專利名稱：病毒被膜蛋白的表位和定向抗該表位的特異性抗體:在宿主組織中檢測hcv病毒抗原中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明基于對以下發(fā)現(xiàn)定向抗HCV的E1和E2蛋白的特異性表位的抗體能用于在宿主組織中檢測病毒抗原。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)傳染在發(fā)達國家和發(fā)展中國家都是重要的健康問題。據(jù)估計全世界人口的1-5％感染該病毒。HCV感染是輸血相關肝炎和經(jīng)常進一步導致的慢性肝損傷的最重要原因。而且有跡象暗示HCV在肝細胞癌誘導中作用。因此，迫切需要可靠的診斷方法和有效的治療劑。同時還需要對HCV污染的血液制品的敏感和特異的篩選方法以及培養(yǎng)HCV的改進方法。
HCV是由約9，400堿基組成的正鏈RNA病毒，編碼至少3個結(jié)構(gòu)蛋白和6個非結(jié)構(gòu)蛋白?；蛄型葱?，結(jié)構(gòu)蛋白功能性地分為1個核心蛋白和2個被膜蛋白E1和E2。E1蛋白包括192個氨基酸，含5-6個N-糖基化位點(根據(jù)HCV基因型)。根據(jù)HCV基因型，E2蛋白包括363-370個氨基酸，含9-11個N-糖基化位點(綜述見Major和Feinstone，1997；Maertens和Stuyver，1997)。E1蛋白包括多個可變區(qū)，而E2蛋白包括兩個高變區(qū)，其主區(qū)定位在蛋白的N末端(Maertens和Stuyver，1997)。被膜蛋白通過在大腸桿菌(Escherichia coli．)，昆蟲細胞，酵母細胞和哺乳動物細胞中運用重組技術制備。表達系統(tǒng)在高等真核生物尤其在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的運用導致產(chǎn)生上等質(zhì)量的被膜蛋白，即，在患者樣品中更有效被抗體識別，如Maertens等在PCT／EP 95／03031中所述。
目前，對細胞或組織中HCV的檢測主要依賴于對病毒RNA的證明。但是，在細胞或組織中檢測RNA是繁重的技術，包括RNA抽提及隨后的逆轉(zhuǎn)錄和嵌套式聚合酶鏈式反應，或原位PCR和雜交。因為這些技術易于得到假陽性反應性，病毒RNA檢測只能在血清樣品中進行。目前仍然缺乏在血清和組織樣品中檢測病毒蛋白抗原的可靠方法。
目前尚不能完全說明HCV的復制位點。一般接受的理論是病毒在肝細胞中復制，但在其它組織，如淋巴樣組織中的復制仍有爭議。因此，一個可靠的在細胞中檢測病毒蛋白或病毒本身的可靠方法可解決這個問題。
在細胞中對病毒蛋白的檢測因缺乏與病毒蛋白特異性結(jié)合及能夠識別天然HCV蛋白抗原(即由HCV感染后的宿主表達的抗原)的抗體而無法進行。結(jié)果僅有很少的研究證明病毒HCV蛋白在宿主細胞中的存在(綜述見Guido和Thung，1996)。而且宿主衍生的抗體運用于許多研究中。但是包括宿主衍生抗體的制備物不易復制，且這些制備物會被自身免疫抗體及抗其它已知或未知介質(zhì)的抗體污染。與之形成對照的是，在動物中通過重組抗原免疫接種制備的抗體可產(chǎn)生具有所需特異性的抗體。為具有復制性，優(yōu)選單克隆抗體。此外，HCV的被膜蛋白需通過哺乳動物表達系統(tǒng)產(chǎn)生高質(zhì)量抗原制備。目前，此表達條件存在不可理解的問題。因此，僅有極少單克隆抗體能用于在患者組織樣品中檢測HCV被膜抗原。這些抗體定向抗E1的N末端區(qū)域，氨基酸192-226(Hiramatsu等，1992，Kaito等，1994)或E2的C末端區(qū)，氨基酸451-715(Sansonno等，1997a，1997b)。但是，從這些出版物和Guido和Thung(1996)，Liang(1996)的綜述來看，很明顯仍需要在血清和組織樣品中進行有效和常規(guī)檢測天然HCV蛋白抗原的優(yōu)良特性的抗體。Dries等人的研究(1999)確認了這種需要。Dries小組工作證明61％HCV抗體陽性和血清RNA陽性個體是HCV的攜帶者，HCV RNA可在肝活組織檢查樣品中檢測到，但僅有1／3的病例可用系列抗體通過免疫組化探測。所以在肝活組織檢查中對HCV抗原的常規(guī)檢測仍缺乏敏感性，對體液如血清或血漿中的病毒抗原檢測也被相同問題所困擾。迄今為止，僅報道過一種技術可在這些體液中檢測核心抗原。但要檢測核心蛋白，此技術需要用氫氧化鈉對樣品中的核心蛋白進行完全變性。(Kashiwakuman等．．1996)總的來說，目前迫切需要對抗體可及的且能在組織或體液樣品中進行抗原檢測的新特異性HCV表位進行鑒定。HCV被膜蛋白是尋找這樣的表位的候選靶，因為這些蛋白應存在于所有生物樣品中在體液中，在病毒的膜上，以及存在于從早期感染(即病毒進入)直至完全復制周期的細胞中。但由于這些被膜蛋白變異多，因此需要對HCV的不同基因型具有高度交叉反應性的抗體。對這些表位的鑒定和針對HCV序列變異的具有高交叉反應性的抗體的研究是一項挑戰(zhàn)性的任務。
