專利名稱：低聚糖混合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一低聚糖混合物，該低聚糖得自于一種或多種動物乳，并且是由二種或多種單糖單元構成，該低聚糖混合物可被用于抵御胃腸功能紊亂。
成人乳中的低聚糖含量約為10g/l。在成人乳中至今為止約有80種不同的低聚糖被確認了結構，它們是由3-13個單糖構成；Newburg，D.S.和Neubauer，S.H.(1995)“乳中的碳水化合物分析，定量和意義”(Carbyhydrates in milkAnalysis，quantities and significance)，《乳組份手冊》(Handbook of Milk Composition)Jensen，R.G.，編輯，學術出版社(Academic Press)，273-349。在這些低聚糖的多種結構中，結構和位置異構起著重要的作用。中性低聚糖或低聚糖結構對唾液酸(酸性)低聚糖或低聚糖結構的比例在成人乳中約為10∶1。
低聚糖在對人體中特定的和非特定的感染抵抗力方面具有下述的重要作用1.人乳中的低聚糖構成雙歧桿菌的一種基質(zhì)源。因此其支持腸胃功能所必須的正常的腸內(nèi)菌叢，并抑制病原菌；Rose，C.S.，Kuhn，R，Zilliken，F(xiàn).和Gyrgy，P.(1954)雙歧因子(Bifidus Factor)V.α-和β-甲基-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷的活性，Arch.Biochem.Biophys.49，123-129。
2.低聚糖會阻止病原菌和/或細菌、毒素和真核寄生蟲類物質(zhì)的附著，因為其起著作為特殊的接收器類似物的作用，并由此防止了感染的第一步。不同的體外試驗顯示低聚糖對于許多不同的致病微生物表現(xiàn)為抗附著作用；Kunz，C.和Rudloff，S.(1993)人乳中低聚糖的生物功能(Biological functions of oligosaccharides in human milk)，ActaPaediatr.82，903-912。
3.低聚糖通過影響不同的有免疫活性的細胞促進抵御感染的能力。一定低聚糖結構的免疫調(diào)節(jié)作用在動物試驗中表現(xiàn)為至少將白介素的產(chǎn)量提高10倍；Velupillai，P.和Harn，D.A.(1994)得自被血吸蟲感染的小鼠的B220+細胞對10倍量白介素的低聚糖特異性指令CD4+T-細胞亞群的調(diào)節(jié)機制(Oligosaccharide-specific instruction ofinterleukin 10 production by B 220+cells from schistosome-infected micea mechanism for regulation of CD4+T-cell subsets)，Proc.Natl.Acad.Sci.91，1-2。
來自至今已知的大多數(shù)哺乳動物的低聚糖的多相性在許多方面與人乳中的低聚糖不同。無論在數(shù)量和質(zhì)量上其低聚糖組成均存在非常大的區(qū)別。哺乳動物乳中的低聚糖的種特異性差別表現(xiàn)在單一組分的濃度上，同時在相似特征的結構上，或基本結構上均有不同。與人乳的低聚糖相比其單糖序列及鍵合均不同。因此在大多數(shù)動物乳中大多數(shù)單一組分的含量比人類母乳中低很多。
