專利名稱：用于將木糖發(fā)酵為乙醇的穩(wěn)定的重組酵母的制作方法
背景本發(fā)明廣泛涉及遺傳工程微生物且特別地涉及用于穩(wěn)定摻入外源DNA至細胞，包括摻入多拷貝外源DNA至宿主中重復DNA序列處的獨特方法。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及能夠將木糖(優(yōu)選其發(fā)酵木糖與葡萄糖)至乙醇的酵母。更為特別的是，本發(fā)明的優(yōu)選方面涉及含有編碼木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XD)和木酮糖激酶(XK)克隆基因的酵母，該酵母甚至在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)很多代后仍基本上維持將木糖發(fā)酵至乙醇的效率。
作為進一步的背景，最近研究表明乙醇為理想的汽車液體燃料。其可作凈燃料(100％乙醇)直接使用或以各種濃度與汽油混合使用。使用乙醇補充或替代汽油可降低許多國家對進口外來原油的依賴并且也提供用于運輸?shù)目稍偕剂?。此外，已證明乙醇較常規(guī)的汽油提供更為清潔的燃料，其向環(huán)境中釋放少得多的污染物。例如，已經證實在汽油中使用氧物質可減少一氧化碳，一種有害的污染物釋放入空氣中。目前用于增加汽油中氧氣含量的幾種增氧劑(oxygenates)中，乙醇具有最高的氧氣含量。美國環(huán)保署(EPA)已顯示混合了10％乙醇的汽油降低一氧化碳排放約25％-30％。
到現(xiàn)在，用于通過發(fā)酵制備工業(yè)乙醇的原料為來自蔗糖或甜菜的糖和來自玉米或其它糧食作物的淀粉。然而，這些農作物目前被認為是太昂貴而不能用作大規(guī)模制備燃料乙醇的原料。植物生物體是用于通過發(fā)酵進行乙醇燃料制備的有吸吲力的原料因為其是可再生的并且可以低價和大量而得到。使用由微生物發(fā)酵糖而制備的乙醇的概念至少起源于二十年以前。來自纖維素材料的主要可發(fā)酵的糖為葡萄糖和木糖，其中的葡萄糖和木糖的比例大約為2或3到1。當然，纖維素材料最為理想的發(fā)酵將完全將葡萄糖和木糖轉變?yōu)橐掖?。不幸的是，甚至現(xiàn)在還沒有一種已知既能夠有效發(fā)酵葡萄糖又能夠有效發(fā)酵木糖的天然微生物。
酵母，特別是糖酵母屬酵母被傳統(tǒng)用于將基于葡萄糖的原料發(fā)酵成為乙醇，并且仍然認為它們是用于該目的最好微生物。然而，已發(fā)現(xiàn)這些葡萄糖發(fā)酵酵母，包括糖酵母屬不能夠發(fā)酵木糖并且也不能夠用此戊糖來生長。
近年來，N.Ho等開發(fā)出重組酵母，特別是能夠有效地將木糖發(fā)酵成乙醇的重組糖酵母屬酵母(Ho和Tsao,1995)。更為特別地是，優(yōu)選的重組酵母能夠將纖維素生物體的2種主要糖組分，葡萄糖和木糖共發(fā)酵成乙醇(Ho和Tsao,1995)。通過以高拷貝數(shù)含有編碼木糖代謝三個關鍵酶的三個克隆基因XR、XD和XK的質粒轉化酵母而開發(fā)出這些重組酵母(

圖1)。圖2和圖3顯示了2種以前制備的稱為1400(pLNH32)和1400(pLNH33)的重組糖酵母屬酵母，它們能夠將存在于相同培養(yǎng)基中的8％的葡萄糖和4％的木糖在2天中幾乎完全共發(fā)酵成乙醇。另一方面，圖4顯示了母本酵母融合株1400(D′Amore等.，1989和D′Amore，等.，1990)僅可發(fā)酵葡萄糖至乙醇而不可發(fā)醇木糖至乙醇。通過以2個高拷貝數(shù)的顯示于圖1中的質粒pLNH32和pLNH33轉化糖酵母屬融合株1400(D′Amore等.，1989和D′Amore，等.，1990)而開發(fā)出1400(pLNH32)(簡稱LNH32)和1400(pLNH33)(簡稱LNH33)。到目前為止，已報導了4種這樣的高拷貝數(shù)質粒，pLNH31、pLNH32、pLNH33和pLNH34(Ho和Tsao,1995)。這些質粒中的每一種可轉化融合1400至重組酵母從而以相近的效率其轉化葡萄糖和木糖。
其木糖代謝基因被克隆于基于2μ穩(wěn)定高-拷貝-數(shù)質粒上的酵母1400(pLNH32)、1400(pLNH33)和有關的重組木糖-發(fā)酵的糖酵母屬酵母十分適用于批量工藝發(fā)酵(process fermentation)。然而，在連續(xù)的工藝發(fā)酵中，在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)后(大于20代)，1400(pLNH32)、1400(pLNH33)和類似的質粒介導的重組酵母喪失其發(fā)酵木糖的能力，如圖5和圖6中所示。
