專利名稱：毛細(xì)管電泳分子信標(biāo)基因檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型快速、靈敏的基因檢測技術(shù)，尤其是能快速靈敏地對基因突變進(jìn)行檢測，適用于臨床疾病的基因診斷。
背景技術(shù)：
疾病的基因診斷主要是對DNA變異的診斷，引起疾病的DNA序列變異包括各種突變和多態(tài)性的變化。例如一個或多個核苷酸移位、缺失或插入、不同數(shù)量的短陣序列重復(fù)等。目前常用的基因突變/多態(tài)性檢測的方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、異源雙鏈分析(HA)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)及分子信標(biāo)技術(shù)(MB)等。
1、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP) 相同長度、不同序列的DNA片段因其二級結(jié)構(gòu)不同電泳遷移率也不同，DNA分子中小到一個堿基的序列變化都能夠改變其原有的二級結(jié)構(gòu)，從而改變其在凝膠中的電泳遷移率。SSCP利用野生型和突變型DNA片段不同的電泳遷移率對變異基因進(jìn)行篩選。SSCP不需要特殊的設(shè)備，是檢測基因突變的傳統(tǒng)方法中最快速且簡便的。但SSCP也存在一些缺點(diǎn)(1)只能指出DNA某一區(qū)域存在突變，不能對突變進(jìn)行解釋或精確定位；(2)單一電泳條件下SSCP突變檢出率為80％；(3)SSCP適宜檢測長度在100～300bp之間的PCR擴(kuò)增片段，片段長度大于300bp將降低檢測效率；(4)SSCP影響因素很多，需要分析人員有豐富的經(jīng)驗(yàn)；(5)SSCP耗時長，完整的SSCP分析過程通常需要6小時以上。
2、異源雙鏈分析(HA) 將PCR產(chǎn)物變性后重新退火，雜合子標(biāo)本中會形成四種雙鏈DNA，兩個同源雙鏈和兩個異源雙鏈，異源雙鏈在錯配堿基處形成鼓泡結(jié)構(gòu)畸變，在凝膠中的遷移速率慢于同源雙鏈。HA的突變檢出率為80％，分析片段長度范圍與SSCP相近，或略長一些。同時傳統(tǒng)HA也具有平板凝膠電泳的一般缺陷，不適合作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。
除SSCP和HA外，常用的平板凝膠電泳DNA變異分析方法還有變性梯度膠電泳(DGGE)、錯配堿基化學(xué)裂解法(CCM)等，因其煩瑣、費(fèi)時等缺點(diǎn)，而限制了它們在常規(guī)分析方面的應(yīng)用，只能在科研領(lǐng)域發(fā)揮其優(yōu)勢。
3、毛細(xì)管電泳篩選基因突變(CE-SSCP) 毛細(xì)管電泳是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳篩選基因突變不僅顯示了高度的敏感性(90％)，而且快速、簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。同時檢測DNA片段長度范圍廣，小到十幾個堿基，大到上千個堿基。但毛細(xì)管電泳對基因突變進(jìn)行篩選仍存在著不能對突變進(jìn)行解釋或精確定位的缺點(diǎn)。
4、分子信標(biāo)(Molecular Beacons，MB) MB是在同一探針的3’和5’末端分別標(biāo)記熒光分子和淬滅分子。該探針5’和3’末端自身形成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)，此時熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會產(chǎn)生熒光。當(dāng)溶液中有特異模板時，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，于是溶液便產(chǎn)生熒光，熒光的強(qiáng)度與溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析。分子信標(biāo)的一個基本特性是，因?yàn)镈NA雙螺旋的剛性，探針-靶序列雜交產(chǎn)物不能夠與莖互補(bǔ)狀態(tài)共存。完全互補(bǔ)的探針-靶序列雜交在能量上比莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而互補(bǔ)不完全的雜交體其能量不及莖環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。這一特性也是分子信標(biāo)檢測單核苷酸多態(tài)性高度特異性的基礎(chǔ)。分子信標(biāo)檢測技術(shù)是核酸檢測方法上重要突破。但分子信標(biāo)基因檢測技術(shù)仍具有其缺點(diǎn)，如它無法進(jìn)行多個基因突變點(diǎn)的同時檢測。同時由于分子信標(biāo)本底問題，很可能造成假陽性。
目前，基因診斷正處于由科研領(lǐng)域向臨床普及過渡的階段，尚無一種成熟的DNA變異篩選方法作為臨床常規(guī)診斷項(xiàng)目。這主要是因?yàn)閭鹘y(tǒng)檢測方法都有其局限性。因此建立簡便、敏感、特異和快速自動化的基因檢測手段迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)基因檢測方法的局限性，本發(fā)明對傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)——利用毛細(xì)管電泳技術(shù)快速、靈敏度高、成本低、可自動化等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合分子信標(biāo)檢測技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，創(chuàng)立新的高度靈敏的基因檢測技術(shù)——毛細(xì)管電泳分子信標(biāo)基因檢測技術(shù)。它不僅克服了毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)不能對基因突變進(jìn)行解釋或精確定位的缺點(diǎn)，也克服了分子信標(biāo)技術(shù)無法進(jìn)行多個基因突變點(diǎn)的同時檢測及由于分子信標(biāo)本底問題造成假陽性的缺點(diǎn)。同時這種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)自動化，適用于臨床疾病的基因診斷。