假定該區(qū)別是由新生兒胃腸道對乳中的低聚糖組分的需求確定的。那么該需求對不同的種類變化也很大。與需求有關的這類區(qū)別不僅新生兒和新生的動物間有，而且在不同新生動物間也有。該區(qū)別取決于于新生兒的胃腸道的功能狀況、免疫系統(tǒng)的成熟程度、偏好的營養(yǎng)種類以及各種類的極特異的細菌環(huán)境。
如果人們試圖用人造乳或基于動物乳的嬰兒乳粉代替人乳，則會面對一個問題，即按照今天的認識狀況就可以看出單一動物種的乳與人乳相比不僅在結構多樣性上會有不同，其相關的低聚糖含量也有不同。
本發(fā)明的目的是提供一種低聚糖混合物，其中的低聚糖得自一種或多種動物乳，該混合物的積極作用，特別是其抗感染的作用最大程度地與人乳相當。
通過按照權利要求書所述的低聚糖的混合物可以實現(xiàn)這一任務。
非常驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過將得自一種或多種不同動物乳的低聚糖混合而得的新型混合物，可使動物乳中低聚糖的抗感染和/或生物效應得到加強。因此本發(fā)明低聚糖混合物由至少兩種低聚糖部分混合而成，每種低聚糖部分至少含有兩種不同的低聚糖。該低聚糖部分可以來自一種或多種動物乳。很自然地，在動物乳中不包括人乳。
每一種低聚糖部分至少含有兩種不同的低聚糖。這樣的低聚糖可認為是，至少有一種特征是不同的。例如兩種二糖，其由相同的單糖單元組成，但是鍵合次序不同，則被視為不同的低聚糖。其不同之處可為結構上的，也可為組成上的。
本發(fā)明的一個最重要方面是，將來自一種或多種不同種的動物乳的低聚糖部分以一種新的方式重新組合，以實現(xiàn)增強的生物效應。當然在此重新組合，或稱為重新混合時應保證，不會得到在一種動物乳或多種動物乳中已存在的原始混合物。鑒于此，在低聚糖混合物中存在的低聚糖的總譜與從中獲取了低聚糖部分的某種動物乳或多種動物乳的低聚糖的總譜必須不同。例如按照本發(fā)明的低聚糖混合物僅來自于一種動物乳時，則該混合物應由后面的有關總譜的特征表達，即從所述單一動物乳獲得的低聚糖部分的新的組合物或新的混合物不再導致產(chǎn)生原始的動物乳。如果該低聚糖混合物來自多種動物乳，則新的組合或新的混合過程不會使所得的低聚糖混合物與原始使用的動物乳的一種低聚糖組合物相應。
如果按照本發(fā)明的低聚糖混合物的低聚糖僅來自一種動物乳，則此時中性低聚糖對酸性低聚糖的比例關系是90-60∶10-40重量％。換句話說，除了酸性的低聚糖部分外，還存在中性的低聚糖部分。這兩種部分均含有至少兩種不同的低聚糖。相對于在動物乳中的中性低聚糖對酸性低聚糖的原始比例，通過改變酸性低聚糖對中性低聚糖的比例，生理作用的效果上升明顯。
如果低聚糖得自不同來源且至少兩種動物乳，必須以這樣的一種方式實現(xiàn)新的組合或新的混合，即得自兩種不同動物乳的每種低聚糖將至少占低聚糖混合物中存在的低聚糖總量的10重量％。如果該低聚糖得自兩種動物乳，則得自一種動物乳的低聚糖應至少占10重量％，而得自另一動物乳的低聚糖同樣至少應占10重量％且最多90重量％，反之亦然。但如果低聚糖得自三種或更多種的動物乳，則其中兩種動物乳的低聚糖必須至少占10重量％，而得自于其他動物乳的低聚糖所占份額可低于10重量％。
作為制備本發(fā)明的低聚糖混合物的來源，可使用所有的動物乳，這里優(yōu)選牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和水牛的乳的低聚糖部分。
