專利名稱：寧南霉素的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寧南霉的生產(chǎn)工藝。
寧南霉素是中科院成都生物所胡厚芝等同志發(fā)明，這一發(fā)明在生物農(nóng)藥領(lǐng)域處于國內(nèi)領(lǐng)先水平，但由于工藝的問題，至今大規(guī)模生產(chǎn)的問題尚水解決。
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的寧南霉素的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于凍干菌種經(jīng)試管斜面培養(yǎng)、茄子瓶斜面培養(yǎng)后制成種子液，種子液在5M3種子罐中培養(yǎng)，種子罐通氣量1-2∶lv／h、2．5-5m3／min，PH值6-7，轉(zhuǎn)速250-350r／min，培養(yǎng)好的種子液在20M3發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵罐通氣量1-2∶lv／h、14-28m3／min，PH值6-7，轉(zhuǎn)速250-350r／min，發(fā)酵液經(jīng)后提取工藝制成寧南霉素。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，年產(chǎn)3000噸寧南霉素工程項(xiàng)目，投資規(guī)模3000萬元，年銷售收入4800萬元，年利稅1277萬，投資利潤率43％，投資償還期3．27年，是具有較高投資回報(bào)率的項(xiàng)目。1997年在黑龍江省某廠成功進(jìn)行20M3罐試生產(chǎn)，先后進(jìn)行40批產(chǎn)品生產(chǎn)達(dá)152噸，效價(jià)達(dá)1萬單位以上。該產(chǎn)品經(jīng)1998年海南、云南、內(nèi)蒙、黑龍江田間實(shí)驗(yàn)取得良好的效果。云南大理在煙草防治花葉病上，防效在70％以上，單葉干重增3．8克，有效葉片增加，上中等煙比例提高21．09％，畝產(chǎn)量增41．2千克，畝產(chǎn)值增657．67元，黑龍江省海林煙草防治花葉病防效高達(dá)83-90％，內(nèi)蒙古阿榮旗防止大豆根腐病防效達(dá)70-92％。1998年在該廠繼續(xù)進(jìn)行生產(chǎn)，先后生產(chǎn)批，280噸產(chǎn)品，效價(jià)達(dá)1-1．5萬單位。經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)，該產(chǎn)品對(duì)瓜類白粉病具有較好防治作用和治療作用，對(duì)大豆根腐菌、全鐮刀菌、灰斑病有抑制作用，對(duì)煙草花葉病有良好防治效果，對(duì)南瓜和馬鈴薯晚疫病也有抑制作用。
下面詳述本發(fā)明的實(shí)施例。
本發(fā)明的生產(chǎn)工藝分為三個(gè)部分菌種培養(yǎng)、發(fā)酵工藝、和后提取工藝。
1、菌種培養(yǎng)(1)斜面培養(yǎng)菌種①、菌種為諾爾斯鏈霉素西昌變種，即由中科院成都生物所提供的(F5)菌株選育分離的凍干種。
②、培養(yǎng)基配制a、配方玉米粉3％、花生餅粉3％、葡萄糖1％、淀粉1％、NaCl0．5％、CuCO30．4％、(NH4)SO40．25％、K2HPO40．02％、MgSO40．025％、酵母粉0．1％、黃豆餅粉1％、瓊脂2．2-2．3％、PH值7．0-7．2，實(shí)施時(shí)，PH值為7．0。
b、配制方法按上述配方稱量。將粉類有機(jī)物煮30分鐘，再與其它成份混合，分裝到試管，后滅菌消毒冷卻。待培養(yǎng)基固化，放置37℃恒溫箱進(jìn)行20-24小時(shí)培養(yǎng)。
c、接種將冷藏于4℃的凍干種放置于常溫。接種后送菌種培養(yǎng)室，在恒溫28℃和恒濕80％無菌空氣流通條件下培養(yǎng)13-17天，實(shí)施時(shí)16天，即可作斜面種子。
d、斜面試管孢子生長凍干種接種斜面產(chǎn)生孢子菌落，4-5天菌落布滿斜面培養(yǎng)基，6-8天孢子在培養(yǎng)基面上呈淺鼠灰色，長勢(shì)豐滿，成熟后的孢子變白，產(chǎn)生菌絲，13-17天菌絲轉(zhuǎn)變?yōu)闇\鼠灰色。這樣的孢子可作為斜面茄子瓶接種菌種。
(2)茄子瓶斜面培養(yǎng)菌種與試管斜面培養(yǎng)菌種相同，從略。
用茄子瓶斜面經(jīng)13-17天，實(shí)施例經(jīng)15天培養(yǎng)的孢子，制作種子罐種子液。
