舉出相當(dāng)于本 組合物10~500g的量。
[0160] 另外，如上所述，通過(guò)向以活菌的狀態(tài)含有雌馬酚產(chǎn)生微生物的組合物中添加上 述(B)，可以穩(wěn)定地保持雌馬酚產(chǎn)生微生物的雌馬酚產(chǎn)生能力，即使長(zhǎng)期保存，也能夠抑制 雌馬酚產(chǎn)生微生物的雌馬酚產(chǎn)生能力的喪失。因此，本發(fā)明進(jìn)而也提供了維持雌馬酚產(chǎn)生 微生物的雌馬酚產(chǎn)生能力的方法，其特征在于，向含有活菌狀態(tài)的雌馬酚產(chǎn)生微生物的組 合物中添加選自抗壞血酸、其衍生物及它們的鹽中的至少1種。雌馬酚產(chǎn)生能力可以按照下 述的實(shí)施例中記載的方法測(cè)定。對(duì)于該保存穩(wěn)定化方法的【具體實(shí)施方式】，可以引用上述關(guān) 于含有雌馬酚產(chǎn)生微生物的組合物所記載的內(nèi)容。實(shí)施例
[0161] 以下，基于實(shí)施例等詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于所述的實(shí)施例。
[0162] 以下的實(shí)施例及比較例中使用的大豆粉末通過(guò)以下方法制備。
[0163] 大豆粉末溶液的制備
[0164] 剝皮，平均分成兩份，然后對(duì)脫皮大豆進(jìn)行蒸煮處理。蒸煮處理是向脫皮大豆連續(xù) 供給蒸汽直到達(dá)到100 °c的溫度，從達(dá)到100 °C的時(shí)刻開始在100 °C下保持140秒鐘。接下來(lái)， 將蒸煮處理后的大豆通過(guò)輥碾機(jī)的輥之間，成為薄片狀。之后，在80°C下對(duì)薄片狀的大豆進(jìn) 行熱風(fēng)干燥，將其干燥至水分含量為3~6 %左右，用風(fēng)動(dòng)磨頭將其粉碎，由此得到大豆粉 末。進(jìn)行采用風(fēng)動(dòng)磨頭的粉碎，使直徑150μπι以上的粉碎粒子為10%以下。
[0165] 接著，向溶解了適量的碳酸氫鈉及檸檬酸三鈉的水中添加規(guī)定量的上述得到的大 豆粉末，使其分散溶解，膨潤(rùn)15分鐘以上。接著，在95°C下加熱所得溶液10分鐘，提取大豆粉 末中的水溶性成分，進(jìn)而使大豆粉末中含有的L0X、胰蛋白酶抑制劑等酶失活。加熱后，保持 80°C以上的溫度并添加適量的檸檬酸，使pH回到中性。之后，使用均質(zhì)機(jī)(GAULIN公司制 LAB40)，在200 - lOOOkgf/cm2范圍的條件下進(jìn)行均質(zhì)化處理，由此制備大豆粉末溶液(換算 成干燥重量則含有14重量％的大豆粉末）。
[0166] 實(shí)施例1:利用第1法的發(fā)酵大豆食品的制備及發(fā)酵大豆食品的評(píng)價(jià)
[0167] 1.發(fā)酵大豆食品的制備
[0168] 使用具有雌馬酚產(chǎn)生能力的格氏乳球菌(乳球菌20 - 92株，F(xiàn)ERM BP-10036號(hào)）， 在以下的條件下，進(jìn)行母發(fā)酵劑的制備、生產(chǎn)用發(fā)酵劑的制備、主發(fā)酵、及向容器中的填充。
[0169] <母發(fā)酵劑的制備>
[0170] 對(duì)100mL含有80重量％大豆粉末溶液（以干燥重量計(jì)含有14%大豆粉末）、0.1重 量％葡萄糖、0.1重量％L-精氨酸、余量為精制水的溶液(pH 7.48)進(jìn)行高壓釜?dú)⒕?21 °C，15分鐘），制備母發(fā)酵劑培養(yǎng)基。在該發(fā)酵劑培養(yǎng)基中接種乳球菌20 - 92株的種菌，使用 Gas Pack在37°C下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)96小時(shí)，由此制備母發(fā)酵劑(pH6.64)。
[0171] <生產(chǎn)用發(fā)酵劑的制備>
[0172] 對(duì)5L含有80重量％大豆粉末溶液（以干燥重量計(jì)含有14%的大豆粉末）、0.1重 量％葡萄糖、0.1重量％L-精氨酸、余量為精制水的溶液(pH 7.48)進(jìn)行高壓釜?dú)⒕?21 °C，15分鐘），制備生產(chǎn)用發(fā)酵劑培養(yǎng)基。在該發(fā)酵劑培養(yǎng)基中接種上述得到的母發(fā)酵劑并 使其為1容量％，在37°C、需氧條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)15小時(shí)，由此得到生產(chǎn)用發(fā)酵劑 (PH6.72)。
[0173] <主發(fā)酵>
[0174] 在95 °C下，使用雙管式殺菌機(jī)，對(duì)200L含有50重量％大豆粉末溶液（以干燥重量計(jì) 含有14%的大豆粉末）、6重量％胡蘿卜汁（宮崎縣農(nóng)協(xié)果汁）、6重量％南瓜糊（長(zhǎng)野三洋食 品）、余量為精制水的溶液(pH 6.78)殺菌30秒鐘，制備主發(fā)酵用培養(yǎng)基。在殺菌后回收的主 發(fā)酵用培養(yǎng)基中接種4L上述得到的生產(chǎn)用發(fā)酵劑，在37°C、需氧條件下進(jìn)行靜置培養(yǎng)15小 時(shí)，由此得到發(fā)酵大豆液(pH4.56)。
[0175] <副原料混合、向容器中的填充>
[0176] 在95 °C下，使用雙管式殺菌機(jī)，對(duì)800L含有65重量％大豆粉末溶液（以干燥重量計(jì) 含有14%的大豆粉末）、7.4重量％砂糖、1.0重量％膠凝劑制劑FG2524(新田明膠制）、0.8重 量％葡糖酸、〇. 4重量％香料、0.1重量％ L-抗壞血酸、余量為精制水的溶液進(jìn)行殺菌30秒 鐘，得到副原料溶液。在37~40 °C下，將80重量份上述副原料溶液和20重量份上述得到的發(fā) 酵大豆液混合。維持混合液的溫度，向聚乙烯杯（總?cè)萘?30ml、口徑7 Imm)中無(wú)菌地填充 I OOg溶液，用鋁蓋密封。將填充物放入5 °C的冰箱中，使其冷卻固化，得到含有格氏乳球菌活 菌的發(fā)酵大豆食品。
[0177] 2.各種評(píng)價(jià)
[0178] 將上述得到的放入容器的發(fā)酵大豆食品在HTC下保存3周。在剛制備后、1周后、2 周后及3周后測(cè)定發(fā)酵大豆食品的pH，進(jìn)而采用以下的方法評(píng)價(jià)發(fā)酵大豆食品中含有的格 氏乳球菌的菌數(shù)及發(fā)酵大豆食品中含有的格氏乳球菌有無(wú)雌馬酚產(chǎn)生能力。另外，對(duì)于上 述制備的母發(fā)酵劑、生產(chǎn)用發(fā)酵劑及主發(fā)酵后的發(fā)酵物，也同樣地測(cè)定格氏乳球菌的菌數(shù) 及各自中含有的格氏乳球菌的雌馬酚產(chǎn)生能力。
[0179] <格氏乳球菌的菌數(shù)的測(cè)定>
[0180] 格氏乳球菌的活菌數(shù)的測(cè)定如下進(jìn)行:使用加入了 BCP的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（日 水制藥株式會(huì)社制)在37°C下進(jìn)行傾注培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)量生長(zhǎng)的菌落數(shù)。
[0181] <格氏乳球菌的雌馬酚產(chǎn)生能力有無(wú)的測(cè)定>
[0182 ]向5ml以I Oμg/ml的濃度含有黃豆苷原的改良GAM肉湯（日水制藥株式會(huì)社制）中添 加200μ1發(fā)酵大豆食品，用氣體容器在37°C下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)96小時(shí)。接著，將得到的培養(yǎng)液 進(jìn)行HPLC分析，對(duì)培養(yǎng)液中的雌馬酚量進(jìn)行定量。利用HPLC的分析如下實(shí)施。首先，向5.Oml 乙酸乙酯中加入0.5ml培養(yǎng)液進(jìn)行浸透提取，將得到的提取液在3000rpm下離心10分鐘，利 用離心蒸發(fā)器來(lái)蒸發(fā)上清液，從而對(duì)溶劑進(jìn)行減壓干燥。接下來(lái)，將得到的固體用1.0ml溶 劑(流動(dòng)相A/流動(dòng)相B = 50/50)再溶解，用作HPLC的樣品。HPLC的分析使用D7000系列（日立 制作所制），色譜柱使用Capcell Pack UGL205ym4.6? X250mm(資生堂制）。對(duì)于流動(dòng)相，使 用以8:2的比例混合有0.05%磷酸緩沖液(含有EDTA)和乙酸乙酯一甲醇（1:10)所得的溶液 作為流動(dòng)相A，以含有2%乙酸乙酯的甲醇作為流動(dòng)相B。使用梯度法，設(shè)定流速為1.0 ml/分 鐘。使用SH) - IOAVP UV-VIS檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm和280nm〇
[0183] <格氏乳球菌的菌數(shù)及雌馬酚產(chǎn)生能力的測(cè)定結(jié)果>
[0184] 結(jié)果示于表1。該結(jié)果表明如果母發(fā)酵劑、生產(chǎn)用發(fā)酵劑的pH為5以上，則即使主發(fā) 酵后的發(fā)酵物、發(fā)酵大豆食品的PH為4.6以下，也能夠制備含有保持了雌馬酚產(chǎn)生能力的格 氏乳球菌的發(fā)酵大豆食品。需要說(shuō)明的是，也確認(rèn)了發(fā)酵大豆食品中的格氏乳球菌的菌數(shù) 本身很少受到PH或雌馬酚產(chǎn)生能力的影響，可以長(zhǎng)期保持恒定。
[0185] [表 1]
Luib/J 5H贓與酚廣王ME刀忮照n = 2頭施，儀倆認(rèn)一T共仴贓與酚廣王ME刀?？獾栋耍?兩個(gè)均確認(rèn)了雌馬酚產(chǎn)生能力時(shí)判定為〇。
[0188] <呈味的評(píng)價(jià)>
[0189] 剛制備后的發(fā)酵大豆食品及保存3周后的發(fā)酵大豆食品的大豆味道均良好、無(wú)異 樣口味無(wú)異樣氣味，作為食品是理想的。
[0190] 比較例1:發(fā)酵大豆食品的制備及發(fā)酵大豆食品的評(píng)價(jià)
[0191] 在母發(fā)酵劑的制備中，除了將葡萄糖添加量由0.1重量％變?yōu)?.0重量％之外，在 與實(shí)施例1相同的條件下，進(jìn)行母發(fā)酵劑的制備、生產(chǎn)用發(fā)酵劑的制備及主發(fā)酵，制備發(fā)酵 大豆食品（比較例1 一 1)。
[0192] 進(jìn)而，在生產(chǎn)用發(fā)酵劑的制備中，除了將葡萄糖添加量由0.1重量％變?yōu)?.0重 量％之外，在與實(shí)施例1相同的條件下，進(jìn)行母發(fā)酵劑的制備、生產(chǎn)用發(fā)酵劑的制備及主發(fā) 酵，制備發(fā)酵大豆食品（比較例1 一 2)。
[0193] 用與實(shí)施例1同樣的方法評(píng)價(jià)比較例1 一 1及1 一 2的發(fā)酵大豆食品的pH、格氏乳球 菌的菌數(shù)及雌馬酚產(chǎn)生能力的有無(wú)。另外，對(duì)于母發(fā)酵劑、生產(chǎn)用發(fā)酵劑及主發(fā)酵液，也同 樣地測(cè)定格氏乳球菌的菌數(shù)、雌馬酚產(chǎn)生能力的有無(wú)。
[0194] 結(jié)果示于表2。在母發(fā)酵劑制備中使用pH降低的培養(yǎng)基的比較例1一1中，雖然沒(méi)有 觀察到格氏乳球菌的菌數(shù)的差異，但雌馬酚產(chǎn)生能力喪失。在隨后的生產(chǎn)用發(fā)酵劑、主發(fā)酵 液制備、發(fā)酵大豆食品制備中，雖然也沒(méi)有觀察到在菌數(shù)、PH及感官方面與實(shí)施例1有顯著 差異，但雌馬酚產(chǎn)生能力沒(méi)有恢復(fù)。另外，在生產(chǎn)用發(fā)酵劑制備中使用PH降低的培養(yǎng)基的比 較例1 一 1中，雖然也沒(méi)有觀察到格氏乳球菌的菌數(shù)有差異，但雌馬酚產(chǎn)生能力喪失。在隨后 的主發(fā)酵、發(fā)酵大豆食品制備中，雖然也沒(méi)有觀察到在菌數(shù)、PH及感官方面有很大差異，但 雌馬酚產(chǎn)生能力沒(méi)有恢復(fù)。
[0195] [表 2]
[0197] *1雌馬酚產(chǎn)生能力按照n = 2實(shí)施，僅確認(rèn)一個(gè)具有雌馬酚產(chǎn)生能力時(shí)判定為Λ， 兩個(gè)均確認(rèn)了雌馬酚產(chǎn)生能力時(shí)判定為?，兩個(gè)均未確認(rèn)到雌馬酚產(chǎn)生能力時(shí)判定為X。
[0198] 實(shí)施例2:利用第2法的發(fā)酵乳的制備及發(fā)酵乳的評(píng)價(jià)
[0199] 1.發(fā)酵乳的制備
[0200] 使用具有雌馬酚產(chǎn)生能力的格氏乳球菌(乳球菌20 - 92株，F(xiàn)ERM BP-10036號(hào)）， 在以下的條件下，進(jìn)行母發(fā)酵劑的制備、生產(chǎn)用發(fā)酵劑的制備、主發(fā)酵及向容器中的填充。
[0201] <母發(fā)酵劑的制備>
[0202] 將500mL含有10重量％脫脂奶粉、6.67重量％新鮮奶油、0.1重量％酵母提取物 ("SK酵母提取物Hi - K"，日本制紙化學(xué)株式會(huì)社）、0.025重量％大豆胚軸提取物（"Soya Flavone HG"，不二制油株式會(huì)社;大豆胚軸提取物中的黃豆苷原類的含量約37重量％)、余 量為精制水的溶液(pH 6.14)進(jìn)行高壓釜?dú)⒕?15°C，15分鐘），制備母發(fā)酵劑培養(yǎng)基。在該 發(fā)酵劑培養(yǎng)基中接種乳球菌20 - 92株的種菌，使用Gas Pack在37°C下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)24小 時(shí)，由此制備母發(fā)酵劑。
[0203] <生產(chǎn)用發(fā)酵劑的制備>
[0204] 將IOL含有10重量％脫脂奶粉、6.67重量％新鮮奶油、0.1重量％酵母提取物（"SK 酵母提取物Hi - K"、日本制紙化學(xué)株式會(huì)社）、0.025重量％大豆胚軸提取物（"Soya Flavone HG"，不二制油株式會(huì)社）、余量為精制水的溶液進(jìn)行UHT(超高溫(Ultra High Temperature))殺菌（140 °C，4秒鐘），制備生產(chǎn)用發(fā)酵劑培養(yǎng)基。在UHT殺菌后回收的生產(chǎn)用 發(fā)酵劑培養(yǎng)基中接種上述得到的母發(fā)酵劑并使其為lv/v%，在37°C下進(jìn)行需氧培養(yǎng)24小 時(shí)，由此得到生產(chǎn)用發(fā)酵劑。
[0205] <主發(fā)酵>
[0206] 將IOL含有10重量％脫脂奶粉、6.67重量％新鮮奶油、0.1重量％酵母提取物（"SK 酵母提取物Hi - K"，日本制紙化學(xué)株式會(huì)社）、0.025重量％大豆胚軸提取物（"Soya Flavone HG"，不二制油株式會(huì)社）、余量為精制水的溶液進(jìn)行UHT(Ultra High Temperature)殺菌（140 °C，4秒鐘），制備主發(fā)酵用培養(yǎng)基。在UHT殺菌后回收的主發(fā)酵用培 養(yǎng)基中接種上述得到的生產(chǎn)用發(fā)酵劑并使其為lv/V%，在37°C下進(jìn)行需氧培養(yǎng)24小時(shí)，由 此得到發(fā)酵乳。
[0207] <向容器中的填充>
[0208] 將通過(guò)上述主發(fā)酵得到的發(fā)酵乳無(wú)菌地裝入已滅菌的容量為600mL的容器中，進(jìn) 而向容器內(nèi)無(wú)菌地添加規(guī)定量的乳酸，混合后密封容器。
[0209] 2.發(fā)酵乳中含有的格氏乳球菌的雌馬酚產(chǎn)生能