專利名稱：類胰蛋白酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在蜱中鑒定出的新型蛋白。這些蛋白可用作疫苗組分、肥大細胞類胰蛋白酶(此后稱為MCT)抑制劑、用于檢測肥大細胞以及分離純化MCT。本發(fā)明還涉及控制寄生物引起的動物和人類疾病和損傷，以及涉及本發(fā)明蛋白在治療疾病和變態(tài)反應(yīng)中的應(yīng)用。
在文章中提及以及在本說明書結(jié)尾列出的所有文獻均通過引用結(jié)合到本文中。
人MCT是一種存儲在肥大細胞分泌顆粒中的內(nèi)切蛋白酶，一旦激活則作為肝素穩(wěn)定化四聚體由肥大細胞釋放。去除肝素導(dǎo)致類胰蛋白酶復(fù)合物解離為酶失活單體(Schwartz，1994)。
類蛋白酶是人肥大細胞顆粒的主要蛋白介導(dǎo)物成分，占總細胞蛋白的20％以上(Schwartz，1994)。MCT是肥大細胞的特異性標志，使肥大細胞與嗜堿性粒細胞區(qū)分開來。
肥大細胞見于許多組織，但沿著機體上皮層(如皮膚、呼吸道和胃腸道)存在的數(shù)目較多。肥大細胞通過位于小血管附近。它們參與各種生理和病理生理狀態(tài)，包括急性炎癥、即發(fā)型超敏反應(yīng)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、細胞生長調(diào)節(jié)、防御瘤形成以及痛覺和發(fā)癢(Liang等，1998)。肥大細胞還影響慢性炎癥狀態(tài)和參與神經(jīng)免疫作用(Leon等，1994)。
肥大細胞類胰蛋白酶是一種重要的炎癥介質(zhì)。實驗(主要在體外進行)表明，它在諸如哮喘、牛皮癬、間質(zhì)性肺炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、齒齦炎和牙周炎的疾病中起重要作用。肥大細胞類胰蛋白酶還由于其激活尿激酶原和基質(zhì)金屬蛋白酶溶基質(zhì)素原的潛能而參與腫瘤發(fā)生和血管發(fā)生。還描述了類胰蛋白酶樣酶參與激活和內(nèi)化致病病毒，如流感病毒、副流感病毒和人免疫缺陷病毒(Pohlig等，1996)。
小分子量物質(zhì)(例如亮抑蛋白酶肽和二異丙基氟磷酸)抑制人類胰蛋白酶。二價陽離子(如鈣離子)和芐脒及其衍生物是人肥大細胞類胰蛋白酶的競爭性抑制劑(Schwartz，1994)。然而，與大多數(shù)其它絲氨酸酯酶不同，人類胰蛋白酶不受典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑(如抑蛋白酶肽和大豆胰蛋白酶抑制劑)抑制。還報道了針對肥大細胞類胰蛋白酶催化部位的內(nèi)源性抑制劑。乳鐵蛋白和髓過氧化物酶(均來源于嗜中性粒細胞)以及抗凝血酶III抑制人類胰蛋白酶活性，所有這些抑制劑都拮抗穩(wěn)定MCT四聚體的粘多糖(肝素或硫酸軟骨素)(Alter等，1990；Cregar等，1999；Elrod等，1997)。
先前已經(jīng)描述了水蛭來源的人類胰蛋白酶抑制劑(LDPI)。已發(fā)現(xiàn)重組形式的Kazal型蛋白有效抑制四聚體類胰蛋白酶4個催化部位中的2個部位(Stubbs等，1997；Auerswald等，1994；Mühlhahn等，1994；Sommerhoff等，1994)。
由于已知MCT在哺乳動物疾病和變態(tài)反應(yīng)中的重要性，因此確實需要針對MCT的高度特異性的有效抑制劑?，F(xiàn)在在蜱物種中發(fā)現(xiàn)了一種能夠抑制人肥大細胞類胰蛋白酶活性的新型蛋白。
本文使用的術(shù)語“顯著序列同源性”是指包括所有與TdPI具有共同功能并具有共同的序列同源性或在多肽序列中存在的基序之間具有共同同源性的蛋白?！帮@著的”整體同源性是指如果將所述同源蛋白與TdPI序列進行序列對比，則在完全保守的序列中有50％或50％以上的氨基酸為相同殘基。最好使用GCG最佳擬合命令(空位生成罰分＝2.5；空位延長罰分＝0.5)(Genetics-Computer-Group，1994)進行序列對比。
所述蛋白完整長度上的同源性程度優(yōu)選為至少60％。更優(yōu)選同源性程度為至少70％，甚至更優(yōu)選為75％，最優(yōu)選為80％或更高。
本發(fā)明在該方面包括提供含本文鑒定為蜱源性蛋白酶抑制劑蛋白(TdPI)的序列的蛋白、其活性片段或其功能等同物。附

圖1給出了該序列。經(jīng)鑒定，該蛋白由蜱唾液腺文庫的cDNA編碼。該蛋白的分子量約13.5kDa，看來屬于Kunitz型蛋白酶抑制劑家族。所述序列與與該家族其它成員如抑蛋白酶肽和間α-胰蛋白酶(inter-alpha-trypsin)抑制劑的相似性低，但推定的反應(yīng)中心和半胱氨酸位置在一定程度上保守。
術(shù)語“功能等同物”在本文用于描述與TdPI蛋白在抑制類胰蛋白酶或具有一個或多個可用于開發(fā)疫苗的表位方面具有相似功能的蛋白，所述疫苗針對與TdPI具有顯著序列同源性的蛋白。術(shù)語“功能等同物”還指在結(jié)構(gòu)上與本文鑒定的TdPI蛋白相似或含有相似或相同三級結(jié)構(gòu)的分子。該術(shù)語還包括保留抑制類胰蛋白酶(優(yōu)選人肥大細胞類胰蛋白酶)能力的蛋白片段。
