專利名稱：Trap蛋白在制備治療金黃色葡萄球菌感染的藥品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體地說涉及TRAP蛋白在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(以下簡稱金葡菌，Staphylococcus aureus)屬葡萄球菌屬，是人類的一種重要病原菌，能夠引起肺炎、心內(nèi)膜炎、燒傷及戰(zhàn)傷感染、敗血癥、中毒性休克等多種嚴(yán)重感染。金葡菌也是引起食物中毒的一種細(xì)菌。金葡菌廣泛分布于空氣、土壤、水及食具中。人和動(dòng)物具有較高的帶菌率。金葡菌能夠在人群密集的區(qū)域通過唾沫，接觸進(jìn)行大規(guī)模傳播。每年僅醫(yī)院內(nèi)感染金葡菌的人數(shù)就超過數(shù)百萬。它是革蘭陽性菌膿毒癥的主要致病菌，也是燒傷創(chuàng)面感染、急性肝衰竭的重要病原菌。
金葡菌的主要致病物質(zhì)是外毒素，包括溶血毒素、殺白細(xì)胞素、腸毒素等。最新研究表明，金葡菌這些毒力因子的合成是受一種可調(diào)節(jié)RNA分子，即RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因轉(zhuǎn)錄，通過堿基互補(bǔ)調(diào)節(jié)毒力因子的翻譯。在細(xì)菌生長的對數(shù)早期其RNAIII水平低，但到對數(shù)晚期RNAIII水平會(huì)增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的RNAIII激活蛋白(RNAIIIactivating protein，以下簡稱RAP)調(diào)節(jié)的，故因子RAP又稱為金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持續(xù)分泌RAP，在RAP達(dá)到一定濃度后才有激活毒力因子產(chǎn)生的作用。沒有RAP產(chǎn)生的金葡菌本身并不致病(Balaban，N.et al.Science 1995，280，438-440)。研究發(fā)現(xiàn)，RAP激活RNAIII的轉(zhuǎn)錄是通過一個(gè)21kD的RNAIII激活蛋白的靶蛋白(Target of RNAIII activating protein，以下簡稱TRAP)介導(dǎo)的，當(dāng)TRAP蛋白的編碼基因被突變失活后，RAP不能夠激活RNAIII的轉(zhuǎn)錄。TRAP由167個(gè)氨基酸組成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生長的早期開始磷酸化，在對數(shù)生長中期達(dá)到最大水平。在RAP作用后，通過自身磷酸化來進(jìn)行信號傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667)。TRAP蛋白是金葡菌表面蛋白，在葡萄球菌屬中高度保守。TRAP蛋白主要生物學(xué)功能是參與金葡菌毒素調(diào)控，隨著TRAP蛋白磷酸化水平的升高，金葡菌的外毒素水平上調(diào)(Gov Y，et al.J Biol Chem 2004，27914665-72)。
研究發(fā)現(xiàn)通過抑制上述金葡菌毒素產(chǎn)生的RAP和TRAP通路，可以有效的降低金葡菌的致病作用。RAP和TRAP的抑制劑如小分子抑制肽(RNAIII inhibitingpeptide，簡稱RIP)、抗體都可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌。TRAP蛋白的C末端可以成為有效的肽疫苗來保護(hù)機(jī)體抵抗金葡菌引起的感染(0leny V，etal.Peptides 2001，221621-1627；Yang，G.，et al.Peptides 2003，24，1823-1828；Yang，G，et al.J Biol Chem 2005，28027431-27435)。
目前解決金匍菌感染的問題的主要方法是抑制上述金匍菌毒素產(chǎn)生的通路從而減少金匍菌毒素的產(chǎn)生，如通過RIP、RAP抗體等，從而降低金匍菌的致病作用。一個(gè)美國專利《RNAIII激活蛋白的靶蛋白(TRAP)》(專利申請?zhí)?53780)以一種金黃色葡萄球菌為例說明TRAP蛋白的DNA序列和氨基酸序列，并對含有TRAP蛋白的核苷酸序列、氨基酸序列、多肽，以及核苷酸序列的啟動(dòng)子、重組載體、試劑盒、寄主細(xì)胞以及產(chǎn)生相應(yīng)產(chǎn)物的方法申請了專利。其已放棄的前一專利《RNAIII激活蛋白的靶蛋白(TRAP)》(專利申請?zhí)?93862)將TRAP蛋白和作為誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體和作為藥物的成分申請了專利保護(hù)，并提出了通過單克隆或者多克隆抗體抑制TRAP蛋白從而抑制金黃色葡萄球菌感染的產(chǎn)生的方法。
