本發(fā)明屬于煙草制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含枯草芽孢桿菌菌株SMXP-58的菌酶混合制劑及其在調(diào)節(jié)煙草薄片質(zhì)量方面中應(yīng)用的專利申請。

背景技術(shù)：

煙草薄片又稱再造煙葉或者均質(zhì)煙葉，是煙草工業(yè)生產(chǎn)中綜合利用和精細加工的產(chǎn)品，主要由煙末、碎片、煙?；虻痛螣熑~加入膠黏劑和其他添加劑等組成。煙草薄片是降焦減害的有效技術(shù)手段之一，它一方面利用了卷煙工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物，另一方面在一定程度上降低了尼古丁和焦油含量，減少和改善了煙草的不良成分。

由于煙草薄片是以煙末、煙梗等煙草廢棄物質(zhì)為原料重新組合成的，因此相比傳統(tǒng)的調(diào)制后煙葉，在煙氣特征、吃味和香氣方面等均有不同程度的差距。國內(nèi)煙草薄片工業(yè)起步較晚，所以薄片性能及使用效果都有待改善。目前在煙草薄片產(chǎn)品品質(zhì)改進方面，以加香、加料處理掩蓋木質(zhì)氣、刺激氣體等處理目的居多，這種改進通常是以經(jīng)驗為出發(fā)點，針對性較差，因而有時效果有限。而卷煙消費者在抽吸時所感知的煙氣成分主要取決于薄片或卷煙產(chǎn)品的化學(xué)成分和物理結(jié)構(gòu)，其中化學(xué)成分的作用更具有決定性。

果膠、淀粉等均是煙草薄片中的主要大分子化學(xué)物質(zhì)成分，其中果膠是構(gòu)成植物細胞壁的主要物質(zhì)，占植物所有多糖的50%以上，在煙梗和煙草薄片中甚至占到總質(zhì)量的1/3以上。果膠對煙草制品的燃燒性以及卷煙的香吃味都有很直接的影響，是燃吸過程中喉部產(chǎn)生尖刺感和不良氣味的主要原因，從而對卷煙品質(zhì)產(chǎn)生副作用；而淀粉含量則與煙葉燃燒性與吸味密切相關(guān)，淀粉降解不完全則顯著制約煙草制品燃燒性，并產(chǎn)生不良氣味，影響整體卷煙品質(zhì)。

由于果膠、淀粉等物質(zhì)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，在自然狀態(tài)下很難降解。針對這一缺陷，開發(fā)利用外源微生物制劑或者酶制劑，加速降解煙草薄片中的果膠以及淀粉等多糖類大分子物質(zhì)，使其生成小分子物質(zhì)，從而進一步參與美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生致香物質(zhì)成分以及致香物質(zhì)前體物，從而有可能較大程度改善煙草薄片的質(zhì)量。而基于這一技術(shù)原理的技術(shù)改進，對卷煙企業(yè)提高卷煙原料整體質(zhì)量、節(jié)約生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟效益等具有廣泛而現(xiàn)實的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在多種菌株選擇基礎(chǔ)上，本發(fā)明目的在于提供一種利用特定枯草芽孢桿菌菌株SMXP-58與淀粉酶和糖化酶所制備的菌酶混合制劑，從而能夠有效降低煙草薄片中果膠和淀粉含量，進而有效改善煙草薄片中的化學(xué)成分，提升煙草原料品質(zhì)。

本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種含枯草芽孢桿菌菌株SMXP-58的菌酶混合制劑，該混合制劑為枯草芽孢桿菌SMXP-58菌株培養(yǎng)液與淀粉酶和糖化酶的復(fù)配物；該混合制劑中，枯草芽孢桿菌SMXP-58的活菌數(shù)為（10~11）×10⁷個/mL，淀粉酶的酶活為500 U/mL，糖化酶的酶活為100 U/mL。