抑制類胰蛋白酶的相似功能最好針對類胰蛋白酶(優(yōu)選肥大細胞類胰蛋白酶，更優(yōu)選人肥大細胞類胰蛋白酶)的催化活性，其特征在于Ki小于1μM，更優(yōu)選小于100nM，甚至更優(yōu)選小于20nM，甚至更優(yōu)選小于10nM，最優(yōu)選小于1nM，可使用如本文描述的任何標準類胰蛋白酶抑制測定評價(參見以下實施例中標題為“蛋白酶抑制測定”的部分)。
或者，或者除了具有抑制類胰蛋白酶活性之外，“功能等同物”在本文用于描述含有表位的蛋白，所述表位可用于開發(fā)針對本發(fā)明蛋白的疫苗。這樣的功能等同物以及含有合適表位的片段，可用于開發(fā)針對吸血寄生物的疫苗，該疫苗針對TdPI蛋白家族成員。當然，可制備免疫原性高于或低于對應(yīng)的野生型蛋白或蛋白片段的功能等同物，以便適于需要的用途。所述“野生型”是指大多數(shù)種成員特征性天然存在的基因型。如果所述蛋白用于誘導(dǎo)針對寄生物蛋白的宿主抗性的免疫接種方案，則可以修飾所述分子，以便增強它們的免疫原性。因此，它們更可能在接種的宿主中激發(fā)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明蛋白的功能等同物相對于野生型蛋白序列存在取代、添加、插入和/或缺失一個或多個氨基酸以及化學修飾氨基酸的取代，而不以相反的方式影響所述蛋白的功能或活性。該術(shù)語還包括天然生物變異體(例如所有產(chǎn)生野生型蛋白的不同物種的等位基因變異體或地理變異)。
“活性”片段是或者抑制類胰蛋白酶(優(yōu)選人肥大細胞胰蛋白酶)和/或包含一個或多個可用于開發(fā)針對本發(fā)明蛋白的疫苗的表位的片段。這些生物特性如上所述。
本發(fā)明這一方面的蛋白優(yōu)選得自吸血外寄生物(如蚊或水蛭)或有毒動物(如蜘蛛、蝎子或蛇)。所述蛋白更優(yōu)選得自蜱，最優(yōu)選得自硬蜱(Ixodid tick)，如非洲扇頭蜱(Rhipicephalus appendiculatus)。
按照本發(fā)明的第二方面，提供抑制類胰蛋白酶的得自吸血節(jié)肢動物外寄生物的重組蛋白、其活性片段或其功能等同物。所述重組蛋白優(yōu)選得自蜱，最優(yōu)選得自硬蜱(Ixodid tick)，如非洲扇頭蜱。這些分子在抑制類胰蛋白酶(優(yōu)選肥大細胞類胰蛋白酶，更優(yōu)選人肥大細胞類胰蛋白酶)催化活性方面具有活性，其特征在于Ki小于1μM，更優(yōu)選小于100nM，更優(yōu)選小于20nM，甚至更優(yōu)選小于10nM，最優(yōu)選小于1nM或更小。
本發(fā)明上述方面的蛋白的衍生物包括在本發(fā)明的實施方案中。這樣的衍生物可包括在其氨基-或羧基-末端融合或內(nèi)部加成的其它蛋白或多肽。其它多肽可用于幫助檢測、表達、分離或純化所述蛋白或可用于賦予所述蛋白其它的需要特性。潛在融合配偶體的實例包括β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶、聚組氨酸標記、T7聚合酶片段和分泌信號肽。
可使用已知的分子生物學和蛋白質(zhì)化學技術(shù)制備本發(fā)明的蛋白?？赏ㄟ^化學合成(一種特別用于產(chǎn)生衍生自全長蛋白序列的短肽的技術(shù))制備用作免疫原的蛋白片段。
可通過在宿主細胞中表達制備重組形式的本發(fā)明的蛋白。這樣的表達方法是本發(fā)明技術(shù)人員眾所周知的，其中許多方法在Sambrook等，1989和Fernandez & Hoeffler，1998中有詳細描述。
本發(fā)明的第三方面提供本發(fā)明的蛋白、蛋白片段和功能等同物在哺乳動物中抑制類胰蛋白酶(如肥大細胞胰蛋白酶)，由此調(diào)節(jié)其活動和控制其病理作用的用途。這樣的分子還可用于抑制胰蛋白酶、纖溶酶和較低程度的抑制組織激肽釋放酶。
本發(fā)明還包括將上述蛋白、蛋白片段和功能等同物用作抗炎藥物。這些分子優(yōu)選以包含惰性載體的藥用組合物提供。所述蛋白、蛋白片段或功能等同物可構(gòu)成所述組合物的唯一活性組分，或者可構(gòu)成完整治療的組成部分，如局部用于昆蟲、蛇或蝎子咬傷部位或皮炎皮膚的乳膏劑組分。它還可以用作乳膏劑、油劑、粉劑或丸劑中的類胰蛋白酶和類胰蛋白酶相關(guān)化合物的載體分子，以緩釋結(jié)合組分。
本發(fā)明還包含本發(fā)明的蛋白、蛋白片段和功能等同物用于定量例如血液、鼻灌洗液、組織或食品中的類胰蛋白酶(優(yōu)選人肥大細胞類胰蛋白酶)水平的用途。這可以是含有一種或多種本發(fā)明的蛋白、蛋白片段或功能等同物以及允許精確定量所測試樣品中的類胰蛋白酶的檢測材料(例如放射性標記類胰蛋白酶、抗體、酶，如堿性磷酸酶、過氧化物酶和熒光素酶)的試劑盒的一部分。該試劑盒類似于放射免疫測定試劑盒或ELISA試劑盒，其中本發(fā)明的蛋白起結(jié)合分子的作用，而不是起抗類胰蛋白酶或類胰蛋白酶相關(guān)分子的抗體的作用。本發(fā)明的一個方面包括加入本發(fā)明分子的這種試劑盒。
