專利名稱:一種蛋白質(zhì)氨基末端殘基的有選擇化學(xué)去除的制作方法
在基因轉(zhuǎn)換的原核細(xì)胞中生物合成蛋白質(zhì)，得到具有連在氨基末端的一個(gè)N-甲酰基-蛋氨酸的蛋白質(zhì)表達(dá)。因?yàn)镹-甲?；?蛋氨酸加到天然蛋白質(zhì)上，可以改變其生物活性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，抗原性等等，所以，若有可能，最好是除去它。
通過(guò)在氨基末端蛋氨酸和所要得到的天然肽之間引入一個(gè)斷裂位置，從而得到所需要的天然肽產(chǎn)物，這從理論上講，可供選擇的方法是靈活多樣的。但是事實(shí)上，要得到有選擇的斷裂的可行方法卻是非常有限的。
例如，對(duì)于不含蛋氨酸的那些天然蛋白質(zhì)，引起產(chǎn)生斷裂(蛋氨酸是選擇的斷裂位置)的溴化氰，已經(jīng)證明是產(chǎn)生天然蛋白質(zhì)的有效方法。但是在事實(shí)上，在中等大小的肽和蛋白質(zhì)中，不含蛋氨酸的情況是十分罕見的。因此，一個(gè)最重要的任務(wù)是去發(fā)現(xiàn)一種方法，可以斷開氨基末端的蛋氨酸，制備天然的生物合成的蛋白質(zhì)。
確定任何從氨基末端蛋氨酰蛋白質(zhì)產(chǎn)生天然蛋白質(zhì)的方法的一個(gè)關(guān)鍵和意想不到的發(fā)現(xiàn)是，生物合成的表達(dá)產(chǎn)物的α-氨基，例如Nα-蛋氨酰-(人類生長(zhǎng)激素)，不被甲?；＿@個(gè)事實(shí)首先是通過(guò)用氰酸鹽對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)改造才發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)又為自動(dòng)埃德曼(Edman)序列分析所證實(shí)。雖然不會(huì)斷裂起始的蛋氨酸，但是可以假定由于酶的作用，E.Coli表達(dá)的有機(jī)體卻可有效地去除Nα-甲酰基。因此，氨基末端蛋氨酸表達(dá)產(chǎn)物的α-氨基可以(至少是可能)直接用于斷裂。
在氨基末端蛋氨酰表達(dá)產(chǎn)物上有一個(gè)游離的α-氨基，導(dǎo)致了除去蛋氨酰的其它方法的可能性。一種方法是使用異硫氰酸苯酯進(jìn)行有選擇的埃德曼型氨基末端順序斷裂，實(shí)際應(yīng)用中要求在天然蛋白質(zhì)中不含有賴氨酸殘基。但是，只有極少數(shù)蛋白質(zhì)中沒(méi)有賴氨酸。
另外可能的方法是用肽鏈端解酶，原則上，這樣能夠分段將氨基酸斷開。但是，由于種種理由，包括它們的非均勻性，價(jià)格高昂，對(duì)變性作用的敏感性，更為重要的是它們對(duì)不同基質(zhì)的特征的和非特征的作用有很大差別，所以在合成研究中，很少見到成功使用肽鏈端解酶的報(bào)道。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種新方法，這種方法代表新的化學(xué)方法，同時(shí)提供新的化合物，以用于進(jìn)行有選擇的氨基末端斷裂，從而產(chǎn)生所需的最終肽產(chǎn)物。本發(fā)明指的正是這一方法和具有上述用途的化合物。
因此，本發(fā)明涉及具有下列結(jié)構(gòu)式的一類化合物。
H-X-脯-肽此處，X是一種天然存在的氨基酸殘基;肽是指一個(gè)有確定生物活性的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸殘基鏈。
