專利名稱：高產(chǎn)長鏈二元酸的假絲酵母的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)長鏈二元酸的假絲酵母的篩選方法，尤其是高效分離獲得α-氧化和β-氧化增強的假絲酵母，從而提高二元酸產(chǎn)酸及轉(zhuǎn)化率的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
長鏈二元酸(Dicarboxylic Acid,DCA)作為一種重要的化工原料是合成工程塑料、香料、耐寒性增塑劑、潤滑油添加劑、涂料、液晶等物質(zhì)的重要原料。此外，長鏈二元酸的鹽類在醫(yī)藥和食品工業(yè)中也具有廣泛用途。
國內(nèi)外研究應(yīng)用發(fā)酵法生產(chǎn)二元酸至今已有三十多年的歷史。其中日本和中國在此領(lǐng)域開展了大量的研究工作。從1986年開始，我國石化總公司開始十三碳二元酸的研究和開發(fā)工作。國家在“九五”期間，又將長鏈二元酸的產(chǎn)業(yè)化作為重點科技攻關(guān)項目；并且到目前為止，我國的十三碳二元酸已初步實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。但是，目前國內(nèi)外在二元酸生產(chǎn)過程中所面臨的首要問題之一是油酸轉(zhuǎn)化率低，以克分子計僅50％左右，從而造成原料的大量消耗和浪費，使成本偏高；其次，在二元酸生產(chǎn)中還面臨著產(chǎn)酸水平低的問題，使生產(chǎn)中的操作費用提高。
為解決上述問題，國內(nèi)外研究人員在以下幾個方面開展大量的研究工作1．菌種選育；2．培養(yǎng)基組成的優(yōu)化和發(fā)酵工藝條件的考察；3．菌體產(chǎn)生二元酸的機理以及代謝調(diào)控等。從目前的研究情況開看，在二元酸的高產(chǎn)菌株的選育過程中，主要采用的依然是常規(guī)化學誘變或物理誘變的方法。
1997年，依據(jù)多年的研究成果，并結(jié)合國外最新的研究報道，清華大學提出了烷烴在假絲酵母(Candia tropicalis)細胞內(nèi)生成DCA的完整代謝網(wǎng)絡(luò)。這是多個細胞器以及多條代謝途徑綜合在一起的立體的代謝網(wǎng)絡(luò)。當烷烴被菌體吸收以后，首先經(jīng)過α-氧化生成α-一元酸(MCA)，然后再進一步被相同的酶系經(jīng)過ω-氧化生成DCA。所以，在長鏈二元酸的生產(chǎn)過程中，α、ω-氧化是將烷烴氧化生成二元酸的反應(yīng)，其中的關(guān)鍵酶是細胞色素P450酶，所以，選擇P450酶強的菌體，其α、ω-氧化的代謝能力也必然增強。其中，在研究中注意到P450是一個多功能酶，他在細胞中主要的作用是消除細胞中的有毒物質(zhì)，是一個解毒酶，所以通過檢測細胞的解毒能力，可以判斷出P450酶的代謝能力。我們可以在特定培養(yǎng)液中添加有毒物質(zhì)，這樣通過一定時間的培養(yǎng)以后，P450酶代謝能力強的菌體可以生存下來，而P450酶代謝能力弱的菌體被抑制或殺死，從而使培養(yǎng)液中P450酶活力強的菌體的相對濃度大大增加，也即α、ω-氧化能力強的菌體被濃縮，從而易于分離篩選生產(chǎn)二元酸能力強的菌株。
綜合以上所述大量的有關(guān)假絲酵母菌種改造的研究工作，無論是應(yīng)用常規(guī)的物理和化學誘變方法還是通過基因工程和代謝工程的改造的方法，最終都將涉及到從改造后的菌株中分離獲得高產(chǎn)菌株的問題。
本發(fā)明的目的是提出一種高產(chǎn)長鏈二元酸的假絲酵母的篩選方法，從大量的菌體細胞中分離獲得烷烴氧化增強型菌株，即α、ω-氧化阻斷的高產(chǎn)酸的菌株，其目的是將上游的菌株改造技術(shù)與最終的菌株的分離獲得結(jié)合起來，在菌體經(jīng)過改造處理后，可以快速地分離獲得目的菌株，使α、ω-氧化增強型菌株快速的從大量的處理細胞中分離出來，從而為提高長鏈二元酸的產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率打下基礎(chǔ)和提供前提。
本發(fā)明提出的高產(chǎn)長鏈二元酸的假絲酵母的篩選方法，由以下步驟組成1、首先采用硫酸二乙酯誘變假絲酵母從菌體的固體平板上挑取假絲酵母的單菌落，接種于裝有20-30毫升麥芽汁培養(yǎng)基的300毫升的三角瓶中，在28-35℃的溫度下于150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)24-48小時；將發(fā)酵菌液在離心機中2000-8000轉(zhuǎn)/分離心3-10分鐘，棄去上清液，用無菌水重新懸浮細胞，使細胞濃度達到1-8×108個/毫升；將上述菌液1-3毫升分裝于5毫升的離心管中，2000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-10分鐘，棄去上清液，用1-3毫升的pH7.0的0.1M的磷酸鈉緩沖液重新懸浮細胞，混勻，吸取0.1-0.5毫升放置于4℃冰箱中作為對照；在剩余的的菌液中加入1-3％體積的硫酸二乙酯，混勻