專利名稱：：新的來源于木層孔菌屬種類的菌株的免疫刺激多糖物質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種屬于木層孔菌屬的菌株，一種產(chǎn)自此菌株的多糖物質(zhì)以及此多糖物質(zhì)的應(yīng)用。特別涉及一種新的木層孔菌屬種類的菌株、一種產(chǎn)自此菌株的新的具有有效的免疫刺激活性的多糖物質(zhì)，及其在預(yù)防和治療免疫相關(guān)疾病例如癌癥和AIDS及其機(jī)理研究方面的應(yīng)用。蕈，一種高級真菌，是異養(yǎng)生物；它們通過顯微結(jié)構(gòu)的菌絲從外界吸收有機(jī)營養(yǎng)。在生物圈中，它們充當(dāng)?shù)氖且粋€(gè)分解者，將復(fù)雜的有機(jī)物降解為簡單的無機(jī)形式并最終返回到自然界中。在真菌中，最典型的蕈屬于擔(dān)子菌綱，它們特征性地形成擔(dān)子，每個(gè)擔(dān)子在成熟期到來時(shí)在其表面均會(huì)有四個(gè)外生的擔(dān)孢子。蕈可以進(jìn)一步分為層菌綱，它自動(dòng)地從暴露的子實(shí)層釋放孢子。層菌綱的代表是多孔菌目和傘菌目。葡萄狀枝瑚菌、安迪氏刺革菌、Climancodonseptentrionalis、雜色革蓋菌和canodermaapplanatum屬于多孔菌目類，糙皮側(cè)耳、埃杜香菇、群交裂褶菌、松口蘑、捕蠅蕈(Amanitsmuscaria)和毛頭鬼傘均在傘菌目類的范圍內(nèi)。在過去的東方草藥中已知許多屬于多孔菌目，一種擔(dān)子菌綱(Basidomycetes)的蕈對多種疾病特別是腫瘤有治療活性。在韓國，它們作為草藥或民間藥物代代相傳，而且在屬于多孔菌科的蕈，特別是裂蹄木層孔菌，被認(rèn)為是一種非常貴重的藥物。然而，裂蹄木層孔菌在自然界中是一種非常稀有的品種，以致于它的子實(shí)體很難得到。而且分離和人工培養(yǎng)裂蹄木層孔菌的菌絲體被認(rèn)為是幾乎不可能。因而，盡管裂蹄木層孔菌被認(rèn)為是一種對腫瘤有非常有效的治療劑，但它的作用一直沒有被有效利用。對于治療癌癥，多種方法包括化療、放療和外科手術(shù)治療均是常規(guī)使用的。盡管這些治療方法對實(shí)體癌有效，但是對于完全征服癌癥是不夠的。特別是，對轉(zhuǎn)移腫瘤是沒有用的。通常，使用抗癌例如阿霉素劑的化療和放療會(huì)帶來嚴(yán)重的副作用。為了減輕副作用，這樣的抗癌劑可能會(huì)減量給藥。然而在這種情況下，藥物的治療作用變差。更糟的是，甚至在使用化療治療癌癥之后，癌轉(zhuǎn)移還不能夠被防止。如此看來，常規(guī)的化療在一定程度上對抑制癌生長有效，但不能完全治愈癌癥。一種替代療法是使用免疫抑制劑，被稱作免疫療法。具有代表性的免疫抑制劑的例子是細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-2，腫瘤壞死因子等等。白細(xì)胞介素-2顯示出較好的治療作用，特別是對癌癥轉(zhuǎn)移。當(dāng)用于人體時(shí)，白細(xì)胞介素-2需要以大劑量使用，以致于會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。最近在新免疫刺激物質(zhì)方面的研究開發(fā)出蘑菇多糖和OK-432，這種新的免疫刺激物質(zhì)是非細(xì)胞因子而且顯示出無副作用的良好的抗癌活性。在最近的幾年中，一種化學(xué)治療與免疫治療聯(lián)合應(yīng)用的被稱為免疫化學(xué)治療的新的技術(shù)一直在積聚力量。例如，阿霉素與免疫增強(qiáng)劑向癌癥患者共同給藥，在增強(qiáng)抗癌作用的同時(shí)減少了化學(xué)藥品的副作用。就我們所知，到目前為止沒有木層孔菌屬種類的菌株的微生物和遺傳特性的研究報(bào)道。微生物即使是相同種的也可能在所產(chǎn)生的物質(zhì)種類和數(shù)量方面彼此有很大的不同，而且可能在培養(yǎng)條件、菌株穩(wěn)定性和遺傳變異頻度方面顯示出很大的差異。在研究真菌木層孔菌屬有價(jià)值的產(chǎn)物時(shí)，需要作的第一件事是篩選能夠產(chǎn)生大量產(chǎn)物并且能在肉湯中培養(yǎng)的菌株，除此之外還具有低的遺傳變異。用顯微鏡觀察裂蹄木層孔菌菌株形態(tài)多樣而且有修飾，因此很難鑒定。但是，在顯微鏡下依靠辨別形態(tài)確定其種類是可行的。最近，將新的DNA分析方法已經(jīng)用于人口遺傳和種族發(fā)育的研究。超過表型分析方法，DNA分析方法具有能夠分析以進(jìn)化速度和遺傳趨勢為基礎(chǔ)的基因型的優(yōu)點(diǎn)。其中，一種限制片段長度多態(tài)性(此后稱作“RFLP”)技術(shù)能夠推斷出堿基序列突變以便進(jìn)行基因型分析(Dowling等，1990，1990.核酸Ⅱ“限制位點(diǎn)分析”中分子系統(tǒng)D.M.Hills和C.Moritz.編輯，P250-317，Sinauer聯(lián)合出版社)。由于核DNA太大不容易分析，細(xì)胞器染色體組通常被用于DNA分析(White和Densmore，“1992線粒體DNA分離”中人口的分子遺傳分析一種實(shí)際方法，A.R.Hoelzel.編輯，P29-58，牛津大學(xué)出版社)。特別是，優(yōu)點(diǎn)是采用了線粒體DNA。一般地，線粒體DNA與核DNA相比大小較小，進(jìn)化變化速度較快，并具有母性單倍體遺傳性，因此線粒體DNA被廣泛用于一個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)和歷史的研究。特別是，線粒體DNA的RFLP被用于種內(nèi)部突變的研究(Foster等，1988，“通過真菌線粒體DNA的分析評價(jià)Phythophothora種類間的相關(guān)性”，《真菌學(xué)》80466-478)。通過利用DNA分析方法對木層孔菌屬種類的菌株深入細(xì)致而且廣泛的研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種新的多糖物質(zhì)，它是由一種木層孔菌屬菌株產(chǎn)生的，具有有效的免疫刺激活性。因而本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種木層孔菌屬種類的菌株，它能夠產(chǎn)生一種新的具有免疫刺激活性的多糖物質(zhì)。本發(fā)明的另一目的是提供一種新的多糖物質(zhì)，顯示出一種有效的抗免疫相關(guān)疾病的免疫刺激活性。本發(fā)明的另一目的是提供所述多糖物質(zhì)作為一種免疫治療劑的用途或在這些疾病基本機(jī)理研究方面的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，首先培養(yǎng)多種木層孔菌屬種類的菌株，并用SDS-苯酚方法分離它們所有的DNA。從總DNA中僅得到線粒體DNA。用限制酶BamHI、ClaI、EcoRI和PvuII消化線粒體DNA，然后在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。按照Nei和Li(1979)的方法分析木層孔菌屬的菌株間的DNA的相關(guān)性。從這些分析資料中，發(fā)現(xiàn)了一種新菌株，它形成與其他菌株不同的新的相關(guān)性。此菌株被命名為裂蹄木層孔菌Yoo并于1997年11月17日在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院韓國模式培養(yǎng)物保藏中心保藏(保藏號KCTC0399BP)。就KCTC0399BP菌株的微生物特性進(jìn)行了一項(xiàng)研究。