本發(fā)明提供一種方法，從而可由如下結(jié)構(gòu)式的化合物生產(chǎn)一種具有氨基酸鏈的化合物，該氨基酸鏈表示一種具有生物活性的肽或蛋白質(zhì)，H-X-脯-肽其中，X是一種天然存在的氨基酸殘基，肽是指有確定生物活性的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸鏈。在第一種實(shí)施方案中，方法包括使H-X-脯-肽在一種質(zhì)子惰性溶劑中，經(jīng)受弱酸條件處理。在第二種實(shí)施方案中，H-X-脯-肽在含水緩沖溶液介質(zhì)中，經(jīng)受酸性，中性或堿性條件處理。無(wú)論在哪一種實(shí)施方案中，伴隨斷裂，H-X-脯-部分形成二酮哌嗪，同時(shí)釋放出肽。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的、能提供本發(fā)明的物質(zhì)的方法包括為生產(chǎn)下式化合物設(shè)計(jì)的生物合成過(guò)程，H-X-脯-肽其中，X和肽的意義規(guī)定如上?；衔锬軌蛴矛F(xiàn)在通用的重組DNA技術(shù)制備，同時(shí)能夠作為直接表達(dá)產(chǎn)物或作為一種前身表達(dá)產(chǎn)物的處理結(jié)果而間接得到。
為了得到所需要的，但尚不能用重組DNA方法直接制備的、術(shù)語(yǔ)“肽”所特指的化合物，此時(shí)化合物H-X-脯-肽是非常有用的。根據(jù)本發(fā)明的方法處理化合物H-X-脯-肽時(shí)，通過(guò)形成中間體二酮哌嗪，而得到所需產(chǎn)物(肽)。在質(zhì)子惰性溶劑中的斷裂過(guò)程通常用下列順序來(lái)描述
如前所述，基團(tuán)γ是天然存在的氨基酸側(cè)鏈。
在H-X-脯-肽中，基團(tuán)X表示任何天然存在的氨基酸的一個(gè)殘基。但是，X代表的氨基酸殘基最好不是脯氨酸，因?yàn)楦?脯順序只能很慢地形成斷裂過(guò)程所需的二酮哌嗪中間體。最常見的是用重組DNA方法產(chǎn)生H-X-脯-肽。當(dāng)化合物直接作為表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生時(shí)，基團(tuán)X將是蛋氨酰;因此，本發(fā)明所指的X最好是蛋氨酰。但是，當(dāng)基團(tuán)X不是蛋氨酰時(shí)，化合物的來(lái)源也可以是生物合成的。但是，表達(dá)產(chǎn)物將首先被一種能產(chǎn)生H-X-脯-肽的方法處理。
這里的“脯”項(xiàng)指的是天然存在的氨基酸脯氨酸的氨基酸殘基。
表示“肽”的基團(tuán)指的是氨基酸殘基鏈，代表任一種具有生物活性的肽和蛋白質(zhì)，包括例如，胰島素原，人類生長(zhǎng)激素，牛生長(zhǎng)激素，α-干擾素，β-干擾素，γ-干擾素，聯(lián)白細(xì)胞素-1，聯(lián)白細(xì)胞素-2，生長(zhǎng)激素釋放因子，類胰島素生長(zhǎng)因子，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑，蛋白質(zhì)C等，以及已知生物活性的肽和蛋白質(zhì)的改進(jìn)形式。
H-X-脯-肽的實(shí)例有蛋-脯-(人類生長(zhǎng)激素);
丙-脯-(α-干擾素);
蛋-脯-(聯(lián)白細(xì)胞素-2);
蛋-脯-(γ-干擾素);
蛋-脯-(牛生長(zhǎng)激素);
蛋-脯-(組織血纖維蛋白溶酶原激活劑);
絲-脯-(人類生長(zhǎng)激素);
天門冬-脯-(人類生長(zhǎng)激素);
蛋-脯-(生長(zhǎng)激素釋放因子);
蛋-脯-(蛋白質(zhì)C);
亮-脯-(類胰島素生長(zhǎng)因子);
等等。
以上述為例的化合物，已經(jīng)把兩種確定了的氨基酸殘基結(jié)構(gòu)加到所需要的最終產(chǎn)物肽上，使生成其他無(wú)用的有生物活性的多肽和蛋白質(zhì)。在氨基末端有一個(gè)由天然氨基酸殘基及其后連接脯氨酸組成的二肽化合物，整理該化合物，使其中二肽易于斷裂，并生成所需要的最終產(chǎn)物。倒數(shù)第二位的脯氨酸在氨基末端的二肽產(chǎn)生順式-構(gòu)型，同時(shí)將最終α-氨基固定在一個(gè)更有利的位置上以進(jìn)攻脯氨酸的羰基〔見Gisin，B.F.，和Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.24卷，3102-3106頁(yè)(1972)〕。形成很有利的環(huán)狀氨基酸一脯氨酸二酮哌嗪，同時(shí)以離去基團(tuán)的形式，釋出所需要的肽，在這一點(diǎn)上進(jìn)行親核進(jìn)攻是有利的。