專(zhuān)利名稱(chēng)：用于抗hiv之dna免疫的自我復(fù)制的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抗HIV之DNA免疫的自我復(fù)制的重組載體，本發(fā)明還涉及含有所述載體的疫苗，制備該載體的方法和含有該載體的宿主細(xì)胞，本發(fā)明還涉及所述載體用于制備抗HIV之疫苗的用途以及治療或預(yù)防HIV的方法。
背景技術(shù)：
脊椎動(dòng)物(因此也包括人類(lèi))與病原體微生物，如細(xì)菌，真菌和病毒之間的相互作用由脊椎動(dòng)物對(duì)入侵微生物發(fā)動(dòng)免疫應(yīng)答的能力來(lái)調(diào)節(jié)。該反應(yīng)以免疫系統(tǒng)區(qū)分自我與非我的能力為基礎(chǔ)；在正常情況下，免疫應(yīng)答耐受生物體自身結(jié)構(gòu)，細(xì)胞和抗原性分子，而攻擊由入侵微生物表達(dá)的外源抗原。當(dāng)脊椎動(dòng)物，如人被微生物感染時(shí)，免疫應(yīng)答通過(guò)殺死微生物或被微生物感染的細(xì)胞或通過(guò)在中和性抗體的作用下防止感染擴(kuò)散而有助于清除感染。其次，更重要的是，一旦對(duì)入侵生物體產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，該反應(yīng)即有一種與生俱來(lái)的記憶機(jī)制，因此，曾被某種特定微生物感染的個(gè)體經(jīng)常具有免疫力而不會(huì)第二次被這種微生物感染。
在正常情況下由感染所致的免疫記憶是以多種方式模擬天然感染的疫苗的基礎(chǔ)。理想的疫苗在經(jīng)免疫的個(gè)體中不會(huì)導(dǎo)致癥狀，或只會(huì)導(dǎo)致輕微癥狀，但仍會(huì)誘導(dǎo)免疫記憶，在疫苗遭遇有問(wèn)題的微生物時(shí)能夠引發(fā)強(qiáng)的預(yù)防性免疫應(yīng)答。
抗特定微生物之疫苗的設(shè)計(jì)取決于處于天然感染狀態(tài)下的生物體清除該特定生物體并防止以后的感染的機(jī)制。關(guān)于免疫應(yīng)答如何能引發(fā)其有利的功能，存在幾種方法。首先，由B淋巴細(xì)胞合成和分泌的抗體能結(jié)合微生物并通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解破壞該微生物；其次，中和性抗體可通過(guò)抑制微生物與其靶細(xì)胞的結(jié)合而防止感染擴(kuò)散；第三，與補(bǔ)體激活相聯(lián)系的抗體可破壞被感染的細(xì)胞；最后，特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)可殺死并破壞被微生物感染的細(xì)胞。據(jù)認(rèn)為由人免疫缺損病毒(HIV)1型和2型(HIV-1和HIV-2)引發(fā)的免疫應(yīng)答涉及所有這些機(jī)制。然而，被HIV感染的個(gè)體中的免疫應(yīng)答的特征通常在于強(qiáng)的抗體反應(yīng)和較低的效力，甚至缺乏T淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Gerstott，J等，Scand.J.Immunol.22(5)463-470，1985；Re，M.C等，臨床病理學(xué)雜志，42(5)282-283，1989)。這就是為什么盡管有強(qiáng)的抗體-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，但個(gè)體一旦被HIV感染仍會(huì)產(chǎn)生慢性感染的原因。
針對(duì)病毒感染的預(yù)防性免疫應(yīng)答一般由上文所述的4種免疫應(yīng)答介導(dǎo)，但已知能殺死病毒感染細(xì)胞的CTL反應(yīng)最為有效，這就是為什么一般所說(shuō)的活減毒病毒疫苗最有效的原因。實(shí)際上，Jenner在200多年前研制出第一個(gè)疫苗，可預(yù)防小-痘病毒感染的活痘苗病毒就是該原理的一個(gè)例子。當(dāng)用活的減毒的病毒疫苗免疫個(gè)體時(shí)，宿主細(xì)胞被感染，病毒蛋白質(zhì)得以合成。一些病毒蛋白質(zhì)分子可用于產(chǎn)生病毒顆粒，而其它病毒蛋白質(zhì)分子被蛋白酶水解成能結(jié)合主要組織相容性(MHC)抗原(對(duì)人而言為HLA Ⅰ和Ⅱ類(lèi))的小肽并被呈遞給感染細(xì)胞表面的T淋巴細(xì)胞。隨后，攜有適當(dāng)T細(xì)胞受體(TCR)的T淋巴細(xì)胞會(huì)識(shí)別與HLA結(jié)合的外源肽，或者幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體(輔助/誘導(dǎo)型T細(xì)胞；Th)，或者破壞感染細(xì)胞(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞；CTL)。
盡管經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力，但仍未研制出有效的抗人免疫缺損病毒(HIV)感染和AIDS的疫苗。最早的努力致力于得到具有抗HIV外膜糖蛋白gp120/gp160之中和抗體的除菌免疫力。然而，對(duì)gp160/gp120所作的相Ⅰ/Ⅱ研究表明中和抗體只能抗實(shí)驗(yàn)室毒株，而不能中和野生型分離物。
相反，猴免疫缺損病毒(SIV)模型中的減毒病毒實(shí)驗(yàn)已獲得成功。NEF或REV基因缺失的SIV可用作減毒病毒并能保護(hù)經(jīng)免疫接種的動(dòng)物免于發(fā)病，但不能抗野生型攻擊病毒的感染。至于REV-缺陷的病毒，與保護(hù)作用僅有的免疫學(xué)聯(lián)系是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫(CMI)反應(yīng)，該反應(yīng)針對(duì)的是SIV調(diào)節(jié)蛋白NEF和TAT。在此實(shí)驗(yàn)中有一重要發(fā)現(xiàn)，即經(jīng)免疫的動(dòng)物甚至能清除野生型攻擊病毒所致的感染。最近，據(jù)報(bào)道被HIV感染的病人有時(shí)也能清除明顯的感染。在這些動(dòng)物和/或人研究中，與保護(hù)作用僅有的相關(guān)聯(lián)系似乎是細(xì)胞介導(dǎo)的抗HIV免疫應(yīng)答。
