專利名稱：對hiv免疫應答的改進或與其相關的改進的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種免疫原，該免疫原被設計為在人類受試者中引發(fā)抗HIV免疫應答(特別是細胞介導的應答)，一種編碼該免疫原的核酸分子，包含所述免疫原和/或所述核酸分子的組合物，以及在人類受試者中誘導抗HIV免疫應答(特別是細胞介導的應答)的方法。
背景技術：
開發(fā)有效的人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗是當前對獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)進行研究的主要目的之一。盡管HIV感染的預防和強效藥物結合治療取得了進展，但估計每天仍有16,000人受到感染。90％以上的新感染發(fā)生在發(fā)展中國家，在這些國家還無法獲得或負擔最新的醫(yī)學進展。這些國家的最大希望是開發(fā)有效的，可獲得的HIV疫苗。目前科學家們對開發(fā)AIDS疫苗的可能性越來越樂觀(McMichael和Hanke 1999 Nat.Med.5，612-614；Gold 1999 IAVI Report 4，pp1-2，8-9，15-16&18)。
一種理想的疫苗應該誘導無病原體的免疫，因此在暴露后，病毒應該在體內檢測不到。然而，這可能是一個不實際的目標。而一個能達到的目標可能是導致有限和短暫病毒復制的疫苗誘導的免疫，此后病毒不能被檢測到，不產生疾病癥狀和傳播到其它個體。替代地，一種有可能成功的疫苗可以誘導至少使被檢測病毒保持低水平的免疫應答，從而完全或基本預防進展為AIDS和傳播。
為了誘導無病原體的免疫，可能需要用預防性疫苗來引發(fā)體液和細胞介導的免疫應答。由于HIV被分離和測序，已經(jīng)付出了相當多的努力來開發(fā)誘導中和性抗體(nAb)的基于被膜的疫苗。然而，已經(jīng)證明這是極端困難的(Heilman和Baltimore 1998 Nat.Med.4(4Suppl.)532-534)。盡管有人報道在誘導抗實驗室HIV株的nAb上取得了一些成功(Berman等，1990 Nature 345，622-625；Fultz等，1992 Science 256，1687-1690)，但中和初級分離物極為困難(Trkola等，1998 J.Virol.72，1876-1885；Haynes 1996 Lancet34，933-937)。核心gp120的晶體結構為最初15年的相對失敗提供了解釋，它揭示了HIV防止有效誘導nAb的多種機制(Wyatt等，1998Nature 393，705-711；Kwong等，1998 Nature 393，638-659)。由于這些困難，許多疫苗設計者的重點轉移到了誘導細胞介導的免疫應答，這是(主要)由細胞毒T淋巴細胞介導的。
細胞毒T淋巴細胞(CTL)通常是CD8+細胞，并且以至少兩種不同的方式參與生物體的防御它們殺滅感染病毒的細胞；而且它們分泌各種直接或間接參與抑制病毒復制的細胞因子和趨化因子。接種后的CTL介導的保護可能取決于循環(huán)中的CTL水平，并可能特異性針對復制循環(huán)中早期表達(調節(jié)蛋白)而不是晚期表達(結構蛋白)的蛋白。
CD8+T細胞應答的誘導和維持需要CD4+T淋巴細胞(輔助T細胞)提供的“輔助”。在一些HIV感染的個體中，檢測到了高水平的HIV特異性輔助應答。
誘導強CD8+T細胞應答的方法的鑒定將提供研究它們在影響HIV感染過程中的作用的工具，并可能刺激研究有效HIV疫苗的進展。以前曾經(jīng)將原型的HIV疫苗構建為一串部分重疊的可以被鼠、獼猴和人CTL識別的表位，它是通過對人類為安全和可接受的疫苗載體而遞送的，即DNA載體和修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)載體(Hanke等，1998Vaccine 16，426-435；Hanke等，1998J.Gen.Virol.79，83-90)。在小鼠中，發(fā)現(xiàn)最有效的CTL誘導方案是用DNA激發(fā)，然后用MVA加強(Hanke等，1998 Vaccine 16，439-445；Schneider等，1998 Nat Med.4，397-402)，即用編碼相關多肽的核酸激發(fā)小鼠，然后通過接種表達相關表位的修飾痘苗病毒Ankara(“MVA”)載體而加強。
WO 98/56919公開了一種“激發(fā)-加強”接種策略，包括(i)用包含靶抗原的一種或更多T細胞表位來源和可藥用載體的組合物激發(fā)，和(ii)用包含靶抗原的一種或更多T細胞表位來源的組合物加強，該組合物中包括至少一種與激發(fā)組合物中的T細胞表位相同的T細胞表位。
本發(fā)明的目的包括，但不限于，提供可以用于引發(fā)人類HIV特異性應答的免疫原。在此引入說明書中提到的所有文件和公開文獻作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一方面提供了以適于給予人類受試者的無病原體形式存在的免疫原，該免疫原包含至少一部分HIV的gag蛋白，所述gag蛋白來源于HIV分化體或與一種或更多HIV分化體具有共有序列，并至少包含部分p17和p24；以及包含多個氨基酸序列的合成多肽，每個序列包含一種HIV蛋白的人CTL表位，并且其中許多HIV蛋白表現(xiàn)為合成多肽形式，所述CTL表位的選擇是為了刺激對感興趣的一種或更多HIV分化體的免疫應答。
這里提到的“無病原體的”是指一般不存在病毒、細菌、真菌、酵母、衣原體、支原體和前述微生物的孢子(尤其是在人類中致病的微生物)。然而，免疫原可以包含一種或更多用于在人類受試者中表達gag蛋白和/或合成多肽的特異性已知微生物(如病毒或細菌)載體。這些載體是本領域技術人員熟知的，并包括，例如，腺病毒和痘病毒等在人類中本身不致病或者經(jīng)遺傳操作或其它修飾使其在人類中不致病的病毒。特別優(yōu)選的是痘苗病毒，尤其是修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)。其它特別優(yōu)選的病毒載體包括Semliki Forest病毒(SFV)和Sindbis病毒(見Smerdon和Liljestrom 2000，Gene Ther.Regul.1，1-31)。合適的細菌載體包括BCG，以及沙門氏菌的減毒株(特別是開發(fā)為腹瀉疾病疫苗的沙門氏菌“雙aro”突變體)，和志賀氏菌(見Shata等，2000 Mol.Med.Today 6，66-71)。
其它可以用于產生免疫原的表達系統(tǒng)包括煙草花葉病毒(TMV)表達載體(Palmer等，1999 Arch.Virol.144，1345-60)和藍舌病毒的NS1小管(Adler等，1998 Med.Microbiol.Immunol.(Berl.)187，91-96)。
這里用到的名詞“合成的”是指其整體不存在于天然存在的HIV分離物中的多肽。名詞“合成的”不準備指必須由固相肽合成的常規(guī)化學技術合成的多肽。盡管這代表一種可能性，多肽一般優(yōu)選通過編碼合成多肽的適當核酸分子的轉錄和/或翻譯而合成。一些合成方法是本領域技術人員熟知的，不構成本發(fā)明的一部分。