本發(fā)明的蛋白、蛋白片段和功能等同物還可以用于檢測攜帶類胰蛋白酶的細胞，尤其是用于檢測肥大細胞。在此檢測方法中可使用本領(lǐng)域通用的任何技術(shù)，可包括免疫細胞化學和組織學技術(shù)，其中所述蛋白、蛋白片段或功能等同物與抗血清(如抗-TdPI抗血清)聯(lián)合使用或所述分子與標記物或染料(如FITC)直接偶合?？墒褂猛暾鞍?，或者可只使用活性結(jié)合片段，以便檢測底物。在另一個實施方案中，所述野生型蛋白可遺傳性或合成性與另一種蛋白(如堿性磷酸酶、熒光素酶或過氧化物酶)融合，以便促進其檢測。其它檢測含類胰蛋白酶細胞或樣品的方法可包括印跡技術(shù)(Towbin等，1979)、凝膠阻滯、親和層析或本領(lǐng)域使用的任何其它合適方法。
本發(fā)明還包括使用與支持物結(jié)合的本發(fā)明蛋白、蛋白片段和功能等同物，以從例如機體組織、血液或食品中去除、純化、分離或提取類胰蛋白酶。所述支持物包括任何合適的惰性物質(zhì)，包括凝膠、磁珠和其它珠、微球、結(jié)合柱和樹脂。
本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的蛋白、蛋白片段和功能等同物作為研究涉及類胰蛋白酶的炎癥、炎癥相關(guān)過程或其它生理過程的工具。這些分子還可以用作進一步研究MCT自身特征和功能的工具。例如，所述分子可用于抑制或消除細胞培養(yǎng)物或發(fā)炎的動物組織中的類胰蛋白酶，以便研究類胰蛋白酶在這些體系中的重要性。
后生動物寄生物，尤其是節(jié)肢動物和蠕蟲，也是人和獸醫(yī)學中具有重要影響的感染性疾病和其它有害作用的來源。目前，控制節(jié)肢動物和蠕蟲寄生物主要依賴于使用化學物質(zhì)，如殺螨劑和抗蠕蟲劑。已經(jīng)通過使用疫苗技術(shù)在免疫控制方法應(yīng)用方面進行了嘗試。已經(jīng)在鑒定某些為潛在疫苗侯選物的保護性抗原方面取得了一定的成功，但迄今對最引人注目的牛肺線蟲胎生網(wǎng)尾線蟲(Dictyocaulusviviparous)和牛蜱微小牛蜱(Boophilus microplus)僅有少量產(chǎn)生了經(jīng)濟效益。不管發(fā)展如何，仍然需要后生動物寄生物疫苗，尤其需要可跨越大范圍的節(jié)肢動物和/或蠕蟲屬使用的疫苗。
因此本發(fā)明還提供本發(fā)明的蛋白、蛋白片段和功能等同物作為免疫原的用途，所述免疫原用作后生動物寄生物疫苗，特別是用作控制由節(jié)肢動物和其它后生動物寄生物引起的疾病的保護性免疫原。合適的疫苗接種侯選者包括家畜(如牛、山羊、綿羊、犬、貓)和其它需要抗后生動物寄生物(尤其是蜱)保護的動物。所述疫苗可以包含某些用作佐劑的化合物。合適的佐劑是本領(lǐng)域眾所周知的，包括水包油乳劑、皂苷佐劑、弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐劑(IFA)、細胞因子和起增強所述組合物功效的免疫刺激劑作用的其它物質(zhì)。
按照本發(fā)明的再一個方面，提供針對疾病或病癥接種哺乳動物的方法，包括給予哺乳動物其表達與所述疾病或病癥相關(guān)的本發(fā)明上述方面的蛋白、蛋白片段或功能等同物。
本發(fā)明的再一個方面提供治療罹患疾病或病癥(例如哮喘、牛皮癬、間質(zhì)性肺病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、齒齦炎、牙周炎、變態(tài)反應(yīng)、癌癥或任何其它類胰蛋白酶介導(dǎo)性疾病)的哺乳動物的方法，包括給予所述哺乳動物治療有效量的本發(fā)明上述方面的蛋白、蛋白片段或功能等同物，任選與藥學上可接受的載體聯(lián)合給予。
按照本發(fā)明的再一方面，提供含本發(fā)明上述方面的蛋白、蛋白片段或功能等同物和藥學上可接受的載體的免疫原性組合物。
藥學上可接受的載體包括其自身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受所述組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常為較大、緩慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂質(zhì)聚合物(如油滴或脂質(zhì)體)和失活病毒顆粒。這樣的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。所述組合物可用作疫苗，并因此可選地含有免疫刺激劑(佐劑)，例如以上列舉的佐劑。按照本發(fā)明的再一方面，提供配制疫苗組合物的方法，包括將按照本發(fā)明上述方面的蛋白、蛋白片段或功能等同物與藥學上可接受的載體、任選與佐劑組合在一起。
按照本發(fā)明的再一方面，提供含編碼本發(fā)明上述方面的蛋白、蛋白片段或功能等同物的核苷酸序列的核酸分子。這樣的分子包括單鏈或雙鏈DNA、cDNA和RNA，以及合成核酸類別。所述核酸序列最好包含DNA。
本文利用實例公開了編碼TdPI的cDNA，圖1顯示了其序列以及其編碼的氨基酸序列(核苷酸和氨基酸以其標準的單字母縮寫給出)。
本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選含有與示于圖1的序列相同或互補的核苷酸序列，或者與其簡并或大致同源的序列，或者在非嚴格條件(例如6×SSC/50％甲酰胺，室溫)下與其雜交并在低嚴格條件(例如2×SSC、室溫或2×SSC、42℃)下清洗或者更優(yōu)選在高嚴格條件(例如2×SSC、65℃)下結(jié)合的序列。(SSC＝0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉、pH7.2)。