所述枯草芽孢桿菌SMXP-58菌株，屬枯草芽孢桿菌屬（Bacillus），最初是由2013年三門峽產(chǎn)的復(fù)烤煙葉中分離而來，其保藏名稱為：枯草芽孢桿菌 SMXP-58，分類學(xué)名稱為Bacillus subtilis SMXP-58，于2016年3月10日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO：M 2016083；保藏地址為：武漢市武漢大學(xué)。

所述含枯草芽孢桿菌菌株SMXP-58的菌酶混合制劑的制備方法，具體包括如下步驟：

（1）活化菌種，將SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃條件下培養(yǎng)1~2d；

（2）制備種子液，刮取步驟（1）中所培養(yǎng)的菌體，接種于液體LB培養(yǎng)基中，30℃、150 rpm條件于搖床過夜培養(yǎng)；

（3）擴大培養(yǎng)，將步驟（2）中種子液按1%的體積比轉(zhuǎn)接液體LB培養(yǎng)基，30℃、150 rpm條件于培養(yǎng)至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制備菌劑，將步驟（3）中發(fā)酵液3600 rpm離心10min，棄上清夜，然后加入無菌水進行充分懸浮，調(diào)整活菌數(shù)為（10~11）×10⁷個/mL左右；

（5）制備菌酶混合制劑，將淀粉酶與糖化酶加入（4）中的菌劑中，調(diào)節(jié)淀粉酶、糖化酶的酶活分別為500 U/mL、100 U/mL，混合均勻后即可。

所述含枯草芽孢桿菌菌株SMXP-58的菌酶混合制劑在煙草薄片中的應(yīng)用，用于降解煙草薄片中果膠和淀粉，使用方法具體為：

造紙法煙草薄片制備過程中，按煙草薄片浸提液1~3%的質(zhì)量比例，將制備好的菌酶混合劑制均勻噴灑于浸提液中，調(diào)節(jié)浸提液pH=5.5~6.5，25℃~35℃條件下作用6~10 h，優(yōu)選條件下，調(diào)節(jié)浸提液pH=6.0，30℃條件下作用8 h；然后按現(xiàn)有技術(shù)將浸提液進行濃縮并涂布于煙草薄片的片基，繼續(xù)制作成煙草薄片即可。

本發(fā)明以煙草薄片中含量較高的果膠與淀粉為作用目標，通過特定菌株篩選和特定生物酶類組合，制備了具有特定降解用途的菌酶混合制劑。初步試驗表明，該菌酶混合制劑能夠在較短時間內(nèi)較好地降低煙草薄片中的果膠與淀粉含量，煙草薄片中果膠的降解率可達30.1%，淀粉降解率可達18%以上，表現(xiàn)出較好地降低煙草薄片中果膠與淀粉含量的技術(shù)效果。

總體而言，本發(fā)明通過特定菌株的篩選與菌酶混合制劑的復(fù)配開發(fā)，設(shè)計了較為簡便的菌酶混合制劑處理煙草薄片的技術(shù)方案，使得本發(fā)明具有：工藝流程較為簡便，處理成本較低，且處理周期較短，可明顯降低煙草薄片中的果膠含量與淀粉含量，并改善煙草薄片品質(zhì)等技術(shù)優(yōu)點，因而在卷煙制造技術(shù)領(lǐng)域具有較好地推廣應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為SMXP-58菌株在油鏡下的形態(tài)圖；

圖2為基于SMXP-58菌株 16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹；

圖3為測量淀粉含量時濃度標準曲線；

圖4為OD₅₇₅值隨菌酶混合制劑處理時間變化結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進一步解釋說明，在介紹具體實施例前就下述實施例中涉及部分物料情況簡要介紹如下。

煙草物料：相關(guān)煙草薄片在河南中煙工業(yè)有限責任公司所屬的某煙草薄片生產(chǎn)線（現(xiàn)有生產(chǎn)線主要制備金薄牌煙草薄片）上進行；