gag蛋白(或其部分)和合成多肽優(yōu)選以一定的方式連接為單個整體。例如，病毒載體可以將gag蛋白和合成多肽表達為免疫原中分開的成分。替代地，免疫原的這兩種成分可以彼此共價偶聯(lián)或結合，或與共同的載體實體(如脂質體、ISCOM或分子)共價偶聯(lián)或結合。在優(yōu)選實施方案中，免疫原的gag蛋白和合成多肽成分存在于單個多肽或融合蛋白。在這種融合蛋白中，gag蛋白和合成多肽可以基本是存在的僅有成分。替代地，融合蛋白可以包含可以與其它HIV抗原(或其部分)相關或來自于其它來源的其它成分。這樣，在一些實施方案中，多肽可以包含基本鄰接于(即小于10個間插氨基酸殘基)合成多肽的gag蛋白的一部分。在其它實施方案中，gag蛋白部分和合成多肽可以由一種或更多間插成分(即有10個或更多間插氨基酸殘基)分開，間插成分一般包括一種或更多其它HIV抗原。
免疫原一般也優(yōu)選不包含完整gag蛋白氨基酸序列。一般存在55％-95％的gag蛋白，優(yōu)選65％-85％，最優(yōu)選約75％。
已知野生型HIV gag蛋白由三個部分，即p17，p24和p15組成。這些部分在感染細胞中合成為單個多蛋白，p17在N端。一般地，在HIV感染的細胞中，p17的N端是豆蔻酰化的。
理想的狀況是免疫原的gag部分至少包含部分p17和p24，但一般優(yōu)選p17成分將以一定的方式被修飾，以便預防豆蔻?；?。通過反轉免疫原中p17和p24的順序可以方便地達到這一目的，這樣p17不再處于游離N端并且因此不能被豆蔻酰化。本發(fā)明者確信這可以改進向受試者免疫系統(tǒng)呈遞來自于免疫原的肽的效率。
免疫原的gag蛋白成分一般包含至少一個T輔助細胞的II類HLA限制性肽表位，并優(yōu)選包含多個這樣的表位(優(yōu)選使許多不同的II類HLA限制性等位基因表現(xiàn)在gag成分中)。gag蛋白成分一般也將包含一種或更多CTL I類HLA限制性肽表位。
免疫原的合成多肽成分將方便地采用一串CTL表位的形式，每一個分別表現(xiàn)為約8-12個氨基酸的序列，或含有約8-12個氨基酸的序列。理想的情況是至少一些(優(yōu)選大多數(shù))表位將部分重疊(使一種表位的一個或更多氨基酸也包含在鄰接表位的序列中)。一些“非表位”氨基酸序列可以出現(xiàn)在鄰近表位之間，但一般要避免這種情況。
鄰近表位之間的非表位氨基酸優(yōu)選少于20個氨基酸殘基，更優(yōu)選少于10個殘基，最優(yōu)選1-5個氨基酸殘基。很明顯這些非表位氨基酸序列可以包含優(yōu)化合成多肽表達水平或優(yōu)化其免疫原性的接頭、間隔區(qū)等。
因此在一種極端的實施方案中，合成多肽中的所有人CTL表位都可以重疊。在另一個極端，每一個表位都可以由至少一些非表位氨基酸將其與鄰近表位隔開。一般優(yōu)選至少50％的人CTL表位是重疊的。
除了重疊表位，合成多肽可以至少包含一些“鄰接表位”。鄰接表位是指不重疊但不由間插非表位氨基酸序列分開的表位。
因此在優(yōu)選實施方案中，合成多肽包含不同HIV蛋白的小片段(一般約10-20個氨基酸殘基)一起拼湊成的嵌合型，這些片段一般將包含一個、兩個或三個已知鄰接和/或重疊的人CTL表位。合成多肽中存在相同HIV蛋白的許多片段，這些片段一般選自蛋白的不連續(xù)部分，因此合成肽一般不會包含對應于特定HIV蛋白的超過20-25個連續(xù)氨基酸殘基的序列。通常合成肽的設計基本省略了已知不含人CTL表位的HIV蛋白部分。
許多不同的HIV蛋白優(yōu)選表現(xiàn)為合成肽。合成肽可以包含存在于任何HIV抗原的表位，但優(yōu)選包含至少一種存在于下列一種或多種蛋白的表位p25；pol；gp41；gp120和nef。在一種優(yōu)選的實施方案中，合成多肽包含至少一種存在于前面提到的每一種HIV蛋白的CTL表位。合成多肽可以額外包含至少一種存在于每一種下列HIV蛋白的CTL表位vpr，vpu，vif(特別是)tat和rev。
應該理解這里用到的術語“人CTL表位”不是指得到的表位的蛋白的來源，而是指由至少一部分人群的CTL識別并應答的表位。一般地說，人CTL表位將由世界人口的至少0.01％、優(yōu)選0.1％以及更優(yōu)選至少1％識別。
在一種特定實施方案中，免疫原特別排除了來自于一般由人免疫系統(tǒng)識別的env蛋白的任何表位。大多數(shù)當前使用的診斷實驗是基于HIV env特異性免疫應答的檢測，因此通過將env成分排除在免疫原外，可以區(qū)分由病毒感染和接種免疫原導致的免疫應答。
在一種實施方案中，存在于合成多肽中的CTL表位的選擇將導致產生對HIV分化體A的免疫應答。然而合成肽優(yōu)選足夠大，并適當選擇CTL表位，從而刺激對不同HIV分化體的交叉反應性免疫應答。這可以通過引入一種或更多不同HIV分化體中的保守CTL表位而方便地達到。一些這樣的表位是本領域技術人員已知的(見下面的表1)。
在一種優(yōu)選實施方案中，免疫原包含至少一個由一種或多種實驗室檢驗哺乳動物(如小鼠和/或猴)識別的表位(方便為CTL表位)。這種表位可以容易插入合成多肽。引入此類表位允許在使用實驗室檢驗哺乳動物(如小鼠或獼猴)進行的效力測定中測定不同批免疫原的質量、再生性和/或穩(wěn)定性。這種表位的例子包括氨基酸序列ACTPYDINQML(Seq.ID No.1；含有來自于猿免疫缺陷病毒SIV，gagp27的顯性表位，由獼猴CTLs識別)和RGPGRAFVTI((Seq.ID No.2；一種來自于HIV env蛋白的H-2Dd限制性CTL小鼠表位)。
一系列共23個適于引入合成多肽的人CTL表位見表1。該列表不是完全的。優(yōu)選的免疫原將包含至少10個這種人CTL表位，更優(yōu)選至少15個，最優(yōu)選至少20個。在一種特別優(yōu)選的實施方案中，列于表1中的23個人CTL表位的每一種將以合成多肽的形式出現(xiàn)，可選擇與同樣列于表1的獼猴和鼠表位一起。
理想的免疫原可以額外包含小分子標志或標記。這種標志或標記應盡可能小，從而盡量減小存在于免疫原中的外源物質量。方便的標志或標記允許檢驗免疫原表達的檢驗和/或免疫原的定量。適當?shù)臉酥景ㄓ蓡慰寺】贵wPk識別的表位(Hanke等，1992 J.Gen.Virol.73，653-660)。
本發(fā)明的免疫原將方便地與其它物質混合，從而提供疫苗組合物。例如，疫苗組合物可以額外包含一種或更多下列成分佐劑(如明礬)、脂質體、或免疫刺激復合物(ISCOM)。疫苗一般包含無病原體稀釋液、賦形劑或載體，如生理可接受的液體(如鹽水或磷酸緩沖液)。疫苗可以以液體或更優(yōu)選以凍干固體存在，在給藥前凍干固體懸浮或溶解于生理可接受的液體。