在序列對比時，最好使用GCG最佳擬合命令(空位生成罰分＝2.5；空位延長罰分＝0.5)(Genetics-Computer-Group，1994)測定，所述核酸序列優(yōu)選與編碼TdPI的cDNA或者與TdPI序列具有至少60％或更高的同一性的翻譯產(chǎn)物(或部分節(jié)段或整個翻譯產(chǎn)物)的DNA序列具有至少60％的同一性。
本發(fā)明還包括含本發(fā)明此方面DNA序列的克隆和表達載體。這樣的表達載體可加入合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，例如按照讀框與本發(fā)明的核酸分子連接的增強子元件、啟動子-操縱子區(qū)、末端終止序列、mRNA穩(wěn)定序列、起始或終止密碼子或核糖體結(jié)合位點。
另外，它們可能便于使某些宿主分泌所述重組蛋白。因此，所述載體的其它元件可包括編碼分泌信號序列和加工序列的核酸序列。
本發(fā)明的載體包括質(zhì)粒和病毒(包括噬菌體病毒和真核生物病毒)以及其它線性或環(huán)狀DNA載體，如使用轉(zhuǎn)座因子或同源重組技術(shù)的載體。許多這樣的載體和表達系統(tǒng)是眾所周知的，并在本領(lǐng)域中有文獻報道(Fernandez & Hoeffler，1998)。特別合適的病毒載體包括桿狀病毒型載體、腺病毒型載體和痘苗病毒型載體。
用于重組表達的合適宿主包括通常使用的原核物種(如大腸桿菌)或可制備來高水平表達重組蛋白并可易于大量培養(yǎng)的真核酵母。體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞系也是合適的，特別是在使用病毒驅(qū)動型表達系統(tǒng)時。另一個合適的表達系統(tǒng)是使用昆蟲細胞作為宿主的桿狀病毒表達系統(tǒng)。表達系統(tǒng)還可以構(gòu)成其基因組中加入編碼DNA的宿主細胞。蛋白或蛋白片段還可以體內(nèi)表達，例如在昆蟲幼蟲或在哺乳動物組織中表達。
可以使用各種已知技術(shù)將本發(fā)明的載體引入到原核或真核細胞中。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)在文獻(Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman & Leinwald等，1998)中有詳細介紹。在真核細胞中，表達系統(tǒng)可根據(jù)該系統(tǒng)的需要或者為瞬時(例如附加型)表達系統(tǒng)或者為持久(染色體整合型)表達系統(tǒng)。
本發(fā)明的核酸分子還可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，尤其是嚙齒動物。這可局部性通過改變體細胞或通過生殖系治療(germ line therapy)加入可遺傳改變來完成。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞，或含有以上定義的核酸分子的轉(zhuǎn)基因生物。
本發(fā)明的再一方面提供制備如上定義的本發(fā)明蛋白、功能等同蛋白片段的方法，包括在表達所述蛋白的條件下培養(yǎng)含本發(fā)明核酸分子的宿主細胞并回收由此產(chǎn)生的所述蛋白。
現(xiàn)在將通過實施例，特別是參考分離自非洲扇頭蜱的蛋白的實施例，更詳細地描述本發(fā)明的各個方面和實施方案。當然，需要指出的是，可以對細節(jié)進行修改，而不背離本發(fā)明的范圍。
圖2顯示了利用金屬親和層析和陽離子交換純化、由15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠顯現(xiàn)的rTdPI。
圖3顯示TdPI與牛初乳胰蛋白酶抑制劑(BovCol；Cechova，1976)、(牛)抑蛋白酶肽(Creighton & Charles，1987)和大鼠組織因子途徑抑制劑(TFPI-2；僅顯示了第二個因子Xa-抑制性結(jié)構(gòu)域；Enjyoji等，1992)的Kunitz結(jié)構(gòu)域的序列對比。
圖4顯示了表明rTdPI對組織激肽釋放酶的較弱的抑制活性的圖。
圖5顯示了在逐漸增加量的rTdPI存在下，通過檢測試鹵靈標記的酪蛋白釋放的肽而測定的纖溶酶(左)和胰蛋白酶(右)的活性。
圖6顯示了TdPI對重組人類胰蛋白酶(Promega)的抑制作用。
圖7顯示了1.5％瓊脂糖凝膠顯現(xiàn)的由幼蟲(L)和若蟲(N)的整體提取物、成蟲的雄性和雌性非洲扇頭蜱(R.appendiculatus)的唾液腺提取物獲得的RT-PCR產(chǎn)物。
測定76-3插入片段的正鏈和負鏈的完整序列。圖1顯示了正向引物(S1→)(相當于核苷酸209-224)、反向引物(←S2)(退火至核苷酸255-271)和質(zhì)粒特異性T3(T3→)和T7(←T7)引物(以下劃線表示插入片段特異性引物序列或它們的退火部位)。P1→和P2←表示RT-PCR實驗中使用的引物部位。
圖1中的粗斜體為通過對rTdPI蛋白進行N端測序獲得的序列。波浪線表示結(jié)合肝素的共有序列。雙線表示推定的糖基化位點。以粗體字型表示聚腺苷酸化信號和poly-A尾。星號指示的亮氨酸在克隆76、76-1和76-2中為甲硫氨酸。