用蛋白質(zhì)免疫一般得不到這種類(lèi)型的免疫應(yīng)答。對(duì)HIV而言，活的減毒疫苗可以有效地預(yù)防感染，但有幾個(gè)原因使得它們?cè)诶碚撋鲜俏ｋU(xiǎn)的。最近描述的方法基因免疫(同義詞核酸免疫，DNA免疫)具有活減毒疫苗的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)但不具有所述疫苗潛在的有害的副作用。一旦該DNA載體被轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，以攜有一個(gè)或幾個(gè)病毒蛋白質(zhì)基因的真核表達(dá)載體形式存在的DNA疫苗即可誘導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。靶細(xì)胞中合成的病毒蛋白質(zhì)可被蛋白酶加工；所形成的肽與MHC/HLA分子結(jié)合并呈遞在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面。這會(huì)導(dǎo)致CTL-介導(dǎo)的免疫學(xué)記憶，當(dāng)個(gè)體隨后被野生型強(qiáng)毒病毒感染時(shí)，能在感染后立即有效地殺死被病毒感染的細(xì)胞從而防止感染。直接肌內(nèi)或真皮內(nèi)注射包含于真核表達(dá)質(zhì)粒中的cDNA可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(Wolff等，科學(xué)2461465-1468，1990)。通過(guò)這種方式表達(dá)外源抗原主要導(dǎo)致輔助性T-細(xì)胞亞型1(TH1)型免疫應(yīng)答和強(qiáng)的細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致高滴度的抗體反應(yīng)(Wang，B等，PNAS 904156-4160，1993；Wang等，Ann.NY Acad.Sci 772186-197，1995；Haynes等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 10(2)43-45，1994)。另外，據(jù)報(bào)道使用甲型流感病毒的病毒核蛋白抗原可產(chǎn)生抗原-特異性的CTL和保護(hù)作用(Ulmer等，科學(xué)，259，1745-1749，1993)。另外，使用DNA免疫已獲得抗小鼠支原體感染的保護(hù)作用(Barry等，自然377(6550)632-635，1995；Lai等，DNA細(xì)胞生物學(xué)，14(7)643-651，1995)和抗兔模型中的人乳頭瘤病毒感染的保護(hù)作用(Donnelly等，傳染病雜志，173(2)314-320，1996)。也可使用DNA免疫誘導(dǎo)由細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫力(Bohm等，癌癥免疫學(xué)和免疫理論，44(4)230-238，1997)。
相對(duì)于活的減毒病毒疫苗而言，DNA免疫有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。由于沒(méi)有形成感染性病毒，導(dǎo)入宿主生物體的病毒基因僅在最初被感染的那些細(xì)胞中停留，未產(chǎn)生病毒感染的癥狀。在HIV問(wèn)題上，通過(guò)突變野生型強(qiáng)毒病毒可逆轉(zhuǎn)活的減毒病毒主要的理論上有害的后果。另外，僅可使用那些已知能有效誘導(dǎo)預(yù)防性免疫應(yīng)答的病毒基因或其部分進(jìn)行DNA免疫。
對(duì)有效的CTL反應(yīng)而言，重要的是細(xì)胞毒T細(xì)胞可在形成結(jié)構(gòu)蛋白之前和釋放成熟的病毒顆粒之前破壞感染細(xì)胞。因此，針對(duì)病毒周期之早期蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答是有利的。HIV的復(fù)制由其自身的調(diào)節(jié)基因和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)。HIV基因組編碼3個(gè)非結(jié)構(gòu)性調(diào)節(jié)蛋白(NEF，TAT，REV)，它們是體內(nèi)病毒復(fù)制所必需的。REV可將基因組RNA轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中，TAT上調(diào)病毒轉(zhuǎn)錄，NEF提供靜息細(xì)胞中的復(fù)制。用SIV進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明缺乏上述調(diào)節(jié)基因之一種功能的病毒因病毒不能充分復(fù)制而不能誘導(dǎo)疾病。在病毒感染周期的前幾個(gè)小時(shí)，這3種蛋白質(zhì)瞬時(shí)少量地進(jìn)行表達(dá)(Ranki等，Arch.Virol.139365-378，1994)。只有一小部分被HIV感染的個(gè)體對(duì)這些蛋白質(zhì)顯示出體液和/或細(xì)胞反應(yīng)，該反應(yīng)與有利的臨床病程有關(guān)。
已深入研究了抗NEF，TAT和REV的CTL反應(yīng)。NEF-特異性的CTL和Th(T輔助細(xì)胞)反應(yīng)與有利的臨床預(yù)后有關(guān)。至于REV缺損的SIV-疫苗，抗NEF和TAT的免疫應(yīng)答是保護(hù)性的。已鑒定了TAT和REV蛋白中的Th和CTL表位，它們由被HIV-1感染的個(gè)體識(shí)別并顯示出臨床相關(guān)性(Blazevic等，AIDS雜志，6881-890，1993；Blazevic等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 111335-1341，1995)。總之，這些結(jié)果表明為了獲得針對(duì)疾病的保護(hù)作用，可能需將病毒的中度復(fù)制(減毒生長(zhǎng))與針對(duì)調(diào)節(jié)蛋白的特異性免疫應(yīng)答相結(jié)合，所述調(diào)節(jié)蛋白參與支持病毒復(fù)制。
