選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿菌共發(fā)酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工程與發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種選育納豆芽孢桿菌與干酪乳桿 菌共發(fā)酵制備富含納豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納豆由大豆經(jīng)納豆芽孢桿菌（Bacillusnatto)發(fā)酵而成，具有多重生理功效： [0003] ①納豆對心血管系統(tǒng)的作用：納豆中一種標(biāo)志性生理活性物質(zhì)納豆激酶 (Nattokinase，NK)是能夠溶解血栓的蛋白質(zhì)，由275個氨基酸殘基組成，分子量27KD左右， 無毒、無副作用，是一種絲氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超過溶栓制劑尿激酶。納豆激酶除 具有直接溶栓作用外，還具有促進靜脈內(nèi)皮細胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑的能力，從而 間接表現(xiàn)其溶栓活性。納豆中亞油酸占全脂質(zhì)的50%，亞油酸能夠降低血漿中膽固醇含量， 有預(yù)防動脈硬化、心臟病和高血壓的功效，具有血栓溶解作用；
[0004] ②納豆對消化系統(tǒng)的作用：大豆蛋白質(zhì)經(jīng)納豆酶的作用轉(zhuǎn)化成可溶性多肽和氨 基酸，有利于人體吸收。lg納豆中含有10億個以上納豆菌，納豆菌繁殖快，能消耗腸道中 的氧，可以抑制引起腸內(nèi)異常發(fā)酵的痢疾桿菌等腐敗菌，促進乳酸菌繁殖，調(diào)節(jié)腸內(nèi)細菌平 衡，預(yù)防痢疾、腸炎和便秘等。大豆經(jīng)過納豆菌發(fā)酵蓄積了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯 酶、纖維素酶和脲酶等酶群，這些生物酶在消化系統(tǒng)中能夠有效調(diào)理促進消化吸收。納豆芽 孢桿菌在通過分解利用大豆蛋白進行繁殖的過程中，可以產(chǎn)生大量酵素、維生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物質(zhì)，其被覆在胃腸粘膜表面起到保護作用，飲酒時可緩解酒醉。納豆 菌還能殺死腸道出血性大腸桿菌；
[0005] ③納豆對免疫系統(tǒng)的作用：通過接種納豆菌的動物實驗發(fā)現(xiàn)，納豆可以提高機體 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，還可以誘發(fā)機體干擾素生成，增強機體免疫力；納豆中含有 活性物質(zhì)如皂草甙、維生素B2、維生素E等，每天食用可除去體內(nèi)致癌物質(zhì)，預(yù)防癌癥發(fā)生， 并可軟化血管，促進肌膚光滑；
[0006] ④促進骨骼發(fā)育：維生素K2可促進鈣與蛋白質(zhì)結(jié)合從而促進骨骼形成，在骨骼形 成過程中起著重要作用，而納豆中維生素1( 2含量是其他發(fā)酵食品的數(shù)百倍，有預(yù)防骨質(zhì)疏 松、腰痛等老年病的功效。
[0007] 近年發(fā)現(xiàn)納豆還具有其它更豐富廣泛的生理功效，源于其另一種標(biāo)志性生理活性 物質(zhì)--卩比略喹啉醌（pyrroloquinolinequinone，PQQ)，它是繼黃素核苷酸和煙酰胺核苷 酸之后在細菌脫氫酶中發(fā)現(xiàn)的第三種輔基，化學(xué)名稱為4, 5-二氫-4, 5-二氧化-1-氫吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。雖然自然條件下僅少數(shù)細菌如Methylovorus、 Deinococcusradiodurans、Gluconobacteroxydans、Klebsiellapneumoniae等能夠合成 PQQ，但在各種植物、動物以及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)含有微量PQQ。日本科學(xué)家測定了 26種常見食 物中的PQQ含量，發(fā)現(xiàn)1克食物中PQQ含量在3. 65-61納克不等，例如，蔬菜中的歐芹、青椒， 水果中的奇異果、木瓜，飲品中的綠茶、烏龍茶，以及人們常吃的豆腐。值得注意的是，日本 傳統(tǒng)食物納豆當(dāng)中PQQ含量最高，達到61納克/克。
