專利名稱：治療用合成寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于治療癌癥的寡核苷酸組合物。
增殖是通過細胞周期致使一個細胞分裂為兩個細胞的細胞連續(xù)積聚。細胞周期的5個主要階段是G0、G1、S、G2和M。在G0階段，細胞是靜止的。在任何時候，體內的大多數細胞處于該階段。G1階段期間，對應于分裂信號的細胞產生DNA合成所需的RNA和蛋白質。S-階段期間(SE早期S-階段；SM中期S-階段；和SL后期S-階段)，細胞復制其DNA。G2階段期間，構建蛋白質，為細胞分裂作制備。有絲分裂(M)階段期間，細胞分裂為兩個子細胞。細胞周期過程中的變化發(fā)生于所有癌癥中，這種變化可由基因的過度表達、調節(jié)基因的突變或DNA損傷關卡的消失引起(Hochhauser D.，Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8903，1997)。
與癌細胞不同，大多數正常細胞不會因為變化期的細胞衰亡而無限度地增殖。細胞衰亡是一種導致細胞生長停止的程序化細胞死亡反應(Dimri等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9220，1995)。據報道，DNA損傷，結腸、乳腺和卵巢癌細胞與拓撲異構體抑制劑的接觸以及鼻咽癌細胞與順鉑的接觸可通過誘導衰亡來防止這些細胞的增殖(Wang等，Cancer Res.585019，1998；Poele等，Br.J.Cancer 809，1999)。
合成寡核苷酸是在細胞中內在化的多陰離子序列(Vlassov等，Biochim.Biophys.Acta 119795，1994)。據報道，合成寡核苷酸選擇性地與核酸(Wagner，R.Nature372333，1994)、特異性細胞蛋白質(Bates等，J.Biol.Chem.27426369，1999)和特異性核蛋白質結合(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252207，1998)來抑制癌細胞的增殖。
據報道，合成的含鳥嘌呤(G)和可變數量的胸腺嘧啶(T)的27個堿基的序列(寡核苷酸GTn)，其中n1或7并且其中堿基的數量20(Scaggiante等，Eur.J.Biochem.252207，1998)通過序列與45kDa核蛋白質的特異性結合抑制癌細胞系的生長；但另據報道，其中堿基數量20的GTn對癌細胞系沒有活性(Morassutti等，Nucleosides andNucleotides 181711，1999)。據報道，兩種合成的用3’-氨基烷基修飾的15個堿基和29個堿基的富含GT的寡核苷酸形成G-四集體，該四集體與核仁蛋白結合并抑制癌細胞系的增殖(Bates等，J.Biol.Chem.27426369，1999)。據報道，合成的6堿基TTAGGG-硫代磷酸酯在體內和體外抑制非洲淋巴瘤細胞的增殖，所述硫代磷酸酯具有與哺乳動物端粒重復序列相同的序列(Mata等，Toxicol.Applied Pharmacol.144189，1997)。但另據報道，合成的6堿基TTAGGG-磷酸二酯不具有抗端粒酶的活性(US 5,643,890)。
細胞死亡可由促進細胞凋亡的免疫調節(jié)劑，或者由直接引發(fā)導致細胞死亡途徑的凋亡誘導劑引起(Muzio等，Cell 85817，1996；Levine，A.，Cell 88323，1997)。細胞凋亡是一種主動的細胞死亡過程，其特征在于顯著的形態(tài)學變化，這些變化包括核染質的縮聚、細胞皺縮、核破碎、原生質膜形成氣泡并形成膜結合的細胞凋亡體(Wyllie等，Int.Rev.Cytol.68251，1980)。細胞凋亡的分子標志是細胞核DNA分解為寡核小體長度的碎片，這是內源性內切核酸酶活化的結果(Wyllie A.，Nature 284555，1980)。
半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶(Caspases)作為一種關鍵酶參與細胞凋亡的后期過程。半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶家族包括至少14種有關的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶。所有的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶都包含保守的QACXG(其中X是R、Q或G)五肽活性位點基元(Cohen G.，Biochim.Biophys.Acta 1366139，1997)。許多半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶是作為無活性酶原被合成的，所述酶原在半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的特異性分解位點分解后被活化(Cohen G.，Biochim.Biophys.Acta 1366139，1997)；或者它們作為無活性的酶被合成，這些酶需與用于活化的調節(jié)分子結合(Stennicke等，J.Biol.Chem.2748359，1999)。
除了它們在細胞凋亡中的作用以外，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶還與B和T淋巴細胞的活化和增殖、炎癥期間細胞因子的成熟、紅細胞生成期間祖代細胞的分化和晶狀體纖維的發(fā)育有關(Fadeel等，Leukemia 141514，2000)。關于B和T淋巴細胞，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3在B淋巴細胞以及CD4(+)、CD8(+)、CD45RA(+)和CD45RO(+)亞型的T淋巴細胞的活化中起作用(Alam等，J.Exp.Med.1901879，1999)。此外，促細胞分裂劑和白介素-2對T淋巴細胞的刺激與半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶途徑的活化和PARP的分解有關(Wilheim等，Eur.J.Immunol.28891，1998)。關于細胞因子，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3活性是通過活化的T淋巴細胞釋放IL-2(Posmantur等，Exp.Cell Res.244302，1998)和促炎細胞因子白介素-16的加工和成熟所必需的(Zhang等，J.Biol.Chem.2731144，1998)。關于紅細胞生成，半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的活化與紅細胞生成的調節(jié)有關，據示該酶調節(jié)GATA-1，一種對于紅細胞前體的成熟至關重要的核調節(jié)蛋白質(De Maria等，Nature 401489，1999)。
細胞溶解是細胞的完全或部分破壞，它由免疫系統(tǒng)介導?；罨木奘杉毎蛦魏思毎a生包括，但不限于細胞因子的生物活性分子。細胞因子包括，但不限于白介素(IL)-1、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α。
IL-1β降低骨髓細胞對細胞減少性藥物、放射和自體骨髓移植中使用藥物的體外腫瘤細胞清除的敏感性(Dalmau等，Bone Marrow Transplant.12551，1993)。
IL-6誘導B細胞分化，刺激IgG分泌(Taga等，J.Exp.Med.166967，1987)，誘導細胞毒性T細胞分化(Lee等，Vaccine 17490，1999)并促進巨核細胞成熟(Ishibashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868953，1989)，并且對癌細胞還具有抗增殖因子(Mori等，Biochem.Biophys.Res.Comm.257609，1999；Alexandroff等，Biochem.Soc.Trans.25270，1997；Takizawa等，Cancer Res.5318，1993Novick等，Cytokine 46，1992)和增殖前因子(proproliferative factor)的功能(Okamoto等，Cancer Res.57141，1997；Okamoto等，Int.J.Cancer 72149，1997；Chiu等，Clin.Cancer Res.2215，1996；Lu等，Clin.Cancer Res.21417，1996)。
在鼠的腫瘤模型中，IL-10提高疫苗的效力(Kauffman等，J.Immunother.22489，1999)并上調抗癌自體反應性T細胞的反應(Alleva等，Immunobiol.192155，1995)。
IL-12單獨和與其它細胞因子聯合使用時，促進白細胞的成熟并誘導γ-干擾素的分泌。據報道，IL-12具有抗癌活性(Stine等，Annals NYAcademy of Science 795420，1996；Chen等，Journal of Immunol.159351，1997)，所述活性包括，但不限于活化特異性溶細胞性T淋巴細胞，活化天然殺傷細胞(NK)并誘導抗血管生成蛋白質IP-10和MiG。
TNF-α引起實體腫瘤的壞死(Porter等，Trends in Biotech.9158，1991)，敏化癌細胞對γ放射引發(fā)的細胞凋亡(Kimura等，Cancer Res.591606，1999)并保護骨髓前體細胞，使其免受抗腫瘤劑的影響(Dalmau等，Bone Marrow Transplant.12551，1993)。
然而，大多數現有技術的抗癌療法，無論是涉及誘導細胞周期停滯、抑制增殖、誘導細胞凋亡，還是激發(fā)免疫系統(tǒng)的，都被證明不能滿足臨床的應用。這些療法中的許多方法不夠有效或具有毒性，具有明顯的副作用，導致形成耐藥性或免疫致敏，以及致患者虛弱。
因此，一直需要新的組合物和方法，所述組合物和方法能誘導癌細胞的細胞周期停滯、抑制癌細胞增殖、活化癌細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶、誘導癌細胞的細胞凋亡并刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子。