將免疫原給予人類受試者的方法對本領域的技術人員是很明確的。具體地說，這些方法包括肌內注射、皮下注射、或通過無針頭注射設備經(jīng)皮膚遞送。另外，也可通過口服、鼻內或任何其它的適當途徑給予疫苗(特別是包含細菌載體如減毒沙門氏菌或志賀氏菌載體)。適當?shù)拿庖咴瓌┝恳话憧梢允?-500mg，一般10-100mg，取決于免疫原的大小和接受者的體重等。如果需要，適當?shù)膭┝靠梢酝ㄟ^接受不同劑量免疫原的不同受試者組的常規(guī)試驗和誤差確定，以及測定受試者對免疫原的免疫應答以判斷最優(yōu)劑量大小。受試者的免疫應答可以通過常規(guī)免疫技術測定(如鉻釋放測定，使用從受試者血樣中獲得的外周血淋巴細胞，作用于肽脈沖激發(fā)的或病毒感染的鉻標記靶細胞)第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼融合蛋白的核酸分子，該融合蛋白包含本發(fā)明第一方面的免疫原。
核酸分子優(yōu)選為分離的無病原體形式，適于給予人類受試者。核酸分子優(yōu)選為“人源化的”，即使用經(jīng)常用于高度表達的人基因中的密碼子來編碼特定氨基酸(Andre等，1998 J.Virol.72 1497-1503)，而不是由HIV使用的密碼子。
理想狀況是將核酸分子包含在載體中，編碼免疫原的序列與人細胞中有活性的啟動子序列可操作性連接。便利的條件是啟動子為強病毒啟動子，如人巨細胞病毒(CMV)啟動子。載體優(yōu)選也包括在人細胞中起作用的增強子和聚腺苷酸信號。理想地，為了最大的安全性，載體不應該含有在人細胞中有功能的復制起點，以便預防不希望的載體復制。
載體可以以分離物形式給予受試者，可以作為基本“裸露”的核酸(優(yōu)選DNA)，或可以裝配在病毒、細菌、脂質體或金包被的顆粒等遞送設備中。一種合適的遞送設備為修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)免疫原基因或開放讀碼框架(ORF)可以插入MVA，例如，在胸腺嘧啶激酶位點。
本領域的技術人員應該理解，載體可以包含編碼免疫原的核酸(此核酸因此符合本發(fā)明的第二方面)，載體也可以在其表面或內部具有本發(fā)明第一方面的多肽免疫原。
不論是作為裸核酸還是裝配在遞送設備中給藥，至少一些給予的核酸進入了受試者細胞并被轉錄(如果需要)或翻譯，導致受試者中免疫原的原位合成，受試者然后產生對免疫原的免疫應答。
對于免疫原制劑本身，可以通過皮下或肌內注射、口服遞送或通過無針頭注射器的方式經(jīng)皮膚給藥等許多已知的途徑給予人類受試者編碼免疫原的核酸。通過無針頭注射設備給藥的具體實施例公開于WO97/34652和WO 97/48485。核酸的合適劑量可以是10μg-10mg，一般為100μg-1mg，取決于核酸分子大小、給藥途徑、接受者體重等。同樣，常規(guī)試驗和誤差(具有本教導的益處)將使本領域的技術人員可以判斷核酸的最優(yōu)劑量。
已經(jīng)用以下方法成功將DNA遞送到動物組織，陽離子脂質體[Watanabe等，Mol.Reprod.Dev.38268-274(1994)；Sharkey等，WO 96/20013]，直接注射裸DNA至動物肌肉組織[Robinson等，Vacc.11957-960(1993)；Hoffman等，Vacc.121529-1533；(1994)；Xiang等，Virol.199132-140(1994)；Webster等，Vacc.121495-1498(1994)；Davis等，Vacc.121503-1509(1994)；以及Davis等，Hum.Molec.Gen.21847-1851(1993)]和胚胎[Naito等，Mol.Reprod.Dev.39153-161(1994)；和Burdon等，Mol.Reprod.Dev.33436-442(1992)]，或用“基因槍”技術皮內注射DNA[Johnston等，Meth.Cell Biol.43353-365(1994)]。
對于基于DNA的疫苗，通過注射裸質粒DNA而遞送已經(jīng)在小鼠模型表現(xiàn)出誘導體液和細胞免疫應答的潛能。然而，在更大的動物中，已經(jīng)證明利用DNA遞送而接種受到了阻礙，因為這需要大量DNA，或者會誘導抗原的持續(xù)表達，從而有可能發(fā)展為對抗原耐受。Berglund報道了通過用含有甲病毒DNA表達載體的質粒DNA注射給小鼠而誘導或增強免疫應答的策略，該載體在真核表達盒中具有重組SemlikiForest病毒(SFV)復制子[Berglund等，Nature Biotechnol.16562-565(1998)]。該真核表達盒控制SFV復制子的初級核酸轉錄物的表達。將這種編碼異源抗原的SFV復制子轉錄物運送到胞漿中并通過自我編碼的SFV復制酶復合物擴增。擴增的RNA復制子導致高水平產生編碼異源抗原的mRNA。相似的結果由Polo和他的研究小組描述過[Polo等，Nature Biotechnol.16517-518(1998)；Hariharan等，J.Virol.72950-958(1998)]。兩組都發(fā)現(xiàn)可以用小量注入質粒DNA誘導強免疫應答。
另外，一種克服了常規(guī)遞送方法的缺點而向動物遞送DNA的方法是給予減毒的、含有細菌DNA載體的侵襲性細菌，該載體具有編碼所表達基因的真核表達盒。例如，授權于Powell等的美國專利5,877,159描述了可以侵入動物細胞而不建立復制性感染或導致疾病的活細菌，從而引入了編碼可以由動物細胞表達的抗原的真核表達盒。
本發(fā)明的第三方面提供了一種刺激人受試者的抗HIV免疫應答的方法，該方法包含制備本發(fā)明第一方面的免疫原，或本發(fā)明第二方面的核酸分子；以及給予受試者所述免疫原或核酸分子。
方便地，該方法既包含給予免疫原，也包含給予核酸分子。具體地說，該方法優(yōu)選包含一次或多次給予核酸分子(“激發(fā)”)，然后經(jīng)過一段適當?shù)拈g隔(如1周至4個月)，再一次或多次給予免疫原(“加強”)?？梢酝ㄟ^例如給予包含免疫原和/或編碼抗原的核酸分子的有能力復制的(即減毒病毒或細菌)或不復制載體而進行加強。加強優(yōu)選通過給予作為MVA病毒顆粒一部分的免疫原而完成，該顆粒可以有利地包含編碼免疫原的核酸。
在一種優(yōu)選實施方案中，該方法的進行將導致在受試者中產生保護性免疫應答，因此當受試者其后暴露于HIV感染時，受試者不會產生與HIV感染相關的AIDS癥狀。
本發(fā)明的第四方面提供了本發(fā)明第一方面的免疫原和/或本發(fā)明第二方面的核酸在制備預防或治療人類受試者HIV感染的藥物中的用途。
第五方面，本發(fā)明提供了一種編碼圖8A所示氨基酸序列的核酸序列。方便地，核酸序列包含或基本由圖8B所示核苷酸序列組成。
第六方面，本發(fā)明提供了一種包含圖8A所示氨基酸序列的多肽。
第五方面的核酸和/或第六方面的多肽可以用于所描述的與本發(fā)明其它方面相關的免疫原/疫苗組合物，因此這些免疫原和疫苗也考慮在本發(fā)明的范圍內，并且可以包含前面所述的載體等(特別是MVA)。本發(fā)明在第七方面進一步提供了一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應答的方法，該方法包含給予受試者本發(fā)明第五方面的核酸和/或本發(fā)明第六方面的多肽。最后，本發(fā)明提供了本發(fā)明第五方面的核酸和/或本發(fā)明第六方面的多肽在制備預防或治療人類受試者HIV感染的藥物中的用途。
