專利名稱：新的人熱休克蛋白、其編碼序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。涉及新的編碼人熱休克蛋白-樹突狀細(xì)胞衍生熱休克蛋白-70(Dendritic cell derived heat shock protein 70，簡稱為“D-HSP70”)的多核苷酸及其編碼的多肽。以及針對多肽的單克隆抗體。本發(fā)明還涉及人D-HSP70蛋白及其抗體的制備和在腫瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)性疾病、燒傷、抗感染、不育癥、Beheet′s綜合癥等疾病中的作用。
熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是一類在生物進(jìn)化中高度保守，廣泛存在于原核及真核生物一類蛋白質(zhì)，是生物細(xì)胞在受熱或者其它理化因素(如細(xì)菌，病毒感染，缺氧，缺血)等應(yīng)激反應(yīng)中所產(chǎn)生的熱休克反應(yīng)的誘導(dǎo)產(chǎn)物(Gilby etal.Mol Brain Res,1997,48:87)。用以增強自身細(xì)胞的保護(hù)作用，使之免受應(yīng)激因子的損害。
按照分子量HSP可以分為四類Hsp90家族、Hsp70家族、HSP60家族和小分子Hsp家族。不同的家族具有序列進(jìn)化上的特點。不同家族的HSPs具有下列共同特點HSP90和HSP70蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上具有高度保守性，小分子量的HSPs則顯示出屬特異性；機體不同組織含有HSP90,HSP70及其異構(gòu)體的量不同，如哺乳動物腦中這些蛋白的含量相應(yīng)高于肝臟；HSP90,HSP70在熱休克時迅速從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并結(jié)合成為細(xì)胞骨架中不溶性組分，恢復(fù)期溶解并返回胞漿，而小分子量HSPs在熱休克期聚集在核周，恢復(fù)期逐漸分解。3個不同家族的HSPs又具有各自的生理和病理意義，其中Hsp70家族是HSP中最保守和最主要的一類。在大多數(shù)生物中含量較多，在應(yīng)激后生成最為顯著的一類，也是最受關(guān)注、研究最為深入的一類HSP(Sharp et al.Trends Neurosci 1999；22:97)。
HSP70家族包括HSP68、72、73、75、78等多種蛋白，它們具有相同的酸性等電點和相似的胰蛋白酶肽譜。人Hsp70和果蠅Hsp70有73％同源性，和大腸桿菌的dnak蛋白有50％同源性。而HSP70(包括HSP72和HSP73)被認(rèn)為是這一家族中的主要成員。人類HSP70及其相關(guān)基因被定位于第6、14、21等對染色體上，HSP7O具有高度的保守性，N端具有ATP結(jié)合區(qū)和ATPase活性，比羧基端具有更高的保守性，與不同生物HSP70所共有的生化特性有關(guān)。
研究表明，HSP70作為分子伴侶，能夠提高細(xì)胞對應(yīng)激原耐受性，誘導(dǎo)抗腫瘤、病毒特異性免疫反應(yīng)，目前在抗腫瘤及病毒感染、抗炎性反應(yīng)、缺血后腦損傷、自身免疫性疾病的治療中等方面具有重要作用。HSP在生理及病理方面的主要有以下作用(1)分子伴侶作用HSP70是目前發(fā)現(xiàn)的主要伴侶蛋白之一，能與蛋白分子結(jié)合，保護(hù)新合成的蛋白分子的恰當(dāng)構(gòu)型，防止在正確的多聚體形成前，蛋白亞單位不恰當(dāng)?shù)恼郫B和聚焦。伴侶蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、跨膜，并參與蛋白質(zhì)的折疊、伸展及多聚復(fù)合體的組裝；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受損變性時，能促使其恢復(fù)或加速其降解和消除，能重新激活某些酶的作用，以維護(hù)細(xì)胞的功能和生存。HSP7O具有幫助蛋白質(zhì)完成細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的功能。HSP70能夠和一些細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合。并幫助這些蛋白質(zhì)穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔或線粒體膜，其解離過程需要ATP參與。細(xì)胞內(nèi)有很多蛋白合成后和HSP70暫時結(jié)合，以保證其適宜的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)移完成后，蛋白質(zhì)與HSP70解離，形成其最終的形態(tài)。
(2)提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性(3)參與機體免疫HSP在免疫方面發(fā)揮著重要作用，參與抗原加工遞呈，參與抗腫瘤免疫與抗感染免疫，并且與自身免疫性疾病關(guān)系密切。
(a)抗腫瘤免疫近年來的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用腫瘤細(xì)胞來源的HSP與腫瘤抗原性多肽形成的復(fù)合物，可誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。Srivastava等發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞表面有HSP受體，HSP-多肽復(fù)合物可以通過HSP受體而被巨噬細(xì)胞攝入胞內(nèi)，加工處理后，與MHC分子形成復(fù)合物，在共刺激分子的協(xié)同作用下，激活CD4+及CD8+T細(xì)胞，并分泌多種細(xì)胞因子輔助應(yīng)答。另外，有證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞可通過HSP-多肽復(fù)合物直接激活γδT細(xì)胞和NK細(xì)胞。應(yīng)用腫瘤組織的HSP-多肽復(fù)合物作為腫瘤疫苗，打破了MHC的限制，可使機體獲得特異性的抗腫瘤免疫，因而具有良好的前景(Menor et al.Semin Oncol 1998 25:654)。
(b)自身免疫性疾病HSP在自身免疫性疾病的發(fā)生與治療中起雙向作用。一方面某些HSP的位點可能與自身細(xì)胞的抗原高度同源(如口腔黏膜抗原)，而來源HSP的多肽可以特異性地激活Tγδ細(xì)胞(如Behcet′s綜合癥)，這可能是導(dǎo)致Behcet′s綜合癥的一個重要原因；另一方面，對于HSP位點的T細(xì)胞又可以在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中起保護(hù)作用。
(4)缺乏性腦損傷后HSP對細(xì)胞的保護(hù)作用。
正常腦組織HSP70 mRNA及蛋白含量極少。局灶及腦缺血后，受損細(xì)胞內(nèi)的變性蛋白可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)。HSP70可作為細(xì)胞或組織遭受可逆性缺血損害的分子生物學(xué)標(biāo)志。HSP70可以對通過抑止神經(jīng)元的調(diào)亡而對神經(jīng)元起保護(hù)作用。