使用GCG序列分析軟件[Genetics-Computer-Group，1994#14]分析序列數(shù)據(jù)。使用BLAST網(wǎng)絡(luò)服務(wù)業(yè)務(wù)(Altschul等，1990)在國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)進行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索。
在測序克隆76之后，通過影印噬菌斑的DNA雜交再篩選所述文庫中的其它克隆(Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，1989)。通過用洋地黃毒苷(Boehringer Mannheim)隨機引物標記原cDNA(用EcoRI和Eco0109I由純化質(zhì)粒切除)，構(gòu)建使用的探針。分離并測序三個陽性克隆。重組蛋白表達重組TdPI(rTdPI)在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢細胞(Sf21；Invitrogen)中表達為組氨酸標記蛋白。使用正向引物5′-GCAGGAGCTCGGCACGAG和反向引物5′-TATGGATCCCAGGTCCAGGCTCTGTTCCG經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增TdPI cDNA的編碼區(qū)，由此在起始密碼子上游加入SacI位點，并以Bam HI位點置換終止密碼子。所述PCR由20個循環(huán)組成，每個循環(huán)為30秒的解鏈步驟(95℃)、30秒的引物退火步驟(50℃)和30秒的延伸步驟(72℃)。在pACl29.1轉(zhuǎn)移載體的Sac I和Bam HI位點之間連接PCR產(chǎn)物(Livingstone & Jones，1989)，所述轉(zhuǎn)移載體進行了修飾，使得羧基端Gly-Ile-(His)6標記加入到表達蛋白中。用所述轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒(BacPak6)共轉(zhuǎn)染Sf21細胞并如Kitts & Possee，1993所述擴增重組病毒。在含10％胎牛血清(Sigma)的TC100培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中表達rTdPI。重組蛋白純化在感染Sf21細胞后60小時收集培養(yǎng)基，加入(NH4)2SO4(30g/100ml培養(yǎng)基)沉淀rTdPI。在含300mM NaCl和10％甘油的50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH8)中再溶解所述沉淀物。主要按照Janknecht等，1991所述使用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)柱純化rTdPI。含300mM NaCl和10％甘油的50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH6.5)用于流洗該柱。使用200mM咪唑的75mM NaH2PO溶液洗脫組氨酸標記蛋白。使用配有HiTrap SP陽離子交換柱(Pharmacia Biotech)的BioLogic系統(tǒng)(Bio-Rad)經(jīng)低壓層析獲得進一步的純化。層析緩沖液為50mM Hepes、pH8，1小時內(nèi)0-250mM NaCl線性梯度；流速1ml/分鐘。Centricon 3濃縮儀(Amicon)用于濃縮洗脫液和交換緩沖液。純化的蛋白在使用前于PBS中儲存于-20℃。使用Bio-Rad蛋白測定儀和Micro BCA蛋白測定儀(Pierce)檢測蛋白濃度。蛋白質(zhì)電泳按照Laemmli，1970進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。
圖2顯示了15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯現(xiàn)的、利用金屬親和層析和陽離子交換純化的rTdPI。A道的蛋白在電泳前用PNGaseF(在凝膠上約35kDa的蛋白)處理。B道含未處理的rTdPI。分子量以kDa給出。C道含未還原的rTdPI(在上樣緩沖液中不含還原劑)。未還原rTdPI道上的分子量較高一般提示通過分子間二硫鍵二聚化，但質(zhì)譜分析法確認分子量約13,500Da，與形成二聚物相矛盾。
通過用N-糖苷酶F(PNGase F；New England BioLabs)處理rTdPI，然后進行SDS-PAGE，研究天冬酰胺連接的糖基化。PNGase F水解所有普通類型的糖基化蛋白的Asn-多糖鏈(Maley等，1989)。