實驗試劑：

淀粉酶與糖化酶均購自泰安信得利生物工程有限公司，酶活分別為600 U/mg、200 U/mg。

實施例1

本實施例僅就SMXP-58菌株的篩選及鑒定過程簡要介紹如下。

SMXP-58菌株，最初是由2013年三門峽產(chǎn)的復(fù)烤煙葉中分離而來。其菌落在NA培養(yǎng)平板上圓形或不規(guī)則，呈乳白色，沒有光澤，菌落表面平整或出現(xiàn)不規(guī)則褶皺凸起，表面粗糙不光滑，菌落不透明。油鏡下形態(tài)如圖1所示，可觀察到細菌分布均勻，為桿狀，很少呈鏈狀，大小為(0.7~0.9)×(1.6 ~2)μm。

采用16S rDNA基因片段為通用引物，對該菌株進行PCR以及克隆測序，可獲得1416bp序列，進行系統(tǒng)進化分析，顯示菌株SMXP-58與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性高達99%，即，與枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近（如圖2所示）。

最終，鑒定認為SMXP-58菌株屬芽孢桿菌屬（Bacillus），其分類學(xué)名稱為Bacillus subtilis SMXP-58，于2016年3月10日保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO：M 2016083。

初步研究表明，該菌株在降解天然煙草果膠含量方面具有一定用途，但是否可以用于降解煙草薄片原料中果膠，及是否可以與其他特定生物酶混合使用則缺乏進一步研究。

實施例2

在實施例1篩選所得特定SMXP-58菌株基礎(chǔ)上，發(fā)明人制備了特定的菌酶混合制劑，具體制備過程如下所述。

（1）活化菌種：將SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃條件下于生化氣候箱中培養(yǎng)1d；

（2）制備種子液：在超凈工作臺中刮取步驟（1）中所培養(yǎng)的菌體，接種于含有5mL液體LB培養(yǎng)基的18×180的試管中，30℃、150 rpm條件于搖床過夜培養(yǎng)；

（3）擴大培養(yǎng)：將步驟（2）中種子液按1 mL菌懸液/100 mL LB培養(yǎng)基（1%的體積比）轉(zhuǎn)接于含100mL液體LB培養(yǎng)基的滅菌的250mL錐形瓶中，30℃、150 rpm條件于培養(yǎng)至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制備菌劑：將步驟（3）中菌液3600 rpm離心10min，棄上清夜，然后加入無菌水充分懸浮，調(diào)整活菌數(shù)為10×10⁷個/mL左右；

（5）制備菌酶混合制劑，將淀粉酶與糖化酶加入（4）中的菌劑中，調(diào)節(jié)淀粉酶、糖化酶的酶活分別為500 U/mL、100 U/mL，混合均勻后即可。

實施例3

在利用實施例2中菌酶混合制劑時，為確定其對于煙草薄片中果膠和淀粉含量的具體效果，發(fā)明人進行了具體實驗，具體過程為：

造紙法薄片生產(chǎn)工藝中，按煙草薄片水溶性浸提液2%的質(zhì)量比例，在5 L浸提液中加入100 mL實施例2所制備菌酶混合制劑，混合均勻，平均分成多份，以便進一步實驗。

為獲得菌酶混合制劑的最佳作用條件，分別以菌酶混合制劑的作用溫度、pH值，以及作用時間為影響因素，進了3因素3水平正交試驗設(shè)計（水平因素表（L9(3)³）），具體設(shè)計如下表所示，其中pH值采用檸檬酸以及檸檬酸鉀調(diào)節(jié)。