，在30℃的溫度下于150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上處理20-60分鐘，然后加入200-600μl的25％硫代硫酸鈉，混勻，終止反應(yīng)；將處理液在離心機上3000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心4-10分鐘，沉淀細胞；2、制備固體平板1，其組成為酵母浸膏粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，制備培養(yǎng)基1，其組成為磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉1g/L，酵母膏1g/L，維生素B10.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH7.5，加入1-3％的8.3g/L濃度的酚紅，制備培養(yǎng)基2磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉1g/L，酵母膏1g/L，維生素B1:0.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH10.5，加入1-3％的10g/L濃度的百里香蘭酚酞乙醇溶液，備用；3、紫外線二次誘變酵母細胞及氯丙嗪濃縮α、ω-氧化增強的假絲酵母將上述沉淀細胞用無菌水稀釋至10-2-10-4，從中取0.1-0.4毫升稀釋液分別涂于含有1-5毫克/升的氯丙嗪的固體平板1以及不含氯丙嗪的固體平板上，每個稀釋度涂3-6個平板，紫外燈預(yù)熱20到30分鐘，以1-5×105J/mm2的計量處理上述平板，同時，設(shè)置不用紫外線處理的對照，平板處理完畢后，避光，于30-37℃培養(yǎng)48-120小時；4、培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選α、ω-氧化增強的假絲酵母經(jīng)過3處理的平板，在經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，可以在平板上獲得經(jīng)過誘變的生長情況不同的菌落，選擇致死率為50-90％且在含有氯丙嗪的培養(yǎng)基的條件下獲得生長的菌株，分別一一對應(yīng)的接種于培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2的平板上，與30-37℃培養(yǎng)120-168小時；5、α、ω-氧化增強的假絲酵母的獲得經(jīng)過4處理的菌株，在經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，觀察菌株在不同篩選平板上的生長情況，首先，測定不同菌株在培養(yǎng)基2平板上的R值(R值=產(chǎn)酸圈的面積/菌落面積)，選擇R值大的菌株作為目的菌株，另外，觀察菌株的菌落在培養(yǎng)基2平板上的變色圈，選擇其中顯示黃色的菌株。結(jié)合在培養(yǎng)基1平板和培養(yǎng)基2平板上的情況，將在培養(yǎng)基1上顯示黃色和R值大的菌株篩選出來，即為本發(fā)明的α、ω-氧化增強的假絲酵母。
為了驗證由本發(fā)明方法篩選的α、ω-氧化增強的假絲酵母，對新獲得的誘變菌株進行發(fā)酵產(chǎn)長鏈二元酸的培養(yǎng)將上述獲得的通過氯丙嗪濃縮以及培養(yǎng)基篩選體系獲得的誘變菌株在種子培養(yǎng)液(硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鈉0.2g/L，磷酸氫二鉀0.04g/L，氯化鈉1g/L，維生素B10.1g/L，尿素2g/L，蔗糖20g/L，正十三烷30g/L)中于28-35℃，150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)24-48小時；培養(yǎng)體積為20-40毫升在種子培養(yǎng)基中生長完畢后，接種發(fā)酵培養(yǎng)基(硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鈉0.2g/L，磷酸氫二鉀0.04g/L，氯化鈉1g/L，維生素B1:0.1g/L，尿素4g/L，蔗糖40g/L，正十三烷80g/L)，接種量為5-15％，培養(yǎng)體積為40-100毫升，搖床轉(zhuǎn)速為150-300轉(zhuǎn)/分，溫度為28-35℃，培養(yǎng)時間為72-120小時。發(fā)酵結(jié)束后，用6N的硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至2.0-3.0以下，使長鏈二元酸完全結(jié)晶析出，5000-8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10-20分鐘，去上清，過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，在60-90℃烘箱中烘干24-48小時，即可獲得產(chǎn)品十三碳二元酸。