低聚糖部分的分離可通過已知的分離方法來進行。通過使用分離機借助密度離心法脫脂。蛋白質(zhì)的分離可借助超濾或借助溶劑(例如乙醇、丙酮)的沉淀來進行。乳糖可通過下述的一種或多種方法分離結晶法、過濾法以及色譜法(配位體交換色譜法、凝膠過濾法、洗脫色譜法、循環(huán)色譜法和模擬逆流色譜法(SMB))。礦物質(zhì)可通過電透析、超微過濾、離子交換和/或反滲透來分離。在中性和酸性低聚糖中的低聚糖部分的分離可通過一種上述提及的色譜法和/或陰離子交換色譜法，以及也可借助傳統(tǒng)的過濾法來進行。
按照優(yōu)選的方式，本發(fā)明的來自至少兩種動物乳的低聚糖混合物為重新組合而成，此時中性低聚糖對酸性低聚糖的比例為90-60∶10-40重量％。
上述給出的比例90-60∶10-40重量％包括了至少全部整數(shù)中間值的比例關系，如89∶11，88∶12，87∶13，......85∶15，......80∶20，79∶21，......75∶25，74∶26，73∶27，72∶28，......68∶32，67∶33，66∶34，65∶35，64∶36，63∶37，62∶38，61∶39。
本發(fā)明的低聚糖混合物中的低聚糖主要是由一個或多個下述的單糖單元構成D-葡萄糖、D-半乳糖、D-N-乙?；咸前贰-N-乙?；肴樘前贰-海藻糖、D-甘露糖、D-形式的唾液酸(例如D-N-乙?；窠?jīng)氨酸和D-N-羥乙?；窠?jīng)氨酸)，及其O-乙?；?、硫酸化的和磷酸化的衍生物。
在動物乳中大量存在的游離乳糖通常不計入得自動物乳的、本發(fā)明應用的低聚糖部分內(nèi)。當然在本發(fā)明的低聚糖混合物中除本發(fā)明應用的低聚糖部分外，也可以有游離的乳糖存在。
換言之，按照本發(fā)明的低聚糖混合物也可僅用含低聚糖的低聚糖部分構成，該部分得自于一種或多種動物乳，由兩個或多個單糖單元構成，在此不計入游離的乳糖。但如上所述，該低聚糖混合物可含有來源于或非來源于動物乳的游離的乳糖。此外低聚糖混合物可含有非來自于動物乳的一種或多種低聚糖。因此按照本發(fā)明的低聚糖混合物可與通常用于食品，特別是嬰兒食品的糖類一同使用、混合。此外，在本發(fā)明的低聚糖混合物中也可存在這樣的低聚糖，其是通過化學、酶和/或技術轉化來獲得本發(fā)明使用的低聚糖或低聚糖部分時，從糖脂和/或糖蛋白中釋放出來的。
按照本文上述所給出的低聚糖范圍，術語低聚糖特別涉及來自于動物乳的低聚糖。除此之外也可存在其它的如上所述的低聚糖，此時該情況是上面提及的或者是與下文有關聯(lián)的。
乳制品是用于低聚糖分離的一個優(yōu)選的來源，其中部分或完全除去了蛋白質(zhì)以及脂肪。由諸如生產(chǎn)奶油時的乳糖-礦物質(zhì)部分、酪蛋白部分和其他成分這樣的產(chǎn)品制取，可使加工和分離大大簡化。在藥用乳糖的制備中出現(xiàn)的上清液同樣也是一種合適的不同低聚糖制備的來源。對此可在實際分離該部分之前，將一種動物或不同動物種的乳或乳清在分離低聚糖之前按所希望的比例混合，使其滿足具有單一結構或結構組的活性低聚糖組成的需要。