(5)在神經(jīng)性疾病中的作用HSP70與癲癇的關(guān)系已被越來越多的文獻(xiàn)報道。受損腦組織中的神經(jīng)細(xì)胞有明顯HSP70表達(dá)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為癲癇發(fā)作模型中HSP70表達(dá)對因過度興奮導(dǎo)致受損的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。
(6)在精子形成中的作用精子的形成需要HSP70-2的輔助，剔除HSP70-2基因的雄性小鼠喪失生育能力。
綜上所述，HSP在(1)腫瘤的治療；(2)抗感染及炎性反應(yīng)；(3)治療某些自身免疫性疾病(如Beheet′s病、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性內(nèi)耳病)；(4)治療某些神經(jīng)性疾病，如癲癇、腦缺血；(5)男性不育(6)抗器官移植排斥反應(yīng)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的熱休克蛋白。
本發(fā)明的目的是提供一種新的人熱休克蛋白D-HSP70蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的D-HSP70多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO:2或3氨基酸序列的多肽。更佳地，該多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人D-HSP70多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中54-1583位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-1757位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人D-HSP70蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人D-HSP70蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人D-HSP70蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人D-HSP70多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-1757個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人D-HSP70多肽活性的化合物，以及抑制人D-HSP70多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人D-HSP70多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在D-HSP70蛋白的方法，它包括將樣品與D-HSP70蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在D-HSP70蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測與人D-HSP70多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人D-HSP70多肽活性的激動劑，或者篩選抑制人D-HSP70多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人D-HSP70蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人D-HSP70多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)性疾病、燒傷、抗感染、不育癥、Beheet′s綜合癥等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明的人D-HSP70的cDNA序列，其中非編碼序列用小寫字母表示，編碼序列用大寫字母表示。
圖2是本發(fā)明的人D-HSP70蛋白的全長氨基酸序列。
圖3是本發(fā)明的人D-HSP70蛋白與小鼠熱休克蛋白HSP70nst的氨基酸序列同源性比較圖。下方序列是人D-HSP70，上方序列是小鼠HSP70nst蛋白。相同的氨基酸在兩個序列之間用“｜”標(biāo)出，相似的氨基酸用“”或“.”標(biāo)出。
圖4是本發(fā)明的人D-HSP70蛋白的Kyte-doolitte疏水性分析的疏水性曲線圖。
在本發(fā)明中，術(shù)語“D-HSP70蛋白”、“D-HSP70多肽”或“熱休克蛋白D-HSP70”可互換使用，都指具有人熱休克蛋白D-HSP70氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的熱休克蛋白D-HSP70。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的D-HSP70蛋白或多肽”是指D-HSP70多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化D-HSP70蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。D-HSP70多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人D-HSP70蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人D-HSP70蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(ⅰ)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(ⅲ)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人D-HSP70多肽”指具有人D-HSP70蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人D-HSP70蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人D-HSP70蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人D-HSP70 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人D-HSP70多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人D-HSP70多肽或其片段的融合蛋白(例如，融合于6His以便純化，比如SEQ ID