本發(fā)明提供了能夠從經(jīng)過菌種改造的大量假絲酵母中快速而高效的獲得α、ω-氧化增強的假絲酵母突變菌株的方法。首先采用氯丙嗪處理可以濃縮α、ω-氧化增強的假絲酵母在含有氯丙嗪的情況下獲得生長的菌株，其細胞中α、ω-氧化代謝途徑中的關(guān)鍵酶細胞色素P450酶活性很高，即在這種情況下獲得良好生長的菌株，是α、ω-氧化代謝增強的菌株。另外，采用培養(yǎng)基篩選體系，可以同時處理大量的經(jīng)過誘變和濃縮的菌株，從而極大地加快篩選過程，高效而準確地獲得具有菌株α、ω-氧化增強的假絲酵母。該方法的建立，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)長鏈二元酸中菌種的改造和篩選提供了有效的手段，從而為提高長鏈二元酸的產(chǎn)酸量和烷烴的轉(zhuǎn)化率打下了基礎(chǔ)，必將在石油發(fā)酵工業(yè)中具有廣闊的推廣和應(yīng)用前景。
下面介紹
具體實施例方式實施例1(1)首先采用硫酸二乙酯誘變假絲酵母本發(fā)明實施例所用的假絲酵母從中國石化總公司撫順石油研究院購買。從菌體的固體平板上挑取假絲酵母的單菌落，接種于裝有20毫升麥芽汁培養(yǎng)基的300毫升的三角瓶中，在30℃的溫度下于200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)36小時；將發(fā)酵菌液在離心機中5000轉(zhuǎn)/分離心6分鐘，棄去上清液，用無菌水重新懸浮細胞，使細胞濃度達到2×102個/毫升；將上述菌液3毫升分裝于5毫升的離心管中，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心6分鐘，棄去上清液，用3毫升的pH7.0的0.1M的磷酸鈉緩沖液重新懸浮細胞，混勻，吸取0.5毫升放置于4℃冰箱中作為對照；在剩余的的菌液中加入2％體積的硫酸二乙酯，混勻，在30℃的溫度下于200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上處理40分鐘，然后加入300μl的25％硫代硫酸鈉，混勻，終止反應(yīng)；將處理液在離心機上5000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，沉淀細胞。
(2)紫外二次誘變酵母細胞及氯丙嗪濃縮α、ω-氧化增強的假絲酵母將上述沉淀細胞用無菌水稀釋至10-2-10-4，從中取0.2毫升稀釋液分別涂于含有2毫克/升的氯丙嗪的固體平板1(酵母浸膏粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，以及不含氯丙嗪的固體平板1，每個稀釋度涂3個平板，紫外線處理劑量為3×105J/mm2。避光，于30℃培養(yǎng)72小時。
(3)培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選α、ω-氧化增強的假絲酵母經(jīng)過2處理的平板，從平板上獲得經(jīng)過誘變的生長情況不同的菌落，選擇致死率為70％，且在含有氯丙嗪的培養(yǎng)基的條件下獲得生長的菌株，分別一一對應(yīng)的接種于培養(yǎng)基1平板和培養(yǎng)基2平板，于30℃培養(yǎng)120小時。培養(yǎng)基1培養(yǎng)基磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉1g/L，酵母膏1g/L，維生素B1:0.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH7.5，加入1％的8.3g/L濃度的酚紅。培養(yǎng)基2培養(yǎng)基磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉；1g/L，酵母膏1g/L，維生素B1:0.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH10.5，加入1％的10g/L濃度的百里香蘭酚酞乙醇溶液。
(4)α、ω-氧化增強的假絲酵母的獲得經(jīng)過3處理的菌株，在經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，觀察菌株在不同篩選平板上的生長情況。測定培養(yǎng)基2平板上菌株的R值，同時觀察這些菌株在培養(yǎng)基1平板上的產(chǎn)酸變色情況，選擇R值大于1.85且在培養(yǎng)基1平板上形成黃色產(chǎn)酸圈的菌株，即為α、ω-氧化增強的假絲酵母。