從這種新菌株的子實(shí)體和菌絲體中分離和提純一種新的多糖物質(zhì)，并對其免疫刺激活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對此免疫刺激多糖物質(zhì)的糖單位和組成進(jìn)行分析，然后對其碳水化合物成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。相似地，培養(yǎng)其他多種木層孔菌屬種類的菌株，并對其子實(shí)體和菌絲體進(jìn)行分離和純化，以獲得同樣具有免疫刺激活性的多糖物質(zhì)。進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對被植入皮膚癌細(xì)胞的小鼠使用此免疫刺激多糖物質(zhì)，以測定免疫刺激活性物質(zhì)的抗癌活性。而且，測定當(dāng)多糖物質(zhì)與化學(xué)藥品聯(lián)合使用時(shí)在抗癌活性方面的變化。研究多糖物質(zhì)對人癌細(xì)胞生長的影響。給尾部靜脈注射了皮膚癌細(xì)胞的小鼠使用多糖物質(zhì)，以便研究其對癌轉(zhuǎn)移的影響。在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)此多糖物質(zhì)的抗癌活性的機(jī)理與抗癌化學(xué)藥物的機(jī)理有所不同。參考附圖從下列實(shí)施方案的描述中將會(huì)清楚地看到本發(fā)明的上述和其他目的，其中附圖1是顯示木層孔菌屬種類菌株間相關(guān)性的系統(tǒng)樹；附圖2是顯示裂蹄木層孔菌菌絲體培養(yǎng)物特性的示意圖；附圖3是從木層孔菌屬的菌株純化多糖物質(zhì)的步驟；附圖4是免疫刺激多糖物質(zhì)糖單位的氣相色譜圖；附圖5是免疫刺激多糖物質(zhì)的HW65F凝膠色譜圖；附圖6是免疫刺激多糖物質(zhì)的碳NMR譜；附圖7是顯示按照給藥方式多糖物質(zhì)抗小鼠癌細(xì)胞的抗癌活性的示意圖；附圖8a是顯示多糖物質(zhì)和0.1mg/kg阿霉素聯(lián)合使用的抗小鼠癌細(xì)胞的抗癌活性的示意圖；附圖8b是顯示多糖物質(zhì)和0.3mg/kg阿霉素聯(lián)合使用的抗小鼠癌細(xì)胞的抗癌活性的示意圖；附圖9a是顯示按照用多糖物質(zhì)和阿霉素治療人癌細(xì)胞的變化的示意圖；附圖9b是顯示按照多糖物質(zhì)和阿霉素治療人癌細(xì)胞的最終重量的示意圖；附圖10a是顯示阿霉素對癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防作用的示意圖；附圖10b是顯示該多糖物質(zhì)和阿霉素聯(lián)合使用對癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防作用的示意圖；附圖11是顯示阿霉素和多糖物質(zhì)的細(xì)胞毒性的示意圖；在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上分別培養(yǎng)13種包括新裂蹄木層孔菌YooKCTC0399BP在內(nèi)的木層孔菌屬菌株。應(yīng)用SDS-苯酚技術(shù)從每種培養(yǎng)物的菌絲體中分離總DNA，然后從總DNA中進(jìn)一步分離線粒體DNA。這些線粒體DNA可用于菌株間相關(guān)性的分析。為此分析，用限制酶消化線粒體DNA，并通過電泳在瓊脂糖凝膠上分離出消化后的DNA片段。DNA片段在凝膠上移動(dòng)的距離是計(jì)算限制酶片段相關(guān)值(F)和序列趨異值(p)的數(shù)據(jù)。依據(jù)這些數(shù)值，可以發(fā)現(xiàn)一種具有相關(guān)性的新的菌株，將它命名為“裂蹄木層孔菌Yoo(PhellinuslinteusYoo)”，并在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院韓國模式培養(yǎng)物保藏中心保藏(保藏號KCTC0399BP)。對裂蹄木層孔菌YooKCTC0399BP子實(shí)體微生物特性的研究有助于這種蕈的增殖。為了提取這種被認(rèn)為具有有效治療作用的物質(zhì)，培養(yǎng)和增殖這種蕈。通過熱水提取得到一種新物質(zhì)，通過苯酚硫酸和福林-苯酚技術(shù)分析證實(shí)此物質(zhì)是一種多糖。另外，通過NMR技術(shù)可以揭示此多糖物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征。給一種動(dòng)物使用后，通過計(jì)數(shù)和測量淋巴細(xì)胞的增殖確定所述多糖物質(zhì)的免疫刺激活性。對其他木層孔菌屬菌株使用與裂蹄木層孔菌Yoo相似的方法。依次進(jìn)行菌株培養(yǎng)、菌絲體提取和物質(zhì)分離。分離出的物質(zhì)也被證實(shí)具有免疫刺激活性。另外，從木層孔菌屬菌株的子實(shí)體中獲得的多糖物質(zhì)被證明具有免疫激發(fā)活性。進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以測定多糖物質(zhì)抗癌的活性。首先，將來源于小鼠的皮膚癌細(xì)胞植入小鼠，然后給小鼠單獨(dú)或聯(lián)合使用所述多糖物質(zhì)和其他化學(xué)藥品。比較每種情況小鼠的生存力。通過使用植入了人癌細(xì)胞的裸鼠測定多糖抗人癌的活性。給此裸鼠單獨(dú)或聯(lián)合使用所述多糖物質(zhì)和阿霉素。另外，多糖物質(zhì)在預(yù)防癌轉(zhuǎn)移方面非常有效。為此，將小鼠皮膚癌細(xì)胞靜脈注射入小鼠的尾部，然后給小鼠使用多糖物質(zhì)和阿霉素。使用sulforhodaminB方法測定先前單獨(dú)或聯(lián)合用多糖物質(zhì)和阿霉素處理過的存活小鼠皮膚癌細(xì)胞和存活人肺癌細(xì)胞。從下列的實(shí)施例中可以更好地理解本發(fā)明，下列的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明的，但不應(yīng)該被理解為對本發(fā)明的限制。在下列的實(shí)施例中，用取自B6C3F小鼠的脾細(xì)胞測定從裂蹄木層孔菌Yoo和其他木層孔菌屬菌株中分離的多糖物質(zhì)的免疫刺激活性。首先，通過用該物質(zhì)處理將脾細(xì)胞免疫2天并以脂多糖作為陽性對照。通過分光光度計(jì)測定所生成的抗體，此抗體認(rèn)作免疫刺激活性的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。通過一種混合淋巴細(xì)胞應(yīng)答技術(shù)測定多糖物質(zhì)對T-細(xì)胞的增殖作用。為檢測淋巴細(xì)胞的增殖，通過使用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷測定新近在淋巴細(xì)胞中合成的核DNA。實(shí)施例Ⅰ木層孔菌屬菌株的培養(yǎng)將下表1中所給的每一木層孔菌屬種類菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上、28℃恒溫下培養(yǎng)5-12天。在450mLPD肉湯中接種后，使每種菌株在28℃、120rpm振搖下生長12天。表l所用的木層孔菌屬的種類及其來源<tablesid="table1"num="001"><table>菌株來源裂蹄木層孔菌WD1222日本裂蹄木層孔茵ATCC26710美國裂蹄木層孔菌KCTC0399BP韓國裂蹄木層孔菌PL5韓國裂蹄木層孔菌PL4韓國裂蹄木層孔菌PLM韓國窄蓋木層孔菌ATCC32233美國P.iohnsonianusATCC60051美國松木層孔菌ATCC12240美國P.tuberculosisATCC13271美國變黑色木層孔菌FP-71807-S美國P.chrysolomaHHB-3585-Sp美國</table></tables>實(shí)施例Ⅱ總DNA的分離應(yīng)用SDS-苯酚方法從菌絲體中分離總DNA。