專利名稱：具有長期穩(wěn)定性的內置假體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有下列組分的活性物質復合物用于形成生物體部分、特別是活體器官的用途，這些組分是彼此不同的，特異性地適應各自所要形成的生物體部分，即，至少一種基于細胞外物質的結構組分，它特異性地適應各自所要形成的生物體部分的細胞，至少一種補充組分，至少一種粘連組分，和至少一種生長和/或成熟組分。
具有所述組分的、用于形成生物體部分、特別是活體器官的活性物質復合物是現(xiàn)有技術已知的。這種已知的活性物質復合物中，結構組分例如可以由不同的膠原、彈性蛋白或蛋白聚糖組成。作為這種活性物質復合物的補充組分，特別可以提到趨化因子類，例如肽類，如N-F-Met-Leu-Phe-，和/或例如花生四烯酸的代謝產物，如白三烯。扮演粘連組分角色的可以是纖連蛋白或層粘連蛋白類型的蛋白質，不過也可以是細胞粘連分子，例如L-CAM、N-CAM，和基質粘連分子，例如腱生蛋白、肌腱蛋白、IV、V、VII型膠原、合成肽類與跨膜化合物蛋白質、例如整合蛋白。關于這里所討論的活性物質復合物，首先提到的粘連組分的實例、即纖連蛋白和層粘連蛋白歸入基質粘連分子類。作為進一步的組分，所述活性物質復合物包含至少一種生長和/或成熟組分，優(yōu)選地是一種或更多細胞因子的形式。這類細胞因子的實例是血液生成中的集落刺激因子；結締組織生成中的成纖維細胞生長因子；皮膚生成中的表皮生長因子；軟骨生成中的軟骨誘導因子；脾或淋巴結生成中的淋巴細胞激活因子與脾肽；用于胸腺生成的T-細胞生長因子與胸腺肽；用于骨生成的骨生長因子與轉化生長因子；和用于血管生成的血管生成因子。也使用下列細胞因子白介素、胰島素樣生長因子、腫瘤壞死因子、前列腺素、白三烯、轉化生長因子、血小板衍生生長因子、干擾素和內皮衍生生長因子。
關于這種活性物質復合物的更多細節(jié)參見歐洲專利No.0,500,556，其內容清楚地包括在本文中。
本發(fā)明的目的是使活性物質復合物具有更廣泛的用途。
利用所述活性物質復合物形成內置假體植入物，可實現(xiàn)該目的。與沒有活性物質復合物的常用內置假體相比，這提供了內置假體以長期穩(wěn)定性。
在根據本發(fā)明的這種用途中，使用適合于形成骨形式的生物體部分、并且具有下列組分的活性物質復合物，這些組分是彼此不同的，特異性地適應于形成骨，即，至少一種基于細胞外物質的結構組分，它特異性地適應各自所要形成的生物體部分的細胞，至少一種補充組分，至少一種粘連組分，和至少一種生長和/或成熟組分。
根據本發(fā)明的這種用途的發(fā)現(xiàn)是廣泛研究的結果，這些研究針對使活性物質復合物與不同的支撐材料、特別是金屬支撐材料結合。支撐材料與活性物質復合物的結合不是不成問題的?；谝郧暗年P于活性物質復合物及其復雜作用模式的經驗，人們至少不得不期望減少所要治療的特定生物體部分的生成或再形成，例如骨再生。組織毒性反應的危險也是令人懷疑的。
因此該問題的解決方案并不是顯而易見的，其原因正如已經解釋過的，使活性物質復合物與支撐物結合是極成問題的，在這種情況下支撐物是內置假體，因為活性物質復合物在骨缺損中的功能可以被可能的免疫反應破壞或至少復雜化了。
所要穩(wěn)定的內置假體具有一個外表面，它至少部分涂有活性物質復合物和/或它具有至少一個充滿活性物質復合物的腔。
涂以和/或充滿活性物質復合物的目的是使內置假體在有機體內更加迅速和永久的一體化。內置假體在植入部位的一體化得以加速且提高，帶來長期穩(wěn)定性，使內置假體的可負載性更高、更早。
按照進一步的實施方案，內置假體具有至少一個充滿活性物質復合物的腔，另將活性物質復合物涂在進一步的支撐材料上。膠原或適合的聚合物可以用作這樣一種進一步的支撐材料。這里可以確切地提到I、IV、V和VII型膠原。膠原例如可以使用網或凝膠的形式，它們特別地具有固有的良好的免疫相容性，易于加工。
可以采用的聚合物支撐材料確切地是天然單體的聚合物，例如聚氨基酸(聚賴氨酸、聚谷氨酸等)和乳酸的聚合物。也可以采用共聚物，例如聚乳酸與羥基乙酸的共聚物。