DNA免疫可使用幾個(gè)真核表達(dá)載體，但它們的效力各不相同。調(diào)節(jié)給定表達(dá)載體誘導(dǎo)免疫應(yīng)答之效力的一些參數(shù)是未知的，但高水平表達(dá)抗原蛋白顯然是有利的。導(dǎo)入細(xì)胞的載體表達(dá)外源抗原性病毒蛋白質(zhì)的時(shí)限可能也很重要。最后，在某種程度上誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的表達(dá)載體可能也是有利的，因?yàn)橐阎M織損傷會(huì)通過(guò)幾種生物活性分子，如細(xì)胞因子，淋巴因子和趨化因子擴(kuò)大免疫應(yīng)答，所述分子是由表達(dá)抗原性蛋白質(zhì)的細(xì)胞分泌的。這可能是在某種程度上導(dǎo)致組織和細(xì)胞損傷的活的減毒病毒也能有效誘導(dǎo)免疫力的另一個(gè)原因，因此，在此方面模擬活的減毒疫苗的DNA載體也是有利的。
在HIV-1感染中，非特異性因子，如細(xì)胞因子和淋巴因子可能也可調(diào)節(jié)病毒復(fù)制和免疫應(yīng)答。Clerici和Shearer(今日免疫學(xué)14(3)107-111，1993)和其他人已闡明輔助細(xì)胞Th1/Th2平衡的作用，該作用由特異于兩種輔助T細(xì)胞群體的淋巴因子的產(chǎn)生來(lái)表現(xiàn)。最近，將CD8細(xì)胞產(chǎn)生的能抑制被HIV-1感染的CD4細(xì)胞產(chǎn)生病毒的適當(dāng)因子鑒定為RANTES，MIPI-α和MIPI-β(Cocchi等，科學(xué)270(5243)1811-1815，1995)。在HIV-1感染中，其產(chǎn)生的量增加或減少的細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄。
使用編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白NEF的基因進(jìn)行的DNA免疫研究闡明了T細(xì)胞增殖反應(yīng)(Hinkula等，疫苗15(8)874-878，1997和Hinkula等，J.Virol.Jul，71(7)5528-5539，1997)。然而，它是具有與有利的臨床病程相關(guān)的積極效果的CTL反應(yīng)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主要目的是提供編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白的DNA免疫疫苗，在感染周期的早期，新的成熟的感染性病毒顆粒釋放之前，該疫苗能引發(fā)抗HIV-感染細(xì)胞的CTL反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供疫苗，該疫苗還能引發(fā)抗HIV的體液反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可安全使用的HIV疫苗，因?yàn)樵撘呙绮粫?huì)將受體暴露于HIV的結(jié)構(gòu)基因或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供自我復(fù)制的載體，該載體可導(dǎo)致HIV調(diào)節(jié)蛋白長(zhǎng)期高水平的表達(dá)并在某種程度上破壞細(xì)胞，其會(huì)進(jìn)一步刺激免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供能表達(dá)HIV調(diào)節(jié)蛋白的自我復(fù)制的重組載體，該載體在包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中能長(zhǎng)期穩(wěn)定地維持并保持高拷貝數(shù)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有所述載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備上述自我復(fù)制的載體的方法。
本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防HIV的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是所述載體制備抗HIV之DNA免疫疫苗的用途。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是通過(guò)下列方法實(shí)現(xiàn)的，即將編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的異源核苷酸序列摻入載體中，所述載體含有乳頭瘤病毒E1基因和E2基因，乳頭瘤病毒基本的(minimal)復(fù)制起點(diǎn)和乳頭瘤病毒微型染色體維持元件。
換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明涉及自我復(fù)制的重組載體，該載體含有基本上由下列組分組成的乳頭瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳頭瘤E1基因和E2基因，(ⅱ)乳頭瘤病毒基本的復(fù)制起點(diǎn)，(ⅲ)乳頭瘤病毒微型染色體維持元件和編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的異源核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了含有所述載體，用于抗HIV的DNA免疫的疫苗；所述載體用于制備HIV疫苗的用途；治療或預(yù)防HIV的方法，所述方法包括給有此需要的人施用有效量的自我復(fù)制的載體并在所述人體中表達(dá)NEF，REV或TAT蛋白或其免疫活性片段。
本發(fā)明還提供了制備自我復(fù)制的重組載體的方法，所述方法包括A)將編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的異源核苷酸序列插入載體中，該載體含有基本上由下列組分組成的乳頭瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳頭瘤病毒E1基因和E2基因，