用20mMEDTA洗滌實(shí)施例Ⅰ培養(yǎng)的每種菌絲體，并通過用一張濾紙(WhatmanNO.1)真空過濾收集，貯存在保持-70℃的深冷藏箱中并進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍干燥后的菌絲體研細(xì)，然后將2g每種粉末加入20mL提取緩沖液(0.2MTris·HCl，pH8.5；0.25MNaCl；25mMEDTA；0.5％(w/v)SDS)，然后加入14mL苯酚和6mL氯仿。通過緩慢攪拌混合后，離心此溶液。用15μlRANase(10mg/mL)在37℃下處理所得上清液30分鐘，然后用15μl蛋白酶K(10mg/mL)在60℃下再處理15分鐘。此后，將酶處理過的上清液與一種等體積的苯酚、氯仿和異戊醇(25∶24∶1)的混合物充分混合，隨后在4℃下以12,000X離心30分鐘。在重復(fù)相同的離心前，將上清液與一種等體積的氯仿和異戊醇(24∶1)的混合物充分混合。如此所得的上清液通過渦旋(voltexing)與0.54體積的異丙醇混合，并在上述相同條件下離心以獲得DNA沉淀。用70％乙醇洗滌該沉淀，并在空氣中干燥。將DNA溶于8mLTE緩沖液(10mMTris·HCl，lmMEDTA，pH8.0)，并在-20℃下保存。實(shí)施例Ⅲ線粒體DNA的分離進(jìn)行超離心，以便將線粒體DNA從總DNA中分離出來，此總DNA是從實(shí)施例Ⅱ每種菌株中獲得的。與8.8g氯化銫(美國Sigma公司有售)和6μl二苯甲亞胺溶液(10mg/mL)混合后，在20℃下以40，000Xg超離心所述的總DNA溶液(8mL)。在紫外光下進(jìn)一步鑒定兩條DNA帶后，在21號注射器針頭的幫助下只回收了是線粒體DNA級分的上帶。向如此獲得的DNA級分加入一種等體積的CsCl飽和的異丙醇，微弱渦旋(voltexing)混合后，在4℃下以1，200Xg離心。重復(fù)洗滌步驟6-7次以便將從線粒體DNA片段中完全去掉二苯甲亞胺。通過向線粒體DNA中加入三倍線粒體DNA片段體積的70％乙醇并在4℃下以100Xg的速度離心10分鐘而去除氯化銫。再重復(fù)一次洗滌步驟以獲得不含二苯甲亞胺和Cs的線粒體DNA。在空氣中干燥后，將線粒體DNA溶于TE緩沖液(pH8.0)，在260nm下用例如美國Beckman公司出售的商品名為“DU-64Spectrometer”的分光光度計(jì)定量。在-20℃下貯存線粒體DNA。實(shí)施例Ⅳ用限制酶消化線粒體DNA從BoehringerMannheim公司(德國)購買本實(shí)施例中所用的限制酶和緩沖液并與其識別位點(diǎn)一起列于下表2中。實(shí)施例Ⅲ所獲得木層孔菌屬菌株的每種線粒體DNA樣品緩沖液的濃度為1μg/10μl，將它們在37℃下消化3小時(shí)。表2限制酶及其識別位點(diǎn)<tablesid="table2"num="002"><table>限制酶識別位點(diǎn)BamHIG↓GATCCClaIAT↓CGATEcoRIG↓AATTCPvuIICAG↓CTG</table></tables>實(shí)施例Ⅴ瓊脂糖凝膠上的電泳將用實(shí)施例Ⅳ中的限制酶處理過的DNA樣品與載有緩沖液(0.25％溴酚蘭、0.25％二甲苯青FF、30％甘油)的凝膠混合，并在德國BoehringerMannheim公司出售的1％瓊脂糖凝膠(瓊脂糖MP)上用美國BRL公司出售的平面電泳分析儀電泳4小時(shí)，其中電泳的緩沖液為TAE緩沖液(40mMTris-乙酸、1mMEDTA，pH8.0)，以50V穿過分析儀。DNA電泳后，將瓊脂糖凝膠浸入溴化乙錠緩沖液(水中0.5μg/mL)以便容易在紫外線燈下檢測這些DNA。將通過電泳確定的線粒體DNA的大小列于下表3中。表3從木層孔菌屬的種類中分離的線粒體DNA的大小實(shí)施例Ⅵ限制片段長度多態(tài)(RFLP)分析按照Nei和Li方法進(jìn)行木層孔菌屬菌株間DNA相關(guān)性的分析。在如果當(dāng)在實(shí)施例Ⅴ瓊脂糖凝膠上電泳時(shí)移動(dòng)的距離相同即被認(rèn)為DNA片斷彼此相同的情況下，獲得限制酶片斷相關(guān)值(F)和序列趨異值(p)。通過未稱量配對組法算術(shù)平均數(shù)(UPGMA)群集技術(shù)，從p值中分析出裂蹄木層孔菌Yoo(KCTC0399BP)菌株與其他木層孔菌屬種類菌株之間的相關(guān)性。以下列的等式為基礎(chǔ)，分別計(jì)算P和F值F=2nxy/(nx+ny)其中F表示兩木層孔菌屬種類間的相關(guān)性，nxy是它們之間共同的片段數(shù)目，nx和ny分別是分離x和y所展開的片段總數(shù)目。p=-(lnF)/r其中p是每個(gè)核苷酸位置核苷酸堿基置換比例的估計(jì)值，r是供限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)的核苷酸堿基對的數(shù)目。在表4中列出當(dāng)用限制酶BamHI處理時(shí)所得的F值，并一同列出它們相應(yīng)的p值。在表5中列出當(dāng)用限制酶ClaI處理時(shí)所得的F值，并一同列出它們相應(yīng)的p值。在表6中列出當(dāng)用限制酶EcoRI處理時(shí)所得的F值，并一同列出它們相應(yīng)的p值。在表7中列出當(dāng)用限制酶PvuII處理時(shí)所得的F值，并一同列出它們相應(yīng)的p值。表8中包括共同片斷的比例，和從表4-7中每張表的左上至右下延伸的對角線上方的相應(yīng)于所列p值的算術(shù)平均距離。從這些數(shù)據(jù)中推斷出系統(tǒng)樹，正如附圖1所示，我們可以非常明顯地看到本發(fā)明的菌株與具有明顯相關(guān)性的木層孔菌屬菌株相比重新有所不同。表4BamHI消化的線粒體DNA的PRLP的F值和P值<tablesid="table4"num="004"><table>WD1222ATCC26710KCTC0399BPPL5PL4PLMATCC32233ATCC60051ATCC12240ATCC13271FP-71807-SHHB-3585-SpWD1222-0.19210.41420.34650.2310ATCC26710NC-0.02570.25700.31200.28410.23100.28410.2203KCTC0399BPNC0.8571-0.31200.28410.23100.28410.3358PL5NC0.85711.0000-0.31200.28410.23100.28410.3358PL4NC0.15380.15380.1538-0.33580.32430.3120PLMNC0.18180.18180.1818NC-0.2841ATCC32233NC0.25000.25000.25000.1333NC-0.37530.29870.17350.3465ATCC600510.3158NCNCNCNCNC0.1052-0.42090.36660.24110.3567ATCC122400.08330.018180.18180.1818NCNC0.16660.0800-0.29150.39960.2165ATCC13271NC0.26660.13130.13330.1428NC0.35300.1110.17390.2203FP-71807-S0.1250NCNCNCNCNCNC0.23530.09090.2666-HHB-3585-SP0.1250NCNCNC0.15380.18180.12500.11760.2727NCNC-</table></tables>表5CIaI消化的線粒體DNA的PRLP的F值和P值<tablesid="table5"num="005"><table>WD1222ATCC26710KCTC0399BPPL5PL4PLMATCC32233ATCC60051ATCC12240ATCC13271FP-71807-SHHB-3585-SpWD1222-0.11550.13