下面將通過說明性的實施例并參考附圖進一步描述本發(fā)明，在附圖中

圖1A是本發(fā)明的免疫原HIVA，HIVTA和HIV AeT；以及免疫原PPA的示意圖；圖1B表示HIVA免疫原的氨基酸序列(Seq.ID No.26)；圖2A表示編碼HIV A免疫原的核酸(稱作“HIVA基因”)的核苷酸序列(Seq.ID No.27)；圖2B是用于構建HIVA基因的方法的示意圖；圖3是本發(fā)明的DNA載體分子(pTHr.HIVA)以及其構建方法的示意圖；圖4是表示pTHr.HIVA轉染后的小鼠細胞表達的HIVA的免疫熒光檢測的顯微照片。
圖5A，B和C表示使用從接種本發(fā)明的DNA分子或免疫原的小鼠獲得的脾細胞進行的鉻釋放測定的結果。
圖6A表示HIV TA免疫原的氨基酸序列(Seq.ID No.28)；圖6B表示編碼HIV TA免疫原的核酸分子的核苷酸序列(Seq.IDNo.29)；圖7A表示存在于HIV AeT免疫原中的tat多肽的氨基酸序列(Seq.ID No.30)；圖7B表示編碼HIV AeT免疫原的核酸分子的核苷酸序列(Seq.IDNo.31)；圖8A表示本發(fā)明第六方面的PPA免疫原的氨基酸序列(Seq.IDNo.32)；圖8B表示編碼PPA免疫原的核酸分子(符合本發(fā)明的第五方面)的核苷酸序列(Seq.ID No.33)。
實施例實施例1本實施例涉及一種用于疫苗的免疫原，該疫苗主要用于誘導由CD4+輔助T淋巴細胞和CD8+效應T淋巴細胞的協(xié)同作用介導的細胞免疫應答。已經(jīng)設計將命名為HIVA(Hanke & McMichael Nat.Med.6，951-955)的免疫原用于在肯尼亞內羅畢進行的一項III期有效性臨床試驗。圖1A是包括HIVA的一些免疫原的示意圖。HIVA來源于HIV-1分化體A的序列，該分化體是內羅畢地區(qū)的最主要HIV分化體并且由大約73％的gag蛋白與一串25個部分重疊的CTL表位融合組成。HIVA的gag結構域含有p24和p17，與病毒gag p17-p24-p15多蛋白的順序相反。這種重排防止p17 N端的豆蔻?；琾17 N端的豆蔻?；梢詫⒅亟M蛋白導向到細胞膜，因此防止有效降解為I類主要組織相容復合物(MHC)呈遞所必需的肽。
圖1B表示HIVA免疫原的氨基酸序列(Seq.ID No.26)。對應于用于裝配基因的限制性核酸內切酶位點的氨基酸表示為粗體(GS對應于Bam HI，GT對應于kpnI，EF對應于EcoRI)。
gag結構域的氨基酸序列來源于HIV-1分化體A的共有序列蛋白數(shù)據(jù)庫(Korber等，″Human retroviruses and AIDS；a compilationand analysis of nucleicacid and aminoacid sequences″1997)。當沒有肯尼亞株序列時，沒有強氨基酸分化體A的區(qū)域優(yōu)選偏向于烏干達分離體。HIV-1 gag蛋白不僅含有重要的I類MHC，也含有刺激CD4+T輔助細胞的II類限制性表位。
HIVA蛋白的C端命名為多CTL表位合成多肽。包括在HIVA中的CTL表位被感染在肯尼亞流行的HIV分化體A株的患者的CTL識別，該表位為8-10個氨基酸長，來源于gag，pol，nef或env蛋白(Rowland-Jones等，1998 J.Clin.Invest.102，1758-1765；Dorrell等，1999 J.Virol.73，1708-1714)。這些表位中的許多是優(yōu)勢免疫表位，并且在其它HIV-1分化體中相對保守(表1)(因此應該可以引發(fā)與分化體A以外的其它HIV病毒分化體交叉反應的免疫應答)。它們由17種不同的HLA等位基因呈現(xiàn)，包括常見非洲等位基因和在大多數(shù)種族人群中常見的等位基因。據(jù)估計由9種最常見的HLA等位基因呈現(xiàn)的優(yōu)選表位應該覆蓋普通人群，而不考慮種族血統(tǒng)(Sydney等，1996 Immunol.Today17，261-266)。因此，只要大多數(shù)HIV感染的供體對gag p17/p24產生良好的CTL應答，每種疫苗應該具有應答于至少兩種或三種存在于HIVA蛋白中的CTL表位的潛能。
HIVA合成多肽也包含分別由獼猴和鼠CTL識別的SIV gag和HIVenv表位，因此容易在小鼠(如果需要也可以是獼猴)效力測定中評估臨床應用的批量產品的質量、再生性和穩(wěn)定性。為便于檢測全長蛋白和估計表達水平，將單克隆抗體表位Pk(Hanke et al，1992 J.Gen.Virol.73，653-660)添加到HIVA的C端。沒有理由相信三種非HLA表位會對接種個體產生健康威脅。
表1.包括在HIVA合成多肽多表位區(qū)的CD8+細胞表位
a-按出現(xiàn)在多表位中的順序列出各表位(Seq.ID Nos.3-25，1，2)。b-存在于約50％(小寫字母)或90％(大寫字母)被測序的HIV分化體分離物中的特定表位序列。c-“＝”表示該表位存在于分化體A gag結構域N端。d-一種來源于SIV gag27的顯性表位，其側翼分別為N端的Ala和C端的Leu，由獼猴CTL識別，可以用于在獼猴中進行的效力研究。E-由I類鼠MHC呈遞的CTL表位，用于小鼠中的效力測定。
由于準備采納“激發(fā)/加強”方案，其中激發(fā)通過給予核酸而完成，因此需要設計編碼HIVA免疫原的核酸序列，以便增加HIVA在人細胞中的表達。首先，為保證有效起始從第一個甲硫氨酸密碼子開始的翻譯，在HIVA開放讀碼框架(ORF)前引入12個核苷酸長的Kozak共有序列(Kozak 1987 Nucl.Acids res.15，8125-8148)。其次，通過用高度表達的人類基因中常用的密碼子替代大多數(shù)HIV-1來源的密碼子而優(yōu)化產生的mRNA的翻譯(Andre等，1998，前面已經(jīng)引用)。HIVA ORF是1608個堿基對長的雙鏈DNA HindIII-XbaI片段中的一部分。(圖2A表示含有HIVA ORF的HindIII-XbaI插入序列的核苷酸序列；Seq.ID No.27)。在圖2A中，包括了用于裝配部分PCR產物的核酸內切酶位點(核苷酸1-6＝HindIII；319-324＝BamHI；712-717＝KpnI；1135-1140＝EcoRI；和1603-1608＝XbaI)。
質粒DNA是用標準方案(Sambrook等，″Molecular Cloning.ALaboratory Manual″2nd Edition；Cold Spring Harbor)制備和處理的。在體外將HIVA基因構建為四部分(如圖2B所示)。每一部分通過70-90個堿基長的重疊正鏈和負鏈寡脫氧核苷酸的裝配而制備。根據(jù)生產商的說明用EconoPureTM試劑盒(Perkin Elmer)純化合成的寡脫氧核苷酸，退火并連接，然后進行PCR裝配。在每個步驟后凝膠純化PCR產物，直到獲得具有期望的、唯一的末端限制性核酸內切酶位點的片段?？寺〔y序這四個產物，將其連接在一起而產生完整的HIVA基因。然后將HIVA基因插入下面所述的pTHr構建體和MVA疫苗載體。
PTHr載體。設計了一種用于直接基因轉移的pTHr載體，其目的是盡量減小功能元件的數(shù)目，從而盡量減小需要給予的DNA量。