表1 正交試驗因素水平L₉(3³)：

注：A為作用溫度；B為pH值；C為作用時間。

依據(jù)上述3因素水平設(shè)計，進行了三因素三水平正交實驗設(shè)計（表2），

表2正交試驗設(shè)計L₉(3³)：

注：A為作用溫度；B為pH值；C為作用時間；同時，設(shè)置空白對照組CK（以等量蒸餾水替代菌酶混合制劑）。

檢測評價：

處理完成后，按現(xiàn)有生產(chǎn)線，將各處理組浸提液以及對照組浸提液進行濃縮并涂布于供試煙草薄片的片基，制作成標準煙草薄片（每份煙草薄片的質(zhì)量均為500 g）。對煙草薄片中的果膠含量進行測定，并換算果膠降解率，以確定最優(yōu)菌酶混合制劑的作用條件；之后檢測優(yōu)化條件處理下（果膠含量較低情況下）煙草薄片中的淀粉含量與淀粉降解率。進一步地，分別將空白對照組和處理后薄片按一定比例添加入配方煙絲中，評價其感官質(zhì)量變化情況。

（一）果膠含量的測定

采用咔唑硫酸分光光度測定法對煙草薄片中的果膠含量進行測定；測定時首先繪制標準曲線，然后依據(jù)測定結(jié)果換算獲得果膠含量變化情況，具體步驟為：

1、制作標準曲線

（1）準確稱取分析純半乳糖醛酸（G.A.）0.0500g，用蒸餾水溶解后定容于50mL容量瓶中(濃度1000mg/L)；

（2）于6個50mL容最瓶中分別吸取此液0、1、2、3、4、5mL，稀釋至刻度(濃度0~100mg/L)；

（3）分別吸取不同濃度的標準稀釋液1mL于6支試管(20mm×150mm)中，然后各加人濃硫酸6mL，用自來水邊加邊冷卻至室溫；

（4）然后各加人0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑無水乙醇溶液，搖勻；

（5）在室溫下暗處放置1.5h，在540nm波長下用1cm比色皿，以試劑空白（G.A.濃度為0的稀釋液）作參比，測定吸光度(A)，繪制A一C標準曲線。

、樣品測定

（1）準確稱取0.050 g煙草薄片于50mL燒杯中；

（2）加入10mL、0.5mol/L硫酸、15mL無菌水，攪勻，在75℃水浴中水解15min，冷卻至室溫后定容于50 mL容量瓶中；

（3）準確移取5.0 mL該液于另一50 mL容量瓶，稀釋至刻度，吸取10倍稀釋液1mL于6支試管(20mm×150mm)中，然后各加人濃硫酸6mL，用自來水邊加邊冷卻至室溫，

（4）然后各加入0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑無水乙醇溶液，搖勻；

（5）在室溫下暗處放置1.5 h，在540nm波長下用1cm比色皿，以試劑空白（G.A.濃度為0的稀釋液）作參比，測定吸光度(A)，再根據(jù)標準曲線計算其濃度。

、計算

計算公式為，G.A.%=[C×50/(5×50)]÷[W×10⁶]×100%；

式中：C為從標準曲線查得的所測果膠液中G.A.的濃度(mg/L)，W為樣品質(zhì)量(g)；

根據(jù)不同煙草薄片樣品中G.A.的含量不同，可計算出相應(yīng)的果膠含量，并參比對照樣品進行果膠降解率的換算，并進一步進行極差分析。具體結(jié)果如下表3所示。

表3果膠降解率的極差分析：

注：A為作用溫度；B為pH值；C為作用時間。

對上表分析可以看出，由于在一定范圍內(nèi)，果膠降解率越高越好，而k₂＞k₃＞k₁，因此選擇A₂為因素A（A代表作用溫度）的優(yōu)水平，同理B、C（分別代表pH值、作用時間）的優(yōu)水平分別為B₂、C₂，所以最優(yōu)水平組合為A₂B₂C₂，即作用溫度為30℃，pH值為6.0，作用時間為8 h，此時水溶性浸提液中果膠的降解率為30.1%。

綜上所述，將菌酶混合制劑施加在造紙法薄片的水溶性浸提液中，在溫度為30℃，浸提液pH值為6.0的條件下作用8 h，之后對浸提液進行濃縮并涂布于煙草薄片的片基，制作成標準煙草薄片，與正常煙草薄片相比，處理后煙草薄片中果膠降解率可達30.1%。