聚乳酸酯是具有下列化學式的乳酸的聚酯 單體的直接聚合作用得到具有相對低分子量的聚合物。上限為約20,000Da。在催化劑的存在下，在高溫和低壓下連接環(huán)狀二聚物可以得到更高的分子量。乳酸聚合物是生物可降解的、生物可相容的、水不溶性的，是以高強度為特征的。
進一步的支撐材料、例如膠原或所述聚合物的另外作用在于減少完全充滿內置假體腔所需活性物質復合物的量，而不會對活性物質復合物的基本效率帶來不利影響。按照這種方法，活性物質復合物的使用從經濟角度上說是更加可取的。
本發(fā)明還涉及內置假體，它在根據該用途的實施方案之一中涂有或者包含活性物質復合物。
下面，根據實施例并參照附圖對發(fā)明作更加詳細的解釋，其中

圖1為與未治療的樣本相比，使用活性物質復合物的兔新骨生成作用圖示；圖2為與純的磷酸三鈣相比，使用活性物質復合物并以磷酸三鈣作為支撐材料的綿羊新骨生成作用圖示；圖3為與純的膠原相比，使用活性物質復合物并以不同的膠原作為支撐材料的大鼠新骨生成作用圖示；圖4a為涂以活性物質復合物的內置假體側視圖；圖4b為圖4a旋轉90°后的內置假體側視圖。
I、活性物質復合物的制備制備活性物質復合物的主要步驟描述如下清洗小牛、綿羊、兔或大鼠管狀骨，尤其除去骨髓，然后將骨冷凍。將冷凍的骨研磨成粒徑小于2mm。將研磨后的骨碎片在丙酮中脫脂，在0.6N鹽酸中脫鈣。然后將產物冷凍干燥，得到脫礦質的骨基質，在4摩爾鹽酸胍溶液中萃取。將萃取溶液對蒸餾水透析，離心，冷凍干燥沉淀，得到活性物質復合物。
這種基本制備方法以下列流程圖表示。
圖1表示活性物質復合物制備的流程圖屠宰后的新鮮管狀骨骨干↓研磨成粒徑＜2mm↓在丙酮中脫脂↓在0.6N HCl中脫鈣↓洗滌，冷凍干燥↓脫礦質的骨基質↓在4M GuHCl中萃取↓ ↓殘余物 上清液↓對蒸餾水透析↓沉淀含有活性物質復合物II、不使用支撐材料的活性物質復合物的功效為了說明活性物質復合物本身是有效的，首先進行這樣一種試驗，其中在植入活性物質復合物時沒有另外的支撐材料。
1、試驗用動物使用平均體重為3089g的雌性毛絲鼠兔。它們攝入兔維持飼料和用鹽酸酸化至pH4.5的雙臭氧化自來水。
皮下注射氯胺酮與賽拉嗪的混合物，使動物麻醉。
2、兔骨缺損的制備使用內部冷卻鉆在兔膝關節(jié)內(股骨遠端)制備直徑4mm、深約9mm的植入床。然后在每種情況下向所形成的孔洞內各自裝入30與90mg已如I下所述制備的活性物質復合物。在每種情況下另有一個孔洞不作處理，充當新骨生成的對照。
圖1顯示手術后28天后未經處理的孔洞和植入活性物質復合物后的孔洞內的新骨生成作用，以及周圍預先存在的海綿物質的密度(n＝2/活性物質量)。
試驗結果分析揭示了植入30mg活性物質復合物后孔洞周圍的海綿物質的密度比未處理孔洞高45％，植入90mg活性物質復合物后比未處理孔洞高69％。預先存在的海綿物質的量對缺損的再生作用完全沒有影響，因為插入活性物質復合物之后的新骨生成作用不是從孔洞外周開始的，而是均勻分布在缺損部位中的。
III、使用磷酸三鈣(TCP)生成綿羊下頜骨磷酸三鈣(TCP)是基于CaO/P2O5系統(tǒng)的磷酸鈣陶瓷，通過壓制隨后燒結原料氧化鈣(CaO)與五氧化二磷(P2O5)而制備。或者，也可以通過熱壓步驟制備。
1、試驗用動物在下述試驗中使用來自Viehzentrale Südwest AG，Stuttgart的成熟馴養(yǎng)綿羊。向它們供應干草和水，在手術前三天供應Altromin顆粒漿液。
向動物預先i.m.給以1ml賽拉嗪/1ml氯胺酮。然后用戊巴比妥鈉麻醉綿羊。
2、植入物的制備將TCP懸浮在100mg活性物質復合物的10ml水溶液中，在恒定攪拌下用液氮深度冷凍。冷凍干燥24小時后，氣體滅菌(環(huán)氧乙烷)，將摻有活性物質復合物的TCP植入綿羊下述下頜骨缺損內。另外，向出于對照目的的另一下頜骨缺損內裝入經過高壓釜內滅菌的未摻雜TCP。