(ⅱ)乳頭瘤病毒基本的復(fù)制起點(diǎn)，(ⅲ)乳頭瘤病毒微型染色體維持元件和B)用所得的自我復(fù)制的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，C)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，和D)回收所述載體。
本發(fā)明還提供了含有所述載體的宿主細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A顯示了穿梭載體pUE83。
圖1B顯示了穿梭載體pNP177。
圖2顯示了本發(fā)明的pBNtkREV質(zhì)粒。
圖3顯示了本發(fā)明的pBNsrαTAT質(zhì)粒。
圖4顯示了本發(fā)明的pBNsrαNEF質(zhì)粒。
圖5顯示了被pBNsrαNEF轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中的NEF表達(dá)。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)采集Western印跡樣品并用ECL進(jìn)行肉眼觀察。
圖6闡明了Western印跡檢測(cè)到的經(jīng)pBNsrαNEF免疫的小鼠血清中的抗NEF抗體。最后一次免疫后2周取樣品1-4，最后一次免疫后4周取樣品5-8。
圖7顯示了經(jīng)pBNsrαNEF載體免疫的小鼠中的CTL反應(yīng)。圖7A顯示了CTL反應(yīng)，由最后一次免疫后2周4只受試小鼠的靶細(xì)胞特異性裂解的百分比表示。圖7B顯示了最后一次免疫后4周的值，特異性裂解＞4％被認(rèn)為是陽(yáng)性的。
圖8顯示了經(jīng)pBN-Nef免疫的3只小鼠中免疫球蛋白亞類(lèi)的分布。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，將異源HIV核苷酸序列插入載體中，所述載體含有乳頭瘤病毒E1基因和E2基因，乳頭瘤病毒基本的復(fù)制起點(diǎn)(MO)和乳頭瘤病毒微型染色體維持元件(MME)。下文中將含有E1/E2/MO/MME的載體稱(chēng)為pBN，WO97/24451(列入本文作為參考)中詳細(xì)描述了該載體。所述專(zhuān)利公開(kāi)基于下列發(fā)現(xiàn)，即乳頭瘤病毒由MO本身開(kāi)始的DNA復(fù)制不足以穩(wěn)定地長(zhǎng)期持續(xù)，但需要另一個(gè)病毒序列MME，當(dāng)載體還含有乳頭瘤病毒的E1和E2基因時(shí)能得到最佳結(jié)果。
本文所用“乳頭瘤病毒”指的是乳頭瘤病毒家族中的任何成員。優(yōu)選本發(fā)明中使用的乳頭瘤病毒是牛乳頭瘤病毒(BPV)或人乳頭瘤病毒(HPV)。
“E1”和“E2”是乳頭瘤病毒的調(diào)節(jié)蛋白，它們經(jīng)由MO復(fù)制并且是復(fù)制所必需的。
“基本復(fù)制起點(diǎn)”(MO)是乳頭瘤病毒的DNA合成起始所最小的基本序列。
“微型染色體維持元件”(MME)指的是乳頭瘤病毒基因組中能與乳頭瘤病毒復(fù)制所必需的病毒或人蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域。MME是宿主中穩(wěn)定的附加型維持乳頭瘤病毒MO所必需的。優(yōu)選MME含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白E2結(jié)合的位點(diǎn)。
本申請(qǐng)中所用的“自我復(fù)制的載體”指的是能在真核宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的載體質(zhì)粒。
“異源”指的是外源，例如，就本發(fā)明的載體而言，異源核苷酸序列指的是非乳頭瘤病毒序列。
“免疫活性片段”指的是能引發(fā)受體中免疫應(yīng)答的片段。
“基本上由……組成的乳頭瘤病毒核苷酸序列”指的是含有乳頭瘤病毒核苷酸序列的載體，所述序列對(duì)載體的長(zhǎng)期維持和復(fù)制來(lái)說(shuō)是必需的和足夠的。例如，這意味著已從本發(fā)明所用的pBN載體中缺失了不必要的序列，如所有由乳頭瘤-編碼的致癌序列。
除了E1和E2基因，MO，MME和NEF，REV或TAT基因以外，本發(fā)明的載體還含有編碼蛋白質(zhì)所用的啟動(dòng)子以及其它調(diào)節(jié)序列，聚腺苷酸化序列和內(nèi)含子。優(yōu)選載體還包括細(xì)菌宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記的基因以在細(xì)菌宿主細(xì)胞中制備載體DNA。
pBN載體的必要特征是它們不是宿主細(xì)胞特異性的載體。這是因?yàn)镋1和E2蛋白的表達(dá)受非天然，即異源啟動(dòng)子的控制。所述啟動(dòng)子在廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中具有功能，或是細(xì)胞或組織特異性的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明的載體中，優(yōu)選E1基因受sr-α啟動(dòng)子或胸苷激酶啟動(dòng)子(tk)的控制，優(yōu)選E2基因受LTR gag啟動(dòng)子的控制。NEF，REV或TAT基因可受CMV啟動(dòng)子或RSV LTR啟動(dòng)子的控制。載體還可含有SV40早期啟動(dòng)子以誘導(dǎo)抗生素選擇(新霉素或卡那霉素)基因的表達(dá)。
本發(fā)明載體中的宿主細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)優(yōu)選為pUC ORI，所用選擇標(biāo)記為例如卡那霉素和/或新霉素，優(yōu)選內(nèi)含子為β-珠蛋白IVS。
在TK啟動(dòng)子基的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的octseq是八聚體蛋白質(zhì)的非編碼序列，它在質(zhì)粒中不具有功能，但卻是產(chǎn)生適當(dāng)限制性位點(diǎn)以制備最終質(zhì)粒所必需的。