將治療動物癌癥的有效量的包含序列和可藥用載體的組合物施用于患癌癥的動物，包括人。本發(fā)明的序列在下列方面具有出人意料的和令人驚奇的能力滿足了醫(yī)療領域長足的未實現的需求并對動物，包括人具有重要的益處，所述方面是誘導細胞周期停滯、抑制增殖、活化癌癥細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶并誘導癌細胞中細胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種有效治療動物，包括人的疾病的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效治療癌癥的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導細胞衰亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導細胞的細胞周期停滯的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導癌細胞的細胞周期停滯的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制細胞增殖的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種抑制癌細胞增殖的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于Fas的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于TNFR1的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于p53/p21的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于p21/waf-1/CIP的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于p15ink4B的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于p16ink4的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導不依賴于TGF-β1受體的癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導非激素依賴性癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導非耐藥性癌細胞的細胞凋亡的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種活化細胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種活化癌細胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療自身免疫疾病的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療淋巴細胞增殖性疾病的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療感染的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療炎癥的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種調節(jié)T-或B-細胞活化的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種調節(jié)祖代細胞成熟的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種調節(jié)紅細胞生成的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種調節(jié)細胞中轉錄因子的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種增強針對細胞的其它治療劑的效果的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種增強針對癌細胞的化療劑的效果的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種增強放射的抗腫瘤效果的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細胞產生IL-1β的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細胞產生IL-6的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細胞產生IL-10的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細胞產生IL-12的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種刺激免疫系統(tǒng)細胞產生TNF-α的組合物和方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種易于制備的組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供對接受者毒性最低的組合物。
在閱讀了下列公開的技術方案和附錄權利要求書的詳細描述后，本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點將變得十分清晰。
圖2不使用0μg/ml和100μg/ml的GT SEQ ID NOs66、67、81、82的83培養(yǎng)的Jurkat人T細胞白血病細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3的活化(用細胞計數方法(A)和比色法(B)測定)。
圖3Jurkat人T細胞白血病細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶的活化。(A)用0μg/ml和100μg/ml的6堿基GT SEQ ID NO25培養(yǎng)的細胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3的活化；(B)用0μg/ml和100μg/ml的6堿基GT SEQ ID NO25培養(yǎng)的細胞中半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶7的活化(a)和PARP含量(b)。
將治療動物癌癥的有效量的包含序列和可藥用載體的組合物施用于患癌癥的動物，包括人。本發(fā)明的序列在下列方面具有出人意料的和令人驚奇的能力滿足了醫(yī)療領域長足的未實現的需求并對動物，包括人具有重要的益處，所述方面是誘導細胞周期停滯、抑制增殖、誘導細胞凋亡和活化癌癥細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶以及刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子。
本發(fā)明采用的術語“序列”是指2-20個堿基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸，其中包含A、C、G和T堿基。
本發(fā)明采用的縮寫“GT”、“AG”、“CG”、“GG”、“AGT”和“CGT”是指以任何順序合成的包含指定堿基的序列。
本發(fā)明采用的術語“反應”是指誘導細胞周期停滯、抑制增殖、活化癌癥細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導癌細胞的細胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子。
本發(fā)明采用的術語“治療性治療”和“有效量”是指有效誘導選自下列反應的量誘導細胞周期停滯、抑制增殖、活化癌癥細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導癌細胞的細胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子。
本發(fā)明采用的術語“懸浮腫瘤模型”和“實體腫瘤模型”是指原發(fā)性或繼發(fā)性癌或肉瘤。
本發(fā)明采用的術語“化療劑”是指一個國家或州政府的管理部門批準的，或者美國藥典或其它通常知道的藥典列出的用于治療動物，包括人的癌癥的任何藥物。
本發(fā)明采用的術語“抗腫瘤”是指防止癌細胞的發(fā)育、成熟、增殖或擴散。
本發(fā)明采用的術語“增強”是指大于各種藥物相加的活性的協同程度。
本發(fā)明采用的術語“協同”是指兩種或多種藥物協調作用。
給動物，包括人施用有效量的本發(fā)明序列是一種預防、治療或消除疾病的治療性治療，所述疾病包括，但不限于癌癥、類風濕關節(jié)炎、淋巴細胞增殖性疾病和哮喘。癌癥包括，但不限于鱗狀細胞癌、纖維肉瘤、類肉瘤、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、結腸直腸癌、腎癌、骨肉瘤、皮膚黑素瘤、基底細胞癌、胰腺癌、膀胱癌、腦癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和由其生成的轉移瘤。
序列的治療有效性可通過不限于下列的方法得到增強化學修飾堿基、糖或磷酸酯骨架，化學添加序列或者用包含適當序列的細菌質粒用生物技術擴增序列，將序列與生物或化學載體配合，或者將序列與組織型或細胞型定向的配體或抗體偶聯。
通過使本發(fā)明的序列與可藥用載體均勻、緊密地結合來制備包含一種或多種序列和可藥用載體的組合物。可藥用載體包括液體載體、固體載體或包括這兩者。液體載體是水性載體、非水性載體或是這兩者，并且包括，但不限于水性懸浮液、油性乳液、油包水乳液、水包油包水乳液、位置特異性乳液、長滯留乳液、粘性乳液、微乳和毫微乳。固體載體是生物載體、化學載體或是這兩者，并且包括，但不限于病毒載體系統(tǒng)、顆粒、微粒、毫微顆粒、微球、毫微球、微泵、細菌細胞壁提取物和使序列緩釋的生物降解或非生物降解的天然的或合成的聚合物。用于配合序列與固體載體的方法包括，但不限于直接吸附于固體載體的表面；直接地或者通過連接部分與固體載體的表面共價偶聯；和與用于制備固體載體的聚合物共價偶聯。任選地，序列可通過添加非離子或離子性聚合物，例如聚氧化乙烯脫水山梨醇一油酸酯(土溫)或透明質酸來穩(wěn)定。
優(yōu)選的水性載體包括，但不限于水、鹽水和可藥用緩沖劑。優(yōu)選的非水性載體包括，但不限于礦物油和中性油或其混合物。與用于使所述序列呈示于響應細胞的可藥用載體無關，可任選地包括賦形劑。這些賦形劑包括，但不限于抗氧劑、緩沖劑和制菌劑，還可以包括懸浮劑和增稠劑。
可單獨施用一種或多種序列，或者可將其與其它治療形式聯合施用，所述其它治療形式包括，但不限于化療劑、免疫治療劑、抗菌劑、抗病毒劑或與放療聯合施用?；焺┌?，但不限于抗代謝劑、DNA損害劑、微管破壞劑、微管穩(wěn)定劑、肌動蛋白解聚劑、生長抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、嘌呤抑制劑、嘧啶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、CDK抑制劑、血管生成抑制劑和分化促進劑。
給藥途徑包括，但不限于口服、局部、皮下、透皮、真皮下、肌內、腹膜內、膀胱內、關節(jié)內、動脈內、靜脈內、真皮內、顱內、損害部位內、腫瘤內、眼內、肺內、脊髓內、前列腺內、置入體腔、經鼻吸入、肺吸入、經皮、電介入途徑。
根據給藥途徑，單位劑量體積優(yōu)選為約0.001-100ml/劑，更優(yōu)選為約0.01-50ml/劑，最優(yōu)選為約0.1-30ml/劑。每劑給予的序列的量優(yōu)選為約0.001-100mg/kg，更優(yōu)選為約0.01-10mg/kg和最優(yōu)選為約0.1-5mg/kg。本發(fā)明的序列或序列加治療劑可以以單劑療法、多劑療法或在一個治療方案中連續(xù)輸注的形式給藥一段時間，所述時間對于被治療的疾病、接受治療者的狀況和給藥途徑而言是適宜的。此外，所述序列可以在所述治療劑給藥之前、同時或之后給予。