NO:3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人D-HSP70多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人D-HSP70多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人D-HSP70蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人D-HSP70多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人D-HSP70蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上,更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸所編碼的多肽與SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼D-HSP70蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人D-HSP70核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230:1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或D-HSP70蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Scienee,1984；224:1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的D-HSP70多肽。一般來說有以下步驟(1)．用本發(fā)明的編碼人D-HSP70多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)．在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3)．從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人D-HSP70多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人D-HSP70編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復(fù)制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人D-HSP70蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療D-HSP70蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笵-HSP70蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人D-HSP70蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人D-HSP70蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人D-HSP70 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人D-HSP70基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人D-HSP70基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人D-HSP70蛋白的分子，也包括那些并不影響人D-HSP70蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人D-HSP70基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人D-HSP70基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人D-HSP70蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人D-HSP70蛋白功能的抗體以及不影響人D-HSP70蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人D-HSP70基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人D-HSP70基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人D-HSP70蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人D-HSP70蛋白。此外，與人D-HSP70蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人D-HSP70蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人D-HSP70蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人D-HSP70蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人D-HSP70蛋白陽性的細(xì)胞(例如淋巴結(jié)細(xì)胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人D-HSP70蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與D-HSP70蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)性疾病、燒傷、抗感染、不育癥、Beheet′s綜合癥方面的治療。在使用本發(fā)明D-HSP70蛋白時，還可同時使用其他治療劑，如TNF-α、TNF-β等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明D-HSP70多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的D-HSP70蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1O微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人D-HSP70蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于D-HSP70蛋白的無表達(dá)或異常/無活性的D-HSP70蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成表達(dá)變異的D-HSP70蛋白，以抑制內(nèi)源性的D-HSP70蛋白活性。來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將D-HSP70基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶D-HSP70基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(xiàn)(Sambrook,et al.)。另外重組人D-HSP70基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制人D-HSP70 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與人D-HSP70蛋白結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對人D-HSP70蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人D-HSP70蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人D-HSP70蛋白水平，可以用作解釋人D-HSP70蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷D-HSP70蛋白起作用的疾病。