插入pBN中的NEF，REV或TAT基因可得自幾個(gè)商購(gòu)來(lái)源，如AIDSReagent Project MHC repositary的質(zhì)粒pKP59。所述基因是眾所周知的，并已被完整地測(cè)序(Wain-Hobson等，細(xì)胞，409-17，1985)。當(dāng)然，也可以插入僅編碼所述HIV蛋白之免疫活性片段的序列。
首先將NEF，REV或TAT基因或其片段插入適當(dāng)?shù)拇┧筝d體。這些載體可包括或不包括MO區(qū)域。實(shí)施例中闡明了兩個(gè)穿梭載體不包括MO的pNp177和包括MO的pUE83。不過(guò)也可以使用其它穿梭載體。優(yōu)選在大腸桿菌中增殖穿梭載體和所得的本發(fā)明載體。圖2，3和4中示出了本發(fā)明所得載體pBN-NEF，pBN-REV或pBN-TAT的例子。本發(fā)明的載體是穩(wěn)定的并以多拷貝數(shù)進(jìn)行自我復(fù)制。通過(guò)轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞，載體(質(zhì)粒)將增殖并產(chǎn)生100-1000倍量的新質(zhì)粒，每個(gè)新質(zhì)粒都能表達(dá)所需的HIV蛋白。
本發(fā)明中要求保護(hù)的宿主細(xì)胞可以是被載體轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞，也可以是被載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞。真核細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，原核細(xì)胞優(yōu)選為細(xì)菌細(xì)胞，尤其是大腸桿菌。
在轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞和被所述質(zhì)粒免疫的小鼠中檢測(cè)本發(fā)明所得質(zhì)粒載體的HIV NEF，REV和TAT表達(dá)。在COS-7細(xì)胞中闡明了HIV蛋白的高表達(dá)，經(jīng)免疫的小鼠中顯示出顯著的體液和細(xì)胞介導(dǎo)(CTL)的免疫應(yīng)答。在猴中也闡明了顯著的CTL反應(yīng)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的載體可潛在地用作有效的HIV疫苗。
還闡明編碼不同HIV調(diào)節(jié)蛋白的pBN-載體混合物對(duì)幾種調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明包括含有編碼不同HIV調(diào)節(jié)蛋白或其免疫活性片段之載體的混合物的疫苗，以及所述混合物在制備疫苗和治療或預(yù)防HIV中的用途。疫苗可含有編碼所有3種不同的調(diào)節(jié)蛋白之載體的混合物。本發(fā)明的疫苗還可含有其它基因或基因片段，如HIV結(jié)構(gòu)基因。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明。實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明是由所附權(quán)利要求書(shū)限定的。
于37℃用XbaⅠ和XhoⅠ(New England BioLabs，USA)將擴(kuò)增基因和pUE83穿梭載體(圖1)消化過(guò)夜以得到相容的末端。在1.5％瓊脂糖凝膠上分析經(jīng)消化的DNA片段，使用Band Prep試劑盒(PharmaciaBiotech，瑞典)進(jìn)一步純化之。16℃保溫過(guò)夜以用T4 DNA連接酶(NewEngland BioLabs，USA)將各個(gè)基因分別連接至載體中。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化One Shot試劑盒(Invitrogen，荷蘭)中的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪于含有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行選擇。從生長(zhǎng)的克隆中制備少量質(zhì)粒DNA，通過(guò)用XhoⅠ和XbaⅠ消化來(lái)分析克隆基因的存在。使用上述引物，由少量制備的質(zhì)粒DNA制品進(jìn)行PCR也可證實(shí)克隆基因的存在。大量培養(yǎng)含有正確基因的克隆，使用Megaprep柱(Qiagen，德國(guó))純化質(zhì)粒。第2階段用HindⅢ(New England BioLabs，USA)消化穿梭載體中含有BPVori，RSV LTR啟動(dòng)子，REV-或TAT-基因和b-珠蛋白IVS poly(A)的DNA片段，使用1％瓊脂糖凝膠和Band Prep試劑盒純化之，連接至經(jīng)HindⅢ消化和脫磷酸化(堿性磷酸酶，CIP，Promega，USA)的pBNsrα或pBNtk中，轉(zhuǎn)化細(xì)胞，按第一階段中所述證實(shí)克隆基因的存在并純化質(zhì)粒。
所得質(zhì)粒被稱(chēng)為pBNtkREV和pBNsrαTAT，并示于圖2和3。
首先用XhoⅠ消化圖1B所示的穿梭載體pNP177，然后用Klenow酶和dNTP混合物處理，最后用XbaⅠ消化。還用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)處理載體。
14℃，使用T4連接酶將合有NEF基因的片段與經(jīng)裂解的pNP177載體連接過(guò)夜。使用One Shot感受態(tài)大腸桿菌試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用限制性酶消化和電泳鑒定陽(yáng)性克隆。在大腸桿菌中進(jìn)一步擴(kuò)增質(zhì)粒DNA，用Qiagen柱進(jìn)行大規(guī)模純化。所得的最終質(zhì)粒被稱(chēng)為pNP177cHIVNEF。第2階段穿梭載體pNP177被設(shè)計(jì)成僅具有其間可克隆插入物的兩個(gè)HindⅢ位點(diǎn)，因此，質(zhì)粒的HindⅢ消化物給出可進(jìn)一步克隆的片段。將pNP177cHIVNEF的HindⅢ片段克隆至pBNsrα，用HindⅢ消化載體并用CIP進(jìn)行處理。按與第一階段相同的方法進(jìn)行帶分離，連接和轉(zhuǎn)化，通過(guò)限制性分析證實(shí)正確方向的插入物，最終的質(zhì)粒被稱(chēng)為pBNsrαNEF，并如圖4所示。
轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞之后72小時(shí)，通過(guò)檢測(cè)裂解細(xì)胞的Western印跡，發(fā)現(xiàn)載體產(chǎn)生了強(qiáng)的瞬時(shí)的HIV調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。用pBNsrαNEF得到的結(jié)果示于圖5。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)物中，經(jīng)自我復(fù)制的pBN載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的NEF表達(dá)持續(xù)了7周。
還使用NEF-轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備cytospin制品，用蘇木精染色該細(xì)胞，按Ovod等，文獻(xiàn)同上所述，在免疫組化中先使用抗NEF的單克隆抗體，再使用生物素化的抗小鼠第二抗體。cytospin載玻片顯示出在大量細(xì)胞中觀察到作為陽(yáng)性染色的表達(dá)，因?yàn)轭w粒體占據(jù)了細(xì)胞質(zhì)。表達(dá)NEF的部分細(xì)胞顯示出細(xì)胞破壞的形態(tài)學(xué)跡象，表明細(xì)胞編程性死亡。盡管細(xì)胞的狀況越來(lái)越差，但表達(dá)水平仍然較高。
在第1，2，3，10，11和12天，按照廠(chǎng)商說(shuō)明使用上述基因槍在8只小鼠的腹部皮膚上進(jìn)行接種。每只小鼠共施用6微克pBN-NEF，最后一次接種后2周處死兩組中的4只小鼠，最后一次接種后4周處死其余4只小鼠。取出血清樣品進(jìn)行Western印跡，收集脾細(xì)胞進(jìn)行CTL試驗(yàn)。被pBN-NEF-載體免疫的所有8只小鼠在第2周和第4周顯示出抗體反應(yīng)(圖6)，Western印跡中的反應(yīng)強(qiáng)度各不相同。4C．檢測(cè)經(jīng)免疫小鼠體內(nèi)的細(xì)胞毒T細(xì)胞活性4C1．刺激效應(yīng)細(xì)胞免疫后2周(16只小鼠)和4周(16只小鼠)，無(wú)菌取出經(jīng)免疫小鼠的脾臟。用Hanks液破碎脾臟，用紗布過(guò)濾，除去紅細(xì)胞。然后將細(xì)胞以5×106/ml的濃度懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有10％胎牛血清(FCS；GibcoBRL)，1％谷氨酰胺，100U青霉素/ml，100(克鏈霉素/ml和5×10-5M 2-巰基乙醇。在含有5ml培養(yǎng)基的25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將反應(yīng)細(xì)胞(5×106)與4×106個(gè)抗原呈遞細(xì)胞(APC；見(jiàn)下文)共培養(yǎng)5天。第1天，在細(xì)胞中加入10U/ml重組白細(xì)胞介素-2(rIL-2)(Hiserodt J等，免疫學(xué)雜志，Jul，135(1)53-59，1985；Lagranderie M等，病毒學(xué)雜志，Mar，71(3)2303-2309，1997；Tsuji T等，免疫學(xué)，Jan，90(1)1-6，1997；Vahising H.L等，免疫學(xué)方法雜志17511-22，1994；Varkila K等，Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.C 95141-148，1987)。4C2．抗原呈遞細(xì)胞用經(jīng)修飾可表達(dá)HIV-1 LAI NEF基因(MVA-HIVNEF)的痘苗病毒Ankara(MVA)感染同系的P815肥大細(xì)胞瘤(H-2d)細(xì)胞。MVA是高度減毒的復(fù)制缺損的痘苗病毒，它可用作表達(dá)異源基因的有效載體，其在生物學(xué)上的安全性水平非常高(Sutter G等，病毒學(xué)雜志，Jul，68(7)4109-4116，1994；Sutter等，疫苗，12(11)1032-1039，1994；Drexler Ⅰ等，普通病毒學(xué)雜志，79347-352，1998；Sutter G等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910847-10851，1992)。在24孔板中，以5為感染復(fù)數(shù)(MOI)進(jìn)行MVA-HIVNEF感染(1×106個(gè)細(xì)胞/孔)。37℃進(jìn)行病毒吸附1小時(shí)之后，將細(xì)胞于37℃保溫15小時(shí)(Carmichael A等，病毒學(xué)雜志，708468-8476，1996)。轉(zhuǎn)染后，用含有10％FCS的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)將細(xì)胞洗滌2次，再以5×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度將細(xì)胞懸浮于上述洗滌溶液中。然后以5000rad的γ-射線(xiàn)照射細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞再加入效應(yīng)細(xì)胞。4C3．細(xì)胞毒性試驗(yàn)通過(guò)51Cr-釋放試驗(yàn)(Hiserodt J等，免疫學(xué)雜志，Jul，135(1)53-59，1985；Lagranderie M等，病毒學(xué)雜志，Mar，71(3)2303-2309，1997；Varkila K等，Acta Path.