在質(zhì)子惰性溶劑中，反應(yīng)的基本特征是被弱酸催化。本發(fā)明的方法具體可行性的關(guān)鍵和不能預(yù)先回答的問(wèn)題，是要得到的最終產(chǎn)物的氨基末端殘基是否能夠并將作為一個(gè)合適的離去基團(tuán)，以便在期望的最終產(chǎn)物能夠穩(wěn)定又可溶解的條件下離去，并形成二酮哌嗪。雖然已經(jīng)發(fā)表了大量合成固相肽的文獻(xiàn)，但是似乎關(guān)于二酮哌嗪的形成尚只報(bào)道過(guò)合成二肽基階段，在這一階段，水解是在功能樹脂酯鍵上進(jìn)行的。
和酯類比較，酰胺的酸穩(wěn)定性增加，這一原則已被普遍接受，所以，沒(méi)有報(bào)道過(guò)在X-脯鏈上形成二酮哌嗪(這需要酰胺水解)，這是不足為怪的。這種沉默強(qiáng)有力地表明本發(fā)明的方法可能成功。
根據(jù)本發(fā)明方法的第一種形式，H-X-脯-肽化合物反應(yīng)是在質(zhì)子惰性溶劑(最好不含水)中進(jìn)行的?？傊?，只有避免任何肯定的加水才能合乎反應(yīng)條件。質(zhì)子惰性溶劑的實(shí)例有1-甲基吡咯烷酮(NMP)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基亞砜(DMSO)，甲酰胺，六甲基磷酰胺(HMPA)等等。較好的是NMP，DMF和DMSO，其中以NMP為最好。
在質(zhì)子惰性溶劑中的反應(yīng)，在弱酸條件下進(jìn)行，使用乙酸、磷酸、亞磷酸、硫酸、三氟乙酸、甲酸，順丁烯二酸，酒石酸、甘氨酸等。最為適宜的是乙酸。
斷裂反應(yīng)也能在緩沖溶液水介質(zhì)中進(jìn)行。當(dāng)水作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，反應(yīng)最好在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。
當(dāng)反應(yīng)在質(zhì)子惰性溶劑中進(jìn)行時(shí)，本發(fā)明的方法一般在大約15℃到50℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，最好從約25℃到大約40℃之間。酸的濃度通常在大約0.1M到大約1M之間，更好是在大約0.25M到約0.5M，最好為約0.30M到約0.35M，尤其以大約0.33M為佳。
當(dāng)在水介質(zhì)中進(jìn)行時(shí)，溫度需要稍高一點(diǎn)。例如一般反應(yīng)溫度范圍是從大約25℃到大約60℃，更為合適的是從大約35℃到大約50℃。溫度的選擇是根據(jù)“肽”的穩(wěn)定性和H-X-脯-肽中第三個(gè)氨基酸的性質(zhì)確定的。若穩(wěn)定性和第三個(gè)氨基酸殘基的性質(zhì)允許的話，盡量提高溫度是適宜的。緩沖液的濃度一般從大約0.1M到大約2M，從約0.5M到約1M更好，最好是從大約0.8M到大約1M。最適宜的緩沖劑鹽類是用磷酸鹽。以PH值約為8最適宜，因?yàn)樵诟叩腜H值時(shí)，斷裂反應(yīng)的收率提高很少，而不需要的副反應(yīng)增加很多〔見Mckerrow，J.H.，和Robinson，A.B.，AnalyticalBiochem.42卷，565-568頁(yè)(1972)〕。
斷裂反應(yīng)進(jìn)行中，定時(shí)監(jiān)測(cè)二酮哌嗪的形成。當(dāng)認(rèn)為適宜時(shí)終止反應(yīng)，同時(shí)使用已知的分離方法，從反應(yīng)混合物中回收斷裂產(chǎn)物。
以下提供說(shuō)明本發(fā)明的例子。這些實(shí)例不是試圖限制本發(fā)明的廣寬范圍。
本發(fā)明選用的典型肽類是由固相合成方法制備的。其純度用高效液相色譜分析證實(shí)。斷裂反應(yīng)之前，該肽類以無(wú)定形凍干的固體形式貯存。改變了一些實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并報(bào)告了它們對(duì)斷裂的影響。