一種檢測檢測樣品中是否存在D-HSP70蛋白的方法是利用D-HSP70蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與D-HSP70蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在D-HSP70蛋白。
D-HSP70蛋白的多聚核苷酸可用于D-HSP70蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，D-HSP70蛋白的多聚核苷酸可用于檢測D-HSP70蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下D-HSP70蛋白的異常表達(dá)。如D-HSP70 DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷D-HSP70蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用D-HSP70蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測D-HSP70蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測D-HSP70基因的突變也可用于診斷D-HSP70蛋白相關(guān)的疾病。D-HSP70蛋白突變的形式包括與正常野生型D-HSP70 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northem印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明D-HSP70蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick,Mendelian Inheritance inMan(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯(lián)機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中分離出的或用RT-PCR法獲得，其序列如SEQ ID NO:1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1757個堿基，其開放讀框位于54-1583位，編碼全長為509個氨基酸的人D-HSP70蛋白(SEQ ID NO:2)。本發(fā)明的D-HSP70蛋白可為治療腫瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)性疾病、燒傷、抗感染、不育癥、Beheet′s綜合癥等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1.人D-HSP70蛋白cDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹突狀細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptⅡ克隆試劑盒(購自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌形成cDNA質(zhì)粒文庫。用雙脫氧法測定隨機挑選克隆的5′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個cDNA克隆SBBI的DNA序列為新的cDNA。對新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測定。計算機分析表明，克隆所含的全長cDNA是一個新的cDNA序列(如SEQ ID NO:1所示)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO:2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人D-HSP70蛋白，其編碼基因命名為人D-HSP70蛋白基因。
D-HSP70的cDNA序列如SEQ ID NO:1和圖1所示，全長為1757bp，包括53bp的5′端非編碼區(qū)和174bp的3′端非編碼區(qū)，編碼含509氨基酸的多肽(SEQ IDNO:2和圖2)。
根據(jù)GCG軟件分析，D-HSP70理論分子量約為55kD，等電點為5.27，包含2個糖基化位點，1個HSP70家族基序，7個PKC磷酸化位點，1個真核半胱氨酸蛋白酶位點，具有典型的HSP70家族蛋白的特點。
BLAST分析表明其與已知基因不同，這種分子的蛋白產(chǎn)物與小鼠HSP-70 nst高度同源，具有90.3％的一致性和93.5％的相似性(圖3)。由于HSP家族分子在不同種屬間具有較高的同源性，這表明本發(fā)明的D-HSP70蛋白是人的熱休克蛋白70家族中的新成員，命名為樹突狀細(xì)胞衍生熱休克蛋白-70(Dendritic cellderived heat shock protein 70，簡稱為“D-HSP70”)。
如圖4所示，對D-HSP70蛋白進(jìn)行的Kyte-doolitte疏水性分析表明，D-HSP70是一胞內(nèi)蛋白。
實施例2用RT-PCR方法克隆人D-HSP70蛋白的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處于對數(shù)生長期前髓白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞總RNA，取6mg細(xì)胞總RNA與0.5μg Oligo-dT12-18混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μl ddH2O進(jìn)行稀釋。PCR擴增D-HSP70所用的引物如下引物#561:5′-CTGTTGCTGT TGGGGGACCC-3′(SEQ ID NO:4)，引物#426:5′-ACAGTTCATTGAAAAAGTATT-3′(SEQ ID NO:5)。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和lU ExTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，擴增參數(shù)為94℃30秒、54℃30秒、72℃45秒，25個循環(huán)后PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。產(chǎn)物片段純化后直接克隆至pGEM-T載體(Promega)。DNA序列分析結(jié)果表明該PCR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQ ID NO:1所示的1-1682bp完全相同。