將有效增強化療劑的抗腫瘤作用量的序列與化療劑聯合施用于患癌癥的動物。每劑施用的治療劑的量優(yōu)選為約0.001-1000mg/m2或者約0.01-1000mg/kg，更優(yōu)選約0.01-500mg/m2或者約0.01-500mg/kg并且更優(yōu)選約0.1-100mg/m2或者約0.1-100mg/kg。施用的特定的序列和特定的治療劑、每劑的量、給藥方案和給藥途徑應由醫(yī)師用本領域專業(yè)技術人員已知的方法決定，并且還應取決于癌癥的類型、癌癥的嚴重程度、癌癥的位置和其它臨床因素，如接受者的大小、體重和身體狀況。此外，可任選地使用體外分析以幫助確定序列給藥或序列加治療劑給藥的最佳范圍。
雖不期望受到下列假說的限制，據認為本發(fā)明的序列形成一類新結構，并且它們不是作為反義RNAs、反義DNAs、三倍螺旋體形成的DNAs、端粒酶抑制劑、轉錄活化劑或轉錄抑制劑而起作用。
下列實施例將用于進一步舉例說明本發(fā)明，而同時不對本發(fā)明構成任何限制。相反，在閱讀本發(fā)明的說明書之后，對于本領域專業(yè)技術人員來說，應該清楚必需借助各種其它的實施方案、其改變的和等同的方案，在不背離本發(fā)明實質精神下來自我啟發(fā)。
實施例1序列的制備磷酸二酯和硫代磷酸酯序列由HUKABEL Scientific Ltd(Montreal，Quebec，Canada)用EXPEDITETM8900自動DNA合成系統(tǒng)(PersSeptiveBiosystems，Inc.，Farminghan，MA)和由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)用算盤分割的合成技術(Abacus Segmented Synthesis Technology)制備。除非另有說明，使用的序列是磷酸二酯序列。除非另有說明，在臨用前，將序列分散到高壓滅菌的去離子水或高壓滅菌的藥用緩沖劑中，例如，但不限于鹽水。
實施例2細胞和試劑所有的細胞系均得自American Type Culture Collection(ATCC，Rockville，MD)并且在ATCC建議的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。表1顯示了細胞系、它們的產地和它們的特性。
表1 細胞系
將細胞接種到6(1ml/孔)、24(0.5ml/孔)或96(0.1ml/孔)孔平底微滴板并保持在37℃下和5％CO2氣氛中。除非另有說明，將2.5×105個細胞/ml與0μg/ml(對照)和100μg/ml(治療的)的包含A、C、G和T的2-45個堿基的序列一起培養(yǎng)48小時。
實施例3細胞增殖的測定用二甲基噻唑-二苯基四唑翁(MTT)還原測定細胞增殖(Mosman等，J.Immunol.Methods 6555，1983)。在570nm波長下用重疊的分光光度計閱讀器(ELX800，Bio-TEK Instruments Inc.，Winooski，VT)測定MTT。
實施例4Jurkat人白血病T細胞增殖的抑制Jurkat人白血病T細胞是耐受非典型的多種藥物的人懸浮腫瘤細胞模型。將Jurkat細胞與27堿基的GT和CT序列一起培養(yǎng)(表2)。
表2Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表2所示，Jurkat T細胞的增殖被測試的GT序列抑制，但不被測試的CT序列抑制。
將Jurkat T細胞與3、6、9、12、14、15、18、21和24堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表3)。
表3Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表3所示，3、6、9、12、14、15和18堿基的GT序列如同21和24堿基GT序列一樣有效地抑制Jurkat T細胞增殖。
將Jurkat T細胞與6堿基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列一起培養(yǎng)(表4)。
表4Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。
如表4所示，6堿基GT序列抑制Jurkat T細胞的增殖。GT SEQ ID NO25抑制60％增殖，AGT SEQ ID NO49抑制45％增殖。用PHARM/PCS-4軟件(Microcomputer Specialists，Philadelphia，PA)比較GT SEQ ID NO25和AGT SEQ ID NO49的相對效力，表明GT SEQ ID NO25是AGTSEQ ID NO49的效力的3.4倍。據報道，AGT SEQ ID NO49-硫代磷酸酯抑制端粒酶的活性并誘導非洲淋巴瘤細胞的細胞凋亡(Mata等，Toxicol.Appl.Pharmacol.144189，1997)。
為測定端粒酶活性，用PCR-端粒重復擴增方法(TRAP)(Roche，Laval，Quebec，Canada)分析2×105個Jurkat T細胞的提取物。在1-100g/ml濃度下，GT SEQ ID NO25-磷酸二酯表現出0-10％的抗端粒酶活性，而AGT SEQ ID NO49-硫代磷酸酯表現出30-75％抗端粒酶活性。GT SEQ ID NO25-硫代磷酸酯和GT SEQ ID NO49-磷酸二酯都沒有表現出任何抗端粒酶活性。
將Jurkat T細胞與2、3、4、5、6和7堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表5)。
表5Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表5所示，2、3、4、5、6和7堿基的GT序列抑制Jurkat T細胞的增殖。
實施例5HL-60人早幼粒細胞白血病細胞增殖的抑制HL-60早幼粒細胞白血病細胞是p53突變的人懸浮腫瘤模型。將HL-60細胞與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表6)。
表6 HL-60人早幼粒細胞白血病細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基。如表6所示，6堿基的GT序列抑制HL-60細胞的增殖。
實施例6MCF-7人乳腺癌細胞增殖的抑制MCF-7人乳腺癌細胞是半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3陰性的、雌激素依賴性的人實體腫瘤模型。將MCF-7細胞(5×105個細胞/ml)與3和6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表7)。
表7MCF-7人乳腺癌細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表7所示，6和7堿基的GT序列抑制MCF-7細胞的增殖。
實施例7PC-3人前列腺癌細胞增殖的抑制PC-3前列腺癌細胞是p53突變的、雄激素非依賴性的人實體腫瘤模型。將PC-3細胞(5×105個細胞/ml)與3和6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表8)。
表8PC-3人前列腺癌細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表8所示，3和6堿基的GT序列抑制PC-3細胞的增殖。
實施例8LNCaP人前列腺癌細胞增殖的抑制LNCaP前列腺癌細胞是TGF-β1受體陰性的、雄激素-非依賴性的、轉移性人實體腫瘤模型。將LNCaP細胞(5×105個細胞/ml)與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表9)。
表9LNCaP人前列腺癌細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表9所示，6堿基的GT序列抑制LNCaP細胞的增殖。
實施例9THP-1人急性單核細胞性白血病細胞增殖的抑制THP-1急性單核細胞性白血病細胞是無p53的人懸浮腫瘤模型。將THP-1細胞(1.6×106個細胞/ml)與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表10)。
表10 THP-1人急性單核細胞性白血病細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表10所示，6堿基的GT序列抑制THP-1細胞的增殖。
實施例10OVCAR-3人卵巢癌細胞增殖的抑制
OVCAR-3卵巢癌細胞是p53突變的、p21/waf-1/Cip缺失的、轉移性人實體腫瘤模型。將OVCAR-3細胞(5×105個細胞/ml)與2、6和18堿基的GT細胞一起培養(yǎng)并與6堿基的AGT序列一起培養(yǎng)(表11)。
表11OVCAR-3人卵巢癌細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表11所示，2、6和18堿基的GT序列以及6堿基的AGT序列抑制OVCAR-3細胞的增殖。
實施例11SK-OV-3人卵巢癌細胞增殖的抑制SK-OV-3卵巢癌細胞是p53突變的、p21/waf-1/Cip缺失的、p15ink4B缺失的、p16ink4缺失的、轉移性人實體腫瘤模型。將SK-OV-3細胞(5×105個細胞/ml)與2、6和18堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表12)。
表12SK-OV-3人卵巢癌細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表12所示，2、6和18堿基的GT序列抑制SK-OV-3細胞的增殖。
實施例12磷酸二酯和硫代磷酸酯序列對細胞增殖的抑制據報道，通過用硫原子取代一個或多個磷酸酯基上的非橋氧原子修飾的天然磷酸二酯序列提高寡核苷酸序列在生物體液和細胞中對內切核酸酶的穩(wěn)定性(Crooke等，Anticancer Drugs 6609，1991)。
將Jurkat人白血病T細胞(表13)、LNCaP人前列腺癌細胞(5×105個細胞/ml)(表14)和MCF-7人乳腺癌細胞(5×105個細胞/ml)(表15)與具有氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)作為磷酸酯基的非橋接原子的6堿基的GT序列一起培養(yǎng)。
表13Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
表14LNCaP人前列腺癌細胞增殖的％抑制
表15MCF-7人乳腺癌細胞增殖的％抑制
如表13、14和15所示，6堿基的GT-磷酸二酯序列比6堿基的GT-硫代磷酸酯序列更有效地抑制Jurkat T、LNCaP和MCF-7細胞的增殖。
實施例13混合的磷酸二酯和硫代磷酸酯序列對細胞增殖的抑制將Jurkat人白血病T細胞(表16)和MCF-7人乳腺癌細胞(5×105個細胞/ml)(表17)與6堿基的GT SEQ ID NO25一起培養(yǎng)，其中氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)是磷酸酯基的非橋接原子。