但是，抗生素的濫用導(dǎo)致金葡菌耐藥性不斷增強(qiáng)，目前已經(jīng)出現(xiàn)的耐藥菌株包括對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐糖肽類抗生素的耐糖肽金葡菌(GISA)、耐萬古霉素的金葡菌(VRSA)等。由于金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性且無好的解決方法，常用的許多抗生素對之無效，因此找到一種既能有效控制控制金葡菌感染又不易產(chǎn)生抗藥性的藥物是臨床醫(yī)學(xué)殛待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能有效抑制和治療金黃色葡萄球菌感染、又不易產(chǎn)生抗藥性和耐藥性的藥物。
本發(fā)明通過以下方式實(shí)現(xiàn)TRAP蛋白在制備治療金黃色葡萄球菌感染的藥品中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用中所述的TRAP蛋白包括天然的TRAP蛋白、重組TRAP蛋白、完整的TRAP蛋白或者是生物學(xué)上有活性的片段。
上述應(yīng)用中所述的TRAP蛋白來自于葡萄球菌。
上述應(yīng)用中所述的TRAP蛋白來自于金黃色葡萄球菌。
上述中應(yīng)用中所述的TRAP蛋白可以是通過基因工程重組得到。
上述中應(yīng)用中所述的藥品可以是TRAP蛋白與其他蛋白構(gòu)成的融合蛋白。
上述中應(yīng)用中所述的藥品可以是TRAP蛋白的化學(xué)修飾物。
上述中應(yīng)用中所述的藥品可以是包含TRAP蛋白的組合物。
上述應(yīng)用中所述的藥品按照通常的方式可以制備成各種劑型。
上述應(yīng)用中所述的藥品可以口服或者注射或者局部應(yīng)用。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞模型和金葡菌感染的動(dòng)物模型上，外源性TRAP蛋白(指加入天然純化的TRAP蛋白或表達(dá)純化的基因工程重組TRAP)本身就對金葡菌外毒素的產(chǎn)生具有很好的抑制作用，降低金葡菌致病性，其效果與TRAP蛋白的多克隆抗體類似。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，TRAP蛋白在抗金葡菌感染方面有著雙重作用，即蛋白本身和其抑制劑或抗體會(huì)達(dá)到同樣效果，它將代表一類全新的藥物作用方式。
本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用TRAP治療金葡菌感染時(shí)，必定會(huì)引起人機(jī)體產(chǎn)生針對TRAP的抗體(因?yàn)門RAP是細(xì)菌來源的外源蛋白)。對傳統(tǒng)藥物來說，抗體的產(chǎn)生意味著對藥物作用的抑制，但是對TRAP來說，產(chǎn)生的抗體恰恰有用。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，多種不同金葡菌菌株來源的TRAP蛋白具有相同的抑制金葡菌外毒素的產(chǎn)生、降低金葡菌致病性的作用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)、本發(fā)明發(fā)掘了TRAP蛋白在制備藥品中的新用途，開辟了將細(xì)菌細(xì)胞膜相關(guān)蛋白用于制備治療藥物的新領(lǐng)域，它代表了一種全新的藥物模式。
(2)、本發(fā)明的TRAP蛋白在人類基因組中未發(fā)現(xiàn)同源序列，所以不會(huì)引起人類免疫性疾病。
(3)、TRAP蛋白在抑制金黃色葡萄球菌產(chǎn)生毒素的同時(shí)，也刺激機(jī)體本身產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，而產(chǎn)生的抗體又能進(jìn)一步發(fā)揮抑制金葡菌外毒素產(chǎn)生的作用，這種TRAP蛋白先起作用，因該蛋白而產(chǎn)生的抗體又繼續(xù)發(fā)揮同樣作用的模式提供了一種全新的藥物作用模式。
(4)、應(yīng)用TRAP蛋白藥物治療金黃色葡萄球菌感染，由于它主要是抑制毒素產(chǎn)生，降低金葡菌致病性，對細(xì)菌本身的生存沒有影響，所以不易導(dǎo)致抗藥性或者耐藥性的產(chǎn)生，這種藥物對于已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的葡萄球菌也同樣能發(fā)揮作用。


圖1不同來源的外源TRAP蛋白對金葡菌外毒素產(chǎn)生的影響的柱狀圖。(注其中的數(shù)字代表TRAP的來源1.GenBankTM接受號AF202641蛋白組；2.GenBankTM接受號AY248703；3.從金葡菌中純化的天然TRAP蛋白組；4.TRAP蛋白與12個(gè)氨基酸的多肽構(gòu)成的融合蛋白；5.為正常細(xì)胞對照；6.生理鹽水對照組)。