實施例3D-HSP70 Northern印跡分析按如下方法進(jìn)行Northern印跡分析待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預(yù)熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預(yù)雜交30分鐘；將標(biāo)記好的cDNA探針(是否要描述一下)于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時。
Northern印跡雜交結(jié)果顯示在腎、腎上腺、心臟、骨骼肌、肝和胰腺、胎盤、睪丸、卵巢、外周血白細(xì)胞、結(jié)腸、腦、脾、胸腺、小腸、前列腺和肺等組織中均有表達(dá)。這表明，D-HSP70是一種廣泛表達(dá)的蛋白，在許多細(xì)胞中發(fā)揮作用。
實施例4 D-HSP70重組表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建中所用的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/neo(Invitrogen公司)含CMV啟動子、SV40復(fù)制起始點、新霉素抗性基因，可進(jìn)行目的基因的短暫表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。在其外源基因克隆位點的下游，含有myc表位和6個連續(xù)組氨酸(6his)編碼序列和該讀框的終止密碼子，因此可根據(jù)需要表達(dá)C端連有myc表位和6His的融合蛋白，利用6His進(jìn)行蛋白純化，利用myc表位檢測表達(dá)的融合蛋白。此外，外源基因克隆位點的兩端分別是含有T7啟動子和牛生長激素BGH的polyA信號，可用T7和BGH通用引物對主的外源基因進(jìn)行直接測序。
(1)構(gòu)建表達(dá)天然D-HSP70的表達(dá)載體pcDNA-D-HSP70以實施例2中的PCR擴增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴增，獲得人D-HSP70 DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′端寡核苷酸引物(有義引物)序列為5′-gggaattcgctgccgtccctgctgcctc-3′(SEQ ID NO:6)該引物含有EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是對應(yīng)于SEQID NO:1的部分序列；3′端引物(反義引物)序列為5′-gggtacctta aaa att ctt gat ttc tct a-3′(SEQ ID NO.7)，該引物含有KpnⅠ限制性內(nèi)切酶的酶切位點和對應(yīng)于SEQ ID NO:1的部分序列。
所擴增的PCR產(chǎn)物記為D-HSP70-CQ，大小為1590bp；由于編碼D-HSP70蛋白的開放讀框中含有D-HSP70本身的終止密碼子，其下游的myc表位和6His無法翻譯，因此所表達(dá)的D-HSP70重組蛋白氨基酸序列與天然D-HSP70理論上完全一致，不含myc表位和6His。表達(dá)產(chǎn)物用于D-HSP70瞬時表達(dá)的研究。
PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化后，EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，直接連入同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重組載體記為pcDNA-D-HSP70。其D-HSP70的基因序列經(jīng)T7和BGH引物測序確證，正確無誤。
(2)構(gòu)建表達(dá)載體pD-HSP70-His，用于表達(dá)熱休克蛋白D-HSP70的C末端與myc/His融合的融合蛋白D-HSP70-His按類似的方法構(gòu)建表達(dá)載體pD-HSP70-His，不同點在于所用的反義鏈引物是5′-gggtaccagatgctatctcaatgt-3′(SEQ ID NO:8)。所擴增的PCR產(chǎn)物記為D-HSP70-BN，預(yù)計大小為1560bp，所表達(dá)的重組蛋白D-HSP70-His C端含有myc表位和6His，成熟蛋白的理論分子量為59kD。用于D-HSP70穩(wěn)定表達(dá)的研究。
PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化后，EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，直接連入同樣酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Myc-His(-)，形成的重組載體記為pD-HSP70-His?；蛐蛄薪?jīng)T7和BGH引物測序確證，正確無誤。
實施例5D-HSP70蛋白和D-HSP70-His融合蛋白的表達(dá)、分離和純化(1)D-HSP70蛋白和D-HSP70-His融合蛋白的表達(dá)將實施例4中制得的兩種重組質(zhì)粒pcDNA-D-HSP70和pD-HSP70-His的DNA，分別與脂質(zhì)體按1∶5比例混合，室溫作用45分鐘；將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞洗兩遍后與DNA混合。在轉(zhuǎn)染后72小時，進(jìn)行35S代謝標(biāo)記。在標(biāo)記后4小時，收集被pcDNA-D-HSP70、pD-HSP70-His和pcDNA3.1質(zhì)粒(作為空白對照)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞，裂解細(xì)胞，離心去除細(xì)胞碎片后，進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳和放射性自顯影分析。
結(jié)果表明用質(zhì)粒pcDNA-D-HSP70轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中，有約55kDa的主條帶；用質(zhì)粒pD-HSP70-His轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中，有約59kDa的主條帶；而用pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中，無上述主條帶。上述主條帶的分子量與預(yù)計分子量相近。
(2)D-HSP70-His融合蛋白的分離和純化用質(zhì)粒pD-HSP70-His轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后72小時添加G418，擴增后收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞被裂解、離心并上His-Trap親和層析柱(Pharmacia公司)，獲得了分子量約為59kDa的融合蛋白D-HSP70-His(SEQ ID NO:3)。