510.15270.28410.29870.32430.03720.14120.23100.2507ATCC267100.5000-0.01960.08510.16860.18310.20880.15270.11550.2570KCTC0399BP0.44440.8888-0.05310.18310.12880.22030.16860.13510.2682PL50.40000.60000.7272-0.19640.14120.34650.18310.15270.2841PL40.18180.36360.33330.3077-0.10470.24110.19640.17360.12560.16860.2987PLM0.16660.33330.46150.42850.5333-0.36660.32430.18310.18310.18310.3120ATCC322330.14280.25870.26660.12500.23530.1111-0.23100.20060.20060.20880.2203ATCC600510.80000.40000.36360.33330.30770.14280.2500-0.34650.16820.2841ATCC122400.4285NCNCNC0.35290.33330.3000NC-0.26820.32430.2203ATCC13271NCNCNCNC0.47060.33330.30000.12500.2000-0.3243FP-71807-S0.25000.50000.44440.40000.36360.33330.28570.20000.14280.1482-0.2507HHB-3585-Sp0.22220.22220.20000.18180.16660.15380.26660.18180.2666NC0.222-</table></tables>表6EcoRI消化的線粒體DNA的PRLP的F值和P值<tablesid="table6"num="006"><table>WD1222ATCC26710KCTC0399BPPL5PL4PLMATCC32233ATCC60051ATCC12240ATCC13271FP-71807-SHHB-3585-SPWD222-0.38370.19210.20060.27640.25970.33020.01750.43390.18990.40710.2987ATCC267100.1000-0.14420.20060.16080.25970.33020.38370.31830.30540.40710.4142KCTC0399BP0.31580.4210-0.05090.20060.25070.25670.42750.31200.23100.21650.2915PL50.30000.30000.7368-0.27640.25970.14700.26820.31830.23780.22400.2987PL40.19040.38090.30000.1904-0.38370.26820.27640.43990.31200.29870.3054PLM0.21050.21050.22220.21050.1000-0.32430.25970.31200.41420.1964ATCC322330.13970.13790.21430.43180.20000.1428-0.33020.36620.12560.34650.2362ATCC600510.90000.10000.07690.20000.19040.21050.1379-0.43390.27380.29150.4142ATCC122400.07400.14810.15380.14810.07140.15380.11110.0740-0.34650.22030.2737ATCC132710.32000.16000.25000.24000.15380.08330.47050.24000.1250-0.256802915FP-71807-S0.08690.08690.27270.26800.1666NC0.12500.17390.26660.2142-0.4339HHB-3585-SP0.1666008330.17390.16660.16000.30770.24240.08330.19350.13790.0740-</table></tables>表7PvuII消化的線粒體DNA的PRLP的F值和P值<tablesid="table7"num="007"><table>WD1222ATCC26710KCTC0399BPPL5PL4PLMATCC32233ATCC60051ATCC12240ATCC13271FP-71807-SHHB-3585-SPWD1222-0.25070.26820.24110.08510.35670.29870.33580.3465ATCC267100.2222-0.11550.11550.29870.25070.34650.34650.3243KCTC0399BPNC0.5000-0.04790.34650.3243PL5NC0.50000.7500-0.3465PL4NC0.1666NCNC-0.19680.26820.3358PLM0.20000.2222NCNC0.3070-0．35670.2682ATCC322330.23530.1250NCNC0.20000.1176-0.23100．39960.4071ATCC600510.6000NCNCNCNC0.2000NC-0.5670.29870.33580.3465ATCC122400.11760.12500.12500.1250NCNC0.25000.1176-0.25970.10100.1760ATCC132710.1666NCNCNC0.1333NCNC0.16660.2105-0.12560.2507FP-71807-S0.13330.14280.1428NCNCNC0.09090.13330.54540.4706-0.2088HHB-3585-SP0.1250NCNCNCNCNC0.08690.12500.34780.22220.2857-</table></tables>表8共同片段的比例和相應(yīng)于P值的算術(shù)平均距離<tablesid="table8"num="008"><table>WD222ATCC26710KCTC0399BPPL5PL4PLMATCC32233ATCC60051ATCC12240ATCC13271FP-71807-SHHB-3585-SPWD1222-4/535/535/553/604/545/789/596/825/685/626/65ATCC267100.2499-6/504/528/606/517/753/565/794/654/592/62KCTC0399BP0.16360.0762-21/526/576/517/753/565/794/656/593/62PL50.17660.16450.0379-5/596/519/774/585/814/675/613/64PL40.28020.23500.23930.2616-7/588/824/634/868/724/664/69PLM0.27550.24440.22120.22830.2284-4/764/575/804/662/606/63ATCC322330.29850.27910.23600.24150.27830.3490-5/8110/10414/905/748/87ATCC600510.08230.26820.29800.22560.23640.28400.3121-3/856/716/654/68ATCC122400.33650.31630.31420.31630.30670.24750.27410.4038-6/9412/8812/91ATCC132710.24430.26280.28340.28680.27440.29860.16650.31230.2914-10/744/77FP-71807-S0.33010.28230.22530.18830.23360.18310.31830.25910.26130.2317-5/71HHB-3585-SP0.38170.33240.24980.29140.30530.26410.3025035030.22160.27110.2978-</table></tables>實(shí)施例Ⅶ裂蹄木層孔菌Yoo菌株KCTC0399BP的微生物特性研究裂蹄木層孔菌YooKCTC0399BP菌株的微生物特性，此菌株被鑒定為一種重新區(qū)別于具有很大相關(guān)性的木層孔菌屬的新菌株。