本申請涉及特異單克隆抗體，該抗體直接抗HCV被膜蛋白的特殊表位，可在患者組織樣本中檢測HCV抗原。一共發(fā)現(xiàn)2個該類表位及相應抗體一個位于被膜蛋白E1 C末端區(qū)(aa 227-383)，另一個位于E2 N-末端高變區(qū)(HVR)(aa 384-450)。盡管后一個區(qū)域，尤其是區(qū)域395-415，一般認為高變異，我們意外地得到一種與E2的HVR多種已知序列反應的抗體。
發(fā)明目的參閱文獻，很明顯目前迫切需要發(fā)展HCV的可靠診斷方法，可靠疫苗及有效治療劑。還需要對HCV污染血液制品的敏感特異篩選方法及培養(yǎng)HCV的改進方法。能夠在動物，或體外模型，或天然宿主中檢測該病毒的新抗體對設計有效診斷工具和治療劑會有幫助。在這一點上，本發(fā)明基于對直接抗E1或E2-HVR的單克隆抗體的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該抗體可用于在不同組織或細胞中檢測HCV抗原。這些組織包括肝和衍生自血液樣本的細胞。所以，本發(fā)明致力于提供并運用與HCV被膜蛋白區(qū)aa 227-450，包括E1蛋白的主要部分(C末端)，和E2蛋白的N末端區(qū)域，特異性結(jié)合的抗體。這些抗體能夠檢測天然HCV蛋白抗原，可用于制備天然HCV蛋白抗原檢測試劑盒。值得注意的是，完整的E1蛋白相應于氨基酸192-383；而完整的E2蛋白相應于氨基酸384-747(Major和Feinstone，1997；Maertens和Stuyver，1997)。
特別地，本發(fā)明旨在提供和運用如上述的抗體，這些抗體與以下表位中的至少一個結(jié)合HCV E1蛋白(SEQ ID 30)的aa 307-326。
HCV E2蛋白(SEQ ID 31)的aa 395-415。
此外，本發(fā)明旨在提供和運用如上所定義的單克隆抗體。在這點上，本發(fā)明旨在提供和運用由歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)保藏的登記號為98031215或98031214的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
應明確本發(fā)明還旨在提供和運用上述抗體的任何功能相同的變種或片斷，以及其突變形式，或表現(xiàn)具有相似的功能性與SEQ ID 30和31結(jié)合反應性的分子，如從噬菌體或其它文庫中獲得的序列。
此外，本發(fā)明旨在提供和運用分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，所分泌的單克隆抗體特異性與HCV E1蛋白(aa 227-383)或HCV E2N-末端高變區(qū)(aa 384-450)結(jié)合且能探測天然HCV蛋白抗原，能用于天然HCV蛋白抗原檢測試劑盒的制備。特別是，本發(fā)明旨在提供并運用相應于歐洲動物細胞保藏中心貯藏的登記號為98031215或98031214的雜交瘤細胞系。
此外，本發(fā)明還致力于提供檢測天然HCV蛋白抗原的方法，包括將可能含HCV蛋白抗原的檢測樣本與如上定義的抗體或所述抗體的功能相同變種或片段相接觸，以形成抗體-抗原復合物，并用適當標記物確定所述抗原抗體復合物。
本發(fā)明尤其旨在提供以上定義的方法，其中所述檢測樣本包括人類細胞，如外周血細胞，或人的組織，如肝組織。
最后，本發(fā)明目的在于提供檢測天然HCV蛋白抗原的試劑盒，包括一種如上定義的抗體，或所述抗體的功能相同的變種或片斷，和一能確定在待測樣本的HCV蛋白抗原和所述抗體或所述抗體的功能相同的變種或片斷之間形成的復合體。
本發(fā)明的所有目的可由以下列出的實施方案實現(xiàn)。
附圖及表格簡述表1提供本申請?zhí)岬降乃须牡碾男蛄小?br> 表2顯示IGH 222對E2的高變區(qū)不同序列的交叉反應性。所有肽由生物素化，與鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板結(jié)合并能與IGH 222反應。


圖1示對E2抗原的染色，單克隆抗體IGH 222HCV患者的肝組織檢查樣免疫染色。免疫組化在新鮮冰凍物質(zhì)的4μm厚恒冷箱切片上進行(肝活組織檢查樣在液氮冷卻的異戊烷中速凍，-70℃貯存至使用)，采用3步間接免疫過氧化物酶方法。切片于40℃加單克隆抗體IGH 222(純化的IgG110ng／μl)孵育過夜。二抗和三抗分別包括過氧化物酶結(jié)合的兔抗鼠和過氧化物酶結(jié)合的豬抗兔IgG(Dakopatts，Copenhagen，丹麥；工作稀釋度分別為1／50和1／100)。溫育物在室溫放置30分鐘，磷酸緩沖鹽(pH7．2)溶液洗3次。反應產(chǎn)物繼續(xù)在含0．05％3-氨基-9-乙基咔唑和0．01％H2O2的100mM乙酸鹽緩沖液(pH5．2)中孵育15分鐘；在免疫活性位點得到明亮紅色染色。切片用蘇木精復染。對照(未出示)包括與一抗相同的同型Ig的不相關單克隆抗體，或僅有色原；這些對照一致為陰性。照片放大25倍。最深染色顯示肝細胞中HCV抗原的存在(見箭頭)。
圖2A顯示E1抗原的染色情況，由單克隆抗體IGH 207對HCV患者的肝活組織檢查樣品免疫染色。以下方法與圖1中描述的相同，但單克隆抗體濃度為30ng／μl。圖片將淋巴細胞浸液中細胞染色呈顯性的部分放大10倍。深染表示在肝細胞(見箭頭)和浸潤淋巴細胞(見雙箭頭)中的HCV抗原的存在。