圖2外源TRAP蛋白對小鼠體內(nèi)TRAP抗體產(chǎn)生的影響的柱狀圖。(注1.TRAP處理組2.鹽水對照組3.陰性對照)。
具體實(shí)施例方式
下面以幾個(gè)實(shí)施例來具體說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
制備實(shí)施例1兩個(gè)金葡菌家族(TRAP蛋白(GenBankTM接受號AF202641/AY248703))的TRAP蛋白的獲得。按照Yang，G，et al.(2005)的方法，根據(jù)GenBank的堿基序列，設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法分別從RN6390B和04018兩種菌株的基因組擴(kuò)增TRAP基因，克隆入pET-28a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni2+親和樹脂純化，獲得兩種相應(yīng)的TRAP蛋白。
制備實(shí)施例2天然TRAP蛋白的制備利用重組的TRAP蛋白制備多抗，將重組的TRAP蛋白偶聯(lián)CNBr活化的Sepherose4B制備親和株純化抗體，將純化的抗體偶聯(lián)CNBr活化的Sepherose4B，通過親和純化的方法從金葡菌RN6390B超聲上清中純化TRAP蛋白，通過HPLC進(jìn)一步純化，獲得天然純化的TRAP蛋白，純度都大于95％。
制備實(shí)施例3TRAP蛋白與12個(gè)氨基酸的多肽構(gòu)成的融合蛋白的制備選擇無關(guān)肽序列(TPSIPSLWWTTP-沈彤等，細(xì)胞與分子免疫學(xué)2002，18623-626)，設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法獲得表達(dá)TRAP-無關(guān)肽融合蛋白的基因序列，克隆入pET-28a載體，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用Ni2+親和樹脂純化，獲得TRAP蛋白與12個(gè)氨基酸的多肽構(gòu)成的融合蛋白。
實(shí)施例1利用MTT法在MDBK細(xì)胞模型上檢測多種來源的TRAP蛋白對金葡菌外毒素的影響(1)、37℃過夜培養(yǎng)金葡菌；將制備實(shí)施例1、制備實(shí)施例2和制備實(shí)施例3制備和純化的各種TRAP蛋白分別溶解于生理鹽水，終濃度為2μg/μl；(2)、將過夜菌離心(5,000rpm/5min)收集菌體，用培養(yǎng)基重旋稀釋至OD600nm＝8，1∶100轉(zhuǎn)接于0.9ml培養(yǎng)基中；(3)、同時(shí)加入步驟(1)的100μlTRAP蛋白，以100μl生理鹽水為對照，培養(yǎng)6小時(shí)；(4)、離心(10,000rpm/5min)收集上清，煮沸10分鐘，再次離心(10,000rpm/5min)收集上清；(5)、接種MDBK細(xì)胞，1×104/孔，在CO2孵箱中，37℃培養(yǎng)4小時(shí)貼壁；(6)、將細(xì)菌培養(yǎng)上清加入MDBK細(xì)胞培養(yǎng)液中(10μl/孔)，CO2孵箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)；(7)、MTT測定細(xì)胞的存活情況。
(8)、圖1縱坐標(biāo)反映細(xì)胞存活情況，OD值越高，結(jié)果表明細(xì)胞存活越多，金葡菌外毒素產(chǎn)生越少。從圖1可以看出外源加入TRAP蛋白的各組細(xì)胞存活情況良好，而沒有加入外源TRAP蛋白的細(xì)胞存活情況不好，說明外源加入TRAP蛋白能夠降低金葡菌外毒素的產(chǎn)生，此外，不同來源的TRAP蛋白抑制金葡菌外毒素產(chǎn)生的效果無顯著性差別。
實(shí)施例2腹腔感染動(dòng)物模型上檢測TRAP蛋白對金葡菌感染的治療作用(1)、材料準(zhǔn)備BALB/c小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，其余材料同制備實(shí)施例1和制備實(shí)施例3。
(2)、37℃過夜培養(yǎng)金葡菌；將制備實(shí)施例1中獲得和純化的兩種基因工程重組TRAP蛋白和制備實(shí)施例3中獲得和純化的TRAP融合蛋白分別溶解于生理鹽水，終濃度為2μg/μl；(3)、將過夜菌離心(5,000rpm/5min)收集菌體，用培養(yǎng)基重懸稀釋至OD600nm＝8。1∶100轉(zhuǎn)接于1ml培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600nm＝5，離心收集菌體，用等體積的生理鹽水重懸；(4)、BALB/c小鼠(20-25g，雄性)，每組20只，共4組；(5)、腹腔注射金葡菌100μl，5小時(shí)后腹腔注射各種TRAP蛋白，以生理鹽水為對照；(6)、記錄各組小鼠的存活時(shí)間和存活狀態(tài)，結(jié)果TRAP蛋白可以有效地降低金葡菌對小鼠的感染，增加感染小鼠存活率(見表1)。