通常，外源DNA或基因可通過2種獨立的方式克隆入酵母。一種方式是將外源DNA或基因克隆入含有可篩選遺傳標記和使質粒能夠在此新宿主中自主復制的有功能的酵母DNA復制起點或ARS(自主復制序列)的質粒載體中(Struhl等.，1979；Stinchcomb等.，1980；Chan和Tye,1980)，然后以含有所需克隆的DNA片段或基因的質粒轉化所需的酵母宿主。得到酵母轉化子能夠在選擇壓力存在下穩(wěn)定地維持該克隆的基因。然而，該克隆的基因在無選擇的培養(yǎng)基(缺少選擇壓力)時長期培養(yǎng)后是不穩(wěn)定的。
克隆外源DNA或基因進入酵母宿主的另一種方式是將該DNA或基因整合入酵母染色體中。在酵母中，整合轉化幾乎都是通過同源重組(Orr-Weaver,1981)。通過整合克隆所需基因至酵母染色體中的最簡單方法首先是將該所需的基因克隆入不含復制起點或ARS(自主復制序列)但的確含有一段宿主DNA用于將此整合靶向至特異性位點的質粒中(Orr-Weaver,1981)。用這種完整的整合載體對新的酵母宿主的轉化將產生含有所需的克隆入與選定靶向酵母DNA序列相鄰位點的所需基因的整合轉化子。然而，該整合轉化的頻率極低(每μg DNA1至10個轉化子)。后來，證明在與宿主染色體DNA同源的DNA片段內線性化的整合性載體可以高得多的頻率(高100至1000倍)轉化酵母)(orr-Weaver,1981,Orr-Weaer和Szostak,1983)。表明由限制酶消化而導入的雙斷裂體是重組性的(recombinogenic)并且與同源染色體DNA是高度相互作用性的。這對于含有一個以上酵母基因的復合質粒特別有幫助從而人們可通過在質粒上相應區(qū)域內造成限制酶切口而將此整合定位于特定的位點。
另一種整合，也描述為置換或基因斷裂利用兩次同源重組以替代酵母染色體DNA(Rothstein,1981)。兩次同源重組的載體含有待克隆的外源DNA或基因和選擇標記，其側翼為與待替代染色體DNA片段的5′和3′區(qū)域同源的酵母DNA序列。轉化前，以限制酶消化該載體，該酶釋放出含有與所需整合位點處的染色體DNA序列同源的5′和3′端的置換片段。如果需要穩(wěn)定的單拷貝轉化子，那么后者的策略便是用于酵母整合轉化的首先方法。
已經用多種基于整合入強調染色體DNA中的策略產生穩(wěn)定的多拷貝整合體。例如，酵母逆轉錄轉座子Ty的Δ序列(Sakai等，1990；Sakar等.，1991)、高度保守的重復元件(Kudla和Nicolas,1992)和核糖體DNA的非轉錄序列(Lopes等1989；Lopes等.，1991；Rossolini等.，1992)均被用作多次整合外源基因至酵母中的靶向位點(Rothstein,1991；Romanos等.，1992)。
有關多重整合外源基因至酵母染色體中文獻中報導的最近工作大部分包括使用適當線性化的非復制性載體或含有待克隆所需基因的DNA片段和用于篩選的遺傳標記，其兩側為與酵母染色體DNA區(qū)域同源的DNA序列。很少用線性化的復制載體并且?guī)缀醪挥猛暾膹椭戚d體，如完整的ARS載體完成這樣的重組轉化，因而，自從開始開發(fā)酵母整合轉化的早期工作(Szoatak和Wu(1979))，并且盡管觀察到克隆于ARS載體上的DNA可整合入宿主染色體中(Cregg等.，1985；Kurtz等.，1986)，但為了整合的目的而對完整ARS載體的使用已被放棄較長一段時間(Struhl等.，1979；Stinchcomb等.，1980；Chan和Tye,1980)。自從發(fā)現(xiàn)由限制酶消化而導入的雙鏈斷裂體為重組性的(Orr-Weaver,1981；Orr-Weaver和Szostak,1983)，這特別地成為現(xiàn)實。
根據(jù)此背景，仍存在將木糖發(fā)酵為乙醇，優(yōu)選將木糖和葡萄糖同時發(fā)酵為乙醇的更為穩(wěn)定的酵母和用于制備高拷貝數(shù)整合體方便而有效方法的必要。本發(fā)明描述這些必要。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供甚至培養(yǎng)于非選擇性培養(yǎng)基中多代(如，大于20代)時仍維持其完整的將木糖發(fā)酵成乙醇能力的含有多拷貝穩(wěn)定克隆XR、XD和XK基因的酵母。更為優(yōu)選地，XR、XD和XK基因均融合至不受葡萄糖存在所抑制并且也無需木糖存在用于其表達的啟動子上。更為優(yōu)選地，本發(fā)明的酵母可將纖維素性生物體的二種主要組分，葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇。