四

下面結(jié)合附圖對此技術(shù)發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行說明圖1為變性后分子信標(biāo)的電泳圖，我們可見其電泳峰在11秒左右出現(xiàn)；圖2為DNA片段與分子信標(biāo)雜交后的電泳圖，我們可見在11秒左右出現(xiàn)分子信標(biāo)峰，而在15秒左右出現(xiàn)雜交后的目的片段的峰。
從這兩個圖我們可以看出，即使分子信標(biāo)探針存在本底熒光問題，可以利用毛細(xì)管電泳技術(shù)對分子信標(biāo)探針與雜交后的目的片段進(jìn)行分離，不會影響檢測結(jié)果，從而避免造成假陽性。
五具體實(shí)施例方式我們以同時檢測腫瘤抑癌基因p53、p16和p73為例，對此檢測技術(shù)的具體實(shí)施方式
進(jìn)行說明。
1、根據(jù)某一待檢基因的特異序列或基因的已知突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)分子信標(biāo)同時檢測腫瘤抑癌基因p53、p16和p73時，我們可以根據(jù)各基因的常見突變位點(diǎn)利用分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)分子信標(biāo)。
2、對已知位點(diǎn)突變的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增根據(jù)上述抑癌基因的目的片段設(shè)計(jì)引物，并利用多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增。但要注意，所設(shè)計(jì)的DNA目的片段長度不要相近，避免分離困難。
3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與分子信標(biāo)進(jìn)行雜交在液相條件下進(jìn)行雜交(方法同普通探針的雜交方法)。有突變或基因缺失的無法與分子信標(biāo)探針進(jìn)行雜交，而無突變的可以進(jìn)行雜交。
4、對雜交后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，并在線利用激光誘導(dǎo)熒光檢測器進(jìn)行檢測。
先對熒光DNA Marker進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，確定各種片段長度的電泳峰位置；然后對雜交后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，能與分子信標(biāo)探針結(jié)合的DNA片段發(fā)出熒光，可被激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測到，按Marker的位置確定是何種基因片段。這種檢測技術(shù)不僅把不同片段的DNA片段進(jìn)行分離檢測，同時也可把未結(jié)合的分子信標(biāo)探針與其他DNA片段分離，達(dá)到檢測基因突變的目的。
權(quán)利要求
一種基因檢測技術(shù)，它克服傳統(tǒng)基因檢測方法的局限性，其特征是利用毛細(xì)管電泳技術(shù)快速、靈敏度高、成本低、可自動化等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合分子信標(biāo)檢測技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以簡便、敏感、特異和快速自動化的對基因及基因突變進(jìn)行檢測。
全文摘要
一種高度靈敏的基因檢測技術(shù)——毛細(xì)管電泳分子信標(biāo)基因檢測技術(shù)。它是對傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，利用毛細(xì)管電泳技術(shù)快速、靈敏度高、成本低、可自動化等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合分子信標(biāo)檢測技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，創(chuàng)立新的高度靈敏的基因檢測技術(shù)。它不僅克服了毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)不能對基因突變進(jìn)行解釋或精確定位的缺點(diǎn)，也克服了分子信標(biāo)技術(shù)無法進(jìn)行多個基因突變點(diǎn)的同時檢測及由于分子信標(biāo)本底問題造成假陽性的缺點(diǎn)。同時這種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)自動化，適用于臨床疾病的基因診斷。
文檔編號C12Q1/68GK1607257SQ200310101118
公開日2005年4月20日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者姜曉峰 申請人:姜曉峰