表1 TRAP蛋白對金葡菌感染的治療作用

注組1為TRAP(GenBankTM接受號AF202641)蛋白處理組；組2為TRAP(GenBankTM接受號AY248703)蛋白處理組；組3為TRAP蛋白與12個(gè)氨基酸的多肽構(gòu)成的融合蛋白處理組；組4為生理鹽水對照組。
實(shí)施例3多次注射TRAP蛋白對小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生的影響(1)、材料方法同制備實(shí)施例1和制備實(shí)施例2，不同的是腹腔注射TRAP(GenBankTM接受號AF202641)共3次，每7天一次。一個(gè)月后收集小鼠血清，ELISA測定小鼠體內(nèi)TRAP抗體產(chǎn)生情況；(2)結(jié)果多次注射TRAP在小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生TRAP抗體，而沒有注射的則基本沒有抗體，說明外源TRAP能夠誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生TRAP抗體(見圖2)參考文獻(xiàn)1、Balaban et al.Science 1998，vol.280438-440.
2、Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667.
3、Yang，G，et al.J Biol Chem 2005，28027431-27435.
4、沈彤等，細(xì)胞與分子免疫學(xué)2002，18623-62權(quán)利要求
1.TRAP蛋白在制備治療金黃色葡萄球菌感染的藥品中的應(yīng)用
2.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的TRAP蛋白可以是天然的TRAP蛋白、重組TRAP蛋白、完整的TRAP蛋白或者是生物學(xué)上有活性的片段。
3.按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的TRAP蛋白來自于葡萄球菌。
4.按照權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的TRAP蛋白來自于金黃色葡萄球菌。
5.按照權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的TRAP蛋白來自于基因重組。
6.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其所述的藥品可以是含有TRAP蛋白的融合蛋白。
7.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其所述的藥品可以是含有TRAP蛋白的化學(xué)修飾物。
8.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其所述的藥品可以是含有TRAP蛋白的組合物。
9.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其所述的藥品可以是各種劑型。
10.按照權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其所述的藥品可以口服或者注射或者局部應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了TRAP蛋白在制備治療金黃色葡萄球菌感染的藥品中的用途。外源使用TRAP蛋白(指天然的TRAP蛋白或基因工程重組TRAP蛋白)對金黃色葡萄球菌外毒素的產(chǎn)生具有很好的抑制作用，降低了金黃色葡萄球菌致病性；此外應(yīng)用TRAP蛋白藥物治療金黃色葡萄球菌感染時(shí)必定引起人機(jī)體產(chǎn)生針對TRAP的抗體，這種抗體又能進(jìn)一步發(fā)揮抑制金黃色葡萄球菌外毒素產(chǎn)生的作用，這種雙重作用提高了藥物的作用效果，而且提供了一種全新的藥物作用模式；此外，TRAP蛋白的作用只是針對細(xì)菌的毒性，而不影響細(xì)菌的生長，因而不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，所以TRAP蛋白對已耐藥的金黃色葡萄球菌也同樣有效；由于在人類基因組中未發(fā)現(xiàn)同源序列，所以使用TRAP蛋白藥物也不會(huì)引起人類免疫性疾病。
文檔編號A61P31/04GK1872335SQ200610075638
公開日2006年12月6日 申請日期2006年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月17日
發(fā)明者楊光, 邵寧生, 高亞萍, 劉玉, 董潔, 李少華, 柳川, 沈倍奮, 范明 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 海南通用同盟藥業(yè)有限公司