本發(fā)明的另一實施方案涉及重復序列的使用，如與5S DNA相鄰的非轉錄r-DNA序列(Valenzuela等.，1977)，其為通過同源重組用于靶向高拷貝數(shù)整合含有XR、XD和XK的DNA片段進入酵母基因組中的同源序列。例如，包括兩側為該同源序列的DNA片段的復制性質粒載體可用于定向整合該DNA片段。本發(fā)明的優(yōu)選方法包括步驟(a)以具有外源DNA且包括篩選標記的復制/整合質粒轉化細胞；和(b)反復擴增步驟(a)的細胞以制備許多代子化細胞同時篩選包括篩選標記的細胞(如，通過在選擇平板上擴增)，從而促進復制和整合性質粒保留于隨后的子代細胞中以及具有多個整合拷貝外源DNA的子代細胞的形成。在進一步的步驟中，可擴增步驟(b)的細胞從而在無篩選包括篩選標記細胞的壓力下制備多代子細胞，從而促進該質粒在隨后子細胞中的丟失(因而得到此穩(wěn)定整合子的富集種群)。
本發(fā)明也提供用于篩選和保持所需轉化子的優(yōu)越的方式。眾所周知，在基本培養(yǎng)基中，所有微生物需要碳源，如葡萄糖或木糖的存在用于生長。然而，在豐富培養(yǎng)基中大多數(shù)微生物無需碳源的存在用于生長。不過，本發(fā)明提供了使用碳源作為篩選壓力用于甚至在豐富培養(yǎng)基如YEP(1％酵母提取物加上2％蛋白胨)中對轉化子的篩選。許多種酵母，特別是糖酵母屬酵母甚至在豐富培養(yǎng)基中的確需要碳源，如木糖或葡萄糖的存在用于生長，如圖8中所示。該發(fā)現(xiàn)大大促進了穩(wěn)定的轉化子，如1400(LNH-ST)(圖7)的開發(fā)，這些轉化子在非選擇培養(yǎng)基中基本上培養(yǎng)無限代后仍能夠有效地發(fā)酵木糖。
在更廣泛的方面，本發(fā)明也提供了用于整合多拷貝外源DNA至細胞中重復染色體DNA的方法。該方法包括(a)以具有外源DNA且包括篩選標記的復制和整合性質粒轉化細胞。該方法也包括(b)擴增步驟(a)的細胞以制備多代的子代細胞同時篩選包括篩選標記的細胞，從而促進該復制和整合性質粒在隨后的子代細胞中的保留并且產生具有多個整合拷貝的外源DNA的子代細胞。在具體應用中，該方法包括(ⅰ)以具有外源DNA且包括篩選標記的復制性質粒轉化酵母細胞，該外源DNA的每端兩側為與宿主DNA的重復序列同源的DNA序列；(ⅱ)反復擴增步驟(ⅰ)的轉化酵母細胞以制備多代的子代細胞同時篩選包括篩選標記的細胞，從而促進該復制性質粒在隨后子代細胞中的保留并且得到每種含多拷貝整合外源DNA的子代細胞；和(ⅲ)擴增步驟(ⅱ)的子代細胞從而在缺乏篩選包括該篩選標記細胞的壓力下制備多代子細胞，進而促進該質粒在隨后子代細胞中的丟失并且回收每種含有多拷貝整合至其染色體DNA中外源DNA的酵母細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了將木糖發(fā)酵成乙醇的酵母，該酵母具有多拷貝整合到其染色體DNA中的外源DNA。該外源DNA包括編碼融合至不受葡萄糖抑制啟動子上木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因，其中的酵母能夠同時將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇并且甚至在非選擇條件下培養(yǎng)至少20代后基本上維持其將木糖發(fā)酵為乙醇的能力。
本發(fā)明的另一方面涉及將木糖發(fā)酵為乙醇的方法，其包括以本發(fā)明的酵母發(fā)酵含有木糖的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一實施方案提供了用于將包括篩選標記的外源DNA序列整合入目標酵母細胞染色體DNA的質粒載體。該本發(fā)明的質粒載體含有有功能的酵母DNA復制起點和包括篩選標記的外源DNA，該DNA每個末端的兩側為與靶酵母細胞重復的核糖體DNA序列同源的DNA側翼序列。該質粒在除了該DNA側翼序列之間的位置進一步具有第二個篩選標記。
本發(fā)明的進一步實施方案提供了用于將外源DNA序列整合至酵母中以形成發(fā)酵木糖至乙醇穩(wěn)定整合體的質粒載體。該載體含有有功能的酵母DNA復制起點和包括編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因的外源DNA，該DNA的每端為與靶酵母細胞的重復DNA序列同源的DNA側翼序列。
本發(fā)明的進一步方面提供了用于形成具有多拷貝整合外源DNA片段的細胞的方法。此發(fā)明方法包括擴增具有重復基因組DNA并且含有具有外源DNA復制和整合性質粒的細胞以制備多代的子代細胞同時篩選包括篩選標記的細胞，從而促進復制和整合質粒在隨后的子代細胞中的保留并且制備具有多拷貝整合外源DNA的子代細胞。