它的子實(shí)體，無芽孢、多年生，含有半圓形菌蓋的木質(zhì)部分，半圓形菌蓋寬約10cm，厚約4cm。在采摘時(shí)，蕈表面為深褐色，但是隨著時(shí)間的流逝，表面會(huì)有許多裂隙而且顏色變深直至黑褐色，同時(shí)其子實(shí)層在顏色方面發(fā)生變化，由鮮紅色變?yōu)辄S褐色。子實(shí)層的菌管為帶有圓形小孔的多層結(jié)構(gòu)。其孢子長3-4cm，近球形，淡黃褐色。而且，有許多蒴柄和一個(gè)大小為15-30×8-10μm的壁。我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株幾乎與如下記載的裂蹄木層孔菌的所有方面均相同，此裂蹄木層孔菌記載在Imazeki，R.和Hongo，T.編輯，HoikushaImazeki出版的“日本蕈的顏色說明”p189中，被命名為裂蹄木層孔菌Yoo。我們于1997年11月17日在韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院韓國模式培養(yǎng)物保藏中心保藏該新型菌株，我們得到的保藏號為KCTC0399BP。實(shí)施例Ⅷ裂蹄木層孔菌YooKCTC0399BP的培養(yǎng)給一種每1L蒸餾水中含有50g淀粉、胨10g和酵母提取物10g的培養(yǎng)肉湯補(bǔ)充KH2PO40.8g，MgSO4·7H2O0.5g和CaCl20.3g，將其調(diào)至pH6.0，并進(jìn)行高壓滅菌。在5升發(fā)酵池的3.5升培養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)裂蹄木層孔菌YooKCTC0399BP菌絲體并在28℃下培養(yǎng)11天，同時(shí)，以2vvm向肉湯池中通氣，并以160rpm旋轉(zhuǎn)發(fā)酵池。培養(yǎng)5天后，得到最高的菌絲體收率(30g/l)，如附圖2所示。從培養(yǎng)5天后的菌絲體中，多糖物質(zhì)的熱水提取收率為0.873％每重量單位的干燥菌絲體。表9裂蹄木層孔菌的菌絲及多糖的產(chǎn)率<tablesid="table9"num="009"><table>項(xiàng)目培養(yǎng)5天的裂蹄木層孔菌的菌絲體干燥菌絲體重量(g/L)30干燥粗多糖重量262粗多糖產(chǎn)率(％)0.873</table></tables>實(shí)施例Ⅸ裂蹄木層孔菌Yoo菌株菌絲體培養(yǎng)物的提取對裂蹄木層孔菌Yoo菌株的菌絲體培養(yǎng)物進(jìn)行提取和純化，以獲得粗免疫刺激物質(zhì)。首先，對280g實(shí)施例Ⅷ中所獲得的菌絲體培養(yǎng)物進(jìn)行熱水提取，然后濃縮，得到3g熱水提取物。向提取物中加入乙醇至最終濃度為80％，在4℃下放置24小時(shí)，然后離心。將沉淀溶于水中，然后在10℃下用一個(gè)纖維素管(例如NipponJunkoJunYakuSeihing出售的)透析72小時(shí)，同時(shí)每12小時(shí)重新?lián)Q一次透析液。將纖維素管中的溶液冷凍干燥，得到2.45g粗提物。實(shí)施例Ⅹ純免疫刺激物質(zhì)的分離通過依次進(jìn)行離子交換層析和凝膠過濾層析完成純化。首先，將實(shí)施例Ⅸ中獲得的粗提物溶于5mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，上DEAE-纖維素柱，用相同的緩沖液洗滌。將一種在相同緩沖液中的NaCl溶液作為洗脫緩沖液，其濃度梯度為0-1M。它以5mL/min的速度流過柱，每實(shí)驗(yàn)試管收集洗脫液15mL。通過一種苯酚-硫酸法測定洗脫部分的糖含量，通過Bradford＇s法測定洗脫部分的蛋白含量。將含糖的部分上柱的頂部，此柱由多孔顆粒組成，例如市售的商品名為ToyopearlHW65F的柱，通過凝膠過濾層析含水洗脫液進(jìn)一步純化，得到在分子量和特性方面相似的純的活性級分。按照上述相同的方法測定其糖和蛋白的含量。如此獲得的純免疫刺激物質(zhì)被命名為“PL”。實(shí)施例Ⅺ多糖物質(zhì)的免疫刺激活性來源于擔(dān)子菌(Basidomycetes)的多糖物質(zhì)對增殖或活化淋巴細(xì)胞具有積極影響，并由此增強(qiáng)對外在因素和甚至癌細(xì)胞的免疫，這是已知的。多糖物質(zhì)的這種作用不是由直接細(xì)胞毒性產(chǎn)生的，而是免疫增強(qiáng)所造成的。因此，其優(yōu)點(diǎn)是在體內(nèi)產(chǎn)生很小的副作用。正是擔(dān)子菌(Basidomycetes)的多糖物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞毒作用的增強(qiáng)和淋巴細(xì)胞、B-細(xì)胞和T-細(xì)胞形成抗體而因此顯示出抗癌免疫活性。由此，通過對形成抗體淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和測量T-細(xì)胞的增殖間接地證明此多糖物質(zhì)具有抗癌免疫活性。在此實(shí)施例中，通過利用形成抗體細(xì)胞的方法對B-細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過混合淋巴細(xì)胞應(yīng)答技術(shù)測定T-細(xì)胞的增殖。另外，為了檢測此多糖物質(zhì)對淋巴細(xì)胞增殖的作用，通過使用3H-胸腺嘧啶核苷測定新近合成的核DNA。結(jié)果顯示于下表10中。表10各種物質(zhì)的免疫刺激活性*每種物質(zhì)的使用濃度為10μgml。從表10的數(shù)據(jù)中可以明顯地看出，從本發(fā)明的新的木層孔菌屬菌株中提取的多糖物質(zhì)在淋巴細(xì)胞增殖和T-細(xì)胞活性方面優(yōu)于對照組，兩者之比均大約為5倍。本發(fā)明的多糖物質(zhì)具有與脂多糖相似的高的B-細(xì)胞形成抗體能力。脂多糖是非常有效的免疫抑制劑，但是由于它在體內(nèi)具有嚴(yán)重的副作用而不能隨便使用。實(shí)施例Ⅻ免疫刺激多糖物質(zhì)的糖單位和組成將從實(shí)施例Ⅹ中獲得的多糖物質(zhì)進(jìn)行氣相色譜分析以分析其糖單位(附圖4)。分別用苯酚-硫酸方法和福林-苯酚方法測定它的碳水化合物和蛋白成份。在下列條件下，在一個(gè)HewlettPackard出售的名為“HP5890GC”的儀器上進(jìn)行分析，此儀器裝有一個(gè)熔融二氧化硅毛細(xì)管柱sp-2330(0.32mm×30m)。首先，將此柱在200℃下保持2分鐘，然后以每分鐘升高4℃的速度加熱直至250℃，然后在250℃維持2分鐘。分別將由儀器提供的檢測器和注射器維持在260℃和250℃。將2mg取自實(shí)施例Ⅺ所得的每份提取級分的多糖物質(zhì)用2NTFA水解，用NaBH4還原并用無水乙酸乙酰化，得到供氣相色譜分析的aditolacetate。結(jié)果顯示于下表11中。表11免疫活性級分的糖單位和組成實(shí)施例ⅪⅡ免疫刺激多糖物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析對免疫刺激多糖物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。首先，用65F凝膠柱層析證實(shí)其純度。附圖5是層析結(jié)果。正如我們所看到，每種碳水化合物和蛋白成分呈現(xiàn)單對稱峰，這說明PL是純的。