以前已經(jīng)描述過pTH的構建(Hanke等，1998 Vaccine16，426-435)。它包含人巨細胞病毒(hCMV)AD169株基因組的有效的表達增強子/啟動子/內含子盒(Whittle等，1987 Protein Eng.1，499-505；Bebbington 1991 Methods 2，136-145)。啟動子區(qū)后為pRc/CMV(Invitrogen)來源的多接頭和牛生長激素基因的聚腺苷酸化信號。賦予被轉化細菌氨芐青霉素抗性的β內酰胺酶基因和雙鏈DNA原核復制起點ColE1均來自質粒pUC19。pTH不含哺乳動物細胞復制起點。在將HIVA DNA插入pTH多接頭后，去除MluI和DraI位點間的β內酰胺酶基因片段，產生的構建體pTHr.HIVA(圖3)在細菌中利用Cobra制藥有限公司(Keele，UK)開發(fā)的阻抑物-滴定系統(tǒng)繁殖，該系統(tǒng)選擇攜帶質粒的細菌，而不需要在質粒上存在抗生素抗性基因(Williams等，1998 Nucl.Acids Res.26，2120-2124)。所以，DNA接種不將大量抗生素抗性基因拷貝引入人類。pTHr.HIVA的構建如圖3所示(CMV e/p/i＝人CMV增強子/啟動子/內含子A盒；BGHpA＝牛生長激素聚腺苷酸化信號；ColE1＝細菌中dsDNA復制起點；箭頭符號表示阻抑物結合序列)。
在補充了10％胎牛血清(FBS；Gibco)、2nM L-谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM；Gibco)中維持293T細胞和雞胚胎成纖維細胞(CEF)。在濕化的孵育器中，5％CO2和37℃的條件下培養(yǎng)細胞。利用DEAE-右旋糖苷一氯奎法(Hanke等，1998Vaccine 16，426-435)用pTHr.HIVA瞬時轉染293T細胞。簡言之，在6孔組織培養(yǎng)板中的蓋玻片上使2.5×105個293T細胞生長過夜。第二天，用每孔5g DNA轉染細胞。48小時后，固定轉染細胞，透化處理它們的細胞膜，用SV5-P-k mAb并隨后用抗鼠FITC結合的抗體檢測所表達的重組蛋白。
說明該標本的顯微照片見圖4。該圖表示三個轉染細胞和一個作為本底的未轉染細胞(左上)。
通過給予表達HIVA免疫原的MVA載體而完成加強。MVA是用于臨床應用的安全減毒痘苗病毒，幾乎失去其在人類細胞中復制的能力(Mayr等，1975 Infection 105，6-14)。已經(jīng)廣泛描述過MVA作為疫苗載體的用途以及使其成為在減毒痘病毒載體中成為一種引起人們興趣的選擇的特征(見如Sutter等，1994 Vaccine12，1032-1040；和Moss等，1996 Adv.Exp.Med.Biol.397，7-13)。
將HIVA基因連接到質粒pSC11中，該質粒將基因定位到親代MVA胸腺嘧啶激酶位點(Carroll和Moss1995 Biotechniques19，352-256)。在從特定不含病原體的禽類卵中獲得的初級CEF上培養(yǎng)大量重組MVA原種。在Beckman SW28轉子上以13,500rpm的轉速將經(jīng)過36％(W/V)的蔗糖緩沖液提取的胞漿提取物離心80分鐘以便純化MVA。利用共同插入的β半乳糖苷酶基因，在用適當?shù)孜锓跤腥镜募毎麊螌雍髲乃{斑的數(shù)目判斷病毒原種滴度。
疫苗效力測定。利用H-2Dd限制性表位的存在，在幾組Balb/c小鼠中檢測DNA和MVA載體的效力(Takahashi等，1993Int.Immunol.5，849-857)。對于pTHr.HIVA疫苗，小鼠可以用針頭肌內注射100μgDNA或使用PowderJect疫苗公司(Madison，WI，USA)的皮膚XR基因遞送設備，將總共2μgDNA隔3周進行兩次皮內免疫。在最后一次免疫后10或21天處死小鼠。去除免疫小鼠的脾，用2ml注射器橡皮柱塞逐個按壓其通過細胞粗濾器(Falcon)。洗滌脾細胞并將其分成兩半，一半凍冷用于四聚物分析，另一半懸于5ml淋巴細胞培養(yǎng)基中(R10，20mM HEPES和15mMβ巰基乙醇)并通過在5％CO2，37℃下的濕化孵育器中用2μg/ml RGPGRAFVTI(Seq.ID No.2)肽孵育5天而進行體外重新刺激。
在U型底加樣孔(96孔板；Costar)中2倍稀釋效應細胞，起始效應細胞與靶細胞比例為100∶1。然后將沒有補充或補充10-6M肽的培養(yǎng)基中的5000個鉻標記的P815靶細胞加入效應細胞并在37℃下孵育5小時。計算孔中的自發(fā)和總鉻釋放，其中分別將靶細胞單獨或與5％的Triton X-100一起放置在培養(yǎng)基中。特異性裂解的百分比計算為[(樣品釋放-自發(fā)釋放)/(總釋放-自發(fā)釋放)]×100。自發(fā)釋放低于總c.p.m的5％。
典型測定的結果見圖5A-C，5A-C為特異性裂解百分比與效應細胞靶細胞比例關系的圖示。圖5A表示從用100μg pTHr.HIVA DNA免疫一次的小鼠中獲得的脾細胞的結果。圖5B表示從用pTHr.HIVA DNA皮內免疫兩次的小鼠得到的結果。圖5C表示從用107pfu的MVA.HIVA肌內免疫的小鼠得到的結果。在圖5A到5C中，每條線代表一個小鼠。肽脈沖激發(fā)靶細胞的裂解由涂黑的符號表示，未脈沖激發(fā)的靶細胞由空心符號表示。
兩種pTHr.HIVA載體遞送方式都是高免疫原性的，并且在所有被免疫動物中誘導高細胞裂解活性(見圖5A和B)。同樣，單次肌內注射107個MVA.HIVA的斑形成單位在所有疫苗中都引發(fā)強效肽特異性裂解活性，這是在培養(yǎng)物再刺激后測得的(圖5C)。實施例2制備編碼基于HIVA的多蛋白免疫原的其它核酸構建體。這些其它的構建體和由它們編碼的免疫原被稱作HIVTA和HIVAeT，如圖1A所示。圖中也表示了稱作PPA的構建體/免疫原。相關的DNA/氨基酸序列分別如圖6A/B-8A/B所示，盡管圖7A僅表示HIVAeT中氨基酸序列的一部分(可歸于tat)，即HIVTA中序列的額外部分。(注意DNA序列的5’和3’端的HindIII和XbaI位點的序列沒有表示于圖6B，7B和8B)。該構建體是通過與前面所描述的構建HIVA的方法相似的方法制備的。
HIVTA和HIVAeT的設計原理與HIVA相同，但額外包括了HIV-1分化體A tat序列，該序列表達為與gag和多表位合成多肽融合的蛋白的一部分(在HIVTA中，tat序列在gag和合成多肽之間)，或存在于同樣的構建體，但表達為分開的多肽(在HIVAeT中)，這是由于引入了內部核糖體進入位點(IRES)。
每一種核酸分子都可以用于免疫受試者，其方法類似于上述與HIVA DNA相關的方法。同樣，這些分子可以被引入適當?shù)妮d體，特別是MVA，如實施例1中所描述，并將得到的載體用于免疫受試者。