本發(fā)明提供了含有穩(wěn)定克隆基因的酵母，該基因使酵母能夠用于非選擇條件(如連續(xù)發(fā)酵)以共發(fā)酵木糖和葡萄糖至乙醇，同時又不喪失其發(fā)酵木糖的能力。此外，本發(fā)明提供了用于形成穩(wěn)定、多拷貝酵母整合體和其它易于操作并可被控制以調整整合外源DNA拷貝數(shù)的細胞的方法和物質。根據(jù)下面的描述和附屬的權利要求，本發(fā)明的其它實施方案和特征及優(yōu)勢將顯而易見。
附圖簡述圖1顯示了質粒pLNH31、-32、-33和-34的限制圖譜和克隆入其中的基因。
圖2顯示酵母轉化子1400(pLNH32)(簡稱LNH32)可有效地共發(fā)酵葡萄糖和木糖。用于培養(yǎng)酵母和發(fā)酵糖的條件類似于實施例7中所述的條件。
圖3顯示酵母轉化子1400(pLNH33)(簡稱LNH33)可有效地共發(fā)酵葡萄糖和木糖。用于培養(yǎng)酵母和發(fā)酵糖的條件類似于實施例7中所述的條件。
圖4顯示母本酵母融合株1400可發(fā)酵葡萄糖但不可發(fā)酵木糖。用于培養(yǎng)酵母和發(fā)酵糖的條件類似于實施例7中所述的條件。
圖5顯示具有克隆于復制性質粒pLNH32中木糖代謝基因的酵母轉化子1400(pLNH32)(簡稱LNH32)在非選擇培養(yǎng)基中是不穩(wěn)定的。在非選擇(例如，葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20代后，1400(pLNH32)喪失其發(fā)酵木糖的能力。
圖6顯示其木糖代謝基因克隆于復制性質粒pLNH33中的酵母轉化子1400(pLNH33)在非選擇性培養(yǎng)基中是不穩(wěn)定的。在非選擇性培養(yǎng)基(例如，葡萄糖培養(yǎng)基)中培養(yǎng)20代以后，1400(pLNH33)喪失其發(fā)酵木糖的能力。
圖7顯示酵母轉化子1400(LNH-ST)(簡稱LNH-ST)甚至在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)40多代后仍然維持其木糖發(fā)酵的能力。
圖8顯示甚至當豐富培養(yǎng)基如酵母提取物和蛋白胨存在于培養(yǎng)基中時，啤酒糖酵母和其它糖酵母屬酵母仍然需要碳源用于生長。例如，這些實驗顯示啤酒糖酵母不能夠在含有1％酵母提取物和2％蛋白胨的YEP培養(yǎng)基中生長，但是，當葡萄糖或木糖加入到YEP培養(yǎng)基中時能夠生長。
圖9A顯示pLNH-ST的限制性圖譜和克隆于其中的基因。
圖9B顯示克隆于pLNH-ST中基因(5S rDNA、KK、AR和KD)的遺傳圖譜(順序和方向)。該基因圖譜上游或下游的寡核苷酸(例如，Oligo25,Oligo26等)為用于通過PCR對克隆的基因的順序和方向進行特征分析的引物。
圖10為簡要描述含有克隆的XR、XD、XK基因的pBluescript ⅡKS(-)的構建構建4個這樣的基因。選擇克隆于pKS(-)-KK-AR-KD-3中的KK-AR-KD片段克隆于pUCKm-rDNA(5S)-ARS中用于也稱為pLNH-ST的pUCKm-rDNA(5S)(KRD)-ARS的構建。
圖11顯示優(yōu)于1400(pLNH32)和1400(pLNH33)的酵母轉化子1400(LNH-ST)(簡稱LNH-ST)可有效地共發(fā)酵葡萄糖和木糖。用于培養(yǎng)酵母和發(fā)酵的條件類似于實施例7中所述的條件。
圖12顯示克隆于廣譜宿主質中的基因以及該質粒的限制性圖譜，該質粒用于分離含有來自啤酒糖酵母和其它酵母染色體DNA的DNA片段的ARS。
發(fā)明詳述為了促進對本發(fā)明原理的理解，現(xiàn)將列出與其一些優(yōu)選實施方案有關的參考文獻，并將用特定的語言描述此內容。不過將會明白其并不意在對本發(fā)明范圍的限制，對這里所述本發(fā)明原理的這種修改、進一步修飾和應用對于本發(fā)明涉及領域的一位技術人員將是顯而易見的。
如上所述，本發(fā)明一個優(yōu)選的方面提供了穩(wěn)定摻入有克隆的XR、XD和XK基因的重組酵母，其代表了較前面報導的重組酵母的改進。一般已報導了可有效共發(fā)酵存在于相同的培養(yǎng)基中葡萄糖和木糖的重組酵母(Ho和Tsao,1995)。本文中制備的酵母通過克隆適當修飾的XR、XD和XK基因于高拷貝質粒，pUCKm10中，然后用此得到的質粒，pLNH3X(X=1到4)(圖1)轉化適當?shù)奶烊唤湍付瓿?。例如，用質粒pLNH32和pLNH33轉化分別融合到1400(pLNH32)和1400(pLNH33)上的融合酵母1400。這些重組的糖酵母屬酵母可有效地共發(fā)酵存在于相同培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖至乙醇，如圖2和3中所示，而母本未加工的1400酵母僅可發(fā)酵葡萄糖，不能既發(fā)酵葡萄糖又發(fā)酵木糖(圖4)。