（二）淀粉含量的測定

將菌酶混合制劑施加在造紙法薄片的水溶性浸提液中，在溫度為30℃，浸提液pH值為6.0的條件下作用8 h，之后對浸提液進行濃縮并涂布于煙草薄片的片基，制作成標準煙草薄片。采用高氯酸法測定薄片中的淀粉含量，并換算淀粉降解率，具體步驟如下：

（1）溶液配制

碘-碘化鉀試劑：稱取4 g碘化鉀和0.4 g碘，放入小燒杯中，加少許蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，于冰箱避光保存；

淀粉儲備液：稱取0.5 g 可溶性淀粉，加入100 mL蒸餾水，攪拌下加熱至沸，保持5min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，于4℃冰箱保存。

（2）標準曲線的繪制

準確吸取1 mg/mL淀粉標準溶液各0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，加入2.5 mL高氯酸（40%）靜置10 min，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻；

各取10 mL加入1 mL碘化鉀-碘試劑，于575 nm處測定各淀粉標準溶液的吸光度；

以吸光度對淀粉濃度作圖（圖4）。

由標準曲線圖4可以看出，淀粉濃度在0~0.06 mg/mL之間時，淀粉濃度與吸光度具有線性關(guān)系；其回歸方程為：

Y=0.0165X-0.0109.(R2=0.9993)；

式中：Y-吸光度；X-淀粉濃度（mg/mL）；測定線性范圍：0~0.06 mg/mL。

（3）煙草中淀粉含量測定步驟

將煙草樣品（煙草薄片）放入40℃烘箱中烘干5h，用植物粉碎機進行粉碎，過40目篩，裝入磨口棕色廣口瓶中，待用；

準確稱取0.5 g煙粉（粉碎后煙草薄片），加入25 mL的80%飽和乙醇-NaCL溶液，85℃水浴30 min；

布氏漏斗進行抽濾，將殘渣轉(zhuǎn)移至25 mL錐形瓶中；

加入40%高氯酸10 mL，準確提取10 min；

布氏漏斗抽濾，充分洗滌殘渣，將濾液收集，定容至250 mL；

取10 mL煙樣淀粉樣品液，加入1 mL碘-碘化鉀溶液，以空白(10 mL蒸餾水+1 mL碘-碘化鉀溶液，下同)為參比，于575 nm處測定樣品液的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品的淀粉含量（圖4）。

（4）分別檢測處理2、4、6、8 h的樣品OD₅₇₅值，換算各處理時間樣品淀粉含量，結(jié)果顯示，經(jīng)菌酶混合制劑處理后薄片中的淀粉明顯降解，處理8 h后降解率可達18.3%。

（三）感官質(zhì)量評價

將經(jīng)過菌酶混合制劑處理后制成的薄片按照20%的質(zhì)量比例添加入標準卷煙中，經(jīng)恒溫恒濕箱平衡后，由專業(yè)評委對香氣質(zhì)（A）、香氣量（B）、濃度（C）、柔細度（D）、余味（E）、雜氣（F）、刺激度（G）等指標進行評定，每項指標均按9分制打分，感官評吸總分為各分項得分總和。

評價結(jié)果如下表4所示。

表4 感官評價結(jié)果：

。

從表4中數(shù)據(jù)可以看出，與對照樣品相比，處理后煙絲香氣量、香氣質(zhì)有所提升，柔細度、雜氣、刺激明顯改善，總得分提高1.01分，整體感官質(zhì)量提升較為明顯。

總體而言，本申請中篩選獲得的SMXP-58菌株，其來源于煙葉中原有菌株，當利用其與淀粉酶、糖化酶復(fù)配制備菌酶混合制劑處理煙草薄片時，在確保對于煙草薄片中果膠、淀粉降解同時，不具有明顯的副作用，可較為有效的促進煙草薄片中大分子物質(zhì)降解形成各類有利于提高卷煙原料品質(zhì)的小分子物質(zhì)，進而達到降低卷煙煙氣中的有害成分，改善卷煙原料內(nèi)在品質(zhì)的目的。