對新獲得的誘變菌株進行發(fā)酵產(chǎn)長鏈二元酸的培養(yǎng)將上述獲得的通過氯丙嗪濃縮以及培養(yǎng)基篩選體系獲得的誘變菌株在種子培養(yǎng)液中于30℃,200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)30小時；培養(yǎng)體積為20毫升；在種子培養(yǎng)基中生長完畢后，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10％，培養(yǎng)體積為50毫升，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，溫度為30℃，培養(yǎng)時間為120小時。發(fā)酵結(jié)束后，用6N的硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至2.0以下，使長鏈二元酸完全結(jié)晶析出，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，去上清，過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，在90℃烘箱中烘干48小時，即可獲得產(chǎn)品十三碳二元酸。
實施例2(1)同實施例1中的(1)，應(yīng)用硫酸二乙酯誘變假絲酵母細胞(2)紫外二次誘變酵母細胞及氯丙嗪濃縮α、ω-氧化增強的假絲酵母將上述沉淀細胞用無菌水稀釋至10-2-10-4，從中取0.3毫升稀釋液涂于含有3毫克/升的氯丙嗪的YPD固體平板(酵母浸膏粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，每個稀釋度涂3個平板以及不含氯丙嗪的YPD平板，每個稀釋度涂3個平板，紫外線處理劑量為2×105J/mm2，紫外線處理。避光，于37℃培養(yǎng)120小時。
(3)培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選α、ω-氧化增強的假絲酵母經(jīng)過2處理的平板，從平板上獲得經(jīng)過誘變的生長情況不同的菌落，在含有氯丙嗪的培養(yǎng)基的條件下獲得生長的菌株，分別一一對應(yīng)的接種于培養(yǎng)基1平板和培養(yǎng)基2平板，與30℃培養(yǎng)168小時。培養(yǎng)基1培養(yǎng)基磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉1g/L，酵母膏1g/L，維生素B1:0.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH7.5，加入2％的8.3g/L濃度的酚紅。培養(yǎng)基2培養(yǎng)基磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉1g/L，酵母膏1g/L，維生素B10.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH10.5，加入3％的10g/L濃度的百里香蘭酚酞乙醇溶液。
(4)同實施例1中的(4)，對α、ω-氧化增強的假絲酵母的進行復(fù)篩確認。
對新獲得的誘變菌株進行發(fā)酵產(chǎn)長鏈二元酸的培養(yǎng)將上述通過氯丙嗪濃縮以及SRC篩選體系獲得的誘變菌株在種子培養(yǎng)液中于30℃,250轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)24小時；培養(yǎng)體積為30毫升；在種子培養(yǎng)基中生長完畢后，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10％，培養(yǎng)體積為60毫升，搖床轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分，溫度為30℃，培養(yǎng)時間為96小時。發(fā)酵結(jié)束后，用6N的硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至2.0以下，使長鏈二元酸完全結(jié)晶析出，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，去上清，過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，在90℃烘箱中烘干48小時，即可獲得產(chǎn)品十三碳二元酸。
實施例3(1)應(yīng)用硫酸二乙酶誘變假絲酵母，各項操作基本同實施例1中的(1)，但將硫酸二乙酯的處理用量改為3％，處理菌量為8×108個/毫升，處理時間為40分鐘，并且應(yīng)用600μl的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)；(2)應(yīng)用紫外線誘變及氯丙嗪濃縮α、ω-氧化增強假絲酵母，基本操作同實施例2中的(2)；(3)培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選的假絲酵母，基本操作同實施例2種的(3)；(4)α、ω-氧化增強的假絲酵母的獲得經(jīng)過3處理的菌株，在經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，觀察菌株在不同篩選平板上的生長情況。測定培養(yǎng)基2平板上菌株的R值，同時觀察這些菌株在培養(yǎng)基1平板上的產(chǎn)酸變色情況，選擇R值大于1.5且在培養(yǎng)基1平板上形成黃色產(chǎn)酸圈的菌株。