3、綿羊下頜骨缺損的制備適當?shù)刂苽渚d羊下頜骨，以生理鹽水作為冷卻劑，用直徑5mm的環(huán)鋸切斷，分別取骨的標準柱體。然后向所形成的孔洞之一裝入TCP，按照試驗操作1該TCP已經摻有活性物質復合物，第二個孔洞裝入未經摻雜的TCP。
為清楚起見，下頜骨缺損內的骨生長結果以圖面形式如圖2所示。試驗的持續(xù)時間分別為26天和41天。
發(fā)現(xiàn)在最初階段，摻有活性物質復合物的TCP促進No.811和No.86綿羊下頜骨缺損的骨再生作用達約100％。41天后，對骨再生作用的促進率仍有10％。因此特別是在開始階段，骨的愈合要比沒有摻有活性物質復合物的植入物的成骨作用更加迅速。
該發(fā)現(xiàn)對涂有活性物質復合物的內置假體來說是特別重要的。例如在股骨頸部骨折的情況下，涂有活性物質復合物的內置假體相應地有利于假體更加迅速的結合，從而有利于更加迅速的再生和患者的恢復。因此縮短了住院期。
IV、用膠原作為支撐材料的試驗上文所討論的已知活性物質復合物可以用于內置假體的結合。在活性物質復合物的制備中，具有所需程度純度的定量收率是非常低的。我們因此檢查了是否存在這樣的支撐材料，它們能夠與活性物質復合物結合，以便減少特定目的所需活性物質復合物的量，但又不會降低它的骨生成效率。
1、活性物質復合物用于下述試驗目的的活性物質復合物完全按I下所述方式制備，并使用來自小牛的管狀骨。
2、試驗用動物使用體重在350與400g之間的雄性Wistar大鼠，飼養(yǎng)在帶空調的動物房內，溫度23℃，相對濕度約50％。對它們給以大鼠與小鼠維持飼料。
將兩個相同支撐材料的植入物植入每只試驗動物的腹部肌肉系統(tǒng)，其中一個植入物涂有活性物質復合物，而另一個保持未涂狀態(tài)，充當對照植入物。21天后處死動物，移出植入物在腹部肌肉系統(tǒng)內的作用區(qū)域，進行組織學評價。
3、所用支撐材料這些試驗中，所用膠原材料都是商業(yè)上可得到的。膠原A是純的、無菌的、天然的、可吸收的牛皮膚膠原，不含任何外來的添加劑，例如穩(wěn)定劑或消毒劑。
膠原B是經過純化的、冷凍干燥的、輕微交聯(lián)的、無菌與無熱原的牛皮膚膠原，具有弱抗原的性質。膠原的螺旋結構得以保留。
膠原C包含純的、天然的和可吸收的牛膠原纖維。
所有所用的膠原都是網狀。切成膠原網的切片，各重50mg，分別加入1ml活性物質復合物溶液(3mg/ml)。在對照植入物中，代之以加入1ml蒸餾水。將處理后的膠原網切片冷凍在-20℃下，冷凍干燥，得到直徑約10mm、厚約5mm的植入物。圖3顯示在21天后，關于涂有和未涂有活性物質復合物(環(huán)孢菌素A)的膠原植入物A、B和C對免疫抑制動物與非免疫抑制動物的骨生成結果。這里，評價數(shù)值(BZ)相當于每組三人對六個植入物的評價數(shù)值的算術平均值。
涂有活性物質復合物的膠原A在該時間階段之后對免疫抑制動物顯示骨生成作用，而這種作用在膠原B中沒有得到證明。不過相形之下，膠原C顯示非常顯著的骨生成作用。
由此可見，這取決于所用特定膠原的制劑，并且顯示了作為支撐材料的適應性。致免疫性膠原不適合用作支撐材料。
IV、試驗支撐材料的生物可相容性在涉及內置假體長期穩(wěn)定性提高的試驗中，使用來自Friedrichsfeld公司的具有不同表面粗糙度(100、20和0.5μm)的鈦盤、TiAl6V4合金(0.5μm)和Al2O3盤，和來自FeldmühleAG公司的羥基磷灰石盤。羥基磷灰石是通過五氫氧化鈣三磷酸鹽粉末在1250℃下的陶瓷燒制作用而得到的。另外，羥基磷灰石也可以利用天然材料制備，例如紅藻的碳酸鹽骨架。經過洗滌和干燥操作后，首先通過在約700℃溫度下的熱解作用除去有機成分。然后在高壓和高溫下加入磷酸鹽溶液，轉化為羥基磷灰石。
在進一步的制備羥基磷灰石陶瓷的方法中，從天然的珊瑚骨架開始，珊瑚的碳酸鈣被水熱轉化為羥基磷灰石或羥基磷灰石與其他礦物結構的混合物。所得材料中，保留了珊瑚狀結構，也就是珊瑚的互連孔系統(tǒng)。