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.C 95141-148，1987；van Baalen C等，AIDS7781-786，1993)檢測(cè)CTL活性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，按上文所述，使用與抗原呈遞細(xì)胞相同的方法用MVA-HIVNEF感染2×106個(gè)P-815細(xì)胞。感染后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次。然后將靶細(xì)胞懸浮于200微升無(wú)血清培養(yǎng)基中，37℃加入100μCi51Cr(Amersham)/1×106個(gè)細(xì)胞達(dá)1小時(shí)。然后用培養(yǎng)基洗滌靶細(xì)胞4次，懸浮于培養(yǎng)基中使?jié)舛葹?×104個(gè)細(xì)胞/ml。用培養(yǎng)基將經(jīng)刺激的效應(yīng)細(xì)胞洗滌1次，再加入靶細(xì)胞中。以100微升(5×103個(gè)細(xì)胞)/孔的量將靶細(xì)胞鋪于U-底96孔板中，以效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞的比例為50，25和12.5加入3份各為100微升的效應(yīng)細(xì)胞。為了自發(fā)地釋放，將靶細(xì)胞鋪于6個(gè)含有100微升培養(yǎng)基的孔中，為了最大程度地釋放，將靶細(xì)胞鋪于6個(gè)含有2.5％Triton-X-100的孔中。將培養(yǎng)板稍作旋轉(zhuǎn)，37℃保溫4小時(shí)，用γ-計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)上清液。靶細(xì)胞特異性裂解的百分比被計(jì)算為(檢測(cè)的51Cr釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)×100。特異性裂解的百分比≥6％即被認(rèn)為是陽(yáng)性。
在經(jīng)pBNsrαNEF免疫的8只小鼠中有6只顯示出CTC活性的例子示于圖7。4D．經(jīng)免疫小鼠的體液免疫應(yīng)答為了檢測(cè)經(jīng)免疫的小鼠血清中抗HIV-1 NEF抗體的存在，在PAGE上電泳NEF蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，按上文所述測(cè)定抗體反應(yīng)性。
結(jié)果概述轉(zhuǎn)染和免疫試驗(yàn)的結(jié)果概述于表1。通過(guò)免疫印跡(WB)評(píng)估經(jīng)免疫小鼠的體液免疫應(yīng)答，通過(guò)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)試驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。如表中所述，被NEF表達(dá)載體免疫的所有8只小鼠都顯示出體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。表1．通過(guò)免疫印跡(Western印跡，WB)或免疫組化闡明被所述載體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中HIV-1 NEF，TAT和REV蛋白的表達(dá)，并闡明經(jīng)其中一個(gè)載體pBNsrαNEF免疫的小鼠中對(duì)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用轉(zhuǎn)染 免疫WB 免疫組化 WB CTLpBNsrαTATND++6/86/8pBNtkREV +++7/87/8pBNsrαNEF++ND6/86/8在此研究中，我們闡明按上述使用自我復(fù)制的表達(dá)載體對(duì)小鼠進(jìn)行DNA免疫可誘導(dǎo)明顯可測(cè)的CTL反應(yīng)。另外，還獲得了體液免疫應(yīng)答。從上述結(jié)果看，我們可以認(rèn)為pBN-NEF，pBN-REV和pBN-TAT質(zhì)粒在體內(nèi)的確表達(dá)NEF，REV和TAT，而表達(dá)量足以誘導(dǎo)預(yù)防或治療HIV所需的體液和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
免疫方案如下所述在2周內(nèi)，用24微克實(shí)施例2中所述的pBN-Nef免疫4只Balb/c小鼠達(dá)6次，因此，DNA的總量為144微克，用Western印跡分析血清中的抗體。4只小鼠中有3只具有抗HIV-1 Nef的抗體，按下述在ELISA試驗(yàn)中測(cè)定這些抗體的亞類(lèi)用移液管將抗原轉(zhuǎn)移至Nunc Maxi Sorb培養(yǎng)板中，4℃保溫過(guò)夜；所用抗原是溶于PBS中的HIV-1 Nef蛋白(NIH，AIDS Research andReference Program)(50ng/孔)。與1％BSA(Sigma)保溫過(guò)夜以封閉培養(yǎng)板，然后于室溫下與小鼠血清(用封閉溶液稀釋100倍)保溫4小時(shí)，用PBS-0.1％吐溫20將培養(yǎng)板洗滌3次，再用PBS將培養(yǎng)板洗滌2次。將用封閉溶液稀釋1000倍的過(guò)氧化物酶綴合的抗小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3和IgM(Calbiochem)用作第二抗體，室溫下保溫培養(yǎng)板2小時(shí)。按先前的描述進(jìn)行洗滌步驟之后，加入底物ABTS(Sigma)和過(guò)氧化氫(溶于檸檬酸鹽緩沖液)達(dá)10分鐘，用ELISA-讀數(shù)儀在405nm處進(jìn)行光度測(cè)定，結(jié)果示于圖8。用IgG2a第二抗體在3只小鼠中檢測(cè)到最高反應(yīng)(405nm處的吸收值分別為0.117，0.262，0.743)，用IgG1抗體檢測(cè)到的反應(yīng)要低得多(A(405)0.004，0.020，0.038)。這表明這些小鼠經(jīng)肌內(nèi)免疫后的反應(yīng)類(lèi)型純粹是導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的Th1型。