圖3顯示TdPI和牛初乳胰蛋白酶抑制劑(BovCol；Cechova，1976)、(牛)抑蛋白酶肽(Creighton & Charles，1987)和大鼠組織因子途徑抑制劑(TFPI-2；僅顯示了第二個因子Xa-抑制性結(jié)構(gòu)域；Enjyoji等，1992)的Kunitz結(jié)構(gòu)域的序列對比。還包括蜱抗凝肽TAP(Waxman等，1990)的Kunitz結(jié)構(gòu)域和ornithodorin中的兩個結(jié)構(gòu)域(ornithl和ornith2；Van de Locht等，1996)。使用GCG的“堆積(pileup)”和“prettyplot”命令，選擇較低的空位和長度權(quán)重(分別為1和0.03)，對TdPI和脊椎動物Kunitz結(jié)構(gòu)域進行序列對比。然后主要通過引入額外空位修改序列對比，使得可以將TAP和ornithodorin結(jié)構(gòu)域包括在內(nèi)。如Van de Locht等，1996所報道，所述修改很大程度上是基于后一結(jié)構(gòu)域與抑蛋白酶肽的序列對比。箭頭表示抑蛋白酶肽結(jié)合環(huán)的P1殘基。星號表示參與傳統(tǒng)Kunitz結(jié)構(gòu)域中二硫鍵形成的半胱氨酸。N端測序在牛津大學生物化學系的MRC免疫化學小組按照Matsudaira，1987測定rTdPI的氨基端序列。使用Applied Biosystems‘Mini-Blott’筒(cartridge)在Applied Biosystems 494A‘Procise’蛋白測序儀(PerkinElmer)上運行電印跡樣品。質(zhì)譜分析在裝備有以陽離子模式操作的電噴射界面的VG BioQ三重四極大氣壓質(zhì)譜儀上進行ESI-MS。該設(shè)備用馬心臟肌紅蛋白(7pmol/μl；平均分子量16,951.48Da)校準。蛋白酶抑制測定由Sigma購買彈性蛋白酶(I型，得自豬胰腺)、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、纖溶酶、組織激肽釋放酶、血漿激肽釋放酶、尿激酶、抑蛋白酶肽、n-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-對硝基苯胺(nitroanilide)、Gly-Arg-對硝基苯胺、n-α-苯甲酰基-DL-Arg-對硝基苯胺和n-苯甲?；?Pro-Phe-Arg-對硝基苯胺。Xa因子和重組人類胰蛋白酶得自Promege，而試鹵靈標記酪蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、Chromozym TH和Chromozym X得自Boehringer Mannheim。
使用n-α-苯甲?；?DL-Arg-對硝基苯胺作為顯色底物以及使用含120mM NaCl的50mM HEPES pH7.6作為反應(yīng)緩沖液，在96孔微量板中檢測類胰蛋白酶活性。將50μl含1μl類胰蛋白酶母液(200μg/ml)的緩沖液與50μl抑制劑溶液(各種濃度)混合。于37℃溫育45分鐘后，加入50μl的3mM底物溶液，使用Titertek Multiskan PlusMKII平板讀數(shù)儀(ICN)檢測405nm吸光度的增加。
將其它蛋白酶與在總體積100μl的蛋白酶緩沖液中的各種量的蛋白酶抑制劑預(yù)溫育(20分鐘；37℃)。通過加入合適底物(在900μl蛋白酶緩沖液中)并檢測消化程度測定殘余的蛋白酶活性。如Nakamura等，1987所述，在蛋白酶緩沖液A(0.1M Tris.HCl、10％甘油、10mM CaCl2、pH8)中檢測胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶活性；在蛋白酶緩沖液B(50mM Tris.HCl、0.1mg/ml牛血清白蛋白、150mM NaCl、1mM CaCl2、pH8)中測定纖溶酶、尿激酶、激肽釋放酶、α-凝血酶和Xa因子活性。試鹵靈標記的酪蛋白用作胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和纖溶酶的底物，并檢測釋放的肽的量，以測定蛋白酶活性(Twining，1984)。對硝基苯胺(pNA)-底物用于彈性蛋白酶、激肽釋放酶、尿激酶、α-凝血酶和Xa因子活性(分別為n-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-pNA、n-苯甲酰基-Pro-Phe-Arg-pNA、Gly-Arg-pNA、Chromozym TH和Chromozym X)；通過測定410nm吸光度的增加檢測蛋白酶活性。
圖4顯示了一幅說明rTdPI對組織激肽釋放酶的較弱抑制活性的圖。顯示在向激肽釋放酶/抗蛋白酶樣品中加入30μg底物(n-苯甲酰基-Pro-Phe-Arg-pNA)后不同時間點的410nm吸光度。每個樣品(1ml終體積)使用0.5u/ml的組織激肽釋放酶。實線(◆-◆)表示沒有蛋白酶抑制劑時的激肽釋放酶活性。使用0.75μM濃度的抑蛋白酶肽完全抑制激肽釋放酶活性(●----●)。10倍高濃度的rTdPI[7.5μM(○----○)]剛剛抑制50％的激肽釋放酶活性。在該實驗中使用的其它rTdPI濃度為3.75μM(△----△)和0.75μM(□----□)。