按照本發(fā)明的低聚糖混合物也可以高度濃縮或以純品形式在胃腸功能紊亂時使用，此時腸內(nèi)菌叢中的細菌種類的失衡(即腸胃菌叢的失衡，例如由在服用抗生素或其他因造成營養(yǎng)吸收障礙等而影響腸內(nèi)菌叢的藥物后引起)或病毒感染對胃腸功能紊亂起著主要作用。本發(fā)明的低聚糖混合物也可在預防這類腸胃感染中應用。因此按照本發(fā)明的低聚糖混合物也可加入嬰兒食品、保健食品或藥品之中。
按照本發(fā)明的低聚糖混合物本身還可作為一種添加劑在其他全營養(yǎng)食品(food complete)中應用。這樣的食品例如有嬰兒食品和腸胃臨床營養(yǎng)制劑。此外它還可作為一般食品的添加劑，用以保持正常的腸胃功能(一種預防作用)以及腸胃功能紊亂的恢復，此時在腸胃中不正常的細菌集群或病毒對腸胃功能紊亂起著重要的作用。
按照本發(fā)明的低聚糖混合物也可以被制成膠囊或粉末，也可以稀液的形式作為添加劑添加到其它全營養(yǎng)食品中。
優(yōu)選以每天至少10mg/kg至4g/kg體重的量應用本發(fā)明的低聚糖混合物，這里的毫克值是指本發(fā)明低聚糖混合物中的得自動物乳的那些低聚糖的毫克值。其它可能存在的低聚糖如乳糖，及不是出自動物乳的低聚糖在此不作考慮。優(yōu)選按每天約100mg/kg體重的量服用。
該發(fā)明將按下述優(yōu)選的實施例作進一步的詳細說明。
實施例1按照下述的方法進行加工100升的牛奶
脂肪的分離是在45℃下借助密度離心法進行的。所得的脫脂牛奶通過乙醇沉淀脫去蛋白質(zhì)(最終濃度66％的乙醇)。借助分離機分離沉淀物。借助降流式蒸發(fā)器蒸去乙醇和部分水，至體積為40升為止。其中約含有4kg乳糖、1kg礦物質(zhì)和其它可溶性的成分如水溶性維生素、尿素或檸檬酸鹽。低聚糖部分的量約為10克。低聚糖部分的組成約為同等量的中性和酸性結構物。通過AG1×2陰離子交換色譜法可將其分為中性部分(洗脫劑脫礦物質(zhì)的水)和酸性部分(洗脫劑300mM乙酸銨)?？山柚Y晶技術將該中性部分的乳糖含量降至60％。借助Toyopearl HW40(S)凝膠色譜可獲得5g中性低聚糖部分，其中殘留的乳糖含量為約10％。酸性的低聚糖部分將通過電滲析，從陰離子交換洗脫緩沖液(乙酸銨)中釋放出來，并同中性低聚糖部分一樣進行冷凍干燥。按此法可獲得4.5g酸性低聚糖部分。組合1g酸性部分和5g中性部分，得到一種具有比天然組成的混合物更高活性的混合物。
實施例2在加工奶酪生產(chǎn)中沉淀的山羊乳、綿羊乳和牛奶的乳清之前將其以3∶1∶1的比例混合，以獲得源自三種不同動物的混合乳清4000升備用。借助一種聚砜膜(截止點20kDa)超濾，將殘余的脂肪、溶液中存在的糖巨肽和乳清蛋白分離。通過反滲透將滲透液濃縮至900升。進一步采取的步驟與上述相同，首先結晶乳糖，然后進行陰離子交換層析以離出肽。經(jīng)用去礦物質(zhì)的水和300mM的乙酸銨洗出的部分被合并、濃縮、電滲析和冷凍干燥?？色@得一種來自三種不同動物的低聚糖混合物約570g。在進行進一步的凝膠色譜分離和電滲析脫鹽后，可通過冷凍干燥獲得最終產(chǎn)品。用凝膠過濾、HPAEC-PAD和MALDI-MS的分析表明，按所使用的乳和混合比例，酸性低聚糖對中性低聚糖的比例為1∶5。由于原料中山羊乳清份額較高，半乳糖基乳糖的份額達到120g。在綿羊乳中，與酸性低聚糖的重要成分N-乙?；窠?jīng)氨酸相比占主導地位的是N-羥乙?；窠?jīng)氨酸。因此與山羊乳或牛乳相比，綿羊乳的羥乙?；窠?jīng)氨酸低聚糖(glycolyl neuraminyloligosaccharide)的含量上升。