結(jié)果表明在實(shí)際操作中，所有小鼠都具有強(qiáng)的針對(duì)重組Nef的IgG2a型反應(yīng)，而其它IgG亞類(lèi)的抗體非常少。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了pBNNef構(gòu)建體能引發(fā)Th1型反應(yīng)，隨后是強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，該反應(yīng)在病毒感染周期的早期能破壞HIV-感染細(xì)胞。
3只猴中有1只具有顯著的針對(duì)表達(dá)HIV-1 Nef和Tat的自身B細(xì)胞的CTL反應(yīng)。結(jié)果表明表達(dá)HIV調(diào)節(jié)蛋白的pBN構(gòu)建體不僅可免疫小鼠，也可免疫靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，經(jīng)免疫的動(dòng)物將會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)，其特征在于能在病毒感染周期的早期破壞HIV-感染細(xì)胞的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的存在。另外，結(jié)果表明構(gòu)建體可作為混合物同時(shí)施用，混合物中一個(gè)構(gòu)建體的存在不會(huì)干擾另一個(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1．自我復(fù)制的重組載體，該載體含有基本上由下列組分組成的乳頭瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳頭瘤E1基因和E2基因，(ⅱ)乳頭瘤病毒基本的復(fù)制起點(diǎn)，(ⅲ)乳頭瘤病毒微型染色體維持元件和編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的異源核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的自我復(fù)制的載體，其中乳頭瘤病毒是牛乳頭瘤病毒(BPV)。
3．權(quán)利要求1或2的自我復(fù)制的載體，其中異源核苷酸序列編碼HIV-1 NEF蛋白。
4．上述權(quán)利要求之任一項(xiàng)的自我復(fù)制的載體，其中E1受sr-α啟動(dòng)子或胸苷激酶啟動(dòng)子的控制。
5．權(quán)利要求4的自我復(fù)制的載體，其為圖2，3或4所示的pBNtkREV，pBNsrαTAT或pBNsrα NEF。
6．用于抗HIV之DNA免疫的疫苗，其含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的自我復(fù)制的載體。
7．權(quán)利要求6的疫苗，其含有編碼不同HIV調(diào)節(jié)蛋白或其免疫活性片段之載體的混合物。
8．制備權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的自我復(fù)制的重組載體的方法，所述方法包括A)將編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白NEF，REV或TAT或其免疫活性片段的異源核苷酸序列插入載體中，該載體含有基本上由下列組分組成的乳頭瘤病毒核苷酸序列(ⅰ)乳頭瘤E1基因和E2基因，(ⅱ)乳頭瘤病毒基本的復(fù)制起點(diǎn)，(ⅲ)乳頭瘤病毒微型染色體維持元件，和B)用所得的自我復(fù)制的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，C)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，和D)回收所述載體。
9．權(quán)利要求8的方法，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。
10．權(quán)利要求9的制備抗HIV之DNA免疫疫苗的用途。
11．權(quán)利要求9的制備疫苗的用途，所述疫苗含有編碼不同HIV調(diào)節(jié)蛋白或其免疫活性片段之載體的混合物。
12．治療或預(yù)防HIV的方法，所述方法包括給有此需要的人施用有效量的權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的自我復(fù)制的載體并在所述人體中表達(dá)NEF，REV或TAT蛋白或其免疫活性片段。
13．權(quán)利要求12的方法，所述方法包括施用編碼不同HIV調(diào)節(jié)蛋白或其免疫活性片段之載體的混合物。
14．含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的自我復(fù)制的載體的宿主細(xì)胞。
15．權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其為細(xì)菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
全文摘要
將編碼HIV調(diào)節(jié)蛋白NEF,REV或TAT或其免疫活性片段的核苷酸序列插入載體中,所述載體含有對(duì)長(zhǎng)期維持而言為必需的和充足的乳頭瘤病毒核苷酸序列,所得載體為自我復(fù)制的并具有高拷貝數(shù)。它們長(zhǎng)期大量地表達(dá)HIV基因。載體引發(fā)了體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,因此是潛在的抗HIV DNA免疫疫苗。本發(fā)明涉及所述載體和疫苗以及制備該載體的方法。本發(fā)明還涉及含有該載體的宿主細(xì)胞,該載體用于制備疫苗的用途和預(yù)防或治療HIV的方法。
文檔編號(hào)C12N15/48GK1295623SQ99804629
公開(kāi)日2001年5月16日 申請(qǐng)日期1999年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月27日
發(fā)明者M·塔蒂恩, P·彼得森, K·克羅, P·A·蘭克 申請(qǐng)人:免疫技術(shù)芬蘭有限公司