用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，證實其N端序列與SEQ ID NO:2所示的N端序列相符。
實施例6抗人D-HSP70蛋白抗體的產(chǎn)生將實施例5中獲得的重組蛋白D-HSP70-His用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人D-HSP70蛋白基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
實施例7人D-HSP70蛋白-多肽復(fù)合物誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答將β-Gal重組表達(dá)載體pSV-βGal(Promega)和實施例4中的D-HSP70-His表達(dá)載體pD-HSP70-His，共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時后，用金屬螯合層析分離出D-HSP-70-多肽復(fù)合物。用該復(fù)合物免疫小鼠，可以刺激機體產(chǎn)生針對β-Gal的CTL特異性免疫反應(yīng)。
將實施例4中的D-HSP70-His表達(dá)載體pD-HSP70-His轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細(xì)胞，分離出D-HSP70-多肽復(fù)合物。將此復(fù)合物注入C57BL/6小鼠體內(nèi)，可使小鼠獲得抵抗黑色素瘤攻擊的能力。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱新的人熱休克蛋白、其編碼序列及用途(ⅲ)序列數(shù)目8(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1757bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CTGTTGCTGT TGGGGGACCC CCTCATTCCT GCCGCTGCCG TCCCTGCTGC 50CTCATGGCGG CCATCGGAGT TCACCTGGGC TGCACCTCAG CATGTGAGGC 100CGTCTATAAG GATGGCCGGG CTGGTGTGGT TGCAAATGAT GCCGGTGACC 150GAGTTAGTGC AGCTGTTGTT GCTTACTCAG AAAATGAAGA GATTGTTGGA 200TTGGCAGCAA AACAAAGTAG AATAAGAAAT ATTTCAAATA CAGTAATGAA 250AGTAAAGCAG ATCCTGGGCA GAAGCTCCAG TGATCCACAA GCTCAGAAAT 3O0ACATCGCGGA AAGTAAATGT TTAGTCATTG AAAAAAATGG GAAATTACGA 350TATGAAATAG ATACTGGAGA AGAAACAAAA TTTGTTAACC CAGAAGATGT 400TGCCAGACTG ATATTTAGTA AAATGAAAGA AACGGCACAT TCTGTATTGG 450GCTCAGATGC AAATGATGTA GTTATTACTG TCCCGTTTGA TTTTGGAGAA 500AAGCAAAAAA ATGCTCTTGG AGAAGCAGCT AGAGCTGCTG GATTTAATGT 550TTTGCGATTA ATTCACGAAC CGTCTGCAGC TCTTCTTGGT TATGGAATTG 6O0GACAAGACTC CGCTACTGGA AAAAGCAATA TTTTGGTGTT TAAGGTTGGA 650GGAACATCCT TATCTCTCAG CGTCATGGAA GTTAACAGTG GAATATATCG 700GGTTCTTTCA ACAAACACTG ATGATAACAT CGGTGGTGCA CATTTCACAG 750AAACCTTAGC ACAGTATCTA GCTTCTGAGT TCCAAAGATC CTTCAAACAT 800GATGTGAGAG GAAATGCGCG AGCCATGATG AAATTAACGA ACAGTGCTGA 850AGTAGCGAAA CATTCTTTGT CAACCTTGGG AAGTGCCAAC TGTTTTCTTG 900ACTCATTATA TGAAGGTCAA GATTTTGATT GCAATGTGTC CAGAGCAAGA 95OTTTGAACTTC TTTGTTCTCC ACTTTTTAAT AAGTGTATAG AAGCAATCAG 1000AGGACTCTTA GATCAAAATG GATTTACAGC AGATGATATC AACAAGGTTG 1050TCCTTTGTGG AGGGTCTTCT CGAATCCCAA AGCTACAGCA ACTGATTAAA 1100GATCTTTTCC CAGCTGTTGA GCTTCTCAAT TCTATCCCTC CTGATGAAGT 1150GATCCCTATT GGTGCAGCTA TAGAAGCAGG AATTCTTATT GGGAAAGAAA 1200ACCTGTTGGT GGAAGACTCT CTTATGATAG AGTGTTCAGC CAGAGATATT 1250TTAGTTAAGG GTGTGGACGA ATCAGGAGCC AGTAGATTCA CAGTGCTGTT 1300TCCATCAGGG ACTCCTTTGC CAGCTCGAAG ACAACACACA TTGCAAGCCC 1350CTGGAAGCAT ATCTTCAGTG TGCCTTGAAC TCTATGAGTC TGATGGGAAG 1400AACTCTGCCA AAGAGGAAAC CAAGTTTGCA CAGGTTGTAC TCCAGGATTT 1450AGATAAAAAA GAAAATGGAT TACGTGATAT ATTAGCTGTT CTTACTATGA 1500AAAGGGATGG ATCTTTACAT GTGACATGCA CAGATCAAGA AACTGGAAAA 1550TGTGAAGCAA TCTCTATTGA GATAGCATCT TAATGTTTTA GAGAAATCAA 1600GAATTTTTAA AAACAAGAAT ATCAACATTT GGTTTTGTAG TATAAGTGGT 1650GTTTGTATTA AAATACTTTT TCAATGAACT GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1700AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1750AAAAAAA 1757(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度509個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2MAAIGVHLGC TSACEAVYKD GRAGVVANDA GDRVTPAVVA YSENEEIVGL 50AAKQSRIRNI SNTVMKVKQI LGRSSSDPQA QKYIAESKCL VIEKNGKLRY 100EIDTGEETKF VNPEDVARLI FSKMKETAHS VLGSDANDVV