專利名稱：Mage家族腫瘤相關抗原衍生物及其編碼核酸序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于包含腫瘤相關抗原的蛋白質衍生物，發(fā)現它具有癌癥疫苗治療效用。詳細地說，本發(fā)明的衍生物包括含有一種抗原的融合蛋白，此抗原是由MAGE基因家族(例如MAGE-3，MAGE-1)編碼的，并連接于一個提供T輔助表位的免疫融合配偶體例如來自流感嗜血桿菌B的蛋白D脂質化形式；還包括化學修飾的MAGE蛋白，其中抗原的二硫鍵被還原，所形成的巰基被阻斷，以及還包括基因修飾的MAGE蛋白，提供了一種親和性標記和/或基因修飾防止二硫橋形成。還描述了純化MAGE蛋白，配制疫苗用于治療一系列癌癥的方法，所治療的癌癥包括，但不局限于黑素瘤，乳腺癌，膀胱癌，肺癌，NSCLC，頭和扁平細胞癌，結腸癌，以及食道癌。
在黑素瘤細胞(包括惡性黑素瘤)以及包括NSCLC(非小細胞肺癌)，頭和頸扁平細胞癌，膀胱移行細胞癌和食道癌的其它一些癌細胞上，可顯著地表達由MAGE基因家族編碼的抗原，但是，在除了睪丸和胎盤之外的正常組織上不能檢測出此抗原(Gaugler，1994；Weynants，1994；Patard，1995)。在69％的黑素瘤中可表達MAGE-3(Gaugler，1994)，在44％的NSCLC(Yoshimatsu 1988)，48％頭和頸扁平細胞癌，34％膀胱移行細胞癌，57％食道癌，32％結腸癌，以及在24％乳腺癌中(Van Pel，1995；Inoue，1995；Fujie 1997；Nishimura 1997)，也可檢測出MAGE-3。表達MAGE蛋白的癌癥被稱為Mage相關腫瘤。
在應用黑素瘤細胞和自體淋巴細胞混合培養(yǎng)物的實驗中，已巧妙地證實人黑素瘤細胞具有免疫原性。這些培養(yǎng)物經常會產生特異性的細胞毒T淋巴細胞(CTLs)，這種細胞能夠專一性地裂解自體黑素瘤細胞，但是不能裂解自體成纖維細胞，也不能裂解自體的EBV-轉化的B淋巴細胞(Knuth，1984；Anichini，1987)。現在，在自體黑素瘤細胞上已鑒定了幾種可由這些CTL克隆識別的抗原，包括MAGE家族的抗原。
在自體黑素瘤細胞上，由于它被特異性CTLs識別而被確定的第一種抗原被稱為MZ2-E(Vanden Eynde，1989)，并且此抗原是由基因MAGE-1編碼的(Vander Brnggen，1991)。定向針對MZ2-E的CTLs可識別和裂解來自自體的以及來自其它病人的MZ2-E陽性黑素瘤細胞，只要這些細胞具有HLA.A1等位基因。
MAGE-1基因屬于12個密切相關基因的家族，MAGE 1，MAGE 2，MAGE 3，MAGE 4，MAGE 5，MAGE 6，MAGE 7，MAGE 8，MAGE 9，MAGE 10，MAGE 11，MAGE 12，它們定位于染色體X上，并且在它們的編碼序列中彼此共有64％-85％的同源性(De Plaen，1994)。有時它們被稱為MAGE A1，MAGE A2，MAGE A3，MAGE A4，MAGE A5，MAGE A6，MAGEA7，MAGE A8，MAGE A9，MAGE A10，MAGE A11，MAGE A12(MAGE A家族)。另二類蛋白質也是MAGE家族的一部分，盡管相關性較遠。它們是MAGE B和MAGE C家族。MAGE B家族包括MAGE B1(也稱為MAGEXp1，和DAM 10)，MAGE B2(也稱為MAGE Xp2和DAM 6)，BAGE B3和MAGE B4，MAGE C家族目前包括MAGE C1和MAGE C2。一般來說，可將MAGE蛋白定義為含有朝向蛋白質C-末端定位的核心序列標記(例如對于MAGE A1，一種309個氨基酸的蛋白質，其核心標記相當于氨基酸195-279)。
可按如下描述此核心標記的共有模式，其中X代表任何一種氨基酸，小寫字體殘基是保守的(所允許的保守性突變體)，大寫字體殘基是完全保守的。
核心序列標記LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv保守性取代是熟知的，在序列對比計算機程序中一般是作為默認計分矩陣(default scoring metrices)被產生。這類程序包括PAM250(Dayhoft M.O.等，(1978)，“蛋白質中的進化改變模型”，在“蛋白質序列和結構圖集”5(3)M.O.Dayhoft(ed)，345-352中)，國家生物醫(yī)學研究基地，Washington，和Blosum 62(Steven Henikoft and JorjaG，Henikoft(1992)，“來自蛋白質模塊的氨基酸取代矩陣”)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(生物化學)10915-10919。
一般來說，在如下種類之內的取代是保守性取代，但是在各種類之間的取代被認為是非保守性的。這些種類是ⅰ)天冬氨酸/天冬酰胺/谷氨酸/谷氨酰胺ⅱ)絲氨酸/蘇氨酸ⅲ)賴氨酸/精氨酸ⅳ)苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸ⅴ)亮氨酸/異亮氨酸/纈氨酸/甲硫氨酸ⅵ)甘氨酸/丙氨酸通常根據本發(fā)明，MAGE蛋白在此核心區(qū)內與MAGE A1的氨基酸195-279將有大約50％的等同性。
在MAGE-3蛋白上已鑒定了幾個CTL表位。一個這樣的表位MAGE-3 A1，是位于MAGE-3蛋白的氨基酸168和176之間的一個九肽序列，當它與MHC Ⅰ類分子HLA.A1相結合被呈遞時，將構成一個對CTLs特異性的表位。最近，根據它們能夠在黑素瘤細胞和自體淋巴細胞的混合培養(yǎng)物中建立起CTL應答，已在MAGE-3蛋白的肽序列上鑒定出另外二個CTL表位。這二個表位具有分別針對HLA.A2(Van derBruggen，1994)和HLA.B44(Herman，1996)等位基因的特異性結合基元。
本發(fā)明提供了一類MAGE蛋白衍生物。這類衍生物適合用于適宜治療一系列腫瘤類型的治療性疫苗制劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，該衍生物是一個融合蛋白，它含有一個連接于異源性配偶體的，來自MAGE蛋白家族的抗原。該蛋白質可能是化學綴合的，但是，可優(yōu)選地作為重組融合蛋白被表達，使之與非融合蛋白相比較，能在表達系統(tǒng)中高水平地被產生。因此，此融合配偶體可能有助于提供T輔助表位(免疫融合配偶體)，優(yōu)選地是由人識別的T輔助表位?；蛘呖赡苡兄谝员忍烊恢亟M蛋白更高的產率表達此蛋白質(表達增強子)。優(yōu)選地，此融合配偶體將既是免疫融合配偶體，又是表達增強配偶體。
在本發(fā)明的優(yōu)選形式中，免疫融合配偶體是由蛋白D產生的，蛋白D是革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌B的一種表面蛋白(WO91/18926)。優(yōu)選地，此蛋白D衍生物大約包含此蛋白質的起始1/3，具體地大約是第一個N末端的100-110個氨基酸。優(yōu)選地此蛋白D衍生物是脂質化的。脂蛋白D融合配偶體的起始109個殘基優(yōu)選地被包含在N-端，以便為疫苗候選抗原提供附加的外源性T細胞表位，并且增加在大腸桿菌中的表達水平(因此也起表達增強子的作用)。此脂質尾部可確?？乖瓕乖蔬f細胞的最佳表現。
其它的融合配偶體包括來自流感病毒，NS1(血細胞凝集素)的非結構性蛋白。雖然可使用不同的片段，只要它們包含T-輔助表位，但是，一般是利用N-端的81個氨基酸。
在另一個實施方案中，免疫融合配偶體是稱為LYTA的蛋白質。優(yōu)選地是應用此分子的C-端部分。LYTA是由合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LYTA的肺炎鏈球菌產生的，(由lytA基因編碼的{基因，43(1986)，265-272頁｝，一種可特異性降解肽聚糖骨架中某些鍵的自溶素)。LYTA蛋白的C-端結構域負責對膽堿，或者對某些膽堿類似物如DEAE的親和性。已經利用此特性開發(fā)大腸桿菌C-LYTA表達質粒，用于表達融合蛋白。對于在其氨基端含有C-LYTA片段的雜交蛋白的純化已有描述{生物技術學10，(1992)，795-798頁｝。如在此使用的，一個優(yōu)選的實施方案利用了在殘基178起始的C-末端中發(fā)現的Lyta分子的重復部分。特別優(yōu)選的形式摻入了殘基188-305。
上面提到的免疫融合配偶體還具有促進表達的優(yōu)勢。特別是以比天然重組MAGE蛋白較高的產率表達這種融合體。
在臨床應用中，本發(fā)明者已顯示這種構建物能夠治療黑素瘤。在一個病例中，給予二劑無佐劑的脂D 1/3 MAGE 3 His蛋白之后，使患有第Ⅳ期黑素瘤的病人消除了轉移病灶。
因此，本發(fā)明在實施方案中提供了幾種融合蛋白，它們含有連接于免疫融合配偶體的，來自MAGE家族的腫瘤相關抗原。優(yōu)選的免疫融合配偶體是蛋白D或其片段，最優(yōu)的是脂蛋白D。優(yōu)選的MAGE蛋白是MAGE A1或MAGE A3。脂蛋白D部分優(yōu)選的是含有起始1/3脂蛋白D。
本發(fā)明的蛋白質優(yōu)選地是在大腸桿菌中被表達。在優(yōu)選的實施方案中，此蛋白連同一個親和性標記一起被表達，例如含有5-9個，優(yōu)選地是6個組氨酸殘基的組氨酸尾部。這些殘基有助于純化。
本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明蛋白質的核酸。可以將這種序列插入適當的表達載體，以及用于DNA/RNA疫苗接種，或者在適當的宿主中表達。表達此核酸的微生物載體可被用作疫苗。這類載體包括例如，痘病毒，腺病毒，α-病毒，李斯特氏菌(listeria)和monarphage。