從碳核磁共振波譜(附圖6)中，PL被鑒定為一種半乳甘露葡聚糖(glactomannoglucan)，其中葡萄糖單位通過α(1→4)和β(1→6)鍵連接形成一個(gè)長鏈，甘露糖和半乳糖結(jié)合作為長鏈的支鏈。按照組成結(jié)果的結(jié)構(gòu)分析表明PL是一種在結(jié)構(gòu)上與β-葡聚糖有很大差異的新的多糖。實(shí)施例ⅪⅤ多糖物質(zhì)從木層孔菌屬種類的菌絲體中提取、其純化及其免疫刺激活性。將木層孔菌屬種類的菌株包括火絨狀木層孔菌、鮑姆氏木層孔菌、松木層孔菌、淡黃色木層孔菌和變黑色木層孔菌進(jìn)行培養(yǎng)得到它們的菌絲體。從它們中提取并純化多糖物質(zhì)，然后用于誘導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞毒作用和淋巴細(xì)胞、B-細(xì)胞和T-細(xì)胞形成抗體，正如實(shí)施例VIII至實(shí)施例11中所述。通過對形成抗體淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和測定T-細(xì)胞的增殖間接地評價(jià)此多糖物質(zhì)的抗癌免疫活性。所得結(jié)果與實(shí)施例XI中的結(jié)果相似。實(shí)施例XV多糖物質(zhì)從木層孔菌屬種類子實(shí)體中的提取、其純化及其免疫激發(fā)活性將木層孔菌屬種類的菌株，包括火絨狀木層孔菌、鮑姆氏木層孔菌、松木層孔菌、淡黃色木層孔菌和變黑色木層孔菌進(jìn)行培養(yǎng)得到它們的子實(shí)體。從它們中提取并純化多糖物質(zhì)，然后用于誘導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞毒作用和淋巴細(xì)胞、B-細(xì)胞和T-細(xì)胞形成抗體，正如實(shí)施例VIII至實(shí)施例11中所述。通過對形成抗體淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和測定T-細(xì)胞的增殖間接地評價(jià)此多糖物質(zhì)的抗癌免疫活性。所得結(jié)果與實(shí)施例XI中的結(jié)果相似。實(shí)施例XVI根據(jù)給藥時(shí)間的多糖物質(zhì)抗癌細(xì)胞的治療活性用來源于小鼠的B16F10皮膚癌細(xì)胞測定多糖物質(zhì)的抗癌活性。在補(bǔ)充了10％血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)B16F10皮膚癌細(xì)胞，并且每周繼代培養(yǎng)2次。在每只小鼠的腹膜腔中植入多如100，000的B16F10細(xì)胞。記錄植入小鼠30天的存活力。對從癌細(xì)胞植入前一周至植入后12夭向腹膜內(nèi)給多糖物質(zhì)(預(yù)治療)的小鼠和癌細(xì)胞植入后12天向腹膜內(nèi)給多糖物質(zhì)(治療后)的小鼠進(jìn)行記錄。結(jié)果顯示于附圖7中，總結(jié)于下表12中。我們看到預(yù)治療小鼠組平均生存力最高，其次是后治療小鼠組，未治療小鼠組最低。實(shí)驗(yàn)鼠在體重方面沒有變化。表12多糖物質(zhì)的免疫治療<tablesid="table11"num="012"><table>實(shí)驗(yàn)組(mg/kg)平均存活力比例(％)第30天存活鼠的數(shù)目未治療20.81000/10預(yù)治療(100)29.01398/10治療后(100)25.81242/10</table></tables>實(shí)施例XVII隨不同免疫化學(xué)治療而變化的多糖物質(zhì)抗癌細(xì)胞的活性實(shí)驗(yàn)例1隨多糖物質(zhì)和阿霉素不同的聯(lián)合給藥而變化的抗癌活性使用B16F10皮膚癌細(xì)胞的相似的植入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定多糖物質(zhì)和阿霉素聯(lián)合給藥的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮膚癌細(xì)胞。阿霉素在腫瘤植入12天后通過腹膜給藥，而多糖物質(zhì)從植入前一周至植入后12天通過腹膜給藥。60天后，每天記錄小鼠的生存力。使用低劑量阿霉素不會(huì)損害小鼠。結(jié)果顯示于附圖8a和8b中，總結(jié)于下表13中。從資料中可以明顯看到?jīng)]有用藥劑治療的小鼠生存力很低，單獨(dú)用多糖物質(zhì)治療的小鼠的生存力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于未治療的小鼠。在附圖8a和附圖8b中顯示了當(dāng)小鼠分別使用劑量為每公斤體重0.1mg/kg阿霉素和0.3mg/kg阿霉素時(shí)的結(jié)果。給藥劑量為0.3mg/kg的小鼠的生存力明顯好于給藥劑量為0.1mg/kg的小鼠的生存力。在與多糖物質(zhì)聯(lián)合使用的情況下，阿霉素給藥劑量為0.3mg/kg的小鼠的生存力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于阿霉素給藥劑量為0.1mg/kg的小鼠的生存力。量化表示，植入B16F10皮膚癌細(xì)胞的小鼠平均存活18.1天。單獨(dú)使用多糖物質(zhì)治療時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間延長到31天。當(dāng)單獨(dú)以0.1mg/kg的給藥劑量使用阿霉素時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為35.4天。而當(dāng)單獨(dú)以0.3mg/kg的給藥劑量使用阿霉素時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為40.1天。如果阿霉素與多糖物質(zhì)聯(lián)合使用，那么小鼠的平均存活時(shí)間顯著延長，由阿霉素0.1mg/kg的給藥劑量下的46.9天延長到阿霉素0.3mg/kg的給藥劑量下的57.8天。實(shí)驗(yàn)中小鼠的體重沒有減輕。表13阿霉素和多糖物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的免疫治療<tablesid="table12"num="013"><table>實(shí)驗(yàn)組(mg/kg)平均存活力比例(％)第60天存活鼠的數(shù)目未治療18.1100.00/10P.S.1(100)31.0171.30/10Am2(0.1)Am(0.1)+P.S.(100)35.446.9195.6259.10/104/10Am(0.3)Am(0.3)+P.S.(100)40.157.8240.9319.32/109/10</table></tables>1多糖物質(zhì)2阿霉素實(shí)驗(yàn)例2隨多糖物質(zhì)和絲裂霉素C不同的聯(lián)合給藥而變化的抗癌活性如實(shí)驗(yàn)例1所述，使用B16F10皮膚癌細(xì)胞的相似植入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定多糖物質(zhì)和絲裂霉素C聯(lián)合給藥的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮膚癌細(xì)胞。絲裂霉素C在腫瘤植入12天后通過腹膜給藥，而多糖物質(zhì)從植入前一周至植入后12夭通過腹膜給藥。60天后，每天小鼠的生存力。使用低劑量絲裂霉素C不會(huì)損害小鼠。得到與實(shí)驗(yàn)例1相似的結(jié)果，并總結(jié)于下表14中。