圖2B顯示E1抗原的染色情況，由單克隆抗體IGH 210對HCV患者的肝活組織檢查樣品免疫染色。肝活組織檢查樣品用甲醛固定，在石蠟中包埋。切片熱預處理(微波方式)并用蛋白酶消化?？贵w濃度為6ng／μl。圖片顯示在一片肝細胞區(qū)域中的清晰染色的分離的單核細胞(箭頭)；而肝細胞不被此單克隆抗體染色。
圖3示單克隆抗體IGH 207對外周血單核細胞中胞內(nèi)E1抗原的染色。外周白血細胞(0．5×106)懸浮在200μl PBS-0．1％皂苷，加2μg IGH 207，4℃反應25分鐘。3ml PBS-0．1％皂苷洗細胞3次，PBS-0．2％NaN3洗細胞3次。細胞最后在250μl PBS-0．2％NaN3中重懸，流式細胞術分析。劃出單核細胞部分(右圖)，繪制其熒光(左圖)。樣品1-5來自HCV慢性帶菌者，而樣品6來自健康血液者。左圖示劃為單核細胞部分的2個樣(樣2和6)，而右圖表示這些單核細胞中的熒光。使用此單克隆抗體，對照樣品完全不被染色，所有HCV患者樣中存在顯著陽性信號，除患者4的樣品中信號較弱。
圖4示由單克隆抗體IGH 201對外周血單核細胞的胞內(nèi)E1抗原染色情況。此技術與圖3所述相同，樣品7-11來自HCV慢性帶菌者，而樣品12來自健康血液者。左圖示劃為單核細胞部分的2個樣(樣7和12)，而右圖表示這些單核細胞中的熒光。盡管對照樣顯示較高的背景染色，患者樣品中的反應根據(jù)兩個可探測的群體仍可容易地區(qū)分，這兩個群體是，與對照中相同染色的群體和對照中不可見的高強度染色的群體。
發(fā)明詳述在此描述的發(fā)明描繪了以往發(fā)表的工作以及待決的專利申請。通過實例的形式，這些工作包括科學論文，專利或待決的專利申請。所有這些在本文前后引用出版物和申請，均納入?yún)⒖嘉墨I。
很明顯，缺乏與病毒蛋白特異性結(jié)合及能識別天然HCV蛋白抗原(即由感染HCV的宿主表達的抗原)的抗體，阻礙了對病毒蛋白的檢測。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)HCV被膜蛋白上2個新表位，通過能定向抗這些表位的抗體，使得在來自宿主的生物樣本中能進行對天然HCV蛋白抗原的常規(guī)檢測。因此，本發(fā)明涉及與HCV E1蛋白(aa 227-383)C末端區(qū)域或HCV E2蛋白(aa 384-450)N末端區(qū)域特異結(jié)合的抗體在天然HCV蛋白抗原檢測試劑盒的應用。術語“與HCV E1蛋白(aa 227-383)或HCV E2蛋白(aa384-450)N末端區(qū)特異結(jié)合的抗體”指與丙型肝炎病毒顆粒或任何從所述病毒顆粒衍生的分子，尤其是E1蛋白的C末端區(qū)域和E2蛋白的N末端區(qū)域結(jié)合的任何多克隆或單克隆抗體。HCV病毒的“被膜區(qū)”，和HCV E1蛋白(aa 227-383)的C末端區(qū)域或HCV E2蛋白(aa 384-450)的N末端區(qū)域，為本領域技術人員熟知的區(qū)域(Wengler，1991；Major和Feinstone，1997；Maertens和Stuyver，1997)。
術語“結(jié)合”意味著本發(fā)明的抗體與HCV蛋白物理結(jié)合。特別地，抗體與HCV被膜蛋白特異性結(jié)合，意味著基本上不存在與HCV的其它組分或其它蛋白的交叉反應?？贵w與HCV蛋白的結(jié)合可通過本領域熟知的任何方法或化驗證明，如結(jié)合-ELISA和RIA型分析或競爭分析(例見免疫學常用方法)。應該明確與抗體結(jié)合的HCV被膜蛋白的區(qū)域不需包括鄰接的序列。
在此所用術語“單克隆抗體”指具均一抗體群的抗體組合物。此術語不限抗體的種或來源，也不限制獲得抗體的方式。此外，術語“抗體”也指人源化抗體，其中，免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)的至少一部分來自人免疫球蛋白序列，且單鏈構(gòu)體如美國專利No．4，946，778所述，抗體的片段如Fab，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)v和其它片段保持親本抗體的抗原結(jié)合功能和特異性。術語“抗體”還包括雙體，三體和四價抗體，如歐洲申請No．97870092．0中Lorré等所述，它們保持親本抗體的結(jié)合功能和特異性。應明確如本發(fā)明所述的抗體可應用于天然HCV蛋白抗原的檢測方法。
術語“待測樣本”指從宿主獲得的任何樣品，如血清，血漿，粘液，脊髓液，或活組織檢查。在這點上，術語“待測樣本”和“生物樣本”在此可交換使用。術語“活組織檢查”尤其指包括細胞，特別是人細胞的樣本。此外，“活組織檢查”也指由液體組織，如外周血細胞，或由固體組織，如肝組織，衍生的樣品。倘若在活組織檢查中進行抗原檢查，使用術語“原位檢測”。