質粒介異的重組酵母可在選擇壓力存在下維持克隆的基因，但無選擇壓力時不能維持克隆的基因。如圖5和6中所示，在無選擇壓力下1400(pLNH32)和1400(pLNH33)最終丟失其質粒和發(fā)酵木糖的能力。
重組的工業(yè)酵母，特別是用于制備大量工業(yè)產品如乙醇，無需選擇壓力存在而穩(wěn)定的那些菌株是高度必要的。本發(fā)明中含有整合XR、XD和XK基因的重組酵母的開發(fā)提供了這種穩(wěn)定性。此外，為了使得到的重組酵母具有與1400(pLNH32)和1400(pLNH33)類似或比其更高的效率的共發(fā)酵葡萄糖和木糖的能力，該重組酵母必需不僅含有整合的木糖代謝基因，而且含有高拷貝數(shù)的這種整合的基因。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，已經通過靶向非編碼區(qū)，如5S核糖體DNA(rDNA)的非編碼區(qū)作為多次整合的位點而開發(fā)出酵母的高拷貝數(shù)(hcn)整合體(即，具有至少約10個整合拷貝外源DNA的酵母)。
rDNA提供了用于整合優(yōu)越的位置因為其是高度保守的，并且酵母一般含有多于100拷貝的rDNA重復序列。然而，將會明白為了達到本發(fā)明的酵母，在重復(repeated)或重復(reiterated)序列的每個位置(occurrence)完成所需基因的整合將是不必要的。根據(jù)本發(fā)明的廣泛的方面，將足以在重復序列多個位點，即2個或2個以上的位點中的每個位點完成此整合。
為了在5S rDNA的位點處將hcn XR、XD和XK整合入酵母染色體，構建圖9中所示的整合質粒，pLNH-ST。pLNH-ST為酵母-大腸桿菌的穿梭載體且為pUCKm6質粒的衍生物(Ho等.，1984)。將5S的rDNA序列插入pUCKm6的XhoⅠ限制位點。通過PCR技術從酵母染色體DNA中拷貝5S rDNA序列并且通過定點誘變技術對其加以修飾從而在其中間(大約)序列中加入XhoⅠ限制位點，如圖9中所示。已將來自pKS(-)-KK-AR-KD的XhoⅠ片段(圖10)(Ho和Tsao,1995)插入克隆于pLNH-ST中5S rDNA的XhoⅠ位點中。
pLNH-ST與其它傳統(tǒng)的基于5S rDNA的hcn酵母整合載體的不同之處在于其也含有有功能的酵母ARS序列(Struhl等.，1979；Stinchcomb等.，1980；Chan和Tye,1980)，如圖9中所示。這樣，pLNH-ST既是復制性載體又是整合性載體。特別的是，在含有高拷貝整合XR、XD和XK重組酵母的開發(fā)中，pLNH-ST首先作為復制性載體而起作用然后作為整合性載體而起作用。將ARS片段插入pUCKm6的EcoR1位點中。此外，pLNH-ST也含有卡那霉素抗性基因(KmR)和氨芐青霉素抗性基因(ApR)。KmR在酵母中作為遺傳霉素抗性基因而起作用并將賦予其酵母轉化子對遺傳霉素的抗性。KmR的XhoⅠ位點通過PCR技術加以去除而不影響其活性。KmR和ApR均為原始pUCKm6質粒的一部分。
如上所述，上述載體與目前技術中所用的載體在于含有ARS序列。此外，在前述用于制備hcn酵母整合體的方法中，克隆基因的整合在以外源基因轉化酵母細胞的即刻便發(fā)生。相反，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方式，在轉化完成長時間后，該克隆基因的整合仍逐漸繼續(xù)發(fā)生。特別地，轉化首先通過復制性質粒，如pLNH-ST在轉化酵母細胞中的存在而建立，并且整合僅僅通過在含有選擇培養(yǎng)基的平板上反復擴增轉化子而發(fā)生。
因此，本發(fā)明涉及開發(fā)含有hcn整合克隆基因的酵母或其它細胞轉化子的下面方法的使用，以復制性/整合性質粒，如pLNH-ST轉化含有重復DNA序列的宿主細胞，例如酵母或真核細胞，并且篩選含有高拷貝數(shù)復制性/整合性質粒的轉化子。將得到篩選出的轉化子于新鮮選擇平板上反復擴增并且培養(yǎng)足夠的次數(shù)至高細胞密度以整合所需拷貝數(shù)的外源DNA，然后在非選擇培養(yǎng)基中對此轉化子培養(yǎng)足夠的代數(shù)從而從此轉化子中去除復制性/整合性質粒。然后可將得到的轉化子培養(yǎng)于選擇培養(yǎng)基中，并且那些維持其在選擇培養(yǎng)基中有效生長能力的轉化子將是含有hcn整合至酵母或其它宿主細胞染色體中所需外源基因的那些轉化子。