個體HIV分離體中遺傳多樣性的意義和它對于疫苗設計的啟示已經(jīng)有長期的爭論。HIV-1分化體在歐洲占大多數(shù)，而在美國，占大多數(shù)并且研究最多的是分化體B。在中非和東非，占大多數(shù)的流行HIV-1株是分化體A，而分化體C在南非、印度和中國占大多數(shù)。一般說來，相對于CTL，分化體特異性疫苗設計要求更細心考慮nAb的誘導。盡管在CTL表位中有一些重要的分化體間差異，許多表位在各種分化體中是保守的，這部分是由于結構/功能限制。然而，為促進效力研究的解釋，應該試圖使疫苗與在試驗人群中占大多數(shù)的地區(qū)流行株相匹配，其目的在于如果沒有達到交叉保護，可以使任何成功的方法適于其它分化體。
序列表<110>醫(yī)療研究局國際艾滋病疫苗行動組織內羅畢大學<120>對HIV免疫應答的改進或與其相關的改進<130>MJL/C1248′1/M<140><141><160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>11<212>PRT<213>猿免疫缺陷病毒<400>1Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>2Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10<210>3<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>3Ala Leu Lys His Arg Ala Tyr Glu Leu1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>4Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>5Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile1 5<210>6<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>6Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys1 5 10<210>7<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>7Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>8Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu1 5 10<210>9<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>9Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>10Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>11Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>12Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>13Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu1 5<210>14<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>14Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys1 5 10<210>15<211>11<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>15Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr1 5 10<210>16<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>16Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys1 5 10<210>17<211>8<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>17Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>18Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>19Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys1 5<210>20<211>8<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>20Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>21Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val1 5<210>22<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>22Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr1 5 10<210>23<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>23His Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>24Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu1 5<210>25<211>10<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<400>25Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu1 5 10<210>26<211>527<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說明嵌合多肽<400>26Met Pro Ile Val Gln Asn Ala Gln Gly Gln Met His Gln Ala Leu Ser1 5 10 15Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe20 25 30Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr35 40 45Pro Gln Asp Leu Asn Met Met Leu Asn Ile Val Gly Gly His Gln Ala50 55 60Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Pro Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro145 150 155 160Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln165 