術語“天然HCV蛋白抗原檢測試劑盒”指用于對任何HCV蛋白抗原檢測的試劑盒，優(yōu)選對處于天然或最初位置的HCV E1蛋白(aa 227-383)的C末端區(qū)或HCV E2蛋白(aa 384-450)的N末端區(qū)檢測，優(yōu)選在待測樣本中存在的抗原，采用本領域技術人員熟知的方法。換而言之，此術語指對天然宿主細胞或組織中HCV E1(aa 227-383)蛋白的C末端區(qū)或HCV E2蛋白(aa 384-450)的N末端區(qū)域的存在進行顯色，通過用本發(fā)明的抗體結(jié)合的方法。此檢測試劑盒包括以下部分(ⅰ)需要時，分離待測樣本的裝置，(ⅱ)可能的，透化細胞的溶液(ⅲ)本文描述的抗體，或功能相同的變種或其片段(ⅳ)可能的二級和三級抗體(ⅴ)可能的孵育和／或漂洗緩沖液(ⅵ)可能的染色液優(yōu)選地，該試劑盒用于對HCV被膜蛋白原位檢測。
天然宿主細胞或組織可為從任何宿主種衍生的任何宿主細胞或組織。特別地，天然宿主細胞指外周血細胞，天然組織指肝組織(見本申請的實施例部分)。天然宿主指，特別指人但也指非人靈長類或其它哺乳動物。
更具體地，本發(fā)明涉及與以下表位中的至少一個特異性結(jié)合的抗體，這些表位為HCF E1蛋白的aa 307-326和HCV E2蛋白的aa 395-415。后一種抗體由歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)保藏的雜交瘤分泌，ECACC位于英國Wiltshire SP4 OJK，Salisbury應用微生物及研究中心，(電話+441980612512；傳真+441980611315)，保藏日期為1998年3月13日，登記號98031215為分泌與表位aa 395-415(SEQ ID 31)結(jié)合的mAb IGH 222的雜交瘤17H10F4D10，98031214為分泌與表位aa 307-326(SEQ ID 30)結(jié)合的mAb IGH 207的雜交瘤14H11B2。在這點上，應明確與所述表位結(jié)合的抗體也是本發(fā)明的部位。例如，與以下表位結(jié)合的抗體aa307-311，aa308-312，aa309-313，aa310-314，aa311-315，aa312-316，aa312-317，aa313-318，aa314-319，aa315-320，aa316-321，aa317-322，aa318-323，aa319-324，aa320-325，aa321-326，aa307-312，aa308-313，aa309-314，aa310-315，aa311-316，aa312-317，aa313-318，aa314-319，aa315-320，aa316-321，aa317-322，aa318-323，aa319-324，aa320-325，aa321-326，aa307-313，aa308-314，aa309-315，aa310-316，aa311-317，aa312-318，aa313-319，aa314-320，aa315-321，aa316-322，aa317-323，aa318-324，aa319-325，aa320-326，aa307-314，aa308-315，aa309-316，aa310-317，aa311-318，aa312-319，aa313-320，aa314-321，aa315-322，aa316-323，aa317-324，aa318-325，aa319-326，aa307-315，aa308-316，aa309-317，aa310-318，aa311-319，aa312-320，aa313-321，aa314-322，aa315-323，aa316-324，aa317-325，aa318-326，aa307-316，aa308-317，aa309-318，aa310-319，aa311-320，aa312-321，aa313-322，aa314-323，aa315-324，aa316-325，aa317-326，aa307-317，aa308-318，aa309-319，aa310-320，aa311-321，aa312-322，aa313-323，aa314-324，aa315-325，aa316-326，aa307-318，aa308-319，aa309-320，aa310-321，aa311-322，aa312-323，aa313-324，aa314-325，aa315-326，aa307-319，aa308-320，aa309-321，aa310-322，aa311-323，aa312-324，aa313-325，aa314-326，aa307-320，aa308-321，aa309-322，aa310-323，aa311-324，aa312-325，aa313-326，aa307-321，aa308-322，aa309-323，aa310-324，aa311-325，aa312-326，aa307-322，aa308-323，aa309-324，aa310-325，aa311-326，aa307-323，aa308-324，aa309-325，aa310-326，aa307-324，aa308-325，aa309-326，aa307-325，aa308-326，and，aa395-399，aa396-400，aa397-401，aa398-402，aa399-403，aa400-404，aa401-405，aa402-406，aa403-407，aa404-408，aa405-409，aa406-410，aa407-411，aa408-412，aa409-413，aa410-414，aa411-415，aa395-400