例如，根據(jù)上述方法以pLNH-ST轉化融合1400酵母，并且得到的穩(wěn)定重組酵母，1400(LNH-ST)較1400(pLNH32)和1400(pLNH33)可更好地共發(fā)酵葡萄和木糖，如圖11中所示。重要的是，新開發(fā)出的穩(wěn)定重組酵母，1400(LNH-ST)在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)4、20和40代后仍以同樣的效率同時發(fā)酵葡萄糖和木糖，如圖7中所示，而1400(pLNH32)和1400(pLNH33)在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)20代后將丟失其發(fā)酵木糖的活性(圖5和6)，此外，1400(LNH-ST)隨后培養(yǎng)于非選擇培養(yǎng)基中幾百代，并且仍保持其共發(fā)酵葡萄糖和木糖的完全活性。
在開發(fā)穩(wěn)定hcn整合體的優(yōu)選方法中，用常見的篩選標記在相同的選擇培養(yǎng)基中選擇和維持2種質粒介導的活性和由整合基因賦予的活性。在本工作中，常見的篩選標記為3個克隆的木糖代謝基因，XR、XD和XK、并且常見的選擇培養(yǎng)基或者為含有木糖的豐富培養(yǎng)基或者為含有木糖的基本培養(yǎng)基(用于酵母)。此外，這些克隆的基因用作大多數(shù)糖酵母屬在豐富培養(yǎng)基中的篩選標記，因為本申請者已顯示大多數(shù)糖酵母屬酵母甚至在豐富培養(yǎng)基中的確需要碳源，如木糖的存在用于生長(圖8)。雖然在豐富培養(yǎng)基中需要碳源的存在用于生長對于選作宿主的酵母并非決定性的，不過，能夠在含有具有木糖的豐富培養(yǎng)基的平板上篩選所需的整合體較在含有具有木糖的基本培養(yǎng)基的平板上要方便得多。在本發(fā)明中用于轉化的優(yōu)選宿主屬于糖酵母屬的種類，因為它們發(fā)酵葡萄糖通常特別有效。在發(fā)現(xiàn)所需的用作整合高拷貝數(shù)木糖代謝基因宿主的酵母種類在豐富培養(yǎng)基中無需碳源的存在用于生長時，可用常規(guī)的方法分離在豐富培養(yǎng)基中無需碳源的這些種類的合適突變體。
用于得到hcn整合的復制/整合性質粒，如pLNH-ST也按照需要含有用于復制質粒-介導轉化子篩選的第二種篩選手段。對于pLNH-ST，第二種篩選機制既利用KmR又利用ApR作為可篩選的標記。盡管含有第二種篩選系統(tǒng)對復制/整合性載體并非是決定性的，但其將提供更為優(yōu)選的載體，特別是當ARS載體甚至在選擇壓力存在下不足夠穩(wěn)定，并且該轉化子在整合足夠拷貝的所需基因之前具有喪失其大部分質粒的趨勢時更是如此。當使用含有第二種篩選機制的載體時，該轉化子可在第二種篩選試劑的存在下培養(yǎng)以增加其質粒的拷貝數(shù)，或以相同的載體但用第二種篩選機制重新轉化該轉化子以重新選擇該轉化子從而此整合過程可持續(xù)或重新起始。
使用KmR和ApR作為第二種篩選系統(tǒng)是本申請者優(yōu)選酵母所需要的。雖然KmR可以是用于轉化對遺傳霉素具有抗性的酵母的顯性篩選標記，但是有些酵母對遺傳霉素是天然具有抗性而沒有獲得含有KmR的質粒。結果，僅僅KmR不是用于酵母轉化子篩選的優(yōu)選篩選標記。另一方面，雖然ApR可在大多數(shù)酵母中有效表達，但其一般不能夠用作酵母轉化的顯性篩選標記因為大多數(shù)酵母天然對氨芐青霉素具有抗性。然而，KmR和ApR一起用作大多數(shù)酵母，特別是糖酵母屬酵母的優(yōu)良的顯性篩選系統(tǒng)。為了使用這樣的篩選系統(tǒng)，首先于含有YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)和適當濃度遺傳霉素(20-80μg/ml，根據(jù)種類不同而變化)的平板上加以篩選。通過青霉素酶測試(Chevallier和Aigle,1979)篩選表達ApR的得到的轉化子以鑒定真正的轉化子。
ApR在pLNH-ST(圖9)和相關復制/整合性質粒中的存在也用作另一種功能。由于ApR僅存在于復制性質粒中并且不存在于整合于酵母染色體中的片段中，故青霉素測試也用作鑒定那些含有hcn整合克隆基因而不含質粒載體的方便方法。
本發(fā)明提供含有hcn整合基因的穩(wěn)定重組酵母方法的特征為待整合基因的拷貝數(shù)可容易地控制。例如，如果另一種篩選標記，如KmR插入到5S rDNA片段(或靶序列)中時，更多拷貝數(shù)的XR-XD-XK基因可插入到融合酵母1400染色體中。此外，用于開發(fā)hcn酵母整合體的本發(fā)明方法也較其它報導的方法更容易完成，其中的實驗條件或許不得不調整和控制并且該轉化方法在可獲得穩(wěn)定菌株之前或許不得不重復。