利用浸涂法涂以已用上述通用操作制備的活性物質復合物。浸涂法被理解為這樣一種涂層方法，其中將所要涂覆的對象——在這種情況下是盤片——浸入具有所需預定濃度的涂覆劑溶液中，在這種情況下是活性物質復合物。然后冷凍干燥。得到薄薄的覆蓋層或涂層。測定指定材料、特別是關于表面粗糙度的生物可相容性(n＝20；各四只盤片)。
所研究材料的這種生物可相容性試驗揭示了鈦作為支撐材料是非常適合的，具有最高數(shù)量的活細胞和最佳的活細胞與死細胞之比。羥基磷灰石得到近似好的結果，TiAl6V4相當差。
至于表面粗糙度，一般發(fā)現(xiàn)最光滑的表面、也就是孔徑為0.2-0.5μm的表面獲得最佳結果，TiAl6V4例外。隨著粗糙度或孔徑的增加，活細胞數(shù)及活細胞與死細胞之比下降。約0.5μm的孔徑使活體(骨)組織與盤片表面直接接觸的比例最高。
表1
這些試驗結果現(xiàn)在能夠轉換成將內置假體涂以活性物質復合物。所用內置假體的視圖如圖4所示。
在使用內置假體之前，通過浸涂過程將它們的外表面(I)涂以活性物質復合物，另外將活性物質復合物加入到假體莖(II)的內腔中，內腔在莖表面上具有開口。其優(yōu)點是，萬一將來可能發(fā)生內置假體松弛，隨后能夠施用活性物質復合物，而無需巨大努力，并且引起骨生成，從而使內置假體穩(wěn)定。如果需要的話，也可以在螺釘連接(III)區(qū)域涂以活性物質復合物。
表2闡述了涂以活性物質復合物使負載能力比未涂表面更高這一事實，以羥基磷灰石(HA)為例。不同植入材料之間界面上的拉伸強度值以N/mm2±標準偏差表示。將通過熱等壓壓制(HIP)法制備的羥基磷灰石與另外涂以活性物質復合物的羥基磷灰石進行比較。將植入材料植入兔股骨遠區(qū)，84天后檢查。拉伸強度值列在下表中。
表2
N＝植入物數(shù)目AS＝涂有活性物質復合物HIP＝熱等壓壓制SR＝表面粗糙度最后必須再次指出，出于本發(fā)明目的所進行的試驗都是經過小心設計的模型試驗，這是由于實際主體(也就是例如植入股骨區(qū)域的內置假體)不能為試驗所利用，因為對人體進行這些試驗將是不可被接受的。
另外，本發(fā)明能夠應用于所有可以想象得到的內置假體。關于股骨頸部區(qū)域中的內置假體實例的說明僅僅是說明性例證。
權利要求
1.具有下列組分的活性物質復合物用于形成生物體部分、特別是活體器官的用途，這些組分是彼此不同的，特異性地適應各自所要形成的生物體部分，即，至少一種基于細胞外物質的結構組分，它特異性地適應各自所要形成的生物體部分的細胞，至少一種補充組分，至少一種粘連組分，和至少一種生長和/或成熟組分，用于制備內置假體植入物。
2.如權利要求1所要求保護的用途，其特征在于該內置假體具有一個至少部分地涂有該活性物質復合物的外表面(I)，和/或具有至少一個充滿該活性物質復合物的腔(II)。
3.如權利要求2所要求保護的用途，其特征在于該內置假體具有至少一個充滿該活性物質復合物的腔(II)，該活性物質復合物另外涂在進一步的支撐材料上。
4.如權利要求3所要求保護的用途，其特征在于使用膠原或一種聚合物作為進一步的支撐材料。
5.內置假體，它涂有如權利要求1至4之一所要求保護的活性物質復合物，和/或它含有這種活性物質復合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及活性物質復合物用于形成生物體部分、特別是活體器官的用途,該活性物質復合物具有下列組分,這些組分是彼此不同的,特異性地適應各自所要形成的生物體部分:至少一種基于細胞外物質的結構組分,它特異性地適應各自所要形成的生物體部分的細胞,至少一種補充組分,至少一種粘連組分,和至少一種生長和/或成熟組分,用于制備內置假體植入物。按照本發(fā)明,內置假體的外部(I)至少部分地涂有該活性物質復合物。內置假體還具有中空的腔(II),其中充滿該活性物質復合物。
文檔編號A61M31/00GK1362887SQ00807736
公開日2002年8月7日 申請日期2000年4月20日 優(yōu)先權日1999年4月20日
發(fā)明者K·H·施密德 申請人:K·H·施密德