，aa396-401，aa397-402，aa398-403，aa399-404，aa400-405，aa401-406，aa402-407，aa403-408，aa404-409，aa405-410，aa406-411，aa407-412，aa408-413，aa409-414，aa410-415，aa395-401，aa396-402，aa397-403，aa398-404，aa399-405，aa400-406，aa401-407，aa402-408，aa403-409，aa404-410，aa405-411，aa406-412，aa407-413，aa408-414，aa409-415，aa395-402，aa396-403，aa397-404，aa398-405，aa399-406，aa400-407，aa401-408，aa402-409，aa403-410，aa404-411，aa405-412，aa406-413，aa407-414，aa408-415，aa395-403，aa396-404，aa397-405，aa398-406，aa399-407，aa400-408，aa401-409，aa402-410，aa403-411，aa404-412，aa405-413，aa406-414，aa407-415，aa395-403，aa396-404，aa397-405，aa398-406，aa399-407，aa400-408，aa401-409，aa402-410，aa403-411，aa404-412，aa405-413，aa406-414，aa407-415，aa395-404，aa396-405，aa397-406，aa398-407，aa399-408，aa400-409，aa401-410，aa402-411，aa403-412，aa404-413，aa405-414，aa406-415，aa395-405，aa396-406，aa397-407，aa398-408，aa399-409，aa400-410，aa401-411，aa402-412，aa403-413，aa404-414，aa405-415，aa395-406，aa396-407，aa397-408，aa398-409，aa399-410，aa400-411，aa401-412，aa402-413，aa403-414，aa404-415，aa395-407，aa396-408，aa397-409，aa398-410，aa399-411，aa400-412，aa401-413，aa402-414，aa403-415，aa395-408，aa396-409，aa397-410，aa398-411，aa399-412，aa400-413，aa401-414，aa402-415，aa395-409，aa396-410，aa397-411，aa398-412，aa399-413，aa400-414，aa401-415，aa395-410，aa396-411，aa397-412，aa398-413，aa399-414，aa400-415，aa395-411，aa396-412，aa397-413，aa398-414，aa399-415，aa395-412，aa396-413，aa397-414，aa398-415，aa395-413，aa396-414，aa397-415，aa395-414 and 396-415。
本發(fā)明還涉及以上提到抗體的功能相同變種或片段。術語“功能相同的變種或片段”指所述抗體在本領域熟知的任何變種或片段，它們保持親本抗體的抗原結(jié)合功能和特異性。
特別地，后一種術語指如前定義的人源化抗體和單鏈抗體以及抗體片段如Fab，F(xiàn)’(ab)2，F(xiàn)v等等。同樣還包括雙體，三體和四價抗體及其突變形式，或表現(xiàn)與SEQ ID 30和31相同功能的結(jié)合反應性的分子，如來自噬菌體或其它文庫的序列，如Ladner，1995；Maclennan，1995和cannon等，1996所述。事實上，這些作者描述的任何肽，凡是能對天然HCV蛋白抗原檢測的，均屬本發(fā)明的部分。
本發(fā)明還涉及分泌如上定義的抗體的雜交瘤細胞系。在這點上，應明確獲得mAbs的雜交瘤技術為本領域技術人員熟知，例，參照Kohler和Milstein(1975)。應明確，對mAbs特異性結(jié)合的表位作圖能通過本領域熟知的任何方法進行，如PCT／EP 97／07268中Depla等描述的。
本發(fā)明還涉及檢測天然HCV蛋白抗原的方法，包括-使用以上定義的抗體或該抗體的功能相同變種或片段與可能含HCV蛋白抗原的待測樣本接觸，形成抗體-抗原復合物，并-用適當標記物確定抗原-抗體復合物。
優(yōu)選該抗體用于HCV被膜蛋白的原位檢測。
術語“用適當標記物確定抗原-抗體復合物”指檢測或顯色以上提到的抗原-抗體復合物的本領域熟知的任何方法，如熒光流式細胞術，結(jié)合一，ELISA-和RIA型分析或競爭分析(見實施例部分，Hertog等，1993，和WO 93／04084 Mehta等)。同樣地，術語“適當?shù)臉擞浳铩敝副绢I域熟知的任何標記物，如Mehta等和Coligan等WO93／04084，1992中所述，對以上提到的抗原抗體復合物顯色。