下面分別敘述使用有機(jī)介質(zhì)和水介質(zhì)的最優(yōu)條件，并應(yīng)用于肽(蛋-脯-甘-甘-NH2)的反應(yīng)，其中“-NH2”表示肽的C-末端有一個(gè)酰胺碎片。
A.有機(jī)相斷裂反應(yīng)條件將10毫克蛋-脯-甘-甘-NH2溶于在4
分子篩上干燥脫水一星期的1毫升N-甲基吡咯烷酮中。將混合物在25℃下不斷攪拌，加入冰乙酸(HOAC)至濃度為0.33M使反應(yīng)開始。用反相色譜分析測(cè)量蛋氨酰-脯氨酸二酮哌嗪形成和反應(yīng)物肽的消失來(lái)監(jiān)測(cè)斷裂速度。色譜分析用0.46×25厘米的Ultrosphere C18柱，在0.1%三氟乙酸中，用乙腈進(jìn)行梯度洗脫，在每次分析時(shí)，用0.1%三氟乙酸稀釋10倍，使反應(yīng)停止。收集二酮哌嗪，并用氨基酸和質(zhì)譜分析來(lái)確證。
表1-8列出有機(jī)斷裂條件下，改變選擇的參數(shù)時(shí)，得到的結(jié)果。
表1列出在DMF中25℃進(jìn)行斷裂反應(yīng)時(shí)，當(dāng)改變酸濃度時(shí)，二酮哌嗪生成的數(shù)量。記錄了可估價(jià)的反應(yīng)速度，觀察到依賴于弱酸濃度。在DMSO中，用相似的弱酸處理，則斷裂速度降低。在DMSO中提高斷裂反應(yīng)溫度到40℃，和在DMF中25℃進(jìn)行的反應(yīng)速度相類似，結(jié)果列于表2。
表1酸濃度(從蛋-脯-甘-甘-NH2在2-5℃生成蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪)試劑 反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))2 4 610 M HOAc/DMF 2% 8% 40%1 M HOAc/DMF 26% 44% 55%0.1 M HOAc/DMF 13% 28% 34%0.01 M HOAc/DMF 3% 6% 8%100% DMF 0% 3% 4%100% HOAc ＜1% ＜1% 2%100% TFA 0% ＜1% ＜1%表2酸濃度(從蛋-脯-甘-甘-NH2于40℃形成蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪)反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))試劑 2 4 240.1 M HOAc/DMSO 25% 45% 95%0.33 M HOAc/DMSO 38% 61% 100%1.0 M HOAc/DMSO 27% 44% 94%3.3 M HOAc/DMSO 7% 12% 41%10.0 M HOAc/DMSO 2% 4% 14%
如前所述，最適宜的酸濃度是大約0.25M到大約0.5M。
表3列出了溫度對(duì)一系列肽的影響的研究結(jié)果，這些肽的區(qū)別只是第三個(gè)殘基的側(cè)鏈不同。十分清楚，在這個(gè)位置上增加位阻現(xiàn)象，將減慢反應(yīng)速度。但是在各種情況下，都明顯發(fā)生斷裂。
表3溫度效應(yīng)(在兩種溫度下，1M乙酸/DMF中蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪的形成)反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))在25℃ 在40℃肽b2 24 2 24MPGG-NH227% 100% 76% 100%MPTG-NH2N.D.aN.D. 22% 88%MPPG-NH2N.D. N.D. 20% 95%MPFG-NH22% 17% 10% 68%a N.D.，沒(méi)有測(cè)定b MPGG-NH2＝蛋-脯-甘-甘-NH2MPTG-NH2＝蛋-脯-蘇-甘-NH2MPPG-NH2＝蛋-脯-脯-甘-NH2MPFG-NH2＝蛋-脯-苯丙-甘-NH2重要的因素是選取質(zhì)子惰性溶劑。溶劑必須是一種促進(jìn)或至少不抑制伴隨斷裂反應(yīng)生成二酮哌嗪，以生成需要的最終產(chǎn)物，并同時(shí)對(duì)最終肽產(chǎn)物只有最少的降解作用。表4-8列出了在有機(jī)斷裂條件下，改變?nèi)軇┬再|(zhì)得到的結(jié)果。