從資料中可以明顯看到?jīng)]有用藥劑治療的小鼠生存力很低，單獨(dú)用多糖物質(zhì)治療的小鼠的生存力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于未治療的小鼠。量化表示，植入B16F10皮膚癌細(xì)胞的小鼠平均存活18.1天。單獨(dú)使用多糖物質(zhì)治療時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間延長到31天。當(dāng)單獨(dú)以0.2mg/kg的給藥劑量使用絲裂霉素時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為32.5天。而當(dāng)單獨(dú)以0.6mg/kg的給藥劑量使用絲裂霉素C時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為38.0天。如果絲裂霉素C與多糖物質(zhì)聯(lián)合使用，那么小鼠的平均存活時(shí)間顯著延長，由絲裂霉素C0.2mg/kg的給藥劑量下的43.5天延長到絲裂霉素C0.6mg/kg的給藥劑量下的51.5天。實(shí)驗(yàn)中小鼠的體重沒有減輕。表14絲裂霉素C和多糖物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的免疫治療<tablesid="table13"num="014"><table>實(shí)驗(yàn)組(mg/kg)平均存活力比例(％)第60天存活鼠的數(shù)目未治療18.1100.00/10P.S.1(100)31.0171.30/10M.C2(0.2)M.C(0.2)+P.S.(100)32.543.5179.6240.30/103/10M.C(0.6)M．C(0.6)+P．S.(100)38.051.5209.9284.51/107/10</table></tables>1多糖物質(zhì)2絲裂霉素C實(shí)驗(yàn)例3隨多糖物質(zhì)和順鉑不同的聯(lián)合給藥而變化的抗癌活性如上述實(shí)驗(yàn)例所述，使用B16F10皮膚癌細(xì)胞的相似植入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定多糖物質(zhì)和順鉑聯(lián)合給藥的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮膚癌細(xì)胞。順鉑在腫瘤植入12天后通過腹膜給藥，而多糖物質(zhì)從植入前一周至植入后12天通過腹膜給藥。60天后，每天記錄小鼠的生存力。使用低劑量順鉑不會(huì)損害小鼠。得到與上述實(shí)驗(yàn)例相似的結(jié)果，并總結(jié)于下表15中。從資料中可以明顯看到?jīng)]有用藥劑治療的小鼠生存力很低，單獨(dú)用多糖物質(zhì)治療的小鼠的生存力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于未治療的小鼠。量化表示，植入B16F10皮膚癌細(xì)胞的小鼠平均存活18.1天。而單獨(dú)使用多糖物質(zhì)治療時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間延長到31天。當(dāng)單獨(dú)以0.5mg/kg的給藥劑量使用順鉑時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為33天。而當(dāng)單獨(dú)以1.5mg/kg的給藥劑量使用順鉑時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為40.5天。如果順鉑與多糖物質(zhì)聯(lián)合使用，那么小鼠的平均存活時(shí)間顯著延長，由順鉑0.5mg/kg的給藥劑量下的44.0天延長到順鉑1.5mg/kg的給藥劑量下的52.6天。實(shí)驗(yàn)中小鼠的體重沒有減輕。表15順鉑和多糖物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的免疫治療<tablesid="table14"num="015"><table>實(shí)驗(yàn)組(mg/kg)平均存活力比例(％)第50天存活鼠的數(shù)目未治療18.1100.00/10P．S.1(100)31.0171.30/10C.P2(0.5)C.P(0.5)+P.S.(100)33.044.0182.3243.00/103/10C.P(1.5)C.P(1.5)+P.S.(100)40.552.6223.8290.62/107/10</table></tables>1多糖物質(zhì)2順鉑實(shí)驗(yàn)例4隨多糖物質(zhì)和5-氟尿嘧啶不同的聯(lián)合給藥而變化的抗癌活性如上述實(shí)驗(yàn)例所述，使用B16F10皮膚癌細(xì)胞的相似植入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定多糖物質(zhì)和5-氟尿嘧啶聯(lián)合給藥的抗癌活性。在小鼠的腹膜腔中植入皮膚癌細(xì)胞。5-氟尿嘧啶在腫瘤植入12天后通過腹膜給藥，而多糖物質(zhì)從植入前一周至植入后12夭通過腹膜給藥。60夭后，每天記錄小鼠的生存力。使用低劑量5-氟尿嘧啶不會(huì)損害小鼠。得到與上述實(shí)驗(yàn)例相似的結(jié)果，并總結(jié)于下表16中。從資料中可以明顯看到?jīng)]有用藥劑治療的小鼠生存力很低，單獨(dú)用多糖物質(zhì)治療的小鼠的生存力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于未治療的小鼠。量化表示，當(dāng)單獨(dú)以1mg/kg的給藥劑量使用5-氟尿嘧啶時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為34.2天，而當(dāng)5-氟尿嘧啶與多糖物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)，小鼠的平均存活時(shí)間為45.5天。當(dāng)單獨(dú)使用5-氟尿嘧啶時(shí)，3mg/kg的給藥劑量可以使小鼠平均存活40.2天，而與多糖物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)，3mg/kg的給藥劑量可以使小鼠平均存活54.8天。實(shí)驗(yàn)中小鼠的體重沒有減輕。表161多糖物質(zhì)25-氟尿嘧啶實(shí)施例XVⅢ多糖物質(zhì)對來源于人體的癌細(xì)胞的抗癌活性應(yīng)用NC1-H23(一種肺癌細(xì)胞系)檢測多糖物質(zhì)抗人腫瘤的活性。給裸鼠皮下植入NC1-H23肺癌細(xì)胞。在癌細(xì)胞植入后的12天里將多糖物質(zhì)和阿霉素經(jīng)腹膜給予裸鼠。在癌細(xì)胞植入后的第19天測量癌細(xì)胞團(tuán)塊的大小，然后分離癌細(xì)胞并稱重。由于裸鼠缺乏T細(xì)胞，所以它們的免疫活性通常歸于自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性。因此，在給予多糖物質(zhì)后所獲得的免疫增強(qiáng)作用是通過這兩類細(xì)胞而介導(dǎo)的。結(jié)果顯示在下面的附圖9a和附圖9b中，并且在表17和18中用數(shù)字進(jìn)行了表示。從這些數(shù)據(jù)中可明顯地看出，既沒有用阿霉素也沒有用多糖物質(zhì)治療的癌細(xì)胞的尺寸最大，用多糖物質(zhì)治療的癌細(xì)胞其次，而用阿霉素治療的癌細(xì)胞最小。稱重后的結(jié)果也是如此。這些實(shí)驗(yàn)鼠的體重沒有增加或減少。