可應用標準的DNA合成技術合成編碼本發(fā)明蛋白質的DNA序列，例如借助于D.M.roberts等在生物化學1985.24.5090-5098中描述的酶促連接反應，或借助于應用例如熱穩(wěn)定性聚合酶的PCR技術，或者借助于這些技術的組合形式。
可在含有所需三磷酸核苷dATP，dCTP，dGTP和dTTP的適當緩沖液中，在溫度10°-37℃，一般在50μl或更小的體積內，應用DNA聚合酶如DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)，在體外進行DNA的酶促聚合反應?？稍谶m當的緩沖液中，如0.05M Tris(pH7.4)，0.01M MgCl2，0.01M二硫蘇糖醇，1mM亞精胺，1mM ATP和0.1mg/ml牛血清白蛋白，在4℃到室溫的溫度下，一般以50ml或更小的體積，應用DNA連接酶如T4 DNA連接酶進行DNA片段的酶促連接反應。應用固相技術，通過常規(guī)的磷酸三酯，亞磷酸鹽或亞磷酸酰胺化學過程，可進行DNA聚合體或片段的化學合成，在例如“基因片段的化學和酶促合成-實驗室手冊”(H.G.Garssen和A.lang編著)，Verlag Chemie，Weinheim(1982)中，或者如下的其它學術刊物中描述了這種固相技術，例如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat，and R.C.Titmas，核酸研究，1982，10，6243；B.S.Sporat，and W.Bannwarth，四面體通訊。1983，24.5771；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，四面體通訊-1980，21.719；M.D.Matteucci and M.H.Caruthers，美國化學協(xié)會雜志，1981，103，3185；SP.Adams等，美國化學協(xié)會雜志，1983，105，661；N.D.Sinha，J.Biernat，J.McMannus，and H.Koester，核酸研究，1984，12，4539；以及H.W.D.Matthes等，EMBO雜志，1984，3，801。
可借助于常規(guī)的重組技術實施本發(fā)明的方法，例如在Maniatis等，分子克隆一實驗室手冊冷泉港，1982-1989中所述的重組技術。
具體地說，此方法可包括如下步驟ⅰ)制備能夠在宿主細胞內表達此DNA聚合體的可復制或整合的表達載體，此DNA聚合體包含編碼該蛋白質或其致免疫性衍生物的核苷酸序列；ⅱ)用所述載體轉化宿主細胞；
ⅲ)在使之能夠表達該DNA聚合體，產生所述蛋白質的條件下培養(yǎng)此轉化的宿主細胞；以及ⅳ)回收這種蛋白質。
在此使用的術語“轉化”意指將外來的DNA導入宿主細胞。例如應用在“基因工程”，S.M.Kingsman和A.J.Kingsman編著，Blackwell學術刊物，牛津，英格蘭，1988中所述的常規(guī)技術，通過以適當的質?；虿《据d體轉化，轉染或感染可達到此目的。術語“轉化的”或“轉化體”，此后將用于所形成的，包含和表達所需外來基因的宿主細胞。
此表達載體是新穎的，也是本發(fā)明的組成部分。
根據本發(fā)明，在連接條件下制備這種可復制的表達載體，可通過切開與宿主細胞匹配的載體而提供具有完整復制子的線性DNA區(qū)段，并且使此線性區(qū)段與一個或幾個DNA分子結合，此DNA分子與所述線性區(qū)段一起，編碼所需產物，如編碼本發(fā)明的蛋白質或其衍生物的DNA聚合物。
因此，可預先形成這種DNA聚合物，或者如果需要，可在構建載體的過程中形成。
載體的選擇部分地由宿主細胞決定，它可以是原核細胞或真核細胞，但優(yōu)選的是大腸桿菌或DHO細胞。適合的載體包括質粒，噬菌體，粘粒和重組病毒。
借助于例如上面引用的Maniatis等所述的步驟，以適當的酶對此DNA進行限制性酶切，聚合反應和連接反應，可實現常規(guī)地制備這種可復制的表達載體。
根據本發(fā)明，可通過在轉化條件下以本發(fā)明可復制的表達載體轉化宿主細胞，制備重組的宿主細胞。合適的轉化條件是常規(guī)性的，例如在上面引證的Maniatis等文獻中所描述的，或者在“DNA克隆”第二卷，D.M.Glover編著，IRL出版公司，1985中所描述的。
轉化條件的選擇取決于宿主細胞。因此，對于細菌宿主細胞如大腸桿菌，可先用CaCl2溶液(Cohen等，國家科學院學報，1973.69，2110)或者用含有RbCl，MnCl2，乙酸鉀和甘油的混合溶液處理，然后用3-[N-嗎啉代]-丙烷-磺酸，RbCl和甘油處理。對于培養(yǎng)的哺乳動物細胞，可通過將載體DNA鈣共沉淀在此細胞上進行轉化。本發(fā)明還延伸至用本發(fā)明的可復制表達載體轉化的宿主細胞。
在使之能夠表達DNA聚合物的條件下對轉化的宿主細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，如在例如上面引證的文獻Maniatis等和“DNA克隆”中所描述的。因此，優(yōu)選地是對此細胞提供營養(yǎng)物，并在50℃以下的溫度培養(yǎng)。
根據宿主細胞和表達產物的定位(細胞內，或者分泌到培養(yǎng)基內或細胞周質內)，用常規(guī)方法回收此產物。因此，例如當宿主細胞是細菌如大腸桿菌，可用物理，化學或酶促法將它裂解，然后從形成的裂解物中分離出蛋白質產物。當宿主細胞是哺乳動物細胞，一般可從營養(yǎng)培養(yǎng)基中，或者從無細胞的提取物中分離出此產物。常規(guī)的蛋白質分離技術包括選擇性沉淀，吸附層析，以及包括應用單克隆抗體親和柱的親和層析。
本發(fā)明的蛋白質或者以可溶解的液體形式，或者以冷凍干燥的形式被提供。
預期每個人劑量包括1-1000μg的蛋白質，優(yōu)選地是30-300μg。
本發(fā)明還提供了在藥劑學允許的賦形劑內包含本發(fā)明蛋白質的藥劑組合物。優(yōu)選的疫苗組合物至少含有脂蛋白D-MAGE-3。這種疫苗還可任選地含有一種或幾種其它的腫瘤相關抗原，例如屬于MAGE和GAGE家族的其它成員。適合的其它腫瘤相關抗原包括MAGE-1，GAGE-1或酪氨酸酶蛋白。
在‘疫苗設計’(“亞單位和佐劑技術”(Powell M.F和Newman M.J編著)，(1995)，Plenum出版社，紐約)中概述了疫苗制劑。Fullerton，美國專利4，235，877描述了將它微囊化在脂質體內。
本發(fā)明的蛋白質優(yōu)選地加入佐劑，配制成本發(fā)明的疫苗制劑。適合的佐劑包括鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(礬)或磷酸鋁，但是還可能是鈣、鐵或鋅鹽，或者可能是?；野彼峄蝓；堑牟蝗苄詰乙海栯x子或陰離子衍生化多糖，或多膦嗪，其它已知的佐劑包括含CpG的寡核苷酸。此寡核苷酸的特征在于CpG二核苷酸未被甲基化。這類寡核苷酸已被熟知，例如已在WO96/02555中被描述。
在本發(fā)明的制劑中優(yōu)選的是，其佐劑組合物可誘導優(yōu)選的TH1型免疫應答。適合的佐劑系統(tǒng)包括例如，單磷酰脂質A(monophosphoryl lipidA)，優(yōu)選的是3-脫氧-?；瘑瘟柞Ｖ|A(3D-MPL)與一種鋁鹽的組合物。CpG寡核苷酸也可優(yōu)選地誘導TH1應答。
一種增強的系統(tǒng)包括單磷酰脂質A和皂角苷衍生物的組合物，優(yōu)選的是如WO94/00153中所公開的QS21和3D-MPL的組合物，或者是一種較低反應原性組合物，在此如在WO96/33739中所公開的，QS21已用膽固醇淬滅了。
一種特別有效的佐劑配方已在WO95/17210中描述了，包括在水包油乳液中的QS21 3D-MPL和生育酚，這是一個優(yōu)選的配方。
因此，在本發(fā)明的一個實施方案中提供了一種疫苗，包含本發(fā)明的蛋白質，更優(yōu)選的是加入單磷酰脂質A或其衍生物佐劑的脂蛋白D(或其衍生物)-MAGE-3。
優(yōu)選地，此疫苗另外還含有皂角苷，更優(yōu)選的是QS21。
優(yōu)選地此制劑另外還含有一種水包油乳液和生育酚。本發(fā)明還提供了一種制備疫苗制劑的方法，包括將本發(fā)明的蛋白質與藥劑學允許的賦形劑如3D-MPL一起混合。
本發(fā)明的一方面是提供了一種方法，用于純化以重組技術產生的MAGE蛋白。此方法包括將此蛋白質溶解于例如強離液劑(StrongChaotropic agent)(例如尿素，鹽酸胍)中，或者溶解于兩性離子去垢劑(如Empigen BB-n-十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸)中，還原此蛋白質分子內和分子間的二硫鍵，阻斷所形成的巰基，以防氧化再偶聯，以及使此蛋白質經歷一次或幾次層析步驟。
優(yōu)選的阻斷劑是烷基化劑。這類阻斷劑包括，但不局限于α-鹵酸或α-鹵酰胺。例如可導致此蛋白質羧甲基化或羧酰胺化(脲基甲基化)的碘乙酸和碘乙酰胺。還可應用其它一些阻斷劑，在文獻中已有論述(參見例如，‘蛋白質’，第二卷，H．neurath，RL Hill和C-L Boeder編著，Academic出版社1976，或者用于蛋白質修飾的化學試劑，第Ⅰ卷，RL Lundblad和CM Noyes編著，CRC出版社，1985)。其它這種阻斷劑的典型例子包括，N-乙基馬來酰亞胺，氯乙酰磷酸鹽，O-甲基異脲和丙烯腈。使用這種阻斷劑是有益的，因為它可防止產物聚集，并可確保下游純化過程的穩(wěn)定性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，選擇阻斷劑以便誘導穩(wěn)定的共價不可逆衍生物(例如α-鹵酸或α-鹵酰胺)。但是，也可選擇其它的阻斷劑，使之在純化過程之后可將阻斷劑除去，以便釋放出非衍生化的蛋白質。