ITVPFDFGEK 150QKNALGEAAR AAGFNVLRLI HEPSAALLAY GIGQDSPTGK SNILVFKLGG 200TSLSLSVMEV NSGIYRVLST NTDDNIGGAH FTETLAQYLA SEFQRSFKHD 250VRGNARAMMK LTNSAEVAKH SLSTLGSANC FLDSLYEGQD FDCNVSRARF 300ELLCSPLFNK CIEAIRGLLD QNGFTADDIN KVVLCGGSSR IPKLQQLIKD 350LFPAVELLNS IPPDEVIPIG AAIEAGILIG KENLLVEDSL MIECSARDIL 400VKGVDESGAS RFTVLFPSGT PLPARRQHTL QAPGSISSVC LELYESDGKN 450SAKEETKFAQ VVLQDLDKKE NGLRDILAVL TMKRDGSLHV TCTDQETGKC 500EAISIEIAS 509(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度540個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:MAAIGVHLGC TSACEAVYKD GRAGVVANDA GDRVTPAVVA YSENEEIVGL 50AAKQSRIRNI SNTVMKVKQI LGRSSSDPQA QKYIAESKCL VIEKNGKLRY 100EIDTGEETKF VNPEDVARLI FSKMKETAHS VLGSDANDVV ITVPFDFGEK 150QKNALGEAAR AAGFNVLRLI HEPSAALLAY GIGQDSPTGK SNILVFKLGG 200TSLSLSVMEV NSGIYRVLST NTDDNIGGAH FTETLAQYLA SEFQRSFKHD 250VRGNARAMMK LTNSAEVAKH SLSTLGSANC FLDSLYEGQD FDCNVSRARF 300ELLCSPLFNK CIEAIRGLLD QNGFTADDIN KVVLCGGSSR IPKLQQLIKD 350LFPAVELLNS IPPDEVIPIG AAIEAGILIG KENLLVEDSL MIECSARDIL 400VKGVDESGAS RFTVLFPSGT PLPARRQHTL QAPGSISSVC LELYESDGKN 450SAKEETKFAQ VVLQDLDKKE NGLRDILAVL TMKRDGSLHV TCTDQETGKC 500EAISIEIASP DPSSVPSFLE QKLISEEDLN SAVDHHHHHH 540(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CTGTTGCTGT TGGGGGACCC 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:ACAGTTCATT GAAAAAGTAT T 21(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GGGAATTCGC TGCCGTCCCT GCTGCCTC 28(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7GGGTACCTTA AAAATTCTTG ATTTCTCTA29(2)SEQ ID NO8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:GGGTACCAGA TGCTATCTCA ATGT 2權(quán)利要求
1．一種分離的人D-HSP70多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2．如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO:2或3氨基酸序列的多肽。
3．一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5．如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中54-1583位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-1757位的序列。
6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7．一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8．一種具有人D-HSP70蛋白活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人D-HSP70蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人D-HSP70蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求1所述的人D-HSP70蛋白特異性結(jié)合的抗體。
10．一種核酸分子，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸中連續(xù)的10-1757個核苷酸。
11．一種檢測樣品中是否存在D-HSP70蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與權(quán)利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在D-HSP70蛋白。
12．如權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于篩選促進(jìn)人D-HSP70蛋白活性的激動劑，或者篩選抑制人D-HSP70蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。
13．一種如權(quán)利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作為引物用于PCR擴增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
14．一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新的人熱休克蛋白－樹突狀細(xì)胞衍生熱休克蛋白－70(Dendritic cell derived heat shockprotein 70,簡稱為“D－HSP70”)、編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種新的D－HSP70的多核苷酸的用途以及抗此蛋白分子的拮抗劑及其治療作用。本發(fā)明還公開了新的人D－HSP70在腫瘤及病毒性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)性疾病、燒傷、抗感染、不育癥、Beheet′s綜合癥等疾病中的治療作用。
文檔編號C12N15/64GK1299830SQ9912427
公開日2001年6月20日 申請日期1999年12月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月16日
發(fā)明者曹雪濤, 萬濤, 章衛(wèi)平, 李楠, 袁正隆, 何龍, 黃欣 申請人:上海華晨生物技術(shù)研究所