對新獲得的誘變菌株進行發(fā)酵產(chǎn)長鏈二元酸的培養(yǎng)將上述獲得的通過氯丙嗪濃縮以及培養(yǎng)基篩選體系獲得的誘變菌株在種子培養(yǎng)液中于30℃,200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)30小時；培養(yǎng)體積為20毫升；在種子培養(yǎng)基中生長完畢后，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10％，培養(yǎng)體積為50毫升，搖床轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，溫度為30℃，培養(yǎng)時間為120小時。發(fā)酵結(jié)束后，用6N的硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至2.0以下，使長鏈二元酸完全結(jié)晶析出，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，去上清，過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，在90℃烘箱中烘干48小時，即可獲得產(chǎn)品十三碳二元酸。
實施例4(1)應(yīng)用硫酸二乙酯誘變假絲酵母，各項操作基本同實施例1中的(1)，但將硫酸二乙酯的處理用量改為1％，處理時間改為60分鐘，并且應(yīng)用200μl的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)；(2)應(yīng)用紫外線誘變及氯丙嗪濃縮α、ω-氧化增強的假絲酵母，基本操作同實施例1中的(2)，但將氯丙嗪的用量改為1毫克/升；(3)同實施例1中的(3)，應(yīng)用培養(yǎng)基篩選體系篩選α、ω-氧化增強的菌株；(4)同實施例1中的(4)，從含有氯丙嗪的YPD平板上共對應(yīng)挑取菌株接種于培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2的菌株為200株，從中篩選出R值大于1.85及在培養(yǎng)基1顯示黃色的菌株7株；對新獲得的誘變菌株進行發(fā)酵產(chǎn)長鏈二元酸的培養(yǎng)將上述通過氯丙嗪濃縮以及培養(yǎng)基篩選體系獲得的誘變菌株在種子培養(yǎng)液中于30℃,250轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)24小時；培養(yǎng)體積為30毫升；在種子培養(yǎng)基中生長完畢后，接種發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為10％，培養(yǎng)體積為60毫升，搖床轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分，溫度為30℃，培養(yǎng)時間為96小時。發(fā)酵結(jié)束后，用6N的硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至2.0以下，使長鏈二元酸完全結(jié)晶析出，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，去上清，過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，在90℃烘箱中烘干48小時，即可獲得產(chǎn)品十三碳二元酸。
實施例5(1)同實施例4中的(1)；(2)同實施例1中的(2)；(3)同實施例1中的(3)；在含有氯丙嗪的YPD平板上經(jīng)過誘變后，共有117個菌株生長，再不含有氯丙嗪的YPD平板上經(jīng)過誘變后，共有1124個菌落生長，說明氯丙嗪的濃縮效率為10倍；(4)同實施例1中的(4)，通過培養(yǎng)基篩選體系從(3)中的117株菌株中獲得了4株R值大于1.85且在培養(yǎng)基1平板上形成黃色產(chǎn)酸斑的假絲酵母；所獲得的菌株2-11,2-7,2-9,2-3，的產(chǎn)酸量分別為7.67g/L,7.10g/L,6.85g/L以及6.20g/L，其對應(yīng)的R值分別為2.04,1.95,1.95,1.85；說明R值可以準確地反應(yīng)菌株產(chǎn)酸能力的強弱。發(fā)酵結(jié)束后，用6N的硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至2.0以下，使長鏈二元酸完全結(jié)晶析出，8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，去上清，過濾，并用蒸餾水將濾餅洗滌至中性，在90℃烘箱中烘干48小時，即可獲得產(chǎn)品十三碳二元酸。