實施例3將馬和山羊的乳分別加工。每種準備50升。借助離心、乙醇蛋白沉淀和分離，每種均得到碳水化合物-礦物質(zhì)部分。通過使用旋轉蒸發(fā)器將每種溶液濃縮至8升。借助在AG 501×8(Ca2+型)上進行的配位體交換層析，并用脫礦物質(zhì)的水洗脫，一方面使得乳糖和單糖發(fā)生了色譜分離，另一方面還成功對低聚糖進行了細級分離。對馬乳而言收集在排斥體積和四糖的洗脫范圍之間的部分，并將其用作以后的低聚糖的新成分。用同樣的方法分離來自山羊乳的碳水化合物-礦物質(zhì)部分，可得到降解了乳糖和降解了單糖單元的的全部低聚糖部分。在此之后對各部分進行脫鹽和通過超微過濾進行同步濃縮，然后冷凍干燥。將這兩個部分以2∶5(馬乳低聚糖部分山羊乳低聚糖部分)的比例混合。
實施例4將山羊乳如實施例1所述進行加工。借助在AG 1×2上的陰離子交換色譜處理可獲得一種酸性部分，其主要成分為2，3’-和2，6’-唾液酸乳糖，以及2，3’-和2，6’-N-羥乙?；窠?jīng)氨酸乳糖。借助反相色譜可將該部分進一步分離，獲得由2，3’-和2，6’-羥乙酰基神經(jīng)氨酸乳糖組成的部分。將該部分通過電滲析脫鹽，噴霧干燥，并為以后的混合備用。
對牛乳清可借助凝膠過濾分離出一種具有六種中性三糖的部分這六種中性三糖體是三種異構的半乳糖基乳糖，一種巖藻糖基化的乳糖胺及分別被N-乙酰基半乳糖胺和N-乙?；咸前窋U展的兩種乳糖單元。
將酸性的山羊乳部分，其主要結構為2，3-異構體，按照1∶7的比例與牛乳清的三糖的中性部分在干燥狀態(tài)下混合，為給食試驗備用。
實施例5采用已述及的方法可從馬乳中分離出乳-N-新-四糖以及乳-N-新-己糖結構。在人乳中也存在這些低聚糖。
采用述及的方法，用色譜法從牛奶中分離出二唾液酸乳糖，并冷凍干燥。
來自山羊乳的巖藻糖基化的四糖的兩種位置異構體可采用已知的確定方法加以分離。
將低聚糖以2∶1∶2(馬乳低聚糖∶牛奶低聚糖∶山羊乳低聚糖)的混合比例進行混合。
實施例6從山羊乳乳清中可分離出一種中性的低聚糖部分，它是由已敘述過的四糖和其他帶有至今為止還未知的單糖組分的戊糖或己糖(2種己糖胺和4種己糖或2種己糖胺和4種己糖以及3種己糖胺和3種己糖)組成。
由同樣的加工方法可得到一種酸性部分，其可用陰離子交換色譜加以分離，得到一種由兩種不同的唾液酸乳糖和兩種不同的羥乙?；窠?jīng)氨酸乳糖組成的混合物。在新的低聚糖混合物的新組成中，既不使用長鏈的酸性低聚糖，也不使用中性的半乳糖基乳糖。分離出的酸性和中性部分以2∶1的比例混合。
實施例7在奶酪生產(chǎn)中沉淀的乳清除含有游離低聚糖外，通常還含有大量的以N-和O-聚糖形式結合的低聚糖。因此該糖巨肽被O-糖基化，乳鐵蛋白被N-糖基化。相應的聚糖結構大部分被唾液酸化。原始的酸性對中性聚糖或低聚糖的比例為約1∶1。為使這一比例向有利于中性低聚糖的方向轉化，可讓其通過陰離子交換色譜。所有唾液酸化的和結合的酸性低聚糖(部分2)與凝膠母體結合，而中性低聚糖(部分1)可用脫礦物質(zhì)的水洗脫。所有結合的組分可用較高離子強度(例如1MNaCl)的液體洗脫，并進行進一步的加工。通過在pH2.0和45℃的弱水解條件下幾個小時，唾液酸被分離出來。在用NaOH溶液中和后，將部分2和中性低聚糖(部分1)合并。則中性對酸性低聚糖的比例向有利于中性低聚糖的方向轉化。
權利要求