170 175Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln180 185 190Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ser Ile Leu Arg Ala Leu Gly Pro Gly195 200 205Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro210 215 220Gly His Lys Ala Arg Val Leu Gly Thr Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu225 230 235 240Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly245 250 255Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu260 265 270Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Ser Leu Leu Glu Thr Ala Glu Gly275 280 285Cys Gln Gln Ile Met Glu Gln Leu Gln Ser Ala Leu Lys Thr Ser Glu290 295 300Glu Leu Lys Ser Leu Phe Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His305 310 315 320Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu325 330 335Glu Ile Gln Asn Lys Ser Lys Gln Lys Thr Gln Gln Ala Ala Ala Asp340 345 350Thr Gln Ser Ser Ser Lys Val Ser Gln Asn Tyr Ala Leu Lys His Arg355 360 365Ala Tyr Glu Leu Glu Phe Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys370 375 380Arg Trp Ile Ile Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu385 390 395 400Arg Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Thr Leu Trp Gln Arg405 410 415Pro Leu Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Thr Val Tyr420 425 430Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met435 440 445Thr Tyr Lys Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly450 455 460Leu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr His Pro Asp Ile Val465 470 475 480Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr485 490 495Pro Leu Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met Leu Arg Gly Pro500 505 510Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp515 520 525<210>27<211>1608<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明嵌合多肽<400>27aagcttcccg ccgccaccat gcccatcgtg cagaacgccc agggccagat gcaccaggcc 60ctgtcccccc gcaccctgaa cgcctgggtg aaggtgatcg aggagaaggc cttctccccc 120gaggtgatcc ccatgttctc cgccctgtcc gagggcgcca ccccccagga cctgaacatg 180atgctgaaca tcgtgggcgg ccaccaggcc gccatgcaga tgctgaagga 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Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Pro Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro145 150 155 160Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln165 170 175Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln180 185 190Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Ser Ile Leu Arg Ala Leu Gly Pro Gly195 200 205Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro210 215 220Gly His Lys Ala Arg Val Leu Gly Thr Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu225 230 235 240Ser Gly Gly Lys Leu Asp Ala Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly245 250 255Gly Lys Lys Lys Tyr Arg Leu Lys His Leu Val Trp Ala Ser Arg Glu260 265 270Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro Ser Leu Leu Glu Thr Ala Glu Gly275 280 285Cys Gln 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權利要求