表16Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“oxygen atom”為“氧原子”；“sulfur atom”為“硫原子”；注表中“bases”為“堿基”。
*注“o”代表磷酸酯基中的氧原子，“s”代表硫原子表17MCF-7人乳腺癌細胞增殖的％抑制
注表中“oxygen atom”為“氧原子”；“sulfur atom”為“硫原子”；“phosphodiester”為“磷酸二酯”；“phosphorthioate”為“硫代磷酸酯”；“bases”為“堿基”。*注“o”代表磷酸酯基中的氧原子，“s”代表硫原子如表16和17所示，用硫原子取代6堿基的GT SEQ ID NO25的一個或多個磷酸酯基上的非橋接氧原子明顯降低對Jurkat T和MCF-7細胞增殖的抑制作用。
實施例14鼠癌細胞增殖的抑制EL-4鼠淋巴瘤T細胞是一種懸浮腫瘤模型。將EL-4鼠淋巴瘤T細胞與6、18、27和33堿基的GT序列以及與15堿基的ACG序列一起培養(yǎng)(表18)。
表18EL-4鼠T淋巴瘤細胞增殖的％抑制
注表中“phosphorothioate”為“硫代磷酸酯”；“bases”為“堿基”。如表18所示，6、18、27和33堿基的GT序列以及15堿基的ACG序列不抑制EL-4鼠細胞的增殖。
A20鼠白血病B細胞是一種懸浮腫瘤模型。將A20鼠白血病B細胞與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表19)。
表19A20鼠B白血病細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表19所示，6堿基的GT序列抑制A20鼠B白血病細胞的增殖。
實施例15犬癌細胞增殖的抑制D-17犬骨肉瘤細胞和CF-51犬乳腺癌細胞是實體腫瘤模型。將D-17犬骨肉瘤細胞(5×105個細胞/ml)(表20)和CF-51犬乳腺癌細胞(5×105個細胞/ml)(表21)與6、9、17、27和33堿基的GT序列并與15堿基的ACG序列一起培養(yǎng)。
表20D-17犬骨肉瘤細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。
表21CF-51犬乳腺癌細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表20和21所示，6、9、17、27和33堿基的GT序列以及15堿基的ACG序列抑制D-17和CF-51犬細胞的增殖。
實施例16癌細胞增殖的抑制表22概括了6堿基的GT SEQ ID NO25對。
表22人、鼠和犬癌細胞增殖的％抑制
如表22所示，人癌細胞比犬癌細胞和鼠癌細胞對6堿基的GT SEQ ID NO25產生的增殖抑制作用更敏感。
實施例17兩種6堿基的GT序列對增殖抑制的協同作用將Jurkat人白血病T細胞與次最佳濃度(5.0g/ml)的6堿基的GT序列一起培養(yǎng)(表23)。
表23Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表23所示，同時使用兩種6堿基的GT序列具有協同抑制Jurkat T細胞增殖的作用。
實施例18對化療劑抗腫瘤作用的增強在0、0.1、1.0或10.0μg/ml的5-氟尿嘧啶或順鉑的存在下，將Jurkat人白血病T細胞與1.0μg/ml 6堿基的GT SEQ ID NO25和27堿基的GT SEQ ID NO1一起培養(yǎng)(表24)。5-氟尿嘧啶是一種干擾DNA和RNA合成的抗代謝劑。順鉑是一種交聯DNA并抑制DNA前體的烷基化試劑。
表24Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
如表24所示，6堿基的GT SEQ ID NO25和27堿基的GT SEQ IDNO1增強，并且GT SEQ ID NO25增強0.1和1.0μg/ml的順鉑對Jurkat T細胞增殖的抗腫瘤作用。
在0、0.1、1.0或10.0μg/ml的5-氟尿嘧啶或他莫昔芬的存在下，將MCF-7人乳腺癌細胞(5×105個細胞/ml)與1.0μg/ml的6堿基的GTSEQ ID NO25和27堿基的GT SEQ ID NO1一起培養(yǎng)。他莫昔芬是一種雌激素拮抗劑。
表25MCF-7人乳腺癌細胞增殖的％抑制
如表25所示，6堿基的SEQ ID NO25增強0.1μg/ml 5-氟尿嘧啶和0.1μg/ml他莫昔芬對MCF-7細胞增殖的抗腫瘤作用。27堿基的SEQ IDNO1不增強5-氟尿嘧啶或他莫昔芬對MCF-7細胞增殖的抗腫瘤作用。
實施例19重復的6堿基的GT SEQ ID NO25對增殖的抑制將Jurkat人白血病T細胞與1、2、3和4重復的6堿基的GG(GT)1GG(SEQ ID NO25)一起培養(yǎng)(表26)。
表26Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表26所示，6堿基的GT SEQ.ID NO25對Jurkat T細胞增殖的抑制率為60％，而12堿基的GT SEQ ID NO68、18堿基的GT SEQ ID NO69和24堿基的GT SEQ ID NO70對Jurkat T細胞增殖的抑制作用減弱。6堿基的GT SEQ.ID NO25的熔化溫度(Tm)為2.5℃，但GT SEQ IDNO68的熔融溫度升至56.8℃，GT SEQ ID NO69的熔融溫度為76.3℃，GT SEQ ID NO70的熔融溫度為86.3℃。
實施例20由Bacillus Calmette-guerin(BCG)衍生的序列對增殖的抑制據報道，BCG衍生的序列抑制體內腫瘤的生長(Kataoka等，Jpn.J.Cancer Res.83244，1992)。另外據報道，當與IMC細胞預先混合并注射到CDF-1小鼠中時，A-2(SEQ ID NO72)和BCG A-4(SEQ ID NO74)對IMC腫瘤生長的抑制分別達88％和37％。
將Jurkat人白血病T細胞與由BCG衍生的45堿基的序列一起培養(yǎng)(表27)。
表27Jurkat人白血病T細胞增殖的％抑制
注表中“bases”為“堿基”。如表27所示，BCG衍生的序列對Jurkat T細胞增殖的抑制率≤24％。
實施例21細胞周期停滯的誘導使用CYCLETESTTMPLUS DNA市售檢測盒(Becton Dickinson)測定細胞周期階段。概括地說，如下得到細胞的核將細胞膜溶于非離子洗滌劑中，用胰蛋白酶除去細胞的細胞支架和核蛋白，用RNA酶消化細胞RNA并用精胺穩(wěn)定核染質。將碘化丙錠加到細胞核中并在安裝有電子雙重識別能力的流式細胞術(FACSCalibur，Becton Dickinson，San Jose，CA)中分析它們的熒光。用MODFIT LT軟件(Verity Software House Inc.，Topsham，MA)分析在細胞周期的G0/G1、早期S(SE)、中期S(SM)、晚期S(SL)或G2/M階段積聚的細胞。
將以指數生長的Jurkat人白血病T細胞(表28)和MCF-7人乳腺癌細胞(5×105個細胞/ml)(表29)與2、6、15、18、27和45堿基的包含A、C、G和T的序列一起培養(yǎng)。將細胞收集并離心，再測定細胞周期的階段。
表28 Jurkat T人白血病細胞的細胞周期停滯的誘導
如表28所示，在Jurkat T細胞中，2、6和27堿基的GT序列誘導細胞周期的SE階段停止，6堿基的CG和AGT，18堿基的GT和45堿基的BCGA-1序列誘導細胞周期的SM階段停止，6堿基的AG序列誘導細胞周期的G0/G1階段停止。
表29MCF-7人乳腺癌細胞的細胞周期停滯的誘導
如表29所示，在MCF-7細胞中，2和6堿基的GT序列誘導細胞周期的SE階段停止，6堿基的AGT序列和18堿基的GT序列誘導細胞周期的SM階段停止。
實施例22GT SEQ ID NO25、AC SEQ ID NO79和GT SEQ ID NO25+AC SEQID NO79誘導細胞周期停滯將Jurkat人細胞白血病T細胞(1×106個細胞/ml)與6堿基的GT SEQID NO25一起培養(yǎng)24小時，其中補充有6堿基的AC SEQ ID NO79和6堿基的GT SEQ ID NO25+6堿基的AC SEQ ID NO79。GT SEQID NO25和AC SEQ ID NO79通過混合所述寡核苷酸(1∶1)并在65℃加熱10分鐘進行雜交。作為對照，將GT SEQ ID NO25和AC SEQID NO79在65℃加熱10分鐘(表30)。
表30Jurkat人白血病T細胞的細胞周期停滯的誘導
如表30所示，6堿基的GT SEQ ID NO25誘導細胞周期的SE階段后期停止，而補充的6堿基的AC SEQ ID NO79對細胞周期沒有影響。GT SEQID NO25和AC SEQ ID NO79的雜交抵銷GT SEQ ID NO25對細胞周期停滯的誘導作用。這些數據證明，為具有有效性，本發(fā)明的序列必須是單鏈的。
實施例23細胞凋亡的誘導原生質膜磷脂酰絲氨酸的再分配和核基質蛋白(NuMA)的釋放是正經歷細胞凋亡的細胞的特征(Martin等，J.Exp.Med.，1821545，1995；Miller等，Biotechniques，151042，1993)。
使用FITC-結合的膜聯蛋白V(BD Pharmingen，San Diego，CA)通過流式細胞術測定細胞凋亡期間原生質膜中磷脂酰絲氨酸的再分配。用市售的ELISA檢測盒(Oncogen/Calbiochem，Cambridge，MA)測定釋放到上清液中的NuMA。
將Jurkat人白血病T細胞與50μM的3、4、5、6和7GT堿基序列、5堿基的ACGT序列、6堿基的AG、GG、AGT和CGT序列以及7堿基的GG序列一起培養(yǎng)。表31顯示出凋亡的細胞的百分數(對磷脂酰-絲氨酸/膜聯蛋白V染色(PS/A-V)陽性的)和由細胞釋放的％NuMA。
表31Jurkat T細胞白血病細胞的細胞凋亡的誘導
注表中“bases”為“堿基”。如表31所示，3、4、5和6堿基的GT、AG、CG和AGT序列誘導Jurkat T細胞的細胞凋亡。5堿基的ACGT和6堿基的CGT以及GG序列不誘導JurkatT細胞的細胞凋亡。
實施例24細胞內鈣的增高(Ca2+)i據報道，細胞內鈣(Ca2+)的增高與細胞凋亡的誘導有關(Lam等，Mol.Endocrinol.7686，1993)。用熒光探針Fluo-3-AM(Cell Permaant，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)跟蹤(Ca2+)i。Fluo-3-AM熒光增強則表示(Ca2+)i增高。
將Jurkat人白血病T細胞與6堿基的GT SEQ.NO25一起培養(yǎng)24小時。離心收集細胞，將其懸浮于含1％FBS的PBS中，并在37℃用10μMFluo-3-AM負載1小時。在488nm激發(fā)波長和530nm發(fā)射波長測定細胞熒光(FL1檢測器)。在FACSCALIBUR上用程序CellQUEST(BectonDickinson)分析數據。
如附

圖1所示，Jurkat T細胞與6堿基的GT SEQ ID NO25一起培養(yǎng)導致細胞熒光增強88％，表明(Ca2+)i增高了。