因此，本申請者提高了以前重組木糖發(fā)酵母，如1400(pLNH32)和1400(pLNH33)的穩(wěn)定性，并且具有優(yōu)勢地開發(fā)出將無需選擇壓力存在以維持克隆基因并且共發(fā)酵葡萄糖和木糖較1400(pLNH32)和1400(pLNH33)同樣有效或甚至更為有效的穩(wěn)定重組酵母，例如1400(LNH-ST)。此外，本申請者也開發(fā)出提供容易hcn整合外源基因至細胞染色體中的方便方法，其中待整合基因的拷貝數(shù)也可容易控制。
與1400(pLNH32)和1400(pLNH33)類似，本發(fā)明優(yōu)選穩(wěn)定的遺傳工程木糖發(fā)酵酵母也可有效地共發(fā)酵葡萄糖和木糖。這是因為插入到新酵母宿主染色體中的XR、XD和XK基因均融合至以下基因的完整5′非-編碼序列，這些基因可有效地在酵母中表達，編碼高水平酶的產生，并且也不受培養(yǎng)基中葡萄糖存在的抑制。例如，為了這些目的，含有用于有效表達糖酵解基因和制備高水平糖酵解酶所有遺傳元件的完整5′非-編碼DNA序列適于替代XR、XD和XK的完整5′非-編碼序列。
克隆于pLNH-ST中的XR、XD和XK來自具柄畢赤酵母(Pichiastipitis)(XR和XD)和啤酒糖酵母(XK)。然而，只要它們在融合到含有有效啟動子、核糖體結合位點等的適當5′非-編碼序列上后可產生高水平的各自的酶，它們可以來自任何微生物。例如，這三種基因眾所周知出現(xiàn)于多種微生物中并且已鑒定和分離出眾多的XR、XD和XK基因。因此，這些基因的特定來源對本發(fā)明的廣泛方面并非是決定性的，編碼具有木糖還原酶活性(以NADPH和/或NADH作為輔因子將D-木糖轉變?yōu)槟咎谴嫉哪芰?、木糖醇脫氫酶活性(以NAD+和/或NADP+作為輔因子將木糖醇轉變?yōu)镈-木酮糖的能力)或木酮糖激酶活性(將D-木酮糖轉變?yōu)镈-木酮糖-5-磷酸的能力)蛋白(酶)的任何DNA將是合適的。這些基因可獲得為天然基因，或者只要該編碼的蛋白仍具有XR、XD和XK活性可以是通過，例如添加、替代或缺失堿基對天然基因加以修飾。同樣，再一次只要該得到的DNA編碼表現(xiàn)所需XR、XD和XK活性的蛋白，這些基因及其蛋白可通過已知的技術人工制備。
作為實例，XR和XD基因的適當來源包括利用木糖的酵母如休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)，具柄畢赤酵母，Pachysolentannophilus，適當?shù)腦K基因的來源包括上述利用木糖的酵母，以及不利用木糖的酵母如來自糖酵母屬的酵母，如啤酒糖酵母，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)屬，如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)，和細菌如大腸桿菌、芽孢桿菌屬種類、鏈霉菌屬種類等。目的基因可利用常規(guī)的方法學從這些來源中回收。例如，雜交、互補或PCR技術可用于此目的。
多種啟動子適用于本發(fā)明中。總的來說，將使用能夠控制XR、XD或XK基因轉錄的可與酵母相容的啟動子。這種啟動子可獲自眾多已知的來源，包括酵母、細菌和其它細胞來源。優(yōu)選地，用于本發(fā)明中的啟動子將是無需木糖誘導的有效而且不受葡萄糖抑制的啟動子。在這方面，這里使用的“有效”啟動子指提供融合基因高水平表達的5′側翼序列。具有這些特征的啟動子也可廣泛獲得，并且這里所講述的它們在本發(fā)明中的使用將在一般技術人員的視野范圍內，如融合這些啟動子至XR、XD和XK基因上，克隆啟動子/基因融合產物至適當?shù)妮d體中和用這些載體轉化酵母。所有這些操作可用本領域和文獻中眾所周知的常規(guī)遺傳工程技術加以完成。
只要DNA片段可作為有活性復制起點而起作用以支持質粒在選作用于hcn整合宿主中的自主復制，酵母DNA復制起點，如含有ARS的DNA片段可從酵母染色體DNA或其它生物的染色體DNA中獲得。如文獻中所報導的(Stinchcomb等.，1980；Ho等.，1984)；通過摻入隨機消化的DNA片段至大腸桿菌質粒中，然后以得到的質粒庫轉化所需的宿主有機體，如啤酒糖酵母可容易地分離作為ARSs而起作用的DNA片段。