1.基于低聚糖的低聚糖混合物，所述低聚糖得自一種或多種動物乳，并且由兩個或多個單糖單元組成，所述的低聚糖混合物的特征是所述的低聚糖混合物含有至少兩種低聚糖部分，該低聚糖部分由不包括游離的乳糖在內(nèi)的至少兩種不同的低聚糖組成；在低聚糖混合物中存在的低聚糖的總譜與得自一種或各種動物乳的低聚糖部分的低聚糖總譜不同，且a)如果該低聚糖僅得自于一種動物乳，則中性低聚糖對酸性低聚糖的比例為90-60∶10-40重量％，或者b)如果低聚糖得自至少兩種動物乳，則其中得自兩種不同動物乳的每種低聚糖將至少占低聚糖混合物中存在的低聚糖總量的10重量％。
2.按照權利要求1所述的低聚糖混合物，其特征是如果低聚糖得自至少兩種動物乳，則中性低聚糖對酸性低聚糖的比例為90-60∶10-40重量％。
3.按照權利要求1或2所述的低聚糖混合物，其特征是低聚糖主要是由下述的一種或多種單糖單元構成D-葡萄糖、D-半乳糖、D-N-乙酰基葡糖胺、D-N-乙酰基半乳糖胺、L-海藻糖、D-甘露糖、D-形式的唾液酸(例如D-N-乙酰基神經(jīng)氨酸和D-N-羥乙?；窠?jīng)氨酸)，及其O-乙酰化的、硫酸化的和磷酸化的衍生物。
4.按照上述權利要求任一項所述的低聚糖混合物，其特征是低聚糖得自下述的一種或多種動物的乳牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和水牛乳。
5.按照上述權利要求任一項所述的低聚糖混合物，其特征是低聚糖得自一種或多種動物的未脫脂或脫脂的乳或乳清或未脫脂或脫脂的乳制品。
6.按照上述權利要求任一項所述的低聚糖混合物，其特征是除了得自動物乳的低聚糖或低聚糖部分外，還存在乳糖，所述乳糖得自于從中獲取了低聚糖的動物乳，以及一種或多種非動物來源的低聚糖和/或通過化學、酶和/或技術轉換提取低聚糖時從由糖脂和/或糖蛋白中釋放出來的低聚糖。
7.按照上述權利要求任一項所述的低聚糖混合物，其特征是該低聚糖可加入嬰兒食品、保健食品或藥品之中，或此外可作為全營養(yǎng)食品的添加劑。
8.按照權利要求1-5任一項所述的低聚糖混合物的應用是，可用來抵御由于細菌或病毒在胃腸道中的集群而導致的胃腸功能紊亂，或用來保持正常的胃腸功能。
9.按照權利要求8所述的應用，其中以每天至少10mg/kg至4g/kg體重的量應用低聚糖混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于低聚糖的低聚糖混合物，所述的低聚糖得自于一種或多種動物乳，并且由二個或多個單糖單元構成。所述的低聚糖混合物的特征在于其含有至少兩種低聚糖部分，所述的低聚糖部分至少由兩種不同的低聚糖組成。本發(fā)明的進一步的特征在于乳糖不包括在內(nèi)，以及存在于低聚糖混合物中的低聚糖的總譜與得自從中獲取了低聚糖部分的一種或多種動物乳的低聚糖總譜不同，且a)如果所述的低聚糖僅得自于一種動物乳，則中性低聚糖對酸性低聚糖的比例為90－60∶10－40重量％，或者b)如果所述的低聚糖得自至少兩種動物乳，則其中得自兩種不同動物乳的每種低聚糖將至少占低聚糖混合物中存在的低聚糖總量的10重量％。本發(fā)明的低聚糖混合物的積極效果，特別是其抗感染作用與人乳近似。
文檔編號A61K35/20GK1407857SQ00816812
公開日2003年4月2日 申請日期2000年12月7日 優(yōu)先權日1999年12月7日
發(fā)明者貝恩德·施塔爾, 京特·伯姆, 貝恩特·芬克, 吉爾達·格奧爾吉, 于爾根·杰利內(nèi)克, 約阿希姆·J·施米特 申請人:N.V.努特里西阿