實施例25細胞凋亡的誘導通過與細胞表面受體結合的配體引發(fā)細胞凋亡，所述配體包括，但不限于Fas(CD95)和腫瘤壞死因子(TNF)。與Fas Ligand結合的Fas和與TNF Receptor 1結合的TNF引發(fā)細胞內產生導致半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶(caspases)活化的引號。半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶引發(fā)致命的與核DNA-碎裂有關的細胞凋亡完成的蛋白水解級聯反應、核基質蛋白(NuMA)的釋放并細胞底物接觸的喪失。
將Jurkat人白血病T細胞(1×106/ml)與6和27GT堿基序列一起培養(yǎng)(表32)。如實施例23測定NuMA。
表32Jurkat人白血病T細胞釋放的％NuMA
注表中“bases”為“堿基”。如表32所示，使用6堿基的GT SEQ ID NO25的％NuMA釋放大于使用27堿基的GT SEQ ID NOs1、2、3和4的％NuMA釋放。
實施例266堿基的GT SEQ ID NO25和6堿基的AC SEQ ID NO79對細胞凋亡的誘導將Jurkat人細胞白血病T細胞與6堿基的GT SEQ ID NO25一起培養(yǎng)24小時，其中補充有6堿基的AC SEQ ID NO79和6堿基的GT SEQID NO25+6堿基的AC SEQ ID NO79。GT SEQ ID NO25和AC SEQID NO79通過混合所述序列(1∶1)并在65℃加熱10分鐘進行雜交。作為對照，將GT SEQ ID NO25和AC SEQ ID NO79在65℃加熱10分鐘(表33)。如實施例23評價細胞凋亡。
表33Jurkat人白血病T細胞的細胞凋亡的誘導
注表中“bases”為“堿基”。如表33所示，6堿基的GT SEQ ID NO25誘導Jurkat T細胞的細胞凋亡，但補充的6堿基的AC SEQ ID NO79對細胞凋亡沒有影響。GT SEQID NO25和AC SEQ ID NO79的雜交抵銷GT SEQ ID NO25的細胞凋亡的誘導作用。這些數據證明，為具有有效性，本發(fā)明的序列必須是單鏈的。
實施例27草分支桿菌衍生的富含GT和富含AC的序列對增殖的抑制、細胞周期的停止和細胞凋亡的誘導作用將Jurkat人白血病T細胞與草分支桿菌的murA基因(GenBankAccession Number X99776)衍生的富含GT和富含AC的序列一起培養(yǎng)。如實施例3通過還原MTT測定增殖的抑制作用，如實施例21通過流式細胞術用碘化丙錠測定細胞周期的停止，以及如實施例23，通過流式細胞術用膜聯蛋白-V-FITC評價細胞凋亡。
表34 Jurkat細胞增殖的抑制、細胞周期的停止和細胞凋亡的誘導
如表34所示，富含GT的SEQ ID NOs81、82和83抑制Jurkat T細胞的增殖、誘導所述細胞的細胞周期停滯并誘導其細胞凋亡；但富含AC的SEQ ID NO15對Jurkat T細胞的增殖、細胞周期停滯和細胞凋亡均沒有抑制作用。
實施例28GT序列對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活化的調節(jié)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶識別3種主要的肽底物序列1)Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-1、-4和-5)(SEQ IDNO84)；2)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-2、-3和-7)(SEQ ID NO85)；和3)Ile-(Leu)-Glu-X-Asp(I(L)EXD；半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-8和-10)(SEQ ID NO86)(Thornberry等，J.Biol.Chem.27217907，1997)。蛋白質靶中序列的識別導致靶的有限的和特異性的蛋白水解，正如在第一個實施例中，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3調節(jié)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7的活化；正如在第二個實施例中，分解的結構蛋白質靶包括，但不限于核纖層蛋白；或者正如在第三個實施例中，活化的酶包括，但不限于PARP。
使用5’-C2酰胺間隔區(qū)臂與標準酰胺-羧基水溶性carbohexiimide綴合技術(Guy等，J.Chromatography.B.Biomed.Sci.Appl.706149，1998)合成的寡核苷酸，通過化學保護的GT序列或化學保護的AC序列與化學保護的選自NH2-YVAD-COOH(SEQ ID NO84)、NH2-DEVD-COOH(SEQID NO85)和NH2-IEGD-COOH(SEQ ID NO87)的序列化學共軛生成NH2-XXXD-COO-GT序列構成物。在共軛后，脫去反應性羧酸酯和反應性氨基的保護基。
包括，但不限于NH2-YVAD-COO-GT；NH2-DEVD-COO-GT；和NH2-I(L)EXD-COO-GT的肽-GT(本文稱PGT)序列構成物被酶在D和GT之間的羧酸酯官能團處裂解，所述酶包括，但不限于半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶、與癌癥轉移有關的酶、膠原酶和金屬蛋白酶。這類裂解導致半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶獲得的GT序列從PGT中釋放。由此產生的胞內半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活性的增高可，例如提高化療劑對多種藥物耐藥的癌細胞的療效或者增強對弱抗原刺激的免疫反應。
為測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的活化，使用制造商建議的條件，將對照組和處理組細胞洗滌、固定、滲透化并與識別活化形式的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的FITC-綴合抗體(Pharmingen，San Diego，CA)一起培養(yǎng)。在FACSCALIBUR上，使用程序CellQUEST(Becton Dickinson)，通過流式細胞術分析與活化的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3有關的熒光?；蛘撸捎没谂c顏色指示分子硝基苯胺綴合的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶特異性的肽的分解分析，通過比色法測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的活化，該分析是在405nm以分光光度分析法定量進行。
實施例29GT SEQ ID NOs66、81、82和83以及AGC序列SEQ ID NO67對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的活化將Jurkat T細胞白血病細胞與下列序列一起培養(yǎng)72小時33堿基的GT SEQ ID NO66；11堿基的GT SEQ ID NO81(GT SEQ ID NO66的堿基1-11)、11堿基的GT SEQ ID NO82(GT SEQ ID NO66的堿基12-22)、11堿基的GT SEQ ID NO83(GT SEQ ID NO66的堿基23-33)和15堿基的ACG SEQ ID NO67。如實施例28，用FITC綴合抗體(CloneC92-605)測定活性半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3(17-22kDa)。
如附圖2A所示，33堿基的GT SEQ ID NO66和11堿基的GT SEQID NOs81、82和83各自誘導非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原3轉變?yōu)榛钚园腚装彼衢T冬氨酰蛋白酶3，但15堿基的ACG SEQ ID NO67不誘導半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原3轉變?yōu)榛钚园腚装彼衢T冬氨酰蛋白酶3。
也可如實施例28，經比色法測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化。如附圖2B所示，在用33堿基的GT SEQ ID NO66和11堿基的GT SEQID NOs81、82和83處理的細胞中，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活性比對照細胞中高105％、77％、100％和60％，但在用15堿基的ACG SEQ IDNO67處理的細胞中，半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化與對照細胞大致相同。
實施例306堿基的GT SEQ ID NO25對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3活性的活化將Jurkat T細胞白血病細胞與6堿基的GT SEQ ID NO25一起培養(yǎng)72小時。如實施例28，用比色法測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化。如附圖3A所示，用6堿基的GT SEQ ID NO25處理的細胞中半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3的活化比對照細胞中高323％。
實施例31GT SEQ ID NO25對半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶-7的活化和PARP的分解將Jurkat T細胞白血病細胞與6堿基的GT SEQ ID NO25一起培養(yǎng)72小時。細胞用PBS洗滌三次，用10mM HEPES(pH 7.5，含5mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇、1.5nM抑肽酶、10mM亮抑蛋白酶肽和2.5μm原釩酸鈉)溶解并測定溶解物的蛋白質含量(Bradford J.Anal.Biochem.72248，1976)。
通過蛋白質印跡分析測定活化的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7和PARP的分解。將溶解物與Laemmli緩沖液(Laemmli U.Nature 15680，1970)混合，振搖并與100℃加熱4分鐘。將Fifty jig蛋白質加到各泳道上，并在100V的恒定電壓下(1.5h)，用10％(半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶)或17％(PARP)月桂基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質。將分得的蛋白質在PVDF膜上進行電印跡。用麗春紅染色該膜監(jiān)測相同的蛋白質負載量。