圖5顯示了在存在逐漸增加量的rTdPI情況下，經(jīng)檢測試鹵靈標記的酪蛋白釋放的肽測定出的纖溶酶(左)和胰蛋白酶(右)活性。不存在抑制劑時的肽釋放設(shè)為100％，0％活性為沒有蛋白酶時的水解。空心圓表示rTdPI值。為了根據(jù)蛋白測定獲得的mg/ml數(shù)據(jù)計算rTdPI單體的μmol濃度，使用12kDa的計算分子量(○----○；假定考馬斯藍未結(jié)合糖蛋白的糖組分)和質(zhì)譜分析測定的(平均)分子量(13.5kDa；○-○)。對應(yīng)于抑制50％纖溶酶的濃度為0.097μM(抑蛋白酶肽，△-△)、0.23μM(大豆胰蛋白酶抑制劑，■-■)、0.32μM(rTdPI單體，○-○)和0.43μM(rTdPI單體，○----○)。50％胰蛋白酶抑制值為0.024μM(△-△)、0.026μM(■-■)、0.033μM(○-○)和0.044μM(○----○)。
圖6顯示TdPI對重組人類胰蛋白酶(Promega)的抑制作用。將重組人類胰蛋白酶與逐漸增加量的rTdPI預(yù)溫育迅速將催化活性降低至沒有抑制劑時活性的約33％(V0不存在類胰蛋白酶時檢測的底物轉(zhuǎn)化速率；Vi加入抑制劑的底物轉(zhuǎn)化速率)。反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從未喂飼的成蟲蜱和已在豚鼠上喂飼2、4和6天的成蟲蜱切取唾液腺。每個組織樣品由15對腺體組成。使用RNAce Total Pure提取試劑盒(Bioline Ltd)由這些腺體中分離總RNA，并將所獲得量的1/30(相當于1個腺體)用作使用Titan單管RT-PCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim)的RT-PCR(35個循環(huán))模板。還對由喂飼2天的成蟲蜱取用的腸、性腺、副性腺和馬爾皮基氏管的合并RNA進行RT-PCR。使喂飼3天的幼蟲和喂飼3天的若蟲的整體勻漿進行相同處理步驟；每個PCR反應(yīng)使用的RNA量相當于1個若蟲或2個幼蟲的提取物。圖1下劃線標示引物序列(P1和P2)。為檢查RT-PCR產(chǎn)物是否由TdPImRNA特異性衍生，將它們的大小與使用相同引物由PCR擴增原質(zhì)粒DNA獲得的標記物的大小進行比較。
圖7顯示1.5％瓊脂糖凝膠顯現(xiàn)的由幼蟲(L)和若蟲(N)的整體提取物、雄性和雌性非洲扇頭蜱成蟲唾液腺提取物獲得的RT-PCR產(chǎn)物。數(shù)字對應(yīng)于不同時間點的成蟲喂飼期；0表示取自未喂飼蜱的樣品；2、4和6分別表示喂飼2、4和6天的蜱。M道顯示用作分子量標記的利用相同引物組(圖1)但使用TdPI cDNA代替RNA作為模板獲得的目標(tee)PCR產(chǎn)物。
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權(quán)利要求
1.與圖1所示的蜱源性蛋白酶抑制劑蛋白(TdPI)序列具有顯著序列同源性的重組蛋白、該蛋白的活性片段或該蛋白的功能等同物。
2.權(quán)利要求1的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它起類胰蛋白酶、優(yōu)選人肥大細胞類胰蛋白酶的抑制劑的作用。
3.權(quán)利要求1-2任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它含有一個或多個可用于開發(fā)疫苗的表位，所述疫苗針對與TdPI具有顯著序列同源性的蛋白。
4.權(quán)利要求1的重組蛋白或蛋白片段，其中所述序列同源性的定義為所述蛋白與圖1的序列進行對比時，在完全保守的序列中有50％或50％以上的氨基酸為相同殘基，序列對比結(jié)果使用GCG最佳擬合命令(空位生成罰分＝2.5；空位延長罰分＝0.5)獲得。
5.權(quán)利要求4的重組蛋白或蛋白片段，其中所述序列同源性為60％或更高。
6.權(quán)利要求5的重組蛋白或蛋白片段，其中所述序列同源性為75％或更高。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的重組蛋白或蛋白片段，它含有所述TdPI序列。
8.抑制類胰蛋白酶、衍生自吸血節(jié)肢動物外寄生物的重組蛋白，或者該蛋白的活性片段或該蛋白的功能等同物。
9.權(quán)利要求8的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它起類胰蛋白酶、優(yōu)選人肥大細胞類胰蛋白酶的抑制劑的作用。
10.權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它含有一個或多個可用于開發(fā)疫苗的表位，所述疫苗針對與TdPI具有顯著序列同源性的蛋白。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的重組蛋白或蛋白片段，它抑制類胰蛋白酶的Ki小于1×10-6M，優(yōu)選小于1×10-7M，更優(yōu)選小于2×10-8M，最優(yōu)選小于1×10-9M。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它抑制類胰蛋白酶催化活性。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它抑制肥大細胞類胰蛋白酶、優(yōu)選人肥大細胞類胰蛋白酶。