[0008]PQQ作為一種普遍存在于動物和植物組織中的氧化還原酶輔基，雖然含量非常低， 但作用重要，不僅是一種新發(fā)現(xiàn)的線粒體呼吸鏈組分，參與催化生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，還 具有非常多樣的生物活性，缺乏時會引起哺乳動物諸多代謝障礙，被認為是一種新型維生 素。PQQ對哺乳動物的主要生理作用有：
[0009] ①全面提高人體免疫功能：PQQ作為人類發(fā)育的必要因子，能刺激人體細胞生長， 尤其是激活人體B細胞、T細胞，提高人體免疫功能；
[0010] ②防治肝損傷：PQQ能顯著降低血清膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平，調(diào)理肝損傷，對肝 臟疾病有極好療效；
[0011] ③減少自由基對人體的傷害：PQQ是一種氧化還原酶輔基，參與生物體內(nèi)氧化還 原反應(yīng)，能有效清除體內(nèi)自由基，減少自由基對人體傷害所引發(fā)的各種疾病，如心臟病、癌 癥以及各類炎癥；
[0012] ④調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。篜QQ在體內(nèi)能促進神經(jīng)因子合成，調(diào)理各種神經(jīng)系統(tǒng) 疾??；
[0013] ⑤促進氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的輔基，參與呼吸鏈電子傳遞，在人體內(nèi)能促 進氨基酸吸收；
[0014] ⑥促進生長因子合成：生長因子是人類生長的激素，PQQ能刺激人體細胞生長，增 加細胞密度，微量PQQ就能提高生物體組織的代謝能力和生長機能；
[0015] ⑦防治老年癡呆癥：PQQ具有修復(fù)神經(jīng)纖維、活化神經(jīng)元、激活休眠神經(jīng)細胞的能 力，能有效防治老年癡呆癥和改善記憶力；
[0016] ⑧促進谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 進機體谷胱甘肽合成，防止白內(nèi)障發(fā)生和肝臟膽紅素積累；
[0017] ⑨極強的抗癌功能：PQQ激活自然殺傷細胞（NK)細胞為ANK細胞，使其具有殺腫 瘤作用；使NK細胞等免疫細胞聚集，更有效地殺滅腫瘤細胞；封閉腫瘤細胞載鐵蛋白受體， 阻斷其功能，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移；破壞腫瘤細胞脂質(zhì)雙層，使腫瘤細胞溶解死亡；阻止腫 瘤細胞DNA復(fù)制，促其凋亡。
[0018] 在天然食品中，納豆獨有NK，并且PQQ含量最豐富。納豆中的NK和PQQ由納豆芽 孢桿菌產(chǎn)生。納豆是日常健康食品，納豆芽孢桿菌是公認安全的食品級微生物（GRAS微生 物），對納豆芽孢桿菌進行定向選育，然后與乳酸菌共發(fā)酵，制備富含NK和PQQ的食品，對于 人們在日常飲食中補充NK和PQQ、充分發(fā)揮NK和PQQ的生理調(diào)理作用具有重要意義。
[0019] 玉米（Zeamays)營養(yǎng)豐富，每100克含有碳水化合物74. 8克，蛋白質(zhì)29克，脂肪 16. 6克，膳食纖維6. 9克，是當(dāng)之無愧的第一黃金主食。玉米所含的"全能營養(yǎng)"適合各個 年齡段人群食用，富含的谷氨酸能促進大腦發(fā)育，是兒童最好的"益智食物"；富含的維生素 B族能調(diào)節(jié)神經(jīng)，是適合白領(lǐng)的"減壓食品";富含的亞油酸和鈣質(zhì)能幫助調(diào)脂、降壓；高纖維 含量則使玉米成為很好的"刮腸食物"，能預(yù)防中年發(fā)福；富含的谷胱甘肽是有效抗癌成分； 富含的維生素E也能幫助抗衰老，軟化血管。玉米汁是用浸泡后的玉米粒高溫研磨加工而 成的飲品，保留了玉米營養(yǎng)成分，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，將進一步形成乳酸菌素、活性脂肪酸、以 乳酸為主的有機酸等諸多食療物質(zhì)。