在4℃下用緩沖液將膜阻斷過夜，所述緩沖液含有1％Tris-緩沖的鹽水(2mM Tris-HCl，13.7mM NaCl，pH 7.6和0.1％聚乙烯脫水山梨醇一月桂酸酯(土溫20)(TBST)+5％脫脂奶粉。洗滌該膜并在室溫下與鼠單克隆IgG抗-半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7抗體(Pharmingen)(用TBST+1％BSA以1∶1000稀釋的)或者與鼠單克隆IgG抗-PARP抗體(用TBST+1％BSA以1∶1000稀釋的)(Pharmingen)一起培養(yǎng)1小時。用與辣根過氧化物酶(用TBST+5％脫脂奶粉以1∶1000稀釋的)(Pharmingen)綴合的羊抗鼠IgG測定與半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7或PARP結合的IgG。用加強的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(ECL，Amersham，Corp.，Amersham，UK)展開印跡。
如附圖3B所示，6堿基的GT SEQ ID NO25誘導非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原7(30kDa)轉變?yōu)榛钚园腚装彼衢T冬氨酰蛋白酶7(19-20kDa)以及活性PARP轉變?yōu)槭Щ畹钠?5kDa降解產物。
實施例32半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活化的正反饋放大將Jurkat人白血病T細胞與下列序列一起培養(yǎng)72小時NH2-YVAD-CO-GG(GT)GG、NH2-DEVD-CO-GG(GT)GG、NH2-IEGD-COO-GG(GT)GG、NH2-YVAD-CO-AACCACAAGCCCAAC、NH2-DVED-CO-AACCACAAGCCCAAC和NH2-IEGD-CO-AACCACAAGCCCAAC。測定半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7的活化。
NH2-YVAD-CO-GT、NH2-DEVD-CO-GT和NH2-IEGD-COO-GT各自誘導非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3轉化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3以及非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7轉化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7，但NH2-YVAD-CO-ACG、NH2DVED-CO-ACG和NH2-IEGD-CO-ACG不誘導非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶原3轉化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3或者非活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7轉化為活性的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7。
雖不期望受到下列假設的限制，但據認為在含半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的細胞內，基礎半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活性調節(jié)半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶的釋放，所述酶通過蛋白水解/水解NH2-XXXD-COO-GT構成物活化GT序列。這通過釋放的半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活化的GT序列導致在細胞內半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶活性(半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶3和半胱氨酸門冬氨酰蛋白酶7的水平增高)的正放大。
實施例33誘導細胞因子的產生除非另有說明，在37℃和5％CO2中，將1×106個細胞與100μg/ml的各種測試序列一起培養(yǎng)48小時。在100μl培養(yǎng)上清液中，用合適的市售ELISA(BioSource，Camarillo CA)測定細胞因子IL-6、IL-10、IL-12、IL-1β和TNF-α的產生(pg/ml)。IL-12 ELISA測定IL-12p70絡合物和游離p40亞基。結果以與對照細胞相比，處理的細胞產生的細胞因子的增加“倍數”(x)表示。
將THP-1人急性單核細胞性白血病細胞與2、3、6、9、12、14、15和18堿基的GT序列一起培養(yǎng)并測定細胞因子IL-6的產生。(表35)。
表35 THP-1人急性單核細胞性白血病細胞產生的細胞因子
注表中“bases”為“堿基”。如表35所示，2、3、6、9、12、14、15和18堿基的GT序列提高THP-1細胞產生的細胞因子IL-6的量。
將THP-1人急性單核細胞性白血病細胞與6堿基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列一起培養(yǎng)并測定細胞因子IL-12和IL-16的產生(表36)。
表36 THP-1人急性單核細胞性白血病細胞產生的細胞因子
如表36所示，6堿基的GT、AG、CG、GG、AGT和CGT序列提高THP-1細胞產生的細胞因子IL-12和IL-6的量。
表37概括了6堿基的序列對IL-12和IL-6合成的誘導。
表376堿基序列誘導的IL-6和IL-12合成
據報道，BCG衍生的序列A-3(SEQ ID NO73)、A-4(SEQ ID NO74)、A-6(SEQ ID NO75)、A-7(SEQ ID NO76)、M3(SEQ ID NO77)和α1(SEQ ID NO78)在體內活化NK細胞(Kataoka等，Jpn.J.Cancer Res.83244，1992)。將THP-1人急性單核細胞性白血病細胞與45堿基的BCG-衍生序列一起培養(yǎng)并測定細胞因子IL-12和IL-6的產生(表38)。
表38 TOP-1人急性單核細胞性白血病細胞產生的細胞因子
注表中“bases”為“堿基”。如表38所示，45堿基的BCG衍生的序列極輕微地提高THP-1細胞產生的IL-12和IL-6的量。
實施例34磷酸二酯和硫代磷酸酯序列誘導IL-12的產生將THP-1人急性單核細胞性白血病細胞與6堿基的GT序列一起培養(yǎng)，所述序列具有作為磷酸酯基非橋接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并測定細胞因子IL-12的產生(表39)。
表39 THP-1急性單核細胞性白血病細胞產生的IL-12
如表39所示，用硫原子(硫代磷酸酯)替代磷酸酯基上的非橋接氧原子(磷酸二酯)明顯減少THP-1細胞產生的IL-12的量。
將THP-1人急性單核細胞性白血病細胞與6堿基的GT SEQ ID NO25一起培養(yǎng)，所述序列具有作為磷酸酯基非橋接原子的氧原子(磷酸二酯)或硫原子(硫代磷酸酯)，并測定細胞因子IL-12的產生(表40)。
表40 THP-1人急性單核細胞性白血病細胞產生的IL-12
注表中“oxygen atom”為“氧原子”；“bases”為“堿基”；“sulfur atom”為“硫原子”；“position”為“位置”。
*注“o”代表磷酸酯基中的氧原子，“s”代表硫原子如表40所述，用硫原子(硫代磷酸酯)替代6堿基的GT SEQ ID NO25中的非橋接氧原子(磷酸二酯)明顯減少THP-1細胞產生的IL-12的量。
實施例35刺激人周圍血單核細胞中細胞因子的合成用Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech，Baie d’Urfee，Quebec，Canada)，通過密度梯度離心全血，從7名健康的人分離周圍血單核細胞(下文稱“PBMCs”)。將PBMCs與6堿基的GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培養(yǎng)并測定細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12的產生。
表41人PBMC產生的細胞因子
注表中“bases”為“堿基”。
實施例36通過黑猩猩外周血液單核細胞合成細胞因子如實施例35所述從4只健康的黑猩猩中分離PBMCs。將PBMCs與6堿基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培養(yǎng)，并測定細胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的生成(表41)。
表41通過黑猩猩PBMC生成細胞因子
注表中“bases”為“堿基”。
如表41所示，6堿基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了黑猩猩PBMC細胞生成細胞因子IL10和IL-12以及TNF-α。
實施例37通過恒河猴外周血液單核細胞合成細胞因子如實施例35所述從4只健康的恒河猴中分離PBMCs。將PBMCs與6堿基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列一起培養(yǎng)，并測定細胞因子IL-10、IL-12和TNF-α的生成(表42)。
表42通過恒河猴PBMC生成細胞因子
如表42所示，6堿基GT、AGT、CGT、AG、CG和GG序列提高了恒河猴PBMC細胞生成細胞因子IL10、IL-12以及TNF-α。
實施例386堿基GT SEQ ID NO25+5-氟尿嘧啶和6堿基GT SEQ ID NO25+他莫昔芬中的6堿基GT SEQ ID NO25對MCF-7人乳腺腫瘤的影響將MCF-7人乳腺癌細胞作為異種皮移植物皮下植入到雌性裸BALB/c小鼠中。將小鼠分成6組，每組10只。在第0天，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受6堿基GT SEQ ID NO25，第3組小鼠接受5-氟尿嘧啶，第4組小鼠接受他莫昔芬，第5組小鼠接受6堿基GT SEQ ID NO25+5-氟尿嘧啶，第6組小鼠接受6堿基GT SEQ ID NO25+他莫昔芬。治療4周后，將小鼠處死，并測定腫瘤質量。第1組小鼠具有最大的腫瘤質量，第2、3和4組小鼠的腫瘤質量比第1組小鼠小，第5和6組小鼠的腫瘤質量比第1、2、3和4組小鼠小。
實施例393和6堿基GT序列和45堿基BCGA-3序列對LNCaP人前列腺癌腫瘤的影響將LNCaP人前列腺癌細胞作為異種皮移植物皮下植入到雄性裸nu/nu小鼠中。將小鼠分成5組，每組10只小鼠。在第0天，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受3堿基SEQ ID NO8，第3組小鼠接受6堿基GT SEQ ID NO25，第4組小鼠接受6堿基AG SEQ ID NO45，第5組小鼠接受45堿基BCG A-3 SEQ ID NO69。治療4周后，將小鼠處死，并測定腫瘤質量。第1組小鼠具有最大的腫瘤質量，第5組小鼠的腫瘤質量比第1組小鼠小，第2、3和4組小鼠的腫瘤質量比第1和5組小鼠小。
