物組合物，其特征在于，該組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
4.一種用來緩解成骨所伴隨的疼痛的藥物組合物，其特征在于，該組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
5.一種用來緩解前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移所伴隨的疼痛的藥物組合物，其特征在于，該組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
6.一種用來改善前列腺癌骨轉(zhuǎn)移引起的成骨性病變的藥物組合物，其特征在于，該組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-密啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
7.一種用來抑制前列腺癌癌細胞增殖的藥物組合物，其特征在于，該組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用來抑制癌細胞增殖的藥物組合物，其特征在于，所述前列腺癌是激素非依賴性前列腺癌。
9.一種用來抑制前列腺癌進展的藥物組合物，其特征在于，該組合物含有N-[6-甲氧基-5-(2-甲氧基苯氧基)-2-(2-嘧啶基)-4-嘧啶基]-2-苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
全文摘要
一種用來治療前列腺癌的藥物組合物，它含有N－[6－甲氧基－5－(2－甲氧基苯氧基)－2－(2－嘧啶基)－4－嘧啶基]－2－苯基乙烯磺酰胺或其制藥學上容許的鹽作為有效成分。
文檔編號A61K31/505GK1434715SQ00818938
公開日2003年8月6日 申請日期2000年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月16日
發(fā)明者湯山弘法, 藤森明, 佐薙征直, 原田博規(guī), 小圷明子, 森美樹子, 山本信行 申請人:山之內(nèi)制藥株式會社