2、發(fā)酵工藝發(fā)酵采用5M3種子罐和20M3發(fā)酵罐，要求滅菌操作。發(fā)酵階段共分二個(gè)階段其一，生產(chǎn)寧南霉素孢子，在培養(yǎng)基中膨脹生成菌絲，并擴(kuò)菌絲量；其二，菌絲在培養(yǎng)基中進(jìn)行菌絲生長，并進(jìn)行代謝合成反應(yīng)，產(chǎn)生抗生素寧南霉素。
(1)5M3種子罐培養(yǎng)a、種子培養(yǎng)基配方玉米粉1％、花生餅粉3％、葡萄糖2％、淀粉1％、酵母粉0．2％、NaCl0．4％、CuCO30．4％、(NH4)SO40．4％、K2HPO40．015％、硅銅0．9％、豆油0．027％，消前PH值6-7，實(shí)施例PH值6．7。
b、種子罐培養(yǎng)的控制保證罐壓為微正壓，大于0．05MPa；選用茄子瓶培養(yǎng)13-17天，實(shí)施例培養(yǎng)15天，淺灰色豐滿的孢子；保證足夠的氧氣量，通氣量控制在1．5∶1v／h、3m3／min；攪拌三級(jí)箭葉型，轉(zhuǎn)速控制在250-350r／min，接種量茄子瓶7-10瓶實(shí)施時(shí)8瓶。改變攪拌速度，調(diào)節(jié)溶解氧濃度。運(yùn)行初期0-18小時(shí)，轉(zhuǎn)速在350r／min，18小時(shí)后減速至250-300r／min實(shí)施時(shí)280r／min，以免打斷菌絲。減速時(shí)調(diào)整通氣量。
(2)20M3發(fā)酵罐發(fā)酵a、發(fā)酵培養(yǎng)基配方玉米粉1．5％、花生餅粉3％、葡萄糖1．5％、淀粉玉米粉1．5％、NaCl0．4％、CuCO30．4％、(NH4)SO40．4％、K2HPO40．015％、MgSO40．025％、酵母粉0．15％、硅銅0．9％、豆油0．027％，PH值6-7，實(shí)施例PH值6．7。
b、發(fā)酵生化過程第一階段為分蘗期。時(shí)段為0-10小時(shí)。這時(shí)期罐內(nèi)溫度變化不大，溫度在28℃左右。孢子開始吸水膨脹，菌絲發(fā)芽，生出分枝，由主生菌絲向次生菌絲繁殖，形成菌絲團(tuán)，著色深，原生質(zhì)充實(shí)，菌絲粗壯。為適宜菌絲的生長，罐內(nèi)液體PH值應(yīng)控制在6-7，實(shí)施例PH值6．4，通氣量控制在1．5∶1v／h、20m3／min；攪拌三級(jí)箭葉型，轉(zhuǎn)速250-350r／min，發(fā)酵罐體徑高比1∶2．8。因運(yùn)行初期，罐液內(nèi)溶解氧少，攪拌速度需保持在350r／min，通氣量控制在2．5m3／min，溶解氧保持在21％左右的飽和度，發(fā)酵罐接種量為罐體積的20-25％，實(shí)施時(shí)為21％。
第二階段為對(duì)數(shù)增長期，時(shí)段為10-34小時(shí)。這期間從1500倍顯微鏡可觀察到，菌絲迅速生長，18小時(shí)后，主生菌絲兩側(cè)次生菌絲，增長快速延伸，菌絲粗壯，交織成網(wǎng)狀。菌絲分枝逐漸把主生菌絲淹沒，菌絲網(wǎng)色加深。此時(shí)罐內(nèi)產(chǎn)生大量生物熱，生化反應(yīng)明顯，要調(diào)控冷卻水流量，嚴(yán)格控制罐溫，使之恢復(fù)到28℃左右。其次，由于菌絲生長旺盛，罐內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，糖、氮總量呈對(duì)數(shù)遞減，菌絲長勢(shì)旺盛，為防止攪拌打斷菌絲。在操作上適當(dāng)降低攪拌轉(zhuǎn)速，溶解氧保持在25％左右的飽和度。
第三階段分泌期，時(shí)段為34-48小時(shí)。這時(shí)期，菌絲長勢(shì)趨短，菌絲側(cè)長有中短分枝，次菌絲旺盛，此時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，開始產(chǎn)生效價(jià)，使發(fā)酵進(jìn)入分泌代謝合成階段。在66-70小時(shí)寧南霉素效價(jià)出現(xiàn)高效區(qū)，峰值在這期間出現(xiàn)。這時(shí)需把握放罐和后處理時(shí)機(jī)。
第四階段衰老期，時(shí)段為72小時(shí)后，菌絲變成更短的分枝。菌絲體粗細(xì)不均，出現(xiàn)碎片，著色淺，開始衰老，發(fā)酵進(jìn)入無效期。
3、后提取工藝(1)發(fā)酵終了，將發(fā)酵液酸化處理，在酸化罐加草酸進(jìn)行攪拌，調(diào)酸使發(fā)酵液PH值在5．5-6．0之間實(shí)施時(shí)PH值5．8，與無機(jī)鹽反應(yīng)，使其固化并防止發(fā)生二次發(fā)酵，并將一些膠狀物絮凝。