表4提供了在進(jìn)行有機(jī)斷裂條件下，幾種蛋白質(zhì)和肽類的穩(wěn)定性資料。列出了用反相高效液相色譜(HPLC)測(cè)得的百分含量，即在某一限定的反應(yīng)介質(zhì)中，在指定的時(shí)間(小時(shí))內(nèi)，處理所選擇的蛋白質(zhì)或肽，其剩余量列于表中，并表明DMF和DMSO相比，DMSO相對(duì)要好一些。
表4蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 (h＝小時(shí))蛋白質(zhì)a1M HOAc/DMF，40℃ 1M HOAc/DMSO，40℃2h 24h 48h 2h 24h 48h胰高血糖素 100%b49% 37% 124% 117% 119%bPP 42% 40% 32% 52% 90% 86%GRF 79% 26% 0% 98% 89% 86%A(SO-3)4100% 58% 36% 100% 100% 96%B(SO-3)297% 62% 37% 94% 106% 68%胰島素原 86% 43% 30% 97% 70% 86%a bpp＝牛胰多肽GRF＝生長(zhǎng)激素釋放因子A(SO-3)4＝胰島素A鏈S-磺酸鹽B(SO-3)2＝胰島素B鏈S-磺酸鹽b 反應(yīng)剩余量的相對(duì)百分?jǐn)?shù)是對(duì)未經(jīng)處理的對(duì)照樣品測(cè)定的。
類似于表4、表5提供的蛋氨酰人類生長(zhǎng)激素穩(wěn)定性結(jié)果，證明和DMF比起來(lái)，NMP得到的結(jié)果和DMSO的結(jié)果更相近。
表5蛋氨酰人類生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))，40℃試劑 2 4 240.33 M HOAc/DMF 78a/78b65/68 45/340.33 M HOAc/DMSO 91/100 77/99 75/860.33 M HOAc/NMP 85/90 70/89 77/75a 反相HPLC測(cè)定的b 陰離子交換HPLC測(cè)定的表6詳細(xì)列出幾種溶劑對(duì)蛋-脯-甘-甘-NH2斷裂反應(yīng)影響的結(jié)果。
表6溶劑效應(yīng)(作為蛋-脯 二酮哌嗪生成的指標(biāo)，蛋-脯-甘-甘-NH2消失情況)反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))，25℃溶劑 0 2 4 6 241M HOAc/CH3CN 100%a114% 105% 99% 66%1M HOAc/nPrOH N.D.b100% 97% 94% 72%1M HOAc/MeOH 100% 101% 99% 99% 97%1M HOAc/CH2Cl2100% 104% 96% 99% 80%1M HOAc/DMF 100% 88% 71% 57% 11%1M HOAc/DMSOc100% 73% 56% N.D.b6%
a 代表起始物質(zhì)剩余量b N.D.，未測(cè)定c 在40℃測(cè)定的從以上結(jié)果看出，NMP，DMF和DMSO，所有質(zhì)子惰性溶劑都十分合用。
表7列出了使用DMF和DMSO作溶劑時(shí)，幾種肽的溫度效應(yīng)研究結(jié)果。
表7溫度效應(yīng)(在40℃，在選定的兩種溶劑(分別和1MHOAC混合)中，蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪的生成)DMF DMSO肽a時(shí)間(小時(shí)) 時(shí)間(小時(shí))2 24 2 24 48MPGG-NH276% 100% 36% 100% 100%MPTG-NH222% 88% 3% 11% 38%MPPG-NH220% 95% 5% 43% 65%MPFG-NH210% 68% 1% 12% 23%a MPGG-NH2＝蛋-脯-甘-甘-NH2MPTG-NH2＝蛋-脯-蘇-甘-NH2MPPG-NH2＝蛋-脯-脯-甘-NH2MPFG-NH2＝蛋-脯-苯丙-甘-NH2如表7和前面其他表的數(shù)據(jù)顯示的，DMF比DMSO對(duì)于生成二酮哌嗪和伴隨的斷裂反應(yīng)有更大的影響，它對(duì)于產(chǎn)物蛋白質(zhì)或肽，也有較大的降解作用。為了得到最佳結(jié)果，考慮到任一特殊肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在選用反應(yīng)條件時(shí)要有綜合考慮。