具有衍生化自由巰基的MAGE蛋白是新型蛋白，構成了本發(fā)明的一個方面。特別是羧酰胺化的或羧甲基化的衍生物是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，為本發(fā)明的蛋白質安裝了一個親和性尾部，例如CLYTA或聚組氨酸尾部。在這種情況下，在阻斷步驟之后優(yōu)選地是使蛋白質經歷親和層析。對于那些具有聚組氨酸尾部的蛋白質，可實施固定化金屬離子親和層析(IMAC)?？梢允侨魏我环N適合的金屬離子。例如鋅、鎳、鐵、鎂或銅，但是優(yōu)選的是鋅或鎳。IMAC緩沖液優(yōu)選地含有兩性離子去垢劑如Empigen BB(此后寫作Empigen)，因為這樣將導致最后的產物內具有較低水平的內毒素。
如果產生了具有Clyta部分的蛋白質，那么可通過利用它對膽堿或膽堿類似物如DEAE的親和性來純化這些蛋白質。在本發(fā)明的實施方案中，為此蛋白質安裝了聚組氨酸尾部和Clyta部分。通過簡單的二步親和層析純化程序就可純化這些蛋白質。
將參照下面的實施例對本發(fā)明作進一步描述實施例Ⅰ制備表達融合蛋白脂蛋白D-MAGE-3-His(LPD 1/3-MAGE-3-His或LpD MAGE-3-His)的重組大腸桿菌菌株。
1．大腸桿菌表達系統(tǒng)為了產生脂蛋白D，已將編碼蛋白D的DNA克隆進入表達載體pMG81。此質粒利用來自λ-噬菌體DNA的信號，驅動轉錄和翻譯插入的外來基因。此載體含有λPL啟動子PL，操縱基因OL和二個利用位點(NutL和NutR)，以便當提供N蛋白時解除轉錄的極性作用(Gross等，1985，分子細胞生物學，5∶1015)。將含有PL啟動子的載體導入大腸桿菌溶原性宿主，以便使質粒DNA穩(wěn)定。溶原性宿主菌株包含被整合進入基因組的復制缺損性λ-噬菌體DNA(Shatzman等，1983，見“基因表達的實驗操作”，Inouya(編著)，PP1-14，Academic出版社，NY)。λ-噬菌體DNA引導cI阻抑蛋白的合成，此阻抑蛋白結合了載體的OL阻抑蛋白，并阻止RNA聚合酶與PL啟動子結合，從而轉錄插入的基因。表達菌株AR58的cI基因含有溫度敏感性突變，使之可以通過溫度改變來調節(jié)PL引導的轉錄，也就是說，提高培養(yǎng)物溫度可使阻抑物失活并啟動對外來蛋白質的合成。此表達系統(tǒng)使之可能對外來蛋白質的合成進行控制，特別是對于有可能對細胞有毒的外來蛋白質的合成(Shimataka和Rosenberg，1981，自然292128)。
2．大腸桿菌AR58菌株。
用于產生LPD-MAGE-3-His蛋白的AR58溶原性大腸桿菌菌株，是標準的NIH大腸桿菌K12菌株N99(F-Su-galK2，lacZ-thr-)的一個衍生株。它含有缺損的溶原性λ-噬菌體(galETN10，1Kil-cI857 DH1)。Kil-表型可防止宿主大分子合成的關閉。cI857突變對cI阻抑物賦予溫度敏感性損傷。DH1缺失除去了λ-噬菌體右側的操縱子以及宿主的bio.uvr3和chlA基因座。通過用以前生長在SAS00衍生株(galETN10，1Kil-cI857 DH1)上的Pλ-噬菌體原種轉導N99產生了AR58菌株。由于在鄰接的galE基因中存在編碼四環(huán)素抗性的TN10轉座子，可用四環(huán)素選擇將缺損性溶原菌導入N99。N99和SA500是從國立健康研究所Dr.Martin Rosenberg氏實驗室得到的大腸桿菌K12菌株。
3．構建設計表達重組蛋白質LPD-MAGE-3-His的載體基本原理是，表達作為融合蛋白的MAGE3，應用脂質化蛋白D的N-端1/3作為在MAGE-3N端連接的融合配偶體，并且將幾個組氨酸殘基序列(His尾部)置于它的C-端。
蛋白D是一個脂蛋白(一個42 KDa的暴露在革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌表面的免疫球蛋白D結合蛋白)。此蛋白作為一個前體被合成，它具有18個氨基酸殘基信號序列，含有對細菌脂蛋白的共有序列(WO91/18926)。
當脂蛋白的信號序列在分泌過程中被加工時，Cys(在前體分子中的位置19)成為氨基末端殘基，并且通過共價脂連接的和酰胺連接的脂肪酸而同時被修飾。
于是，連接于氨基端半胱氨酸殘基的脂肪酸發(fā)揮膜固定點的作用。
將表達此融合蛋白的質粒設計成表達一個前體蛋白，此前體蛋白含有18個氨基酸的信號序列和被加工蛋白D的起始109個殘基，二個無關的氨基酸(甲硫氨酸和天冬氨酸)，MAGE-3的氨基酸殘基2-314，二個起樞紐區(qū)作用的Gly殘基，以便暴露出后面的7個His殘基。
因此，該重組菌株產生432個氨基酸殘基長度的被加工的脂質化His結尾的融合蛋白(見

圖1)，在ID No 1中描述了其氨基酸序列，在ID No2中描述了其編碼序列。
4．為產生LPD-MAGE-3-His融合蛋白的克隆方案(載體pRIT14477)使用了含有編碼序列MAGE-3基因(Gaugler.B等，1994)的cDNA質粒(從Ludwig研究所Dr.Thierry Boon獲得)，以及含有Lipo-D-1/3編碼序列的N-端部分的載體pRIT 14586(按照圖2中的草圖制備)。此克隆方案包括如下步驟(圖3)。
a)-應用有義寡核苷酸5’gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agtcag cac tgc aag cct，以及反義寡核苷酸5’gcg tct aga tta atg gtgatg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa，PCR擴增在質粒cDNA MAGE3中存在的序列；此擴增將導致在N端出現如下的修飾將起始的5個密碼子改變成大腸桿菌應用密碼子，在位置1以Asp密碼子轉換Pro密碼子，在5’端安裝NcoⅠ位點，以及最后加入二個2Gly密碼子和7個His密碼子，隨后是C端的XbaⅠ位點。
b)-將上面擴增的外原片段克隆進入TA克隆載體，并且制備中間載體pRIT 14647。
c)-從質粒pRIT 14647切取NcoⅠ XbaⅠ片段，并將它克隆進入載體pRIT 14586。
d)-轉化宿主菌株AR58。
e)-挑選和鑒定含有質粒pRIT 14477，表達LPD-MAGE-3-His融合蛋白的大腸桿菌菌株轉化體。
實施例Ⅱ制備LPD 1/3-MAGE-3-His抗原1．菌株的培養(yǎng)和誘導-表達LPD 1/3-MAGE-3-His在2升的搖瓶內培養(yǎng)用質粒pRIT 14477轉化的AR58細胞，每個搖瓶含有400ml以酵母浸膏(6.4g/L)和硫酸卡那霉素(50mg/L)補充的LY 12培養(yǎng)基。在搖床上30℃培育8±1小時之后，從每個搖瓶內取出少量樣品作顯微鏡檢查。將二個搖瓶中的內含物合并，對20升的發(fā)酵罐提供此接種物。
將此接種物(大約800ml)加入預先滅菌的20升(總容積)發(fā)酵罐中，其中含有7升以50mg/L硫酸卡那霉素補充的培養(yǎng)基。通過定時加入NH4OH(25％ v/v)校準pH并保持在6.8，并將溫度校準和保持在30℃。利用攪拌速度反饋控制法使通氣速度校準和保持在12升/分鐘，使溶解氧張力保持在50％的飽和度。保持發(fā)酵罐內500g/cm2(0.5巴)的過壓狀態(tài)。
通過對加入碳素注入液的控制實施分批加料培養(yǎng)法。以0.04ml/分鐘的起始速度加入此注入液，在起初42小時中按指數遞增，以便保持0.1/小時的生長速度。
42小時之后使發(fā)酵罐內的溫度迅速升高至39℃，并且在誘導期內使加料速度保持恒定在0.005ml/g DCW/min，再持續(xù)22-23小時，在此時間內，LPD-MAGE-3-His的細胞內表達達到最高水平。
在整個生長/誘導期內按規(guī)定的時間間隔，以及在發(fā)酵的終點取出小份量(15ml)發(fā)酵液，以便跟蹤微生物生長和細胞內產物表達的動力學，并且為微生物鑒定和純度檢測提供樣品。
在發(fā)酵的終點，培養(yǎng)物的光密度是80-120(相當于48-72g DCW/L的細胞濃度)，液體總量是大約12升。使培養(yǎng)物迅速冷卻至6-10℃，并通過在4℃以5000xg的速度離心30分鐘，從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離出了ECK32細胞。將濃縮的ECK32細胞迅速貯存在塑料袋中，并立即在-80℃冷凍。
2．提取此蛋白質在4℃使冷凍的濃縮ECK32細胞融化，然后再懸浮于細胞裂解緩沖液中，達到最后的光密度60(相當于大約36g DCW/L的細胞濃度)。
借助于二次通過高壓勻漿器(1000巴)使此細胞裂解。離心破裂的細胞懸液(10000g，4℃，30分鐘)，用TritonX100(1％ w/v)+EDTA(1mM)洗此沉淀組份2次，隨之用磷酸緩沖鹽水(PBS)+Tween20(0.1％ v/v)洗，最后再用PBS洗。在每次清洗步驟之間，以10000g，4℃離心懸浮液30分鐘，棄去上清液，保留沉淀組份。
實施例Ⅲ對融合蛋白Lipo D-MAGE3的鑒定1．純化應用下述的步驟順序從細胞勻漿中純化了LPD-MAGE-3-Hisa)-使來自細胞裂解物的洗過的沉淀組份溶液化，b)-化學還原蛋白質分子內和分子間的二硫鍵，隨之阻斷巰基，以防氧化再偶聯，
c)-微過濾此反應混合物，以便除去顆粒并減少內毒素，d)-利用多組氨酸尾部和鋅裝填的螯合瓊脂糖之間的親和性相互作用，捕獲和初步純化LPD-MAGE-3-His，e)-通過陰離子交換層析除去污染蛋白質。
使此純化的LPD-MAGE-3-His經受幾次精制步驟f)-應用Superdex 75，通過尺寸排阻層析法進行緩沖交換/尿素清除，g)-作過濾處理，h)-應用葡聚糖凝膠G25，通過尺寸排阻層析法進行緩沖交換/脫鹽。
下面對每個步驟作更詳細的描述1.1)-使細胞勻漿沉淀溶液化在800ml鹽酸胍(6M)和磷酸鈉(0.1M.pH7.0)溶液中，使來自最后漂洗步驟(如上面所述)的沉淀組份在4℃再溶液化過夜。
1.2)-還原和羧甲基化用氬氣沖洗此溶液化材料(淡黃色混濁懸液)，以便清除所有殘留的氧氣，并加入2-巰基乙醇貯備液(14M)使最后濃度為4.3M(這相當于每ml溶液中含0.44ml2-巰基乙醇).