實施例413、6、8和27堿基序列對EL-4鼠T淋巴瘤的影響將EL-4鼠T淋巴細胞植入到C57/BL6小鼠體內。將小鼠分成6組，每組10只小鼠。在第0天，第1組小鼠接受鹽水，第2組小鼠接受3堿基GT SEQ ID NO8，第3組小鼠接受6堿基SEQ ID NO25，第4組小鼠接受6堿基AG SEQ ID NO45，第5組小鼠接受18堿基GT SEQ ID NO18，第6組小鼠接受27堿基GT SEQ ID NO1。治療4周后，將小鼠處死，并測定腫瘤質量。第1組小鼠具有最大的腫瘤質量，第2、3、4、5和6組小鼠的腫瘤質量比第1組小鼠小。
實施例42將人結腸癌細胞系作為粘著細胞培養(yǎng)物維持。將處于指數生長期的細胞用2-20堿基GT、GA、GC或GG序列以0μg/ml-100μl/ml的劑量處理24-72小時。通過MTT還原測定對細胞增殖的抑制，通過流動血細胞計數測定細胞周期停滯，通過膜聯蛋白-V結合或NuMA釋放測定細胞凋亡。在結腸癌細胞系中，GT、GA、GC或GG序列抑制增殖，誘導細胞周期停滯，并誘導細胞凋亡。
用鹽水或者用在體外具有抗人結腸直腸癌細胞系的抗癌活性的2-20堿基GT、GA、GC或GG序列治療皮下攜帶人結腸直腸癌細胞系的SCID小鼠。用在體外具有抗人結腸直腸癌細胞系的抗癌活性的2-20堿基GT、GA、GC或GG序列治療的小鼠的腫瘤質量比用鹽水治療的小鼠顯著減小。
雖然已經詳細描述了本發(fā)明，并提供了其具體實施方案，但是顯然本領域技術人員可在不背離其實質和范圍的情況下對其作各種改變和改進。
序列表<110>奈杰爾·菲利普斯馬里奧·菲利翁<120>治療用合成寡核苷酸<130>6857-21<150>60/170,325<151>1999-12-13<150>60/228,925<151>2000-08-29<160>87<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>1gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg 27<210>2<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>2gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg 27<210>3<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>3gggggtgggg gtgggggtgg gggtggg27<210>4<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>4gggggggtgg gggggtgggg gggtggg 27<210>5<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>5tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgt 27<210>6<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>6tctctctctc tctctctctc tctctct 27<210>7<211>3<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>7tgt 3<210>8<211>3<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>8gtg 3<210>9<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>9tgtgtg6<210>10<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>10gtgtgt6<210>11<211>9<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>11tgtgtgtgt 9<210>12<211>9<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>12gtgtgtgtg 9<210>13<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>13tgtgtgtgtg tg 12<210>14<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>14gtgtgtgtgt gt 12<210>15<211>14<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>15tgtgtgtgtg tgtg14<210>16<211>15<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>16gtgtgtgtgt gtgtg 15<210>17<211>18<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>17tgtgtgtgtg tgtgtgtg18<210>18<211>18<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>18gtgtgtgtgt gtgtgtgt18<210>19<211>21<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>19tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg t21<210>20<211>21<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>20gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt g21<210>21<211>24<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>21tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtg 24<210>22<211>24<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>22gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgt 24<210>23<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>23tttgtt 6<210>24<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>24ggtggg 6<210>25<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>25gggtgg 6<210>26<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>26ttgttt 6<210>27<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>27aagtaa 6<210>28<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>28ccgtcc6<210>29<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>29tggttg6<210>30<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>30atgtat6<210>31<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>31aggtga6<210>32<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>32gagtga6<210>33<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>33gggtct6<210>34<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>34ccgtgg6<210>35<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>35gggtcc6<210>36<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>36ctgtct 6<210>37<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>37tcgttc 6<210>38<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>38cggtgc 6<210>39<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>39ttgtgg 6<210>40<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>40gggttt 6<210>41<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>41ggttgg 6<210>42<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>42ggaagg 6<210>43<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>43ggccgg6<210>44<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>44gggggg6<210>45<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>45gggagg6<210>46<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>46gggcgg6<210>47<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>47ggaggg6<210>48<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>48gtgggg6<210>49<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>49ttaggg6<210>50<211>2<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>50gt2<210>51<211>2<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>51tg 