表8給出了把有機(jī)相斷裂條件用于模型肽得到的結(jié)果。這種模型肽模擬本發(fā)明的化合物，其中基團(tuán)肽是人類生長(zhǎng)激素。值得注意的是，人類生長(zhǎng)激素的頭兩個(gè)氨基酸是苯丙-脯，所以是一種特殊情況。這樣，從本發(fā)明的化合物的X-Pro形成二酮哌嗪，和從得到的人類生長(zhǎng)激素的開始的苯丙-脯中找到二酮哌嗪形式都是可能的。表8將蛋-脯-苯丙-脯-蘇-異亮-NH2和苯丙-脯-蘇-異亮-NH2作了比較。結(jié)果表明，從后者生成二酮哌嗪較慢。這樣，能夠明確確定本發(fā)明的一種化合物蛋-脯-人類生長(zhǎng)激素的處理?xiàng)l件，以便最大限度生成單一的二酮哌嗪，同時(shí)發(fā)生斷裂反應(yīng)，生成最少的次級(jí)二酮哌嗪。關(guān)于這方面，NMP是一種最好的溶劑，因?yàn)槎哙荷闪棵黠@比在DMSO中多，在較后的幾次測(cè)定中，幾乎和在DMF達(dá)到的一樣。當(dāng)考慮到在NMP中比在DMF中生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性增加(表5)時(shí)，至少在這個(gè)應(yīng)用中，NMP是理想的溶劑。
表8從生長(zhǎng)激素模型肽中生成二酮哌嗪蛋-脯-苯丙-脯-蘇-異亮-NH2反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))40℃試劑 2 4 6 240.33M HOAc/NMP 17% 32% 47% 99%0.33M HOAc/DMSO 4% 6% 27% 33%0.33M HOAc/DMF 14% 47% 63% 98%
苯丙-脯-蘇-異亮-NH2反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))，40℃試劑 2 4 6 240.33M HOAc/NMP 7% 12% 23% 78%0.33M HOAc/DMSO 4% 7% 11% 27%0.33M HOAc/DMF 15% 26% 37% 88%B.水相斷裂條件在1M磷酸鈉緩沖溶液中溶解1毫克肽，PH8，達(dá)到蛋-脯-甘-甘-NH2最佳水相斷裂。為了加速斷裂反應(yīng)，在55℃保溫24小時(shí)。用在有機(jī)相斷裂時(shí)同樣的方法測(cè)定斷裂的程度。
下列表9到12，提供了在一緩沖水溶液介質(zhì)中，使用酸性，中性或堿性條件得到的結(jié)果。
表9記載用肽蛋-脯-甘-甘-NH2作基質(zhì)，在PH7.0時(shí)斷裂反應(yīng)的收率?？疾炝藘煞N不同緩沖鹽類和濃度下的三個(gè)不同溫度的影響。結(jié)果表明，磷酸鹽緩沖液比乙酸鹽好，1.0M磷酸鹽濃度得到的結(jié)果最好。
表9不同的緩沖體系及濃度對(duì)從蛋-脯-甘-甘-NH2生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影響，PH＝7.0生成量＊緩沖溶液 100℃ 40℃ 25℃0.1M 磷酸鈉 100% 70% 14%1.0M 磷酸鈉 100% 93% 25%0.1M 乙酸鈉 55% 12% 1%1.0M 乙酸鈉 86% 35% 4%
＊在100℃下蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪生成情況，是在兩小時(shí)時(shí)測(cè)量的;40℃和25℃下的形成情況是在72小時(shí)時(shí)測(cè)量的。