[0020] 乳酸菌發(fā)酵除能產(chǎn)生諸多食療成分外，還能賦予怡人的甜酸口感。納豆芽孢桿菌 發(fā)酵則能產(chǎn)生NK和PQQ。本發(fā)明通過選育納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌及其共發(fā)酵，開發(fā)出 富含NK和PQQ的食療發(fā)酵玉米汁。但如果干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌在同一體系中生長不 平衡會導(dǎo)致一種菌在競爭中排斥另一種，共發(fā)酵無法順利進行。關(guān)于生理特性，即使在野生 狀態(tài)下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少數(shù)菌株具有且活力不高，分解蛋白質(zhì)獲得必需氨 基酸的能力不足，而納豆芽孢桿菌具有較強蛋白酶活力，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸和肽可 滿足乳酸菌對氨基酸的需求。納豆芽孢桿菌兼性厭氧，通過消耗氧氣也促進乳酸菌生長和 產(chǎn)酸。在本發(fā)明中，除了納豆芽孢桿菌和干酪乳桿菌兩者之間存在不嚴(yán)格偏利共生關(guān)系外， 更通過選育手段使干酪乳桿菌因形成甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷（Met-)而與納豆芽孢桿菌形成嚴(yán) 格偏利共生關(guān)系，從而保證了干酪乳桿菌與納豆芽孢桿菌的共發(fā)酵順利進行。
[0021] 納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的代謝途徑迄今尚未完全明了，從而無法通過理性優(yōu) 化手段提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率。而且由于糖、氨基酸、脂類、核苷酸四大有 機物代謝之間的相通和密切關(guān)聯(lián)，使得微生物細胞代謝網(wǎng)絡(luò)既顯示出剛性（Rigidity)又 顯示出柔性（Plasticity)，處于嚴(yán)格控制之中，剛性表現(xiàn)為牽一發(fā)而動全身，從而在許多情 形下，即使明了代謝途徑，定點理性突變也并不能獲得理想表型，而柔性表現(xiàn)為對整個代謝 網(wǎng)絡(luò)中處于不同節(jié)點但又相關(guān)的途徑進行協(xié)同突變后，會表現(xiàn)出新的代謝屬性。欲提高納 豆芽孢桿菌合成NK和PQQ的產(chǎn)率，不明了其代謝途徑并不成為不可逾越的障礙，只要有合 適的非理性優(yōu)化手段（Unrationaloptimizationtechnique)，對所有可能與NK和PQQ合 成有關(guān)的主流及旁支途徑統(tǒng)籌優(yōu)化，實現(xiàn)多位點協(xié)同突變，并通過高通量篩選使多位點協(xié) 同突變的表型從突變庫中凸顯，即可實現(xiàn)提高納豆芽孢桿菌合成NK和PQQ產(chǎn)率的目標(biāo)。
[0022] 隨機突變是最常見的非理性優(yōu)化手段，雖然它能夠產(chǎn)生突變位點數(shù)量足夠大的突 變庫，但在突變庫中，各突變位點往往是分散獨立于單個細胞中，相互之間無法優(yōu)化組合， 而且大多不產(chǎn)生可見表型，從而使得絕大多數(shù)突變隱沒于突變庫中而不能得到篩選。
[0023] 基因組重排（GenomeShuffling)是在隨機突變的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型誘變育 種技術(shù)。它是在通過隨機突變產(chǎn)生突變位點數(shù)量足夠大的突變庫的基礎(chǔ)上，進一步通過 細胞融合使各突變位點優(yōu)化組合，從而使突變指數(shù)級上升特別是增加大量表型可見突變。 基因組重排為利用微生物代謝網(wǎng)絡(luò)這種柔性進行多點協(xié)同突變的菌種選育提供了技術(shù)支 撐。Zhang等（2002)首先以傳統(tǒng)誘變方法獲得一個突變庫，篩選出若干個正向突變株作為 出發(fā)株，然后通過多輪遞推原生質(zhì)體融合的方式使眾多基因隨機重組，實現(xiàn)基因組重排，最 終從突變庫中篩選出性狀被提升的目的菌株；St印hanopoulos(20