2<210>52<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>524gtgg<210>53<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>534ttgt<210>54<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>544gtgt<210>55<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>554ttgg<210>56<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>564ggtg<210>57<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>574tgtt<210>58<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>58ggtt 4<210>59<211>4<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>59tgtg 4<210>60<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>60ggtgg 5<210>61<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>61gggtg 5<210>62<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>62ggggtgg7<210>63<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>63gggtggg7<210>64<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>64tgggtgg7<210>65<211>7<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>65gggtggt7<210>66<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>66gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg27<210>67<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>67gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg27<210>68<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>68gggggtgggg gtgggggtgg gggtggg27<210>69<211>27<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>69gggggggtgg gggggtgggg gggtggg27<210>70<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>70tgtgtg 6<210>71<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>71gtgtgt 6<210>72<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>72tttgtt 6<210>73<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>73ggtggg 6<210>74<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>74gggtgg 6<210>75<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>75ttgttt 6<210>76<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>76gccgagaagg tgcgcaacct gccggctggc cacggactga acgct 45<210>77<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>77acgccgacgt cgtctgtggt ggggtgtcta ccgccaacgc gacgg 45<210>78<211>45<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>78cgactacaac ggctgggata tcaacacccc ggcgttcgag tggta 45<210>79<211>6<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>79ccaccc 6<210>80<211>5<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>80cggta 5<210>81<211>11<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>81gtgtgtttgg t 11<210>82<211>11<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>82ggttttgttt g 11<210>83<211>12<212>DNA<213>合成寡核苷酸<400>83ttgttttttt tg12<210>84<211>4<212>PRT<213>合成肽<400>84Tyr Val Ala Asp1<210>85<211>4<212>PRT<213>合成肽<400>85Asp Glu Val Asp1<210>86<211>5<212>PRT<213>合成肽<220><221>SITE<222>(4)..(4)<223>X＝Any Amino Acid<400>86Ile Leu Glu Xaa Cys1 5<210>87<211>4<212>PRT<213>合成肽<400>87Ile Glu Gly Asp權利要求
1.一種組合物，包含2-20個堿基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(序列)的組合物，所述寡核苷酸選自(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是1-7的整數，n是1-12的整數，a和b是一個或多個As、Cs、Gs或Ts。
2.權利要求1的組合物，其中所述序列是2-15個堿基的。
3.權利要求2的組合物，其中所述序列是2-10個堿基的。
4.權利要求3的組合物，其中所述序列是2-7個堿基的。
5.一種組合物，包含選自SEQ ID NOs7-18、23-47、50-66和81-83的序列。
6.權利要求5的組合物，其中所述序列選自SEQ ID NOs7、8、9、10、22-65、70-75、79和80。
7.權利要求1和5的組合物，還包含可藥用載體。
8.權利要求1和5的組合物，還包含化療劑。
9.權利要求8的組合物，其中所述化療劑選自抗代謝劑、烷化劑和激素拮抗劑。
10.一種方法，其中將組合物以誘導反應有效的量施用于患癌癥的動物，所述組合物包含2-20個堿基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(序列)，所述寡核苷酸選自(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是1-7的整數，n是1-12的整數，a和b是一個或多個As、Cs、Gs或Ts；其中所述反應選自誘導細胞周期停滯、抑制增殖、活化癌細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導癌細胞的細胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子。
11.權利要求10的方法，其中所述序列是2-15個堿基的。
12.權利要求11的方法，其中所述序列是2-10個堿基的。
13.權利要求12的方法，其中所述序列是2-7個堿基的。
14.一種方法，其中將組合物以誘導反應有效的量施用于患癌癥的動物，所述組合物包含選自SEQ ID NOs7-18、23-47、50-66和81-83的序列；其中所述反應選自誘導細胞周期停滯、抑制增殖、活化癌細胞中的半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶和誘導癌細胞的細胞凋亡以及刺激免疫系統(tǒng)細胞產生細胞因子。
15.權利要求14的方法，其中所述序列選自SEQ ID NOs7、8、9、10、22-65、70-75、79和80。
16.權利要求10和14的方法，其中細胞動物的誘導與細胞系特性無關，所述特性選自Fas、p53/p21、p21/waf-l/CIP、p15、p16、耐藥性、半胱氨酸門冬氨酰特異性蛋白酶3、TGF-β1受體和激素依賴性。
17.權利要求10和14的方法，其中的細胞因子選自IL-1-β、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α。
18.權利要求10和14的方法，其中所述癌癥選自原發(fā)性癌癥、繼發(fā)性癌癥、原發(fā)性肉瘤和繼發(fā)性肉瘤。
19.權利要求18的方法，其中所述癌癥選自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌和骨癌。
20.權利要求10和14的方法，還包括可藥用載體。
21.權利要求10和14的方法，還包括化療劑。
22.權利要求21的方法，其中所述化療劑選自抗代謝劑、烷化劑和激素拮抗劑。
23.一種方法，其中將治療動物癌癥有效量的組合物施用于患癌癥的動物，所述組合物包含2-20個堿基的3’-OH，5’-OH合成寡核苷酸(序列)，所述寡核苷酸選自(GxTy)n、(TyGx)n、a(GxTy)n、a(TyGx)n、(GxTy)nb、(TyGx)nb、a(GxTy)nb、a(TyGx)nb，其中x和y是1-7的整數，n是1-12的整數，a和b是一個或多個As、Cs、Gs或Ts。
24.一種方法，其中將治療動物癌癥有效量的組合物施用于患癌癥的動物，所述組合物包含選自SEQ ID NOs7-18、23-47、50-66和81-83的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種包含2－20個堿基的3’－OH，5’－OH合成寡核苷酸(序列)的組合物和方法，所述寡核苷酸選自(G
文檔編號A61K31/513GK1433469SQ00818858
公開日2003年7月30日 申請日期2000年12月12日 優(yōu)先權日1999年12月13日
發(fā)明者奈杰爾·C·菲利普斯, 馬里翁·C·菲利翁 申請人:拜昂尼科生命科學有限公司