在此方面，本發(fā)明還涉及檢測天然HCV蛋白抗原的分析試劑盒，包括如上定義的抗體或該抗體的功能相同變種或片段，和能確定待測樣本中HCV蛋白抗原和所述抗體或該抗體的功能相同變種或片段形成的復合物的適當?shù)臉擞浳铩?br> 本發(fā)明參考以下闡述具體有利的實施方案的實例說明。但必須指出這些實施方案僅作說明而本發(fā)明不限于此。
實施例實施例1抗E1和E2的單克隆抗體的產(chǎn)生用由重組痘苗病毒產(chǎn)生的截短的E1(aa 192-326)和E2(aa 384-673)免疫小鼠，如Maertens等在PCT／EP 95／03031中所述。免疫后，將鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞系融合。所獲的分泌對E1或E2特異的雜交瘤通過ELISA選擇。
實施例2單克隆抗體的選擇一系列(共25種，詳細列出14種，其余可從InnogeneticsNv，Gent．比利時，獲得)定向抗E1或E2的單克隆通過對HCV患者肝活組織檢查中的天然HCV抗原的染色來評估(見下文)。染色在冰冷切片或甲醛固定的活組織檢查樣上進行(步驟見附圖)。僅三種單克隆抗體表現(xiàn)了清晰和特異的染色。所有其它單克隆抗體或是染色非常弱或無，或是非特異性染色。值得注意的有兩種不同抗原染色模式。定向抗E2的單克隆抗體IGH 222清晰染色的肝細胞(圖1)，定向抗E1的IGH 207和IGH 210，染色在肝中滲透的淋巴細胞(圖2a和2b)。IGH 207也可染色肝細胞，但與IGH 222比較，著色弱(比較圖1和2a)。5個不同患者的一系列活組織檢查樣肯定了此染色模式。單克隆被膜染色模式IGH 200E1 陰性IGH 201E1弱IGH 202E1陰性IGH 204E1弱IGH 207E1淋巴細胞強陽性，肝細胞弱陽性IGH 209E1陰性IGH 210E1淋巴細胞陽性(僅在甲醛固定后顯著)IGH 212E2弱IGH 214E2陰性IGH 215E2陰性IGH 216E2陰性IGH 219E2陰性IGH 221E2陰性IGH 222E2肝細胞強陽性實施例3對能在外周血細胞中進行病毒被膜抗原檢測的單克隆抗體的鑒別滲透在肝中的淋巴細胞可進行HCV被膜抗原的染色，這發(fā)現(xiàn)使我們著眼于外周血單核細胞。為進行胞內(nèi)染色，用皂苷滲透外周血細胞，此后與單克隆抗體IGH 201或207(定向抗E1，分別在肝活組織檢查樣上表現(xiàn)弱和強陽性)。最后使用二級FITC標記的抗體在熒光細胞分選儀上檢查反應活性。IGH 207，在肝中滲透的淋巴細胞中著色，表現(xiàn)為高特異性。使用此單克隆抗體，本底幾乎為零，5個患者中4個樣清晰染色陽性(圖3)。第2個單克隆，IGH 201(與SEQ ID29結(jié)合，ECACC登記號98031216)也定向抗E1，產(chǎn)生較高本底，但5個患者樣本中都檢測到細胞內(nèi)E1，可從圖4的直方圖推論出，與對照樣相比，該圖表現(xiàn)一個清晰的亞細胞群具有高度的熒光。
實施例4抗E1或E2的活性單克隆抗體作圖對所有14個單克隆抗體作圖，繪出各自的表位，使用肽掃描E1和E2蛋白，找出抗體隆起的。這些肽經(jīng)生物素化，與鏈霉抗生物素蛋白敏化的微量滴定板結(jié)合，能夠與單克隆抗體反應。重組被膜蛋白檢測作為陽性對照。
每種單克隆抗體活性分配在由兩種重疊肽定義的特異性表位區(qū)(序列詳見表1)。肽aa區(qū) 活性單克隆V1V2 192-226IGH 201，204，202，200V2V3 212-244IGH 201，204，202，200V3V4 230-263HR261-290V5C4 288-327IGH 207，210，209C4V6 307-340IGH 207，210，209重組體192-326IGH 201，207，210，204，202，200，209HVRⅠ 384-415IGH 222，215HVR1／C1a 395-428IGH 222，215C1a 413-447C1b 430-467HVRⅡ 460-487IGH 212，214，221C2a 480-513IGH 219，216C2b 500-530V3-C3 523-566V4561-590C4a 578-627C4b 621-648C4c 641-673重組體384-673IGH 222，215，212，214，221，219，216IGH 201的表位定義為區(qū)域212-226(SEQ ID 29)，IGH 207和IGH 210的表位為307-326(SEQ ID 30)，IGH 222的表位為395-415(SEQ ID 31)。IGH 201的表位的氨基酸區(qū)為HCV的E1蛋白的可變區(qū)，在HCV的原位檢測中曾報道過(Hiramatsu等，1992，Kaito等，1994)。但從我們的研究看來，定向抗此表位的抗體不適宜進行HCV的原位檢測，因用此抗體進行的肝活組織檢測染色為陰性而對外周血淋巴細胞染色有相當高的本底。與之對照，IGH 207和IGH 210識別E1的完全保守區(qū)(Maertens和Stuyver，1997)。單克隆抗體IGH 222識別E2的一個區(qū)，此區(qū)為E2的N末端高變區(qū)的部分，經(jīng)證明適于有效的HCV原位檢測。