(2)發(fā)酵液用壓縮空氣壓入板框過濾機(jī)進(jìn)行固液分離，得到濾液。
(3)濾液經(jīng)快速熱交換器加熱至95℃，固化高溫蛋白質(zhì)。
(4)再迅速壓入冷卻罐，固化低溫蛋白質(zhì)。
(5)經(jīng)管式分離器將變性的固化蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)從濾液中分離出來。
(6)負(fù)壓濃縮濾液?？刂茲饪s倍數(shù)，濃縮時(shí)要求溫度低于60℃，蒸發(fā)壓力為0．05mpa，真空度為700mmHg。
(7)按比例加入苯甲酸鈉，醋酸乙酯，并調(diào)制PH為4．5。經(jīng)充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆?，檢測效價(jià)，合格后輸入貯罐靜置沉淀，再取其上清液抽樣標(biāo)定效價(jià)。合格后輸送到成品罐，待灌瓶、包裝、打箱。
另外，工藝用水的水質(zhì)要求，渾濁度＜2．0，色級(jí)＜2．5，PH值6．8-7．2，電導(dǎo)率500-1500微歐姆／厘米，硬度100-230ppm，氯離子≈0ppm，鐵離子0．1-0．4ppm，蒸餾水殘?jiān)?50ppm和無菌。
權(quán)利要求
1.一種寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于凍干菌種經(jīng)試管斜面培養(yǎng)、茄子瓶斜面培養(yǎng)后制成種子液，種子液在5M3種子罐中培養(yǎng)，種子罐通氣量1-2∶1v／h、2．5-5m3／min，PH值6-7，轉(zhuǎn)速250-350r／min，培養(yǎng)好的種子液在20M3發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵罐通氣量1-2∶lv／h、14-28m3／min，PH值6-7，轉(zhuǎn)速250-350r／min，發(fā)酵液經(jīng)后提取工藝制成寧南霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于試管斜面培養(yǎng)、茄子瓶斜面培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)條件為溫度28℃、濕度80％，PH值7．0，培養(yǎng)13-17天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于種子罐接種量為茄子瓶7-10瓶，發(fā)酵罐接種量為罐體積的量20-25％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于種子罐運(yùn)行初期0-18小時(shí)，轉(zhuǎn)速為350r／min，18小時(shí)后減速至250-300r／min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于發(fā)酵罐體徑高比1∶2．5-1∶3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于工藝用水的水質(zhì)要求為，渾濁度＜2．0，色級(jí)＜25，PH6．8-7．2，電導(dǎo)率500-1500微歐姆／每米，硬度100-230ppm，氯離子≈0ppm，鐵離子0．1-0．4ppm，蒸餾殘?jiān)?50ppm和無菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的寧南霉素的生產(chǎn)工藝，其特征在于后提取工藝為，將發(fā)酵液放酸化罐加草酸進(jìn)行攪拌，調(diào)PH值5．5-6．0，經(jīng)板框過濾后，經(jīng)熱交換器快速加熱后冷卻，負(fù)壓濃縮濾液，加苯甲酸鈉、醋酸乙酯，調(diào)PH值為4．5。
全文摘要
本發(fā)明涉及寧南霉素的生產(chǎn)工藝,能夠?qū)崿F(xiàn)寧南霉素的大規(guī)模生產(chǎn)。技術(shù)方案:凍干菌種經(jīng)試管斜面培養(yǎng)、茄子瓶斜面培養(yǎng)制成種子液,種子液在5M
文檔編號(hào)C12P21/00GK1286309SQ9911321
公開日2001年3月7日 申請(qǐng)日期1999年8月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者胡湘晃, 胡湘韓, 王健, 余兆林 申請(qǐng)人:中國綜合開發(fā)研究院東北設(shè)計(jì)研究分院