表10記載了40℃下在緩沖水介質(zhì)中，PH對(duì)由蛋-脯-甘-甘-NH2生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影響。磷酸鈉用作緩沖鹽。結(jié)果表明，PH值在堿性范圍將是更好一些。因?yàn)樵诟逷H值時(shí)，會(huì)加速不希望有的付反應(yīng)，例如脫酰胺基作用和脫硫作用，故PH在8左右是適宜的。
表10在1.0M磷酸鈉溶液中，PH值對(duì)蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪生成的影響，40℃時(shí)間(小時(shí))4 24 48 72pH3 1% 30% 31% 9%pH5 2% 9% 18% 25%pH7 18% 29% 89% 92%pH8 27% 80% 97% 100%pH9 30% 86% 98% 100%表11列出了在PH8和40℃時(shí)，不同緩沖鹽溶液對(duì)由蛋-脯-甘-甘-NH2斷裂的收率的影響情況。磷酸鹽是較好的緩沖劑。
表11不同緩沖鹽對(duì)PH＝8和40℃時(shí)從蛋-脯-甘-甘-NH2生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影響時(shí)間(小時(shí))緩沖劑 2 241.0M 磷酸鈉 22% 86%1.0M 亞磷酸鈉 6% 40%1.0M 亞硫酸鈉 6% 35%
表12列出了溫度對(duì)一系列肽生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影響結(jié)果，這幾種肽中只是從N-端起第三個(gè)殘基側(cè)鏈彼此有所不同。像前面表3中列出的情況一樣，十分清楚，在第三個(gè)殘基位置上增加位阻，將減慢反應(yīng)。但是，除了兩種情況例外，其他全都有相當(dāng)?shù)臄嗔寻l(fā)生。對(duì)于所有四種試驗(yàn)的四肽，溫度從40℃增加到55℃，斷裂的速度和程度都有明顯增加。
表12溫度效應(yīng)在1.0M磷酸鹽緩沖溶液和PH8時(shí)，在兩種溫度下蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪生成情況反應(yīng)時(shí)間(小時(shí)) 反應(yīng)時(shí)間(小時(shí))40℃ 55℃肽a2 24 48 2 24 48MPGG-NH216% 84% 96% 47% 100% 100%MPTG-NH22% 18% 26% 8% 47% 75%MPPG-NH20% 12% 19% 6% 30% 53%MPFG-NH20% 9% 14% 4% 28% 57%a MPGG-NH2＝蛋-脯-甘-甘-NH2MPTG-NH2＝蛋-脯-蘇-甘-NH2MPPG-NH2＝蛋-脯-脯-甘-NH2MPFG-NH2＝蛋-脯-苯丙-甘-NH2
對(duì)肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行有代表性的取樣，用前述斷裂方法得到產(chǎn)物，該產(chǎn)物用高效陰離子交換和反相色譜分析。陰離子交換色譜是在MOnoQ柱上，在0.05M三羥甲基氨基甲烷(Tris)，含有30%乙腈的PH8的緩沖溶液中進(jìn)行的，用氯化鈉溶液線性梯度淋洗。反相分析在Zorbax C8，150
孔徑，柱子中進(jìn)行，使用在0.1M磷酸銨中乙腈梯度淋洗，溫度為45℃，PH＝7.0。
勘誤表
權(quán)利要求
1.從結(jié)構(gòu)式為H-X-脯-肽的化合物生產(chǎn)一種含有氨基酸鏈的化合物的方法，該氨基酸鏈能確切表示一種具有生物活性的肽或蛋白質(zhì)，式中X是一種天然存在的氨基酸殘基，肽是一個(gè)有確定生物活性的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸鏈；其特征在于把H-X-脯-肽置于a)一種質(zhì)子惰性溶劑中，弱酸性條件下，或b)一種緩沖水介質(zhì)中，酸性，中性或堿性條件下，H-X-脯部分變成二酮哌嗪，伴隨發(fā)生斷裂并釋放出肽。
2.權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于質(zhì)子惰性溶劑是N-甲基吡咯烷酮，N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜，甲酰胺或六甲基磷酰胺。