實施例6(1)應(yīng)用硫酸二乙酯誘變假絲酵母，各項操作基本同實施例1中的(1)，但將硫酸二乙酯的處理用量改為1.5％，處理時間為60分鐘，處理菌液的濃度為3×108，體積為3毫升，應(yīng)用300μl的硫代硫酸鈉終止反應(yīng)；(2)紫外線誘變及氯丙嗪濃縮處理經(jīng)過誘變的假絲酵母，采用的方法基本同實施例1中的(2)，但將氯丙嗪的用量改為3毫克/升紫外線處理計量為5×105J/mm2；(3)、(4)同實施例2中的(3)、(4)。
權(quán)利要求
1．一種高產(chǎn)長鏈二元酸的假絲酵母的篩選方法，其特征在于，該方法由以下步驟組成(1)、首先采用硫酸二乙酯誘變假絲酵母從菌體的固體平板上挑取假絲酵母的單菌落，接種于裝有20-30毫升麥芽汁培養(yǎng)基的300毫升的三角瓶中，在28-35℃的溫度下于150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)24-48小時將發(fā)酵菌液在離心機中2000-8000轉(zhuǎn)/分離心3-10分鐘，棄去上清液，用無菌水重新懸浮細胞，使細胞濃度達到1-8×108個/毫升將上述菌液1-3毫升分裝于5毫升的離心管中，2000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-10分鐘，棄去上清液，用1-3毫升的pH7.0的0.1M的磷酸鈉緩沖液重新懸浮細胞，混勻，吸取0.1-0.5毫升放置于4℃冰箱中作為對照；在剩余的的菌液中加入1-3％體積的硫酸二乙酯，混勻，在30℃的溫度下于150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上處理20-60分鐘，然后加入200-600μl的25％硫代硫酸鈉，混勻，終止反應(yīng)；將處理液在離心機上3000-6000轉(zhuǎn)/分鐘離心4-10分鐘，沉淀細胞；(2)、制備固體平板1，其組成為酵母浸膏粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，制備培養(yǎng)基1，其組成為磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉1g/L，酵母膏1g/L，維生素B1:0.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH7.5，加入1-3％的8.3g/L濃度的酚紅，制備培養(yǎng)基2磷酸二氫鉀4g/L，葡萄糖10g/L，磷酸氫二鈉2g/L，氯化鈉1g/L，酵母膏1g/L，維生素B1:0.1g/L，尿素2g/L，烷烴20g/L；pH10.5，加入1-3％的10g/L濃度的百里香蘭酚酞乙醇溶液，備用；(3)、紫外線二次誘變酵母細胞及氯丙嗪濃縮α、ω-氧化增強的假絲酵母將上述沉淀細胞用無菌水稀釋至10-2-10-4，從中取0.1-0.4毫升稀釋液分別涂于含有1-5毫克/升的氯丙嗪的固體平板1以及不含氯丙嗪的固體平板上，每個稀釋度涂3-6個平板，紫外燈預(yù)熱20到30分鐘，以1-5×105J/mm2的計量處理上述平板，同時，設(shè)置不用紫外線處理的對照，平板處理完畢后，避光，在30-37℃培養(yǎng)48-120小時；(4)、培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選α、ω-氧化增強的假絲酵母經(jīng)過3處理的平板，選擇致死率為50-90％且在含有氯丙嗪的培養(yǎng)基的條件下獲得生長的菌株，分別一一對應(yīng)的接種于培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2的平板上，在30-37℃培養(yǎng)120-168小時；(5)、α、ω-氧化增強的假絲酵母的獲得經(jīng)過4處理的菌株，首先，測定不同菌株在培養(yǎng)基2平板上的R值，選擇R值大的菌株作為目的菌株，觀察菌株的菌落在培養(yǎng)基2平板上的變色圈，選擇其中顯示黃色的菌株，結(jié)合在培養(yǎng)基1平板和培養(yǎng)基2平板上的情況，將在培養(yǎng)基1上顯示黃色和R值大的菌株篩選出來，即為本發(fā)明的α、ω-氧化增強的假絲酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及高產(chǎn)長鏈二元酸的假絲酵母的篩選方法,首先采用硫酸二乙酯誘變假絲酵母,然后用紫外線二次誘變酵母細胞及氯丙嗪濃縮α、ω－氧化增強的假絲酵母,用培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選α、ω－氧化增強的假絲酵母,最后獲得α、ω－氧化增強的假絲酵母。使用本發(fā)明的方法可以快速地分離獲得目的菌株,使α、ω－氧化增強型菌株快速的從大量的處理細胞中分離出來,從而為提高長鏈二元酸的產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N13/00GK1233658SQ99107779
公開日1999年11月3日 申請日期1999年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月28日
發(fā)明者曹竹安, 焦鵬, 朱濤, 林榮勝, 黃英明 申請人:清華大學