1.一種適于給予人類受試者的無病原體形式的免疫原，該免疫原包含至少一部分HIV的gag蛋白，所述gag蛋白來源于一種HIV分化體或與一種或更多HIV分化體具有共有序列，并至少包含部分p17和p24；以及包含多個氨基酸序列的合成多肽，每個序列包含一種HIV蛋白的人CTL表位，并且其中許多HIV蛋白表現(xiàn)為合成多肽形式，所述CTL表位的選擇是為了刺激對一種或更多感興趣的HIV分化體的免疫應答。
2.權利要求1的免疫原，其中所述至少一部分gag蛋白和合成多肽作為融合蛋白存在。
3.權利要求1或2的免疫原，其中gag蛋白55-95％的氨基酸序列存在于gag的所述部分。
4.權利要求1、2或3的任意一項的免疫原，其中gag蛋白65-85％的氨基酸序列存在于gag的所述部分。
5.前面任意一項權利要求的免疫原，其中修飾了所述至少部分p17以防止N端豆蔻?；?br> 6.前面任意一項權利要求的免疫原，其中至少一些存在于合成多肽中的人CTL表位是重疊的。
7.權利要求6的免疫原，其中至少50％存在于合成多肽中的人CTL表位是重疊的。
8.前面任意一項權利要求的免疫原，其中至少一些存在于合成多肽中的人CTL表位是鄰接的。
9.前面任意一項權利要求的免疫原，其中至少一些人CTL表位是由非表位氨基酸序列分開的。
10.前面任意一項權利要求的免疫原，包含至少一個由一種或更多實驗室檢驗哺乳動物識別的表位。
11.權利要求10的免疫原，其中所述由一種或更多實驗室檢驗哺乳動物識別的表位是CTL表位。
12.前面任意一項權利要求的免疫原，其中合成多肽包含至少10個表1所指出的人CTL表位。
13.前面任意一項權利要求的免疫原，其中合成多肽包含至少15個表1所指出的人CTL表位。
14.前面任意一項權利要求的免疫原，其中合成多肽包含至少20個表1所指出的人CTL表位。
15.前面任意一項權利要求的免疫原，其中合成多肽包含所有23個表1所指出的人CTL表位。
16.一種用于人類受試者的HIV免疫原，該免疫原包含至少一部分gag蛋白，所述gag蛋白來源于一種感興趣的HIV分化體或與一種感興趣的HIV分化體具有共有序列，其中所述部分至少包含部分p17和p24，并且經(jīng)修飾而防止N端豆蔻酰化；以及包含來自于多種不同HIV蛋白的多個人CTL表位的合成多肽，每個CTL表位具有8-12個氨基酸，所述CTL表位的選擇是為了刺激對感興趣的分化體的免疫應答。
17.一種用于人類受試者的HIV免疫原，該免疫原包含至少一部分gag蛋白，所述gag蛋白來源于一種感興趣的HIV分化體或與一種感興趣的HIV分化體具有共有序列，其中所述部分至少包含部分p17和p24，并且經(jīng)修飾而防止N端豆蔻?；?；以及包含來自于多種不同HIV蛋白的多個人CTL表位的合成多肽，每個CTL表位具有8-12個氨基酸，所述CTL表位的選擇是為了刺激對所述感興趣的分化體的免疫應答；并且所述合成多肽可選擇具有至少一個由實驗室動物識別的免疫原性表位。
18.前面任意一項權利要求的免疫原，包含圖1B所示的氨基酸序列。
19.權利要求18的免疫原，基本由圖1B所示的氨基酸序列組成。
20.前面任意一項權利要求的免疫原，其中所述感興趣的分化體選自HIV分化體A，B，C，D，E，F(xiàn)，G和H。
21.權利要求20的免疫原，其中所述感興趣的分化體為HIV分化體A。
22.權利要求20的免疫原，其中所述感興趣的分化體為HIV分化體B。
23.權利要求20的免疫原，其中所述感興趣的分化體為HIV分化體C。
24.前面任意一項權利要求的免疫原，其中所述人CTL表位包括至少一種來自于HIV蛋白nef，p24，p17，pol，gp41和gp120的每一種的表位。
25.權利要求24的免疫原，其中所述人CTL表位包括至少一種來自于HIV蛋白nef，p24，p17，pol，gp41，gp120，tat和rev的每一種的表位。
26.權利要求24的免疫原，其中所述人CTL表位包括至少一種來自于HIV蛋白nef，p24，p17，pol，gp41，gp120，tat，rev，vpr，vpu和vif的每一種的表位。
27.編碼前面任意一項權利要求的免疫原的核酸分子。
28.權利要求27的核酸分子，其中將免疫原編碼為融合蛋白。
29.權利要求27或28的核酸分子，包含圖2A所示核苷酸序列。
30.包含權利要求27、28或29的任意一項的核酸分子的載體。
31.權利要求30的一種特殊載體，進一步包含權利要求1-26的任意一項的免疫原。
32.一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應答的方法，該方法包括以下步驟制備權利要求1-26的任意一項的免疫原和/或權利要求27-29的任意一項的核酸分子；并將該免疫原和/或該核酸分子給予受試者。
33.權利要求32的方法，其中通過一次或多次給予該核酸分子激發(fā)受試者；并隨后通過一次或多次給予免疫原而加強。
34.權利要求1-26的任意一項的免疫原和/或權利要求27-29的任意一項的核酸分子在制備預防或治療人類受試者中HIV感染的藥物中的用途。
35.一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應答的方法，包括一次或多次以足夠激發(fā)對所述免疫原的免疫應答的含量給予所述受試者編碼權利要求1-26的任意一項的免疫原的核酸分子，并一次或多次以足夠加強對所述免疫原常見部分的免疫應答的含量給予所述受試者編碼和/或含有權利要求1-26的任意一項的免疫原的修飾痘苗病毒Ankara(MYA)顆粒。
36.一種細菌，含有權利要求1-26的任意一項的免疫原，或含有權利要求27-29的任意一項的核酸分子。
37.權利要求36的細菌，該細菌為減毒病原體，適于給予人類受試者。
38.一種編碼包含圖8A所示氨基酸序列的多肽的核酸分子。
39.一種編碼基本由圖8A所示氨基酸序列組成的多肽的核酸分子。
40.權利要求38或39的核酸分子，包含圖8B所示核苷酸序列。
41.一種包含圖8A所示氨基酸序列的多肽。
42.一種基本由圖8A所示氨基酸序列組成的多肽。
43.一種特殊的載體，包含權利要求38或39的核酸序列和/或權利要求41或42的多肽。
44.一種刺激人類受試者中抗HIV免疫應答的方法，該方法包括以下步驟制備權利要求38或39的核酸分子和/或權利要求41或42的多肽，并將該核酸分子和/或該多肽給予受試者。
45.權利要求38或39的核酸分子和/或權利要求41或42的多肽在制備預防或治療人類受試者中HIV感染的藥物中的用途。
46.一種基本如此前所描述并參考附圖的免疫原。
47.一種基本如此前所描述并參考附圖的刺激人類受試者中抗HIV免疫應答的方法。
全文摘要
公開了一種無病原體形式的適于給予人類受試者的免疫原，該免疫原包含至少一部分HIV的gag蛋白，所述gag蛋白來源于一種HIV分化體或與一種或多種HIV分化體具有共有序列，并至少包含部分p17和p24；以及包含多個氨基酸序列的合成多肽，每個序列包含一種HIV蛋白的人CTL表位，并且其中許多HIV蛋白表現(xiàn)為合成多肽形式，所述CTL表位的選擇是為了刺激對一種或更多感興趣的HIV分化體的免疫應答。
文檔編號A61K48/00GK1434831SQ0081767
公開日2003年8月6日 申請日期2000年12月22日 優(yōu)先權日1999年12月23日
發(fā)明者T·翰克, A·J·麥克邁克爾 申請人:醫(yī)療研究局, 國際艾滋病疫苗行動組織, 內羅畢大學