3.權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于質(zhì)子惰性溶劑是N-甲基吡咯烷酮。
4.權(quán)利要求
1，2或3所述方法，其特征在于，加入乙酸，磷酸，亞磷酸，硫酸，三氟乙酸，甲酸，順丁烯二酸，酒石酸或甘氨酸，產(chǎn)生弱酸性條件。
5.權(quán)利要求
4所述方法，其特征在于酸是乙酸。
6.權(quán)利要求
1到5中任一項(xiàng)所述方法，其特征在于，反應(yīng)在大約15℃到大約50℃溫度下進(jìn)行。
7.權(quán)利要求
1到6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于酸的濃度是大約0.1M到大約1M。
8.權(quán)利要求
7所述方法，其特征在于使用乙酸，在濃度大約為0.33M時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。
9.權(quán)利要求
1所述方法，其特征在于將H-X-脯-肽置于中性或堿性的緩沖水解質(zhì)中反應(yīng)。
10.權(quán)利要求
9所述方法，其特征在于緩沖鹽是一種磷酸鹽，亞磷酸鹽或亞硫酸鹽。
11.權(quán)利要求
10所述方法，其特征在于，緩沖鹽是一種磷酸鹽，其濃度為大約0.1M到大約2.0M。
12.權(quán)利要求
11所述方法，其特征在于磷酸鹽的濃度是大約0.8M到大約1M。
13.權(quán)利要求
1或9到12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征是在PH值為大約7到大約9時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。
14.權(quán)利要求
13所述方法，其特征是在PH大約為8時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。
15.權(quán)利要求
1或9到13中任一項(xiàng)所述方法，其特征是在溫度為大約25℃到大約60℃時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。
16.權(quán)利要求
1到15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于X是蛋氨酸。
17.權(quán)利要求
1到16中任一項(xiàng)所述方法，其特征在于，肽是氨基酸殘基鏈，它表示胰島素原，人類生長(zhǎng)激素，牛生長(zhǎng)激素，α-干擾素，β-干擾素，γ-干擾素，聯(lián)白細(xì)胞素-1，聯(lián)白細(xì)胞素-2，生長(zhǎng)激素釋放因子，類胰島素生長(zhǎng)因子，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑，蛋白質(zhì)C，或上述任一種的改進(jìn)了生物活性的形式。
18.權(quán)利要求
17所述方法，其特征在于肽是人類生長(zhǎng)激素。
19.權(quán)利要求
17所述方法，其特征在于肽是牛生長(zhǎng)激素。
專利摘要
本發(fā)明是關(guān)于從結(jié)構(gòu)式為H-X-脯-肽的化合物，產(chǎn)生一種具有氨基酸鏈的化合物的方法，該氨基酸鏈表示具有生物活性的肽或蛋白質(zhì)，式中X是一個(gè)天然存在的氨基酸殘基，肽是一個(gè)具有確定生物活性的肽或蛋白質(zhì)的氨基酸鏈，方法包括讓H-X-脯-肽在一定條件下反應(yīng)，在此條件下，H-X-脯-部分形成二酮哌嗪，并隨著斷裂而釋放出肽。
文檔編號(hào)C07K19/00GK86107569SQ86107569
公開日1987年7月8日 申請(qǐng)日期1986年10月28日
發(fā)明者理查德·丹尼斯·迪馬奇, 杰拉爾德·斯蒂芬·布魯克 申請(qǐng)人:伊萊利利公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan