固體發(fā)酵法制備富含大豆抗毒素的豆粉及功能性大豆蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豆粉及大豆蛋白，特別是涉及一種固體發(fā)酵法制備富含大豆抗毒素的 豆粉及蛋白的方法；屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國人均資源相當(dāng)匱乏，巨大的人口總量和物質(zhì)需求與生態(tài)環(huán)境的有限承載能力 和脆弱性之間的矛盾日益尖銳，且中國人口在急速老齡化。人口老齡化和不合理膳食等原 因可能導(dǎo)致老年性骨質(zhì)疏松、糖尿病及其它相關(guān)疾病高發(fā)，特別是更年期婦女面臨的形勢 更為嚴(yán)峻。由于雌性激素分泌水平下降，處于更年期和絕經(jīng)后的婦女很容易并發(fā)其他的一 些疾病，如乳腺癌、更年期憂郁癥。因此，針對中老年特別是更年期和絕經(jīng)后婦女，合理補(bǔ)充 植物蛋白和植物雌激素來實(shí)現(xiàn)健康保健和疾病的防治尤為重要。
[0003] 大豆蛋白作為食品配料廣泛用于各類體系中。在國際市場上，美國有2500余種食 品需要添加大豆蛋白，日本每年消耗大豆蛋白達(dá)60余萬噸。相對于蛋白質(zhì)的加工功能特 性，人們對食品蛋白的營養(yǎng)和特殊功能性要求逐漸迫切。目前，大豆蛋白食品由于其在慢性 疾病的預(yù)防作用，作為健康食品在歐美市場上正以10%的速度增長，種類增加到了萬余種。 對于特殊人群的不同需要應(yīng)該開發(fā)特定的功能性蛋白產(chǎn)品，如更年期婦女需要食品蛋白質(zhì) 具有如減肥、降血脂、預(yù)防糖尿病、預(yù)防更年期綜合癥和骨質(zhì)疏松的特殊功能。
[0004] 大豆除了含有豐富的植物蛋白，也含有大量具有生物活性的多酚。異黃酮作為大 豆中存在的活性成分，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗氧化活性、抗真菌活性，抗腫瘤、改善心血管功能、提高 機(jī)體免疫力，有效預(yù)防和減輕骨質(zhì)疏松、婦女更年期綜合癥等多種疾病的活性。普遍認(rèn)為， 食品中的異黃酮主要以糖苷的形式存在，幾乎不能為人體細(xì)胞所吸收，生物利用率較低，只 有在人體消化酶（特別是0 -葡萄糖苷酶）作用下轉(zhuǎn)化為苷元形式才能被吸收，表現(xiàn)出較 高的生物活性。近些年發(fā)現(xiàn)，大豆組織在遭遇外界刺激或感染病菌后合成并積累的植物抗 毒素，對人體同樣具有多重生物學(xué)功效，如抗氧化、抗炎、抗癌等，在功能食品和膳食補(bǔ)充劑 領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。異戊烯基異黃酮（Glyceollins)作為大豆在生物或非生物因素 誘導(dǎo)下累積形成的植物抗毒素之一，表現(xiàn)了強(qiáng)大的生物活性功能，抗癌、降脂、降血壓等功 能。研宄發(fā)現(xiàn)，食品級的醬油曲霉等真菌可以誘導(dǎo)異黃酮轉(zhuǎn)化為更高活性的Glyceollin。 此領(lǐng)域的基礎(chǔ)研宄及產(chǎn)品開發(fā)逐漸成為熱點(diǎn)問題。
[0005] 在特殊人群專用保健食品開發(fā)方面，強(qiáng)化大豆蛋白中的生物活性成分含量是行之 有效的方法之一。從國際食品業(yè)的發(fā)展趨勢看，功能性大豆蛋白食品即將成為21世紀(jì)促進(jìn) 人類健康的基本保健食品和主流食品。富含生物活性苷元型異黃酮和Glyceollins的豆 粉及大豆蛋白的開發(fā)將滿足中老年特殊人群對功能性食品的強(qiáng)大市場需求。富含苷元及 Glyceollins的大豆所表現(xiàn)出的抗腫瘤、改善心血管疾病及預(yù)防骨質(zhì)疏松的活性在一定程 度上與大豆中的多酚-蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)，而目前并未存在Glyceollins與蛋白質(zhì)相互 作用的蛋白產(chǎn)品的研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種固體發(fā)酵法制備 富含苷元型異黃酮及Glyceollins的功能性大豆粉及蛋白的方法。
[0007] 本發(fā)明針對目前專用蛋白配料應(yīng)用面窄的現(xiàn)狀，從營養(yǎng)性質(zhì)出發(fā)，擬利用固態(tài)發(fā) 酵等生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，通過合理的設(shè)計(jì)，將大豆中糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為具有更高生物活性的 苷元型異黃酮和Glyceollins，制備富含異黃酮苷元和Glyceollins的豆粉及大豆蛋白配 料。
[0008] 本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種固體發(fā)酵法制備富含大豆抗毒素的豆粉的方法：將米曲霉孢子懸浮液接種于 已浸泡6~12h，去皮、損傷的大豆中；得到染菌的大豆；將染菌的大豆置于培養(yǎng)皿中，封口 膜密封，20~30°C暗箱中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵3~5d，凍干、粉碎，得到富含大豆抗毒素的豆粉。 [0010] 優(yōu)選地，所述曲霉孢子懸浮液按國標(biāo)SB/T10815 - 1999《孢子數(shù)測定法》方法制 備。
[0011] 優(yōu)選地，所述接種是以個作為孢子數(shù)單位，將1. 〇~4.OmL孢子數(shù)分別為IX107~ 5X107個、1X10 8~5X10 8個和1X10 9~5X10 9個的米曲霉孢子懸浮液分別接種于4~ l〇g大豆中。
[0012] 一種固體發(fā)酵法制備富含大豆抗毒素的功能性大豆蛋白的方法：將所述富含大豆 抗毒素的豆粉用正己烷進(jìn)行脫脂，即可得到富含大豆抗毒素的脫脂豆粉；
[0013] 將所得脫脂豆粉過篩，分別以g和mL作為質(zhì)量和體積的單位，將脫脂豆粉按 1:10~1:15的料液比分散于去離子水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)料液的pH值至8. 0~9. 0,室溫 攪拌50~60min，離心后收集上清液；將上清液用鹽酸調(diào)pH至4. 5~5. 0,靜置30~40min 后，離心，所得沉淀用濕重7~10倍去離子水重新分散，調(diào)節(jié)其pH至中性后，即得富含大豆 抗毒素的功能性大豆蛋白。
[0014] 優(yōu)選地，所述脫脂是分別以g和mL作為質(zhì)量和體積的單位，將富含大豆抗毒素的 豆粉與正己烷按照1:10~1:15混合。
[0015] 優(yōu)選地，所述鹽酸和氫氧化鈉的濃度為1. 0~2. 0mol/L。
[0016] 優(yōu)選地，所述離心的轉(zhuǎn)速都為6000~8000rpm/min;離心的時間都為10~20min。
[0017] 優(yōu)選地，所述過篩為過60目篩。
[0018] 應(yīng)用本發(fā)明方法，所得的3d發(fā)酵豆粉中糖苷大部分轉(zhuǎn)化為苷元，且Glyceollins 得到了最大富集；通過堿溶酸沉所提取得到的大豆蛋白中蛋白得率多56. 13%，糖苷含量 降低，苷元及Glyceollins含量顯著增加。
[0019] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0020] 1)現(xiàn)有技術(shù)多采用外源添加異黃酮及其轉(zhuǎn)化酶等技術(shù)實(shí)現(xiàn)異黃酮的生物轉(zhuǎn)化和 異黃酮在大豆蛋白中的富集，存在需要用有機(jī)溶劑以及乳化劑等不安全因素；本發(fā)明通過 微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)富含植物抗毒素的功能蛋白配料，不僅能克服大豆分離蛋白未形成生 產(chǎn)能力的局限，而且工藝條件溫和，不需要加入有機(jī)溶劑和乳化劑等化學(xué)成分，安全性好。
[0021] 2)本發(fā)明以高異黃酮大豆種子為主要原料，通過利用具有較高生物轉(zhuǎn)化活性的米 曲霉對大豆進(jìn)行侵染，在固體發(fā)酵過程中實(shí)現(xiàn)糖苷型異黃酮向具有更高生物活性的苷元型 異黃酮及Glyceollins的轉(zhuǎn)化和積累，明確大豆種子固體發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)Glyceollins的積 累。
[0022] 3)本發(fā)明利用生物轉(zhuǎn)化理念獲得具有良好生物適用性的高苷元型異黃酮及 Glyceollins功能性大豆豆粉及蛋白配料，建立低成本的大豆加工新技術(shù)，開發(fā)功能性保健 食品。
【附圖說明】
[0023] 圖1為六種大豆異黃酮混標(biāo)的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的發(fā)明，但實(shí)施 例不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0025] 本發(fā)明中蛋白含量采用GB/T5009. 5 - 03凱氏定氮法測定，用于計(jì)算蛋白提取率。
[0026] 本發(fā)明獲得的豆粉及蛋白樣品中異黃酮含量采用液相色譜法測定，液相色譜測定 條件及計(jì)算方法參考國標(biāo)GB/T23788 -2009,其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元 標(biāo)品進(jìn)行當(dāng)量計(jì)算，單位為大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 未損傷組：取6g大豆種子，用70%的酒精浸洗2min，接著用無菌水浸洗3次，最后 用無菌水25°C浸泡12h，去皮。將1. 5mL孢子懸浮液（米曲霉孢子數(shù)為1X107個）加入大 豆中，用無菌勺子混勻。將已染菌的大豆置于培養(yǎng)皿中，每皿25 - 30瓣，封口膜密封，25°C 暗箱培養(yǎng)，所得發(fā)酵豆子凍干備用。
[0029] 損傷組：取大豆種子，用70 %的酒精浸洗2min，接著用無菌水浸洗3次，最后用無 菌水25°C浸泡12h，去皮，并用手術(shù)刀在豆子表面各劃3次進(jìn)行損傷處理。
[0030] 將1.5mL孢子懸浮液（米曲霉孢子數(shù)為1X107)加入損傷后的大豆中，用無菌勺 子混勻。將已染菌的6g大豆置于培養(yǎng)皿中，每皿25 -30瓣，封口膜密封，25°C暗箱培養(yǎng)3d， 所得發(fā)酵豆子凍干、粉碎、備用。以未接種大豆種子（〇)作為空白對照。
[0031] 獲得的豆粉樣品（損傷組和未損傷組）中異黃酮含量采用液相色譜法測定，液相 色譜測定條件及計(jì)算方法參考國標(biāo)GB/T23788 - 2009,具體是根據(jù)附圖1中3種糖苷型和 3種苷元型異黃酮的出峰時間，結(jié)合國標(biāo)GB/T23788 -2009,對實(shí)施例1中各種樣品中6種 異黃酮及Glyceollins的含量進(jìn)行計(jì)算，其中，Glyceollins(Glys)的含量以大豆苷元標(biāo)品 進(jìn)行當(dāng)量計(jì)算，單位為大豆素/豆粉（mgDE/kgDW)，經(jīng)計(jì)算，測試結(jié)果如表1。
[0032] 表1實(shí)施例1中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)變化
[0033] CN104905162A 說明書 4/7 頁
[0034] 由表1可知，損傷處理組中的總異黃酮糖苷和總苷元含量分別為224. 67mg/kg 和892. 51mg/kg，而未損傷處理組中總異黃酮糖苷和總苷元含量則分別為852. 96mg/kg 和309. 05mg/kg，損傷對發(fā)酵大豆中Glyceollins的生成量有顯著的影響，損傷處理的發(fā) 酵大豆中Glyceollins的含量是未損傷發(fā)酵大豆中的4倍。損傷作為大豆中苷元轉(zhuǎn)化 為植物抗毒素的誘導(dǎo)子之一，由于菌種等因素的影響，其與微生物誘導(dǎo)子結(jié)合對發(fā)酵生成 Glyceollins的研宄結(jié)果不同，在米曲霉侵染的條件下，損傷不僅能促進(jìn)大豆中異黃酮糖苷 轉(zhuǎn)化為苷元，還能大大促進(jìn)Glyceollins的積累。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] 取6g大豆種子，用質(zhì)量濃度70%的酒精浸洗2min，接著用無菌水浸洗3次，最后 用無菌水25°C浸泡12h，去皮，損傷。將1.5mL孢子懸浮液（米曲霉孢子數(shù)為1X107個） 加入損傷后的大豆中，用無菌勺子混勻。將已染菌的大豆置于培養(yǎng)皿中，每皿25 -30瓣，封 口膜密封，25°C暗箱分別培養(yǎng)0d、ld、3d、5d，所得發(fā)酵豆子凍干、粉碎、備用。以未接種大豆 (〇)作為空白對照。測試方法同實(shí)施例1，測試結(jié)果見表2。
[0037] 表2實(shí)施例2中的苷元含量（mg/kg)及Glys含量（mgDE/kgDW)變化
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