將形成的溶液分成2份，轉移至2個玻璃燒瓶內，在水浴中將二個燒瓶加熱至95℃。在95℃15分鐘之后，從水浴中取出燒瓶，使之冷卻，將其中的溶液合并進入一個箔片加蓋的燒杯(5L)內，置于冰上，加入固體碘乙酰胺并劇烈攪拌，使最后濃度為6M(這相當于每ml溶液內含有1.11g碘乙酰胺)。在黑暗中使此混合物在冰上保持1小時，確保碘乙酰胺完全溶解，然后通過加入大約1升氫氧化鈉(5M)進行中和(繼續(xù)劇烈攪拌，并繼續(xù)監(jiān)測pH)，使最后的pH為7.5-7.8。
使所形成的混合物在黑暗中，再在冰上保持30分鐘，此后將其pH再校準至pH7.5-7.8。
1.3)-微過濾在裝配有Minikros中空纖維濾芯(參考NO.M22M-600-01N；面積5600cm2，0.2μm)的Amicon Proflux M12切向流動濾器中對此混合物作微過濾。保留濾過液進行后續(xù)的層析純化。
1.4)-金屬(Zn2+)螯合層析(IMAC)
以被裝填進入BPG100/500柱(Pharmacia Biotechnology，分類號18-1103-01)的螯合瓊脂糖FF(Pharmacia Biotechnology，分類號17-0575-01)進行金屬螯合層析。裝填床的尺寸為直徑10cm；橫切面積79cm2，床高度19cm，裝填容量1500ml。空柱先用氫氧化鈉(0.5M)清潔，然后用純水洗。
在Buchner漏斗上(真空下)，用純水(8升)洗此支持載體(在20％ v/v乙醇中)，并借助于使至少15升ZnCl2溶液(0.1M)流過而以鋅裝填此支持載體，通過用10升純水洗支持載體而除去過剩的鋅，直至流出液的pH達到ZnCl2溶液的pH(5.0)。然后用4升含有鹽酸胍(6M)和磷酸鈉(0.1M.pH7.0)的溶液平衡此支持載體。
將來自微過濾，含有LPD-MAGE-3-His的濾出液與此支持載體混合(分批結合)，然后裝BPG柱，并填充含有鹽酸胍(6M)和磷酸鈉(0.1M.pH7.0)的溶液。
下面的金屬螯合層析步驟是以60ml/分鐘的沖洗流速度進行。先用含有鹽酸胍(6M)和磷酸鈉(0.1M，pH7.0)的溶液洗柱，然后用含有尿素(6M)和磷酸鈉(0.1M，pH7.0)的溶液洗，直到柱洗出液達到在OD280nm的吸光度為O(基線)。
用二個柱體積的含有尿素(6M)，磷酸鈉(0.1M，pH7.0)和咪唑(0.5M)的溶液，洗脫出了半純的LPD-MAGE-3-His蛋白組份。此組份的電導大約是16mS/cm。
1.5)陰離子交換層析在繼續(xù)陰離子交換層析之前，通過用含有尿素(6M)和Tris-HCl(20mM，pH8.0)的溶液稀釋，將半純LPD-MAGE-3-His蛋白組份的導電性降低至大約4ms/cm。
應用裝填在BPG200/500柱(Pharmacia Biotechnology，分類號18-1103-11)內的Q-瓊脂糖FF(Pharmecia Biotechnology，分類號。17-0510-01)進行陰離子交換層析。裝填床的尺寸為直徑10cm；橫切面積314cm2；床高度9cm；裝填容量2900ml。
裝柱(連同20％ v/v乙醇)，并用9升純水，以70ml/分鐘的沖洗流速度洗柱。用3升氫氧化鈉(0.5M)清潔裝填的柱床，再用30升純水洗，然后用6升含有尿素(6M)和Tris-HCl(20mM，pH8.0)的溶液平衡。將稀釋的半純LPD-MAGE-3-His對柱上加樣，然后用9升含有尿素(6M)，Tris-HCl(20mM，pH8.0)，EDTA(1mM)和Tween(0.1％)的溶液洗脫，直至洗脫液的吸光度(280納米)降到0。
再用6升含有尿素(6M)和Tris-HCl(20mM，pH8.0)的溶液作進一步的洗脫。
用含有尿素(6M)，Tris-HCl(20mM，pH8.0)和NaCl(0.25M)的溶液從柱上將純化的LPD-MAGE-3-His洗脫出。
1.6)-尺寸排阻層析通過尺寸排阻層析達到了從純化的LPD-MAGE-3-His中除去尿素和緩沖交換二個目的。應用裝填在XK50/100柱(PharmaciaBiotechnology，分類號。18-8753-01)中的Superdex 75(PharmaciaBiotechnology，分類號。17-1044-01)進行這種層析。裝填床的尺寸為直徑5cm；橫切面積19.6cm2；床高度90cm；裝填容量1800ml。
在乙醇(20％)中裝柱，并用5升純水，以20ml/分鐘的流出速度洗柱。用2升氫氧化鈉(0.5M)清洗柱床，用5升純水洗，然后用5升含有Tween 80(0.1％ v/v)的磷酸緩沖鹽水平衡。
將純化的LPD-MAGE-3-His組份(每次脫鹽運轉的最大量為500ml)在柱上加樣，使洗出流速為20ml/分鐘。用3升含有Tween 80(0.1％ v/v)的PBS從柱中洗脫出脫鹽的純LPD-MAGE-3-His。
含有LPD-MAGE-3-His的組份在柱床的空隙容積中被洗脫出。
1.7)過濾處理使來自尺寸排阻層析的批量LPD-MAGE-3-His在層流通風櫥(級別10.000)中通過0.22μm孔徑的膜進行過濾。將此批量濾液在-80℃冷凍，貯存直至脫鹽步驟。
1.8)-脫鹽層析因為最后批量產品的重量克分子滲透壓濃度應該小于400mOsM，所以需要進行進一步的緩沖交換步驟，以便降低鹽濃度。這可通過應用裝填在BPG100/950柱(Pharmacia Biotechnology，分類號。18-1103-03)中的葡聚糖凝膠G25(Pharmacia Biotechnology，分類號。17-0033-02)的脫鹽層析步驟來實現。裝填床的尺寸為直徑10cm，橫切面積78.6cm2，床高度85cm，裝填容量6500ml。
用7升純水使葡聚糖凝膠G25水合，使其在4℃膨脹過夜。然后隨同純水將此凝膠裝填于柱中，使洗出流速為100ml/分鐘。
用6升氫氧化鈉(0.5M)清洗柱床，然后用10升含有磷酸鈉(10mM，pH6.8)，NaCl(20mM)和Tween80(0.1％ v/v)的溶液平衡。
將純化的LPD-MAGE-3-His組份(每次脫鹽運轉的最大量為1500ml)在柱上加樣，使洗出流速為100ml/分鐘。使在柱床的空隙容積中被洗脫出的脫鹽的純LPD-MAGE-3-His組份通過0.22μm孔徑的膜過濾除菌，并貯存在-80℃。
將最后的批量蛋白質融化至+4℃，然后被等量分裝至小藥瓶內，并在乳糖賦形劑(3.2％)中冷凍干燥。
2．在考馬斯染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析在還原狀態(tài)的12.5％丙烯酰胺凝膠上，通過SDS-PAGE對LPD-MAGE-3-His純化的抗原進行了分析。
加樣蛋白質50μg用于考馬斯蘭染色，5μg用于硝酸銀染色。分析了臨床組96K19和指示組96J22。可見一條相當于60KDa分子量的主要電泳帶。還可見二條較小的大約45KDa和35KDa的附加電泳帶。
3．蛋白質印跡(Western Blot)分析法應用小鼠單克隆抗體，借助于蛋白質印跡試驗，對通過SDS-PAGE分析LPD-MAGE-3-His顯示的肽進行了鑒定。這些抗體是應用MAGE-3-His蛋白(這種蛋白質不含LPD-MAGE-3-His的LPD部分)的純制劑在組織內形成的。
根據它們對蛋白質印跡分析的適配性，選擇了二個單克隆抗體制劑(Mab 22和mab 54)，并用于大批量釋放的鑒定試驗，圖4顯示用Mab 32和54染色之后對組分96K19和96J22獲得的電泳帶圖形。在12.5％的SDS-PAGE上對600ng蛋白質進行了分析，并被轉移至尼龍膜上，與Mab32和54(60μg/ml)反應，最后用偶聯于過氧化物酶的抗-小鼠抗體顯示。
借助于這二個單克隆抗體，揭示了由SDS-PAGE檢測的60KDa和30KDa肽。
實施例Ⅳ1．應用LPD-MAGE-3-His蛋白的疫苗制劑用于這些實驗的疫苗是從編碼脂蛋白D1/3-MAGE-3-His的重組DNA產生，在來自菌株AR58的大腸桿菌中被表達，加入佐劑或不加入佐劑。佐劑的配方包括在水包油乳劑中的3-脫氧酰基化單磷酰脂質A(3D-MPL)和QS21的混合物。在WO95/17210中以前已描述過佐劑系統(tǒng)SBAS2。
3D-MPL是一種以革蘭氏陰性菌明尼蘇達沙門氏菌的脂多糖(LPS)衍生的免疫刺激物。MPL已被脫?；?，并在其脂質A部分缺乏磷酸基。這種化學處理顯著地降低了其毒性，然而保留了其免疫刺激特性(Ribi，1986)。Ribi Immunochemistry對SB-Biologicals生產和供應MPL。在Smith Kline Beecham Biologicals完成的實驗已表明，與各種賦形劑組合的3D-MPL，其體液免疫性和TH1型細胞免疫性都大大提高了。
QS21是一種從南美Quillaja Saponaria Molina樹的樹皮中提取的天然皂角苷分子。為了從樹皮粗提取物中分離出單一的皂角苷而建立的純化技術，使之可能分離出特定的皂角苷QS21，這是一種三萜苷，已證明與其原始成分相比較具有較強的佐劑活性和較低的毒性。已表明QS21可激活將CTLs局限于幾種亞單位Ags的MHCⅠ類，并且可刺激Ag特異性淋巴細胞增殖(Kensil，1992)。Aquila(正規(guī)的劍橋生物技術公司)對SB-Biologicals生產和供應QS21。
在SmithKline Beecham Biologicals完成的實驗已表明，在體液和TH1型細胞免疫應答中，MPL和QS21的組合物具有清楚的協(xié)同作用。
水包油乳劑由用兩種油(生育酚和角鯊烯)制成的有機相和作為乳化劑的含有Tween 80的PBS構成的水相組成。該乳劑包含5％角鯊烯、5％生育酚、0.4％ Tween 80，平均粒徑為180nm，并被稱為SB62(參見WO95/17210)。
在SmithKline Beecham Biologicals完成的實驗已證明，對3D-MPL/QS21(SBAS2)添加這種O/W乳劑，將進一步增加3D-MPL/QS21針對各種亞單位抗原的免疫刺激特性。
2．乳劑SB62(2倍濃縮的)的制備將Tween 80溶解于磷酸緩沖鹽水(PBS)中，形成在PBS中的2％溶液。為了提供100ml二倍濃縮的乳劑，將5g DL-α-生育酚和5ml角鯊烯徹底攪拌均勻。加入90ml PBS/Tween溶液并徹底混勻。然后使所形成的乳劑通過一個注射器，并最后用M110S微液化機使之微液化。形成的油滴具有大約180nm的大小。
3．制備脂蛋白D 1/3-MAGE-3-His QS21/3D-MPL水包油(SBAS2)制劑在水包油乳劑中配制作為MPL和QS21組合物的佐劑。將此制劑輸運進入0.7ml的小藥瓶內，以便與冷凍干燥的抗原混合(小藥瓶內含有30-300μg抗原)。
為用于冷凍干燥的疫苗，佐劑稀釋劑的組成如下 用此佐劑或者僅用PBS重建溶解冷凍干燥的LPD-MAGE-3-His制劑之后，可得到最終的疫苗。
通過以PBS代替此蛋白質，制備了無抗原的佐劑對照。
4．疫苗抗原融合蛋白脂蛋白D 1/3-MAGE-3-His脂蛋白D是暴露在革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌表面的脂蛋白。
作為融合配偶體摻入被加工蛋白D起始109個殘基的包函體，以便提供具有T-細胞表位的疫苗抗原。除了LPD部分之外，此蛋白還含有二個無關的氨基酸(Met和Asp)，MAGE-3的氨基酸殘基2-314，二個起樞紐區(qū)作用，以便暴露后面7個His殘基的Gly殘基。
實施例Ⅴ1．LPD-MAGE-3-His對小鼠和猴的免疫原性為了測定人MAGE-3蛋白的抗原性和免疫原性，對二個不同品系的小鼠(C 57BL/6和Balb/c)注射了待選用的疫苗，這二個品系在它們的基因背景和MHC等位基因有所不同。對于二個小鼠品系，理論上預測潛在的MHCⅠ類和MHCⅡ類肽基元序列為LPD-MAGE-3-His融合蛋白的MAGE部分。