表17人癌細(xì)胞的免疫治療(細(xì)胞大小mm3)1多糖物質(zhì)2阿霉素表18人癌細(xì)胞的免疫治療1多糖物質(zhì)實(shí)施例ⅪⅩ多糖物質(zhì)對鼠癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用為了實(shí)驗(yàn)多糖物質(zhì)對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，將B16F10皮膚癌細(xì)胞種植在C57BL/6鼠的尾靜脈中。在種植后的第14天，切除鼠的肺以研究是否有癌轉(zhuǎn)移發(fā)生或者轉(zhuǎn)移發(fā)生至何種程度。在腫瘤種植后的12天里將阿霉素經(jīng)腹膜給予此鼠，同時(shí)在種植前的1周至種植后的12天里將多糖物質(zhì)經(jīng)腹膜給藥。經(jīng)靜脈注射至鼠尾的B16F10皮膚癌細(xì)胞發(fā)生易位，在肺上形成黑點(diǎn)。結(jié)果顯示在下面的附圖10a和附圖10b中，并且數(shù)字總結(jié)在表19中。如附圖10a所示，未用任何藥物治療的鼠組中發(fā)現(xiàn)大約有272個(gè)癌斑點(diǎn)，按1mg/kg的劑量用阿霉素治療后斑點(diǎn)減少至197個(gè)，按3mg/kg的劑量用阿霉素治療后斑點(diǎn)進(jìn)一步減少至172個(gè)。阿霉素0.1-0.3mg/kg的劑量在抑制癌細(xì)胞生長方面顯示出潛在的活性，但是其1-3mg/kg的劑量抑制癌轉(zhuǎn)移的作用很弱。在單獨(dú)應(yīng)用多糖物質(zhì)治療后，這些癌斑點(diǎn)的數(shù)目減少至83個(gè)。在多糖物質(zhì)與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用的鼠組中，當(dāng)阿霉素的劑量為1mg/kg和3mg/kg時(shí)，所發(fā)現(xiàn)的癌斑點(diǎn)分別為136個(gè)和131個(gè)。因此在抑制癌轉(zhuǎn)移方面多糖物質(zhì)比阿霉素更有效。表191多糖物質(zhì)實(shí)施例ⅩⅩ多糖物質(zhì)對癌細(xì)胞的直接細(xì)胞毒作用的實(shí)驗(yàn)對多糖物質(zhì)的抗癌活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以觀察它是通過免疫增強(qiáng)作用來表達(dá)，還是通過對癌細(xì)胞的直接細(xì)胞毒作用來表達(dá)。用多糖物質(zhì)和劑量為0.3-30μg/kg的阿霉素對B16F10鼠皮膚癌細(xì)胞和NC1-H23人肺癌細(xì)胞進(jìn)行直接治療。在治療后的第2天根據(jù)sulforhodaminB方法測定尚存活的癌細(xì)胞。結(jié)果顯示在下面的附圖11中，數(shù)字總結(jié)在表20中。將沒有用任何化學(xué)藥品治療的實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量表示為“100％”，用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對治療實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較。從此數(shù)據(jù)中可清楚地看到，阿霉素對這兩類癌細(xì)胞均表現(xiàn)出潛在的細(xì)胞毒作用，而多糖物質(zhì)并沒有作用。綜合來看，上面實(shí)施例中所獲得的數(shù)據(jù)顯示阿霉素是通過細(xì)胞毒作用來發(fā)揮抗癌活性，而多糖物質(zhì)是通過免疫增強(qiáng)作用來表現(xiàn)其抗癌活性。表20多糖物質(zhì)的直接細(xì)胞毒作用實(shí)施例ⅩⅪ作為AIDS的預(yù)防和治療輔助用藥(Aid)的實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明的多糖物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以觀察其作為AIDS的預(yù)防和治療輔助用藥的可行性，并且發(fā)現(xiàn)它是有效的。綜合來看，實(shí)施例的數(shù)據(jù)顯示，按照RFLP分析，本發(fā)明的蕈是一種與木層孔菌屬的種類具有相關(guān)性的新的菌株，并且從木層孔菌屬種類的菌絲體獲得的多糖物質(zhì)具有抗癌活性，它是通過刺激T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和B細(xì)胞的抗體形成能力來表現(xiàn)的。另外，本發(fā)明的多糖物質(zhì)表現(xiàn)一種有效的抗癌轉(zhuǎn)移的活性。結(jié)果，可刺激機(jī)體免疫的這種多糖物質(zhì)在對諸如腫瘤和AIDS的免疫相關(guān)疾病的預(yù)防和治療方面是有效的，而且因此它在生物醫(yī)藥工業(yè)中是非常有用的。已對本發(fā)明進(jìn)行了舉例說明，并且可以認(rèn)識到所用的術(shù)語是為了進(jìn)行描述，而不是限制于此。根據(jù)上面的描述，可對本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變動(dòng)。因此可以認(rèn)為在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)可對本發(fā)明進(jìn)行實(shí)施，而不拘泥于具體的說明。權(quán)利要求1．一種新菌株，裂蹄木層孔菌YooKCTC0399BP，其能夠產(chǎn)生一種免疫刺激多糖物質(zhì)并且具有大小為61kb的線粒體DNA。2．一種新的天然免疫刺激物質(zhì)，它是從木層孔菌屬種類的菌絲體或子實(shí)體的培養(yǎng)物中提取和純化的。3．一種如權(quán)利要求2所述的新的天然免疫刺激物質(zhì)，其中所述的物質(zhì)由甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成。4．一種用于制備一種新的免疫刺激多糖物質(zhì)的方法，其特征在于它包括下列步驟在含有葡萄糖、酵母提取物和胨的培養(yǎng)基中培養(yǎng)木層孔菌屬的菌株以得到菌絲體或子實(shí)體；用熱水從菌絲體或子實(shí)體中提取所述的物質(zhì)；通過用乙醇沉淀、懸浮于水中和用透析管透析分離此物質(zhì)；并且通過依次進(jìn)行DEAE-纖維素層析和凝膠層析純化此物質(zhì)。5．一種抗癌免疫刺激活性的藥物可接受的組合物，其特征在于它含有從木層孔菌屬種類的菌絲體或子實(shí)體中獲得的多糖物質(zhì)或其衍生物作為有效成分。6．利用權(quán)利要求2或3中所述的多糖物質(zhì)作為一種免疫抗癌劑的用途。7．利用權(quán)利要求2或3中所述的多糖物質(zhì)作為一種包括AIDS在內(nèi)的免疫相關(guān)疾病的治療的輔助劑用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種新裂蹄木層孔菌Yoo,此蕈通過限制片段長度多態(tài)性和微生物特性分析被鑒定為新的。一種從其或其他木層孔菌屬種類的子實(shí)體或菌絲體中分離的多糖物質(zhì)具有一種通過刺激T－細(xì)胞的細(xì)胞毒作用和B－細(xì)胞的抗體形成能力所致的抗癌活性,而且此多糖物質(zhì)具有一種有效的抗癌轉(zhuǎn)移活性。此多糖物質(zhì)能夠刺激人體的免疫力在預(yù)防和治療免疫相關(guān)疾病例如癌癥和AIDS和研究這些疾病的基本機(jī)理方面有效。文檔編號C12P19/00GK1294196SQ9912544公開日2001年5月9日申請日期1999年10月25日優(yōu)先權(quán)日1999年10月25日發(fā)明者俞益東,趙秀默,樸柄彧,劉載國,洪南斗,金桓默,韓相配,李昌雨申請人:韓國科學(xué)技術(shù)研究院,韓萬愚