實施例5不同表位上交叉反應的確定使用E2的N末端高變表位的不同序列衍生的肽的擴充序列，進一步辨別IGH 222。表2顯示這些實驗的概要。從該表可得出結(jié)論此單克隆抗體與若干序列反應而與其它若干不反應。本領域技術人員了解此表位，則足以添加抗此表位的額外抗體，它們對IGH 222不能識別的其它序列具更好活性。順便舉例，這些序列的肽編號為490，940，884，484和494，但在aa 395-415的區(qū)中其它序列可能抗IGH222與之無反應活性的區(qū)域。
從這些實施例明顯可知，單克隆抗體IGH 201，207，210和222識別的表位容易為結(jié)合抗體進入，且能在肝活組織檢查和外周血細胞中進行抗原檢測。單克隆抗體IGH 201，207，210和222的特性是唯一的，其它定向抗相同表位的單克隆抗體導致高本底和非特異性染色。例如，單克隆抗體IGH 207，209和210都識別相同表位，但IGH209不能在任何細胞型中對E1抗原染色，而IGH 210僅對淋巴細胞著色，IGH 207既可染淋巴細胞，又可染肝細胞。根據(jù)本發(fā)明，本領域技術人員可生產(chǎn)大量系列的抗體(在不同種中天然多克隆或單克隆類型)，可將其用于檢測天然HCV蛋白抗原。
對抗指定表位的一系列抗體的生產(chǎn)需求反映以下事實抗體的功效不僅由識別的表位確定，還決定于次要特性如表位的親合性和親合力，溶解度，等模式，和產(chǎn)生表位的種類。對于抗體的每種應用，可能需要不同的次要特性。因此，這樣的大的系列的抗體制備能夠確認與IGH 201，207，210和222具相同特性的抗體，即能在宿主的生物學樣本中顯示HCV被膜蛋白的存在。實際上，這些表位在宿主表達的HCV被膜蛋白上，可達到的特性，為發(fā)展不僅如此所述的原位檢測，而且在溶液中(例血漿或血清)檢測這些抗原的分析，提供了必要的信息。單克隆抗體IGH 201，207，210或222，或其它抗相同表位但有最佳的檢測溶解的抗原特性的抗體，或可能是幾種抗體的組合，也能用于發(fā)展這些的分析。
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表1E1肽 基因型 名字 # 氨基酸YQVRNSTGLYHVTNDCPNSSIVYEAADAILHTPGC 1a V1V21071 192-226YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGC 1b V1V2888 192-226VEVKNNSNSYMATNDCSNSSIIWQLEGAVLHTPGC 2a V1V21019 192-226VEVKNTSTSYMVTNDCSNSSIVWQLEGAVLHTPGC 2c V1V21074 192-226LEWRNTSGLYVLTNDCSNSSIVYEADDVILHTPGC 3 V1V21008 192-226INYRNVSGIYHVTNDCPNSSIVYEADHHILHLPGC 4 V1V21075 192-226VPYRNASGIYHITNDCPNSSIVYEADNLILHAPGC 5 V1V21084 192-226LTYGNSSGLYHLTNDCSNSSIVLEADAMILHLPGC 6 V1V21023／1085 192-226LNYANKSGLYHLTNDCPNSSIVYEANGMILHLPG 7 V1V21334 192-225IQVKNASGIYHLTNDCSNSSIVFEAETMILHLPGC 9 V1V21333 192-226LEYRNASGLYWVTNDCSNGSIVYEAGDIILHLPGC 10 V1V21332 192-226IVYEAADMIMHTPGCVPCVRENNSSRCWV1b V2V31036 212-244VRENNSSRCWVALTPTLAARNASVPTTTIRRHVD 1b V3V41022 230-263HVDLLVGAAAFCSAMYVGDLCGSVFLVSQL 1b HR 1150 261-290SQLFTISPRRHETVQDCNCSIYPGHITGHRMAWDMMMNWS 1b V5C41176 288-327SIYPGHITGHRMAWDMMMNWSPTTALVVSQLLRI 1b C4V61039 307-340
續(xù)表1E2肽 基因型 名字 # 氨基酸HTRVSGGAAASNTRGLVSLFSPGSAQKIQLVN1b HVRⅠ 1139384-415NTRGLVSLFSPGSAQKIQLVNTNGSWHINRTALN 1b HVRⅠ／C1a 1173395-428LVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKF 1b C1a1149413-447NDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQ 1b C1b1148430-467RSIDKFAQGWGPLTYTEPNSSDQRPYCW1b HVRⅡ 1020460-487SDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSP 1b C2a1147480-513SQVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRFGVPTYNWG 1b C2b1143500-530GVPTYNWGANDSDVLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGG1b V3-C3 1178523-566TKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHP 1b V4 1142561-590TDCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIF 1b C4a16 583-627TVNFTIFKVRMYVGGVEHRFEAACNWTR1b C4b1141621-648EAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQ 1b C4c1140641-673KTTNRLVSMFASGPKQNVHLINT -HVRⅠ 485 394-416HTTSTLASLFSPGASQRIQLVNT -HVRⅠ 492 395-416HVTCTLTSLFRPGASQKIQLVNT -HVRⅠ 489 394-416AHNARTLTGMFSLGARQKIQLINT-HVRⅠ 520 394-416SDTRGLVSLFSPGSAQKIQLVNT -HVRⅠ 886 394-416SSTQSLVSWLSQGPSQKIQLVNT -HVRⅠ 494 394-416HTMTGIVRFFAPGPKQNVHLINT -HVRⅠ 484 394-416RAMSGLVSLFTPGAKQNIQLINT -HVRⅠ 884 394-416HVTGTLTSLFRPGASQKIQLVNT -HVRⅠ 940 394-416
表2序列 # 氨基酸區(qū)域IGH 222識別HTRVSGGAAASNTRGLVSLFSPGSAQKIQLVN 1139 384-415+KTTNRLVSMFASGPKQNVHLINT 485 394-416 +HTTSTLASLFSPGASQRIQLVNT 492 395-416 +AHNARTLTGMFSLGARQKIQLINT 520 394-416 +SDTRGLVSLFSPGSAQKIQLVNT 886 394-416 +SSTQSLVSWLSQGPSQKIQLVNT 494 394-416 -HTMTGIVRFFAPGPKQNVHLINT 484 394-416 -RAMSGLVSLFTPGAKQNIQLINT 884 394-416 -HVTGTLTSLFRPGASQKIQLVNT 940 394-416 -RTTQGLVSLFSRGAKQDIQLINT 490 394-416 -明顯顯示不與IGH 222反應的肽中的非保守的突變
權利要求
1．與HCV E1蛋白(aa227-383)的C末端區(qū)或HCV E2蛋白(aa384-450)的N末端區(qū)特異性結(jié)合的抗體在制備天然HCV蛋白抗原檢測試劑盒中的應用。
2．根據(jù)權利要求1的抗體的應用，其中所述抗體與以下表位中的一個特異性結(jié)合-HCV E1蛋白(SEQ ID 30)的aa 307-326-HCV E2蛋白(SEQ ID 31)的aa 395-415。
3．根據(jù)權利要求1或2的抗體的應用，其中所述抗體為單克隆抗體。
4．根據(jù)權利要求1至3任一項的抗體的應用，其中所述抗體由ECACC登記號為98031214或98031215的保藏物分泌。
5．根據(jù)權利要求1至4任一項的抗體的功能相同變體或其片段的應用。
6．登記號98031214的ECACC保藏物分泌的單克隆抗體。
7．根據(jù)權利要求6的抗體的功能相同變體或其片段。
8．登記號為98031214的ECACC保藏物的雜交瘤細胞系。
9．檢測天然HCV蛋白抗原的方法，包括將可能含HCV蛋白抗原的待測蛋白與根據(jù)權利要求1至4的任意一項的抗體或該抗體的功能相同變體或片段接觸，形成抗體-抗原復合物，和用適當標記物確定所述抗原抗體復合物。
10．根據(jù)權利要求9的方法，其中所述待測樣本包括人細胞或組織。
11．根據(jù)權利要求10的方法，其中所述人細胞是外周血細胞。
12．根據(jù)權利要求10的方法，其中所述人組織為肝組織。
13．用于天然HCV蛋白抗原檢測的分析試劑盒，包括一種根據(jù)權利要求1至4中任一項的抗體，或所述抗體的功能相同變體或片段，和能夠確定在待測樣本中的HCV蛋白抗原和所述抗體或該抗體的功能相同變體或片段之間形成的復合物的適當?shù)臉擞浳铩?br> 全文摘要
對HCV被膜蛋白上兩個新表位的抗體進行鑒定,從而使在寄主的組織或衍生細胞中對天然HCV被膜抗原的常規(guī)檢測成為可能。新表位為:E1區(qū)氨基酸307—326和E2區(qū)N末端高變區(qū)氨基酸395—415。驚人地,我們描述一種與E2高變區(qū)不同的序列反應的抗體的特性。在此描述特異性單克隆抗體,它們定向抗這些表位并使對病毒抗原的常規(guī)檢測成為可能。
文檔編號C12N5/10GK1294598SQ99804420
公開日2001年5月9日 申請日期1999年3月29日 優(yōu)先權日1998年3月27日
發(fā)明者G·梅爾滕斯, E·德普拉, M·－A·比斯 申請人:基因創(chuàng)新有限公司