a)-免疫方案用在SBAS2中配制的或不在其中配制的5μg LPD-MAGE-3-His，以用于人時的1/10濃度，對每個品系的5只小鼠，間隔2周在腳墊內注射2次。
b)-增殖測定在第二次注射的2周之后，通過碾磨來自此小鼠的脾或腘淋巴結制備淋巴細胞。將2×105個細胞一式三份置于96孔培養(yǎng)板中，并用不同濃度(1-0.1μg/ml)的His-MAGE-3照這樣，或者包被在乳膠微珠上，在體外對此細胞反復制激72小時。
與僅注射SBAS-2制劑或PBS的小鼠淋巴細胞增殖反應相比較，注射LPD-MAGE-3-His蛋白的C57BL/6或Balb/C小鼠，對其脾細胞(見圖5和7)和淋巴結細胞(見圖6和8)都觀測到提高的MAGE-3特異性淋巴細胞增殖活性。
而且，小鼠用在佐劑SBAS2中的LPD-MAGE-3-His免疫之后，對于來自此小鼠的淋巴細胞，獲得了顯著較高的增殖反應(見圖6和8)。
c)-結論LPD-MAGE-3-His對小鼠是致免疫性的，并且通過使用SBAS2佐劑制劑，可使這種免疫原性增加。
2．抗體應答a)-免疫方案
用PBS或SBAS2，或者5μg LPD-MAGE-3-His或5μg LPD-MAGE-3-His+SBAS2，通過以2周的間隔腳墊內注射2次免疫Balb/C或C57BL/6小鼠。分別以3只動物和5只動物用于對照組和試驗組。
b)-間接ELISA試驗第二次注射之后二周，采集各個動物的血清，用于間接ELISA試驗。將2μg/ml的純化His MAGE3用作包被抗原。在PBS+1％新生牛血清中37℃飽和1小時后。將此小鼠血清在飽和緩沖液內作系列稀釋(從1/1000開始)，并在4℃溫育過夜，或者在37℃溫育90分鐘。在PBS/Tween20，0.1％中漂洗之后，用生物素化的羊抗-小鼠總IgG(1/1000)或羊抗-小鼠IgGl，IgG2a，IgG2b抗血清(1/500)作第二抗體。在37℃溫育90分鐘之后，加入偶聯于過氧化物酶的鏈親和素，并用TMB(四甲基聯苯胺過氧化物)作底物。10分鐘之后，通過加入H2SO40.5M終止反應，并測定光密度(O.D)。
c)-結果圖9對不同組小鼠(N=5只/組)之間的血清相對平均中點滴度進行比較，此滴度是達到曲線中點所需的平均稀釋度。
這些結果表明，對于所測定的二個品系小鼠，在單純注射2次LPD-MAGE-3-His之后都可測定到微弱的抗體應答，但是，在有SBAS2存在情況下注射LPD-MAGE-3-His時，可產生較高的抗-MAGE-3抗體濃度。因此，只要二次注射LPD-MAGE-3-His+SBAS2，間隔2周，就足以產生所觀測到的高水平抗體應答。
當與C57BL/6小鼠所得到的反應相比較，對于Balb/c小鼠可觀測到較強的抗體應答，這可以用這二個品系之間單倍型或背景不同來解釋，盡管對于C57BL/6小鼠，與單獨注射LPD-MAGE-3-His相比較，注射LPD-MAGE-3-His+SBAS2之后，也達到較高的抗體滴度。
在圖10和11上可看到對不同組小鼠免疫接種之后的Ig亞類-特異性抗-MAGE-3應答，圖中給出了血清平均中點稀釋度的比較值。
即使是來自用LPD-MAGE-3-His在佐劑SBAS2中免疫接種的小鼠的任何一個血清樣品，都未檢測出IgA或IgM。
相反，對于單用LPD-MAGE-3-His免疫接種的小鼠，其血清中的總IgG水平輕微升高，對于用在SBAS2中的LPD-MAGE-3-His注射的動物，其血清中IgG水平顯著地升高。
對不同IgG-亞類的濃度分析表明，在小鼠中誘發(fā)了混合的抗體應答，因為與單用抗原(Ag)或佐劑注射的小鼠相比較，用加佐劑的Ag免疫接種的小鼠，其所有被測定的IgG亞類(IgG1，IgG2a，IgG2b)的水平都比較高。
但是，用存在SBAS2的LPD-MAGE-3免疫接種之后，這種混合抗體應答的特性似乎取決于小鼠的品系，因為在Balb/c和C57BL/6小鼠的血清中，分別發(fā)現IgG1和IgG2b占優(yōu)勢。
3．脂蛋白D 1/3 MAGE-3-His+SBAS2佐劑對獼猴的免疫原性選用3組獼猴(MacacaMulatta)，每組5只動物。RTS，S和GP120用作陽性對照。
分組第一組右腿RTS.S/SBAS2左腿GP120/SBAS2第二組右腿RTS.S/SB26T左腿GP120/SB26T第三組右腿Lipo D 1/3 MAGE-3-His/sbas2在0天使動物接受疫苗注射，在28天和84天作加強接種，然后采血測定它們對MAGE-3和蛋白D成分的抗體應答。在右腿后部肌肉內快速濃注給予疫苗(0.5ml)。
每14天采集小量血液樣品一次從股靜脈采集3ml血液樣品，未加入肝素，允許其凝結至少1小時，然后在室溫下以2500rpm離心10分鐘。
分離出血清，在-20℃冷凍，送交借助于特定的ELISA試驗測定抗體水平。
將96孔微量培養(yǎng)板(maxisorb Nunc)用5μg His MAGE 3或蛋白D在4℃包被過夜。在37℃用PBS NCS1％飽和1小時之后，加入系列稀釋的兔血清(從1/10開始)，在37℃作用1小時30分鐘，用PBS Tween洗3次之后，加入生物素化的抗-兔血清(Amersharm ref RPN 1004lot88)(1/5000)。洗培養(yǎng)板，加入過氧化物酶偶聯的鏈親和素(1/5000)，在37℃作用30分鐘。洗滌之后，加入50μl TMB(Bio Rad)作用7分鐘，用0.2M H2SO4終止反應，在450nm測定光密度(O.D)。借助于Softmaxpro計算中點稀釋度。
抗體應答每14天采集小量血液樣品一次，以便通過ELISA試驗跟蹤對MAGE-3抗體應答的動力學。結果表明，一次注射LPD 1/3 MAGE-3-His+SBAS2之后，MAGE-3特異性總Ig滴度較低，而對相同的猴注射第2次和第3次Lipo D 1/3 MAGE-3-His+佐劑之后，在5只動物中的3只看到明顯的增強反應。對于不良的應答者即使注射3次之后仍然為陰性。在第Ⅱ或第Ⅲ次注射后28天(post Ⅱ or post Ⅲ)，抗體滴度已返回到基線水平。測定這些抗體的亞類主要是IgG而不是IgM。轉換至IgG暗示，T輔助應答已被觸發(fā)。蛋白D特異性抗體應答雖然較弱，但是正好與MAGE-3抗體應答平行。
實施例Ⅵ1．LPD-MAGE-3-His以類似的方法制備了LPD-MAGE-1-His。其氨基酸和DNA序列被描繪在SEQUENCE ID NOS3和4中。以類似于LPD-MAGE-1-His蛋白的方式純化了所形成的蛋白質。簡單地說，將此細胞培養(yǎng)物制成勻漿，并在0.5％ Empigen去垢劑存在下用4M鹽酸胍和0.5M β-巰基乙醇處理。將此產物過濾，并用0.6M碘乙酰胺處理其濾出液。使此羧酰胺化組份經受IMAC(鋅-螯合-瓊脂糖FF)層析處理。首先用含有4M鹽酸胍和磷酸鈉(20mM，pH7.5)以及0.5％ Empigen的溶液平衡并洗柱，然后用以磷酸鈉(20mM，pH7.5)0.5％ Empigen緩沖液配制的含有4M尿素的溶液洗柱。以同樣的緩沖液洗脫此蛋白質，但是此緩沖液含有遞增濃度的咪唑(20mM，400mM和500mM)。
用4M尿素稀釋此洗出液。用存在0.5％ Empigen的20mM磷酸緩沖液(pH7.5)配制的4M尿素平衡和洗Q-瓊脂糖柱。用同樣的但不含去垢劑的緩沖液實施第二次洗柱。用同樣的，但含有遞增濃度咪唑(150mM，400mM，1M)的緩沖液洗脫此蛋白質。對洗出液進行了超過濾。
實施例Ⅶ為了產生NS1-MAGE-3-His構建表達質粒pRIT 14426并轉化宿主菌株AR58蛋白質設計在圖12中描繪了對將在大腸桿菌中被表達的融合蛋白NS1，-MAGE-3-His的設計。
所形成蛋白質的一級結構具有在ID NO 5中列出的序列。
在大腸桿菌表達質粒中，將對應于上述蛋白質設計的編碼序列(IDNO.6)安排在λpL啟動子的控制之下。
為了產生NS1-MAGE-3-His融合蛋白的克隆方案起始材料是從Ludwig研究所Dr.Tierry Boon得到的cDNA質粒和載體PMG81，DNA質粒含有MAGE-3基因編碼序列，載體PMG81含有來自流感病毒(Influenza)NS1(非結構蛋白)編碼區(qū)的81aa。
圖13中草擬的克隆方案包括如下步驟a)應用如下有義寡核苷酸和反義寡核苷酸PCR擴增在質粒cDNAMAGE-3中呈遞的序列有義寡核苷酸5’gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cactgc aag cct，反義寡核苷酸5’gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atgacc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa，這種擴增在N端導致了如下的修飾起始5個密碼子改變成大腸桿菌應用密碼子，在位置1用天冬氨酸密碼子代替脯氨酸密碼子，在5’端安裝了一個NcoⅠ位點，最后加入了2個甘氨酸密碼子和7個組氨酸密碼子，隨后是C端的XbaⅠ位點。
b)將上面擴增的片段克隆進入外源的TA克隆載體，并制備過渡性載體pRIT 14647。
c)從質粒pRIT14647切取NCoⅠ XbaⅠ片段，并克隆進入載體pRITPMG81。
d)轉化宿主菌株AR58。
e)選擇并鑒定含有表達NS1-MAGE-3-His融合蛋白的質粒pRIT14426(見圖14)的大腸桿菌菌株轉化體。
鑒定重組NS1-MAGE-3-His(pRIT14426)使細菌在30℃生長在以50μg/ml卡那霉素補充的LB培養(yǎng)基上。當此培養(yǎng)物達到O.D=0.3(在620nm)后，通過將溫度升高至42℃進行加熱誘導。
誘導4小時后，收獲細胞，再懸浮于PBS中，通過在French壓碎機中碎壓3次使細胞裂解(借助于崩解作用)。離心(100000g，60分鐘)之后，通過SDS-PAGE分析沉淀的上清液和總提取物。在考馬斯B1染色的凝膠中可見蛋白質，在此融合蛋白相當于大腸桿菌總蛋白的大約1％。此重組蛋白顯示為一條單獨的電泳帶，具有44.9K的近似MW。應用抗-NS1單克隆抗體通過蛋白質印跡分析法對此融合蛋白進行了鑒定。
實施例Ⅷ純化NS1-MAGE-3-His(大腸桿菌)用于兔/小鼠免疫純化步驟以如下純化步驟用于純化此抗原細胞裂解+離心↓抗原溶液化+離心↓Ni2+-NTA瓊脂糖↓濃縮↓制備室(Prep cell)↓TCA沉淀和PBS溶液化。
a．裂解借助于Rannie(勻漿器)在203ml 50mM PO4pH7緩沖液中使細菌細胞(23g)裂解，然后在JA 20轉子中以15000rpm離心此裂解液30分鐘。
棄去上清液。
b．抗原溶液化將1/3的沉淀物在34ml 100mM PO4-6M GuHCl pH7中在4℃再溶液化O/N。在JA20轉子中以15000rpm離心30分鐘之后，棄去沉淀，上清液通過IMAC進一步純化。
c．親和層析Ni2+-NTA瓊脂糖(Qiagen)柱容量15ml(16mm×7.5cm)裝填緩沖液0.1M PO4-6M GuHCl pH7
樣品緩沖液同上洗柱緩沖液0.1M PO4-6M GuHCl pH70.1M PO4-6M尿素pH7洗脫在以6M尿素補充的0.1M PO4pH7緩沖液中的咪唑梯度液(0→250mM)。
流速2ml/min。
a．濃縮合并IMAC洗出液抗原陽性的組份(160ml)，在Amicon攪拌室內通過Filtron膜(ω-型，截止分子量10000)濃縮至5ml。此時當用SDS-PAGE測定時純度是大約70％。
b．制備電泳(Prep Cell Biorad)在0.8ml還原性樣品緩沖液中將2.4ml濃縮的樣品煮沸，并在10％丙烯酰胺凝膠上加樣。以用4％SDS補充的Tris-甘氨酸緩沖液pH8.3洗脫此抗原，合并NS1-MAGE-3-His陽性的組份。
a．TCA沉淀對此抗原作TCA沉淀，在JA20轉子內以15000rpm離心20分鐘之后棄去上清液。將此沉淀物在PBS緩沖液pH7.4中再溶液化。
此蛋白質冷凍/融化后可溶解于PBS，存放于37℃3小時未發(fā)現有任何降解，當借助于SDS(12.5％PAGE)測定時，此蛋白質具有大約50000道爾頓的近似分子量。