14.前述權(quán)利要求中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它得自蜱。
15.權(quán)利要求14的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它得自非洲扇頭蜱(Rhipicephalusa appendiculatus)。
16.前述權(quán)利要求中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它與一種或多種肽或多肽遺傳性或化學性融合。
17.前述權(quán)利要求中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它與諸如樹脂的支持物結(jié)合。
18.一種藥用組合物，它包含權(quán)利要求1-17中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物和藥學上可接受的載體。
19.一種疫苗組合物，它包含權(quán)利要求1-15中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物以及任選包含佐劑。
20.一種配制權(quán)利要求19的藥用組合物的方法，該方法包括將權(quán)利要求1-15中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物與藥學上可接受的載體締合。
21.權(quán)利要求1-15中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物，它用作藥物。
22.一種預(yù)防或治療患者疾病的方法，該方法包括給予所述患者有效劑量的權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的組合物。
23.一種編碼權(quán)利要求1-16中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物的核酸分子。
24.一種核酸分子它具有圖1所示的序列；它在嚴格雜交條件下與所述核苷酸序列雜交；或者表達時它編碼權(quán)利要求1-16中任一項定義的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物。
25.一種包含權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的核酸的載體。
26.權(quán)利要求25的載體，它為病毒型載體。
27.用權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
28.用權(quán)利要求23或權(quán)利要求24的核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動物。
29.一種制備權(quán)利要求1-16中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物的方法，該方法包括在宿主細胞中表達權(quán)利要求25或權(quán)利要求26的載體，在表達所述重組蛋白、蛋白片段或功能等同物的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞，以及回收由此產(chǎn)生的所述重組蛋白、蛋白片段或功能等同物。
30.權(quán)利要求1-17中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物在下列方面的用途檢測或定量類胰蛋白酶；耗竭或去除食品或細胞培養(yǎng)物中的類胰蛋白酶；用作抗類胰蛋白酶劑；或用作抗炎藥物。
31.權(quán)利要求1-16中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物在生產(chǎn)用于治療人或動物炎癥的藥物中的用途。
32.一種接種哺乳動物以抵抗疾病或治療患病哺乳動物的方法，該方法包括給予所述哺乳動物權(quán)利要求1-16中任一項的重組蛋白、蛋白片段或功能等同物。
33.選自以下的蛋白或蛋白片段用作類胰蛋白酶抑制劑的用途牛初乳胰蛋白酶抑制劑、大鼠組織因子途徑抑制劑(TFPI-2)、蜱抗凝肽TAP的Kunitz結(jié)構(gòu)域以及ornithodorin的兩個結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及在蜱中鑒定出的新型蛋白酶抑制劑蛋白。這些蛋白可用作疫苗組分、肥大細胞類胰蛋白酶抑制劑、用于檢測肥大細胞以及分離純化肥大細胞類胰蛋白酶。本發(fā)明還涉及控制動物和人體內(nèi)由寄生物引起的疾病和損傷，而且涉及本發(fā)明蛋白在治療某些疾病和變態(tài)反應(yīng)方面的用途。
文檔編號A61P1/02GK1474871SQ0081277
公開日2004年2月11日 申請日期2000年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月19日
發(fā)明者P·A·努塔爾, G·C·佩森, P A 努塔爾, 佩森 申請人:發(fā)展技術(shù)有限公司