實施例Ⅸ制備表達融合蛋白CLYTA-MAGE-1-His尾部的大腸桿菌菌株。
1．構建表達質粒pRIT14613和轉化宿主菌株AR58蛋白質設計在圖15中描繪了對將在大腸桿菌中被表達的融合蛋白CLYTA-MAGE-1-His的設計。
所形成蛋白質的一級結構具有在序列ID.NO.7中列出的序列。
在大腸桿菌表達質粒中，將對應于上述蛋白質設計的編碼序列(見SEQUENCE 1D NO.8)安排在λPL啟動子的控制之下。
克隆起始材料是載體PCUZ1和載體pRIT14518。載體PCRZ1含有來自肺炎鏈球菌LytA編碼區(qū)的117個C-端密碼子，在此載體pRIT14518中，以前我們已經亞克隆了MAGE-1基因cDNA，此cDNA來自從Ludwig研究所Dr.Thierry Boon得到的質粒。
為表達CLYTA-MAGE-1-His蛋白的克隆方案(見圖16中的示意圖16)包括下列步驟2．制備CLYTA-MAGE-1-His編碼序列的組件a)第一步是PCR擴增，指定使NdeⅠ-AflⅢ限制性位點位于CLYTA序列的二側。應用質粒PCUZ1a作模板以及如下寡核苷酸作引物進行此PCR擴增，有義寡核苷酸為5’tta aac cac acc tta agg agg ata taacat atg aaa ggg gga att gta cat tea gac。反義寡核苷酸為5’gccaga cat gtc caa ttc tgg cct gtc tgc cag。這將導致擴增378個核苷酸長度的CLYTA序列。
b)第二步是使CLYTA序列連接于MAGE-1-His序列，產生此融合蛋白的編碼序列。此步驟包括切取NdeⅠ-AflⅢ Clyta片段，并插入預先用NdeⅠ和NcoⅠ(NcoⅠ和AflⅢ兼容性的)限制性酶切開的載體pRIT14518中，產生質粒pRIT14613。
c)轉化宿主菌株AR58。
d)選擇并鑒定含有質粒pRIT14613的大腸桿菌轉化體(KAN抗性的)(見圖16)。
1．對重組蛋白cLYTA-MAGE-1-His(pRIT14613)的鑒定使細菌在30℃生長在以50μg/ml卡那霉素補充的LB培養(yǎng)基上。當此培養(yǎng)物達到OD=0.3(在620nm)后，通過升高溫度至38℃進行加熱誘導。
誘導4小時后，收獲細胞，再懸浮于PBS中，通過一次投射(oneshot)使細胞裂解(借助于崩解作用)。離心之后，通過SDS-PAGE分析沉淀的上清液和總提取物。在考馬斯B1染色的凝膠中可見蛋白質，在此融合蛋白相當于大腸桿菌總蛋白的大約1％。此重組蛋白顯示為一條單獨的電泳帶，具有大約49KD的近似MW。應用抗-MAGE-1多克隆抗體通過蛋白質印跡分析法對此融合蛋白進行了鑒定。
重建由長λPL啟動子(對萘啶酮酸誘導有用的)和CLYTA-MAGE-1編碼序列(pRIT14614)組成的表達單元由質粒pRIT DVA6制備了含有長PL啟動子和部分CLYTA序列的EcoRⅠ-NCO1限制性片段，并將它插入質粒pRIT14613的EcoRⅠ-NCO1位點之間。
得到了重組質粒pRIT14614。
將編碼融合蛋白CLYTA-MAGE-1-His的重組質粒pRIT14614(見圖17)用于轉化大腸桿菌AR120。選擇卡那霉素抗性候選菌株，并進行了鑒定。
對重組蛋白的鑒定使細菌在30℃生長在以50mg/ml卡那霉素補充的LB培養(yǎng)基上。當此培養(yǎng)物達到CD=400(在620nm)時，加入萘啶酮酸至60mg/ml的最終濃度。
誘導4小時后，收獲細胞，再懸浮于PBS中，并借助于崩解作用(崩解CLS“one shot”型)使細胞裂解。離心之后，通過SDS-PAGE分析沉淀的上清液和總提取物。在考馬斯蘭染色的凝膠中可見蛋白質，在此融合蛋白相當于大腸桿菌總蛋白的大約1％。應用兔抗-Mage-1多克隆抗體，通過蛋白質印跡分析法對此融合蛋白進行了鑒定。此重組蛋白顯示為一條單獨的電泳帶，具有大約49KD的近似MW。
實施例ⅩCLYTA-MAGE-3-HisA腫瘤排斥性重組抗原融合蛋白CLYTA-MAGE-3-His；在此，C-lyt A融合配偶體導致表達一個可溶性蛋白，起親和性標記的作用，并且提供有用的T-輔助細胞。
制備表達融合蛋白CLYTA-MAGE-3-His尾部的大腸桿菌菌株。
構建表達質粒pRIT14646并轉化宿主菌株AR120蛋白質設計在圖18中描繪了對將在大腸桿菌中被表達的融合蛋白Clyta-Mage-3-His的設計。
所形成蛋白質的一級結構具有在序列ID NO.9中描繪的序列，其編碼序列被描繪在序列ID NO.10中。
在大腸桿菌表達質粒中，將對應于上述蛋白質設計的編碼序列安排在λPL啟動子的控制之下克隆起始材料是載體PCUZ1和載體pRIT14426，載體PCUZ1含有在“基因”43(1986)P.265-272中論述的，來自肺炎鏈球菌LytA編碼區(qū)的117個C-端密碼子，在載體pRIT14426中，以前我們已經亞克隆了MAGE-3基因cDNA，此cDNA來自從Ludwig研究所Dr.Tierry Boon得到的質粒。
為表達CLYTA-MAGE-3-His蛋白的克隆方案(見示意圖19)包括如下步驟1．-制備CLYTA-MAGE-3-His編碼序列的組件1．1第一步是PCR擴增，指定使Af1Ⅱ和AflⅢ限制性位點位于CLYTA序列的二側。應用質粒PCUZ1作模板以及如下寡核苷酸作引物進行此PCR擴增，有義寡核苷酸為5’tta aac cac acc tta agg agg atataa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac，反義寡核苷酸為5’ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg。這將導致擴增427個核苷酸長度的CLYTA序列。將上面的擴增片段克隆進入外源(Invitrogen)的TA克隆載體，以便產生過渡性載體pRIT14661。
1．2第二步是使CLYTA序列連接于MAGE-3-His序列，產生此融合蛋白的編碼序列。此步驟包括切取AflⅡ-AflⅢ Clyta片段，并插入預先用AflⅡ和NcoⅠ(NcoⅠ和AflⅡ兼容性的)限制性酶切開的載體pRIT14426中，產生質粒pRIT14662。
2．-重建由長λPL啟動子(對萘啶酮酸誘導有用的)和CLYTA-Mage-3編碼序列組成的表達單元由質粒pRIT14662制備了含有短PL啟動子和CLYTA-MAGE-3-His編碼序列的BglⅡ-XbaⅠ限制性片段，并將它插入質粒TCM67的BglⅡ-XbaⅠ位點之間(質粒TCM67是含有氨芐青霉素抗性和長λPL啟動子的PBR322衍生物，在國際專利申請PCT/EP92/01827中已有論述)。獲得了質粒pRIT14607。
將編碼融合蛋白Clyta-mage-3-His的重組質粒pRIT14607用于轉化大腸桿菌AR120(Mott等1985，國家科學院學報8288)。選擇并鑒定了氨芐青霉素抗性的候選菌株。
3．-制備質粒pRIT 14646最后構建了類似于pRIT 14607但具有卡那霉素選擇作用的質粒(pRIT14646)。
對重組蛋白質的鑒定
使細菌在30℃生長在以50mg/ml卡那霉素補充的LB培養(yǎng)基上。當此培養(yǎng)物達到OD=400(在600nm)時，加入萘啶酮酸至60？g/ml的最終濃度。
誘導4小時之后，收獲細胞，再懸浮于PBS中，并借助于崩解作用(崩解CLS“one shot”型)使細胞裂解。離心之后，通過SDS-PAGE分析沉淀的上清液和總提取物。在考馬斯蘭染色的凝膠中可見蛋白質，在此融合蛋白相當于大腸桿菌總蛋白質的大約1％。應用兔抗Mage-3多克隆抗體，通過蛋白質印跡分析法對此融合蛋白進行了鑒定。此重組蛋白顯示為一條單獨的電泳帶，具有大約58KD的近似MW。
實施例Ⅺ重組蛋白CLYTA-MAGE-3-His的純化在20升的發(fā)酵罐內，在分批加料的條件下30℃培養(yǎng)重組菌AR120(pRIT14646)。通過加入萘啶酮酸至最終濃度60？g/ml，誘導重組蛋白的表達。在發(fā)酵終點收獲細胞，以60OD/600的密度，使之二次通過French壓力破裂器(20000psi)而被裂解，在4℃將裂解的細胞以15000g離心20分鐘。將含有此重組蛋白的上清液對DEAE瓊脂糖DL6B樹膠交換柱(pharmacia)加樣，此交換柱已用0.3M NaCl，20mM Tris HCl pH7.6的緩沖液A預先平衡。用緩沖液A洗柱之后，以在緩沖液A中配制的2％膽堿洗脫融合蛋白。將應用抗-Mage-3抗體，通過蛋白質印跡分析揭示的陽性抗原組份合并在一起。將DEAE洗脫的抗原加入0.5％Empigen BB(一種二性離子去垢劑)和0.5M NaCl，然后在以0.5％ EmpigenBB，0.5M NaCl，50mM磷酸緩沖液pH7.6(緩沖液B)平衡的金屬離子親和性層析柱上加樣。
用緩沖液B洗此IMAC柱，直至在280nm的吸光度達到基線值。為了實施清除去垢劑，以不含Empigen BB的緩沖液B(緩沖液C)第二次洗柱。然后用在緩沖液C中配制的0-250mM的咪唑梯度液洗脫抗原。
合并0.090-0.250 M的咪唑組份，在10KDa的Filtron ω-膜上濃縮，然后對PBS緩沖液透析。
結論我們已證實，融合蛋白LPD-MAGE-3-His對小鼠是致免疫的，且該免疫原性(增殖性應答和抗體應答)可通過使用上述佐劑被進一步增強。通過衍生化形成二硫鍵的巰基可以提高純化作用。
我們還證實，通過用存在佐劑的LPD-MAGE-3-His作疫苗接種可觸發(fā)更強的抗體應答。在C57 BL/6小鼠血清中發(fā)現的優(yōu)勢同種型是IgG2b暗示產生了TH1型免疫應答。
對于人，臨床安排一個病人用未加入佐劑的LPD-MAGE-3-His制劑治療后清除了黑素瘤。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人SmithKline Beecham Biologicals(ⅱ)發(fā)明名稱疫苗(ⅲ)序列數10(ⅳ)通訊地址(A)收信人SmithKline Beecham(B)街道2 New Horizons Court， Great West Road，B(C)城市Middx(D)洲(E)國家UK(F)郵編TW8 9EP(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM兼容機(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0(ⅵ)目前申請數據(A)申請?zhí)?B)申請日期(C)分類(ⅶ)在先申請數據(A)申請?zhí)?B)申請日期(ⅷ)代理人/代理商信息(A)姓名Dalton，Marcus J(B)注冊號(C)參照/摘要書號B45126(ⅸ)電訊信息(A)電話0181 9756348(B)光傳真0181 9756177(C)電報(2)SEQ ID NO1信息(ⅰ)序列特征(A)長度452個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu1 5 10 15Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys20 25 30Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro35 40 45Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp50 55 60Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val65 70 75 80Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe85 90 95Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr100 105 110Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met115 120 125Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu130 135 140Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr145 150 155 160Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr165 170 175Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro180 185 190Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser195 200 205Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr210 215 220Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val225 230 235 240Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro245 250 255Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Ash Trp Gln Tyr260 265 270Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val275 280 285Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile290 295 300Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn305 310 315 320Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile325 330 335Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu340 345 350Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp355 360 365Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu370 375 380Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp385 390 395 400Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His405 410 415Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His420 425 430Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Thr Ser Gly Gly His His His435 440 445His His His450(2)SEQ ID No2信息(ⅰ)序列特征(A)長度1353個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC120CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA180CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT240ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT300CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA360ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGATCTG GAACAGCGTA GTCAGCACTG CAAGCCTGAA420GAAGGCCTTG AGGCCCGAGG AGAGGCCCTG GGCCTGGTGG GTGCGCAGGC TCCTGCTACT480GAGGAGCAGG AGGCTGCCTC CTCCTCTTCT ACTCTAGTTG AAGTCACCCT GGGGGAGGTG540CCTGCTGCCG AGTCACCAGA TCCTCCCCAG AGTCCTCAGG GAGCCTCCAG CCTCCCCACT600ACCATGAACT ACCCTCTCTG GAGCCAATCC TATGAGGACT CCAGCAACCA AGAAGAGGAG660GGGCCAAGCA CCTTCCCTGA CCTGGAGTCC GAGTTCCAAG CAGCACTCAG TAGGAAGGTG720GCCGAATTGG TTCATTTTCT GCTCCTCAAG TATCGAGCCA GGGAGCCGGT CACAAAGGCA780GAAATGCTGG GGAGTGTCGT CGGAAATTGG CAGTATTTCT TTCCTGTGAT CTTCAGCAAA840GCTTCCAGTT CCTTGCAGCT GGTCTTTGGC ATCGAGCTGA TGGAAGTGGA CCCCATCGGC900CACTTGTACA TCTTTGCCAC CTGCCTGGGC CTCTCCTACG ATGGCCTGCT GGGTGACAAT960CAGATCATGC CCAAGGCAGG CCTCCTGATA ATCGTCCTGG CCATAATCGC AAGAGAGGGC 1020GACTGTGCCC CTGAGGAGAA AATCTGGGAG GAGCTGAGTG TGTTAGAGGT GTTTGAGGGG 1080AGGGAAGACA GTATCTTGGG GGATCCCAAG AAGCTGCTCA CCCAACATTT CGTGCAGGAA 1140AACTACCTGG AGTACCGGCA GGTCCCCGGC AGTGATCCTG CATGTTATGA ATTCCTGTGG 1200GGTCCAAGGG CCCTCGTTGA AACCAGCTAT GTGAAAGTCC TGCACCATAT GGTAAAGATC 1260AGTGGAGGAC CTCACATTTC CTACCCACCC CTGCATGAGT GGGTTTTGAG AGAGGGGGAA 1320GAGGGCGGTC ATCACCATCA CCATCACCAT TAA1353(2)SEQ ID NO3信息(ⅰ)序列特征(A)長度1341個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC120CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA180CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT240ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT300CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA360ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGGCTCT CTGGAACAGC GTAGTCTGCA CTGCAAGCCT420GAGGAAGCCC TTGAGGCCCA ACAAGAGGCC CTGGGCCTGG TGTGTGTGCA GGCTGCCACC480TCCTCCTCCT CTCCTCTGGT CCTGGGCACC CTGGAGGAGG TGCCCACTGC TGGGTCAACA540GATCCTCCCC AGAGTCCTCA GGGAGCCTCC GCCTTTCCCA CTACCATCAA CTTCACTCGA600CAGAGGCAAC CCAGTGAGGG TTCCAGCAGC CGTGAAGAGG AGGGGCCAAG CACCTCTTGT660ATCCTGGAGT CCTTGTTCCG AGCAGTAATC ACTAAGAAGG TGGCTGATTT GGTTGGTTTT720CTGCTCCTCA AATATCGAGC CAGGGAGCCA GTCACAAAGG CAGAAATGCT GGAGAGTGTC780ATCAAAAATT ACAAGCACTG TTTTCCTGAG ATCTTCGGCA AAGCCTCTGA GTCCTTGCAG840CTGGTCTTTG GCATTGACGT GAAGGAAGCA GACCCCACCG GCCACTCCTA TGTCCTTGTC900ACCTGCCTAG GTCTCTCCTA TGATGGCCTG CTGGGTGATA ATCAGATCAT GCCCAAGACA960GGCTTCCTGA TAATTGTCCT GGTCATGATT GCAATGGAGG GCGGCCATGC TCCTGAGGAG 1020GAAATCTGGG AGGAGCTGAG TGTGATGGAG GTGTATGATG GGAGGGAGCA CAGTGCCTAT 1080GGGGAGCCCA GGAAGCTGCT CACCCAAGAT TTGGTGCAGG AAAAGTACCT GGAGTACCGG 1140CAGGTGCCGG ACAGTGATCC CGCACGCTAT GAGTTCCTGT GGGGTCCAAG GGCCCTCGCT 1200GAAACCAGCT ATGTGAAAGT CCTTGAGTAT GTGATCAAGG TCAGTGCAAG AGTTCGCTTT 1260TTCTTCCCAT CCCTGCGTGA AGCAGCTTTG AGAGAGGAGG AAGAGGGAGT CGGCGGTCAT 1320CACCATCACC ATCACCATTA A 1341(2)SEQ ID NO4信息(ⅰ)序列特征(A)長度466個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu1 5 10 15Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys20 25 30Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro35 40 45Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp50 55 60Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val65 70 75 80Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe85 90 95Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr100 105 110Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met115 120 125Gly Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu130 135 140Glu Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Thr145 150 155 160Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr165 170 175Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe180 185 190Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser195 200 205Ser Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser210 215 220Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe225 230 235 240Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met245 250 255Leu Glu Ser Val Ile Lys Ash Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe260 265 270Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys275 280 285Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly290 295 300Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr305 310 315 320Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His325 330 335Ala Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr340 345 350Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr355 360 365Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp370 375 380Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala385 390 395 400Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala405 410 415Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu420 425 430Glu Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His 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Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr100 105 110Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Leu Asp Met Gly115 120 125Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu Glu130 135 140Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Thr Ser145 150 155 160Ser Ser Ser Pro Leu val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr Ala165 170 175Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe Pro180 185 190Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser195 200 205Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser Leu210 215 220Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe Leu225 230 235 240Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu245 250 255Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe Gly260 265 270Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu275 280 285Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu290 295 300Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr Gly305 310 315 320Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His Ala325 330 335Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr Asp340 345 350Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln355 360 365Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp Ser370 375 380Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu385 390 395 400Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg405 410 415Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu Glu420 425 430Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His His His His His435 440 445(2)SEQ ID NO8信息(ⅰ)序列特征(A)長度1338個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 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Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile355 360 365Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn370 375 380Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu385 390 395 400Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val405 410 415Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro420 425 430Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His435 440 445His His His His His450(2)SEQ ID NO10信息(ⅰ)序列特征(A)長度1362個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線性(ⅱ)分平類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC 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GCACCATATG1260GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCGCATTTCC TACCCACTCC TGCATGAGTG GGCTTTGAGA1320GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC CATCACCATT AA 1362
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權利要求
1．一種腫瘤相關性抗原衍生物，其來自MAGE家族。
2．根據權利要求1的抗原，其中該衍生物是連接于免疫融合配偶體或表達增強配偶體的MAGE蛋白。
3．根據權利要求1或2的抗原，其中的衍生物包含一個親和性標記。
4．根據權利要求1-3中任何之一的抗原，它包含衍生化的自由巰基。
5．根據權利要求4的抗原，它是一個羧酰胺化或羧甲基化的衍生物。
6．一種根據權利要求2，3，4或5的蛋白質，其中的融合配偶體是來自流感嗜血桿菌B的蛋白D或其片段，來自流感病毒的NS1蛋白或其片段，或者是來自肺炎鏈球菌的Lyta或其片段。
7．根據權利要求2，3，4或5的蛋白質，其中的融合配偶體是來自流感嗜血桿菌B的蛋白D的脂質化形式或其片段。
8．根據權利要求1-7的蛋白質，其中的MAGE蛋白是選自如下種類MAGE A1，MAGE A2，MAGE A3，MAGE A4，MAGE A5，MAGE A6，MAGEA7，MAGE A8，MAGE A9，MAGE A10，MAGE A11，MAGE A12，MAGE B1，MAGE B2，MAGE B3和MAGE B4，MAGE C1，MAGE C2。
9．一種核酸序列，編碼在此要求專利保護的蛋白質。
10．一種載體，包含權利要求9的核酸。
11．一種宿主，是用權利要求10的載體轉化的。
12．一種疫苗，含有根據權利要求1-8中任何之一的蛋白質，或者根據權利要求9的核酸。
13．根據權利要求12的疫苗，另外還包含一種佐劑，和/或免疫刺激細胞因子或趨化因子。
14．根據權利要求12或13的疫苗，其中該蛋白質是以水包油或油包水乳劑作賦形劑提供的。
15．根據權利要求13或14的疫苗，其中的佐劑包括3D-MPL，QS21或CpG寡核苷酸。
16．在此要求專利保護的疫苗，另外還包含一種或幾種其它抗原。
17．在此要求專利保護的疫苗，是用于醫(yī)藥。
18．在此要求專利保護的蛋白質或核酸在制造一種用于免疫治療患有黑素瘤或其它MAGE-相關腫瘤的病人的疫苗中的用途。
19．一種純化MAGE蛋白或其衍生物的方法，包括還原二硫鍵，用封阻基團封閉所形成的自由巰基，以及使所形成的衍生物經受一個或幾個層析純化步驟。
20．一種用于生產疫苗的方法，包括借助于權利要求19的方法純化MAGE蛋白或其衍生物的幾個步驟，以及將所形成的蛋白質配制成疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自MAGE家族的幾種新型蛋白質以及產生它們的方法,特別是涉及與免疫融合配偶體如脂蛋白D融合的MAGE蛋白。可以將這種抗原配制成疫苗,用于治療一系列腫瘤。還提供了用于純化MAGE蛋白的幾種新穎的方法。
文檔編號C12N15/12GK1295616SQ99804604
公開日2001年5月16日 申請日期1999年2月2日 優(yōu)先權日1998年2月5日
發(fā)明者T·卡貝宗斯爾瓦, J·科亨, M·M·斯拉歐伊, C·維納爾斯巴索爾斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司