新方法已用于產生本發(fā)明穩(wěn)定的菌株。然而，有數(shù)種跡象表明克隆的基因不位于復制質粒上并且已整合入宿主基因組中。例如，從1400(LNH-ST)分離的染色體DNA可用作模板用于通過聚合酶鏈式反應(PCR)分離包括既含有5S rDNA又含有克隆基因序列融合克隆基因的分離。同樣，雖然很少質粒(pLNH-ST)能夠在相同條件下通過大腸桿菌的轉化而從1400(LNH-ST)中回收，但數(shù)百種pLNH32或pLNH33質?？煞謩e從1400(pLNH32)和1400(pLNH33)中回收。此外，含有高拷貝數(shù)復制pLNH-ST的起始1400融合酵母轉化子是不穩(wěn)定的(相對于其發(fā)酵木糖的能力)但為青霉素酶(由ApR編碼的酶)測試陽性(Chevallier和Aigle,1979)。相反，發(fā)現(xiàn)在沒有選擇時仍維持其發(fā)酵木糖能力的最終穩(wěn)定轉化子，1400(LNH-ST)為青霉素酶測試陰性。如果該外源DNA在5S rDNA位點處整合，此結果是預期的因為ApR不是整合到宿主染色體中此DNA片段的一部分。有些穩(wěn)定的酵母轉化子可含有在酵母染色體ARS位點整合的外源基因也是可能的。
為了促進對本發(fā)明及其特征和優(yōu)勢的進一步理解，提供了下面的實施例。然而應該明白這些實施例是對本發(fā)明的說明而不是限制。
實施例1通過PCR合成5S rDNA片段為了通過PCR合成5S rDNA片段(以用作定向高拷貝數(shù)整合入酵母染色體中的酵母DNA序列)，根據(jù)發(fā)表的5S rDNA序列(Valenzuela，等.，1977)合成下面的寡核苷酸并且用作PCR反應的引物。除了5S rDNA序列，將定義SalⅠ限制位點的其它核苷酸也添加至引物的5′末端以利于將PCR合成的5S rDNA克隆入大腸桿菌的質粒中。
寡核苷酸Ⅰ: TTAGTCGACGTCCCTCCAAATGTAAAATGG。
寡核苷酸Ⅱ: AATGTCGACGTAGAAGAGAGGGAAATGGAG將從融合酵母1400分離的染色體DNA用作PCR反應的模板。首先將PCR合成的5S rDNA片段克隆入大腸桿菌pBluescriptⅡ KS(-)質粒(Stratagene克隆系統(tǒng)，LA Jolla,CA)的SalⅠ位點中。得到的質粒命名為pKS-rDNA(5S)。
實施例2將XHOⅠ位點插入克隆的5S rDNA序列中通過寡核苷酸介導的定點誘變(Kunkel,1985；Kunkel等.，1987)修飾5S rDNA序列(Valenzula等.，1977)-29與-56之間的核苷酸序列。結果，將XhoⅠ限制位點插入上述的特異性位點。除了用pKS質粒而不是用質粒pTZ18U或pTZ19U之外，根據(jù)伯樂實驗室公司提供的用于寡核苷酸介導的定點誘變的方法完成此任務。得到的含有突變5S rDNA的質粒命名為pKS-5S rDNA(XhoⅠ)。用下面的寡核苷酸完成定點誘變GAGGGCAGGCTCGAGACATGTTCAGTAGG實施例3從啤酒糖酵母DNA或其它在酵母中作為ARS而起作用的DNA中分離DNA片段以Sau3A限制酶消化啤酒糖酵母DNA(或來自其它酵母或其它生物的DNA)并且將其克隆入pUCKm6的BamHⅠ位點中(圖12)(Ho，等.，1984)。用得到的質粒庫轉化啤酒糖酵母。篩選出那些能夠于含有YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)和50μg/ml遺傳霉素的平板上生長并且也為青霉素酶測試(Chevallier和Algle,1979)陽性的轉化子。通過類似于Ward(1990)所述的方法回收篩選出真轉化子的質粒。
插入pUCKm6(圖12)并且以酵母轉化子中回收的酵母DNA片段都應含有可在啤酒糖酵母，可能也在其它酵母中作為ARS(自主復制序列)而起作用的DNA片段。將DNA插入子以各種限制酶消化并將得到的DNA片段重新插入pUCKm6中。用后者的質粒重新轉化啤酒糖酵母?？墒筽UCKm6作為酵母質粒而有效發(fā)揮作用的任何適當大小的限制片段必需含有有效的“ARS”并且可用于構建復制/整合性載體如pLNH-ST用于高拷貝數(shù)整合外源基因至啤酒糖酵母的染色體中。這些限制片段也可能在其它酵母中作為ARS而起作用，并且適于構建其它酵母的復制/整合性質粒。
實施例4從遺傳霉素(卡那霉素)抗性基因，KmR中去除XHOⅠ限制位點實施例1中所述的來自Tn903的遺傳霉素(卡那霉素)抗性基因，kmR(A.Oka等.，1981)和5S rDNA片段為設計用于整合多拷貝外源基因至酵母染色體中質粒的一部分。然而，KmR在其編碼序列中含有XhoⅠ位點。這與下面的事實相沖突，即XhoⅠ位點被加工入克隆的5SrDNA序列中心以用于插入外源基因如XR、XD和XK至用于整合的質粒中。因此，從KmR中去除XhoⅠ位點是必要的。這可通過多種不同的方法完成，本申請人選用定點誘變通過重疊延伸的PCR技術(S.N.Ho等.，1989)以去除KmR中的XhoⅠ位點而不改變其氨基酸編碼序列且不影響由該基因所編碼的酶的催化活性。按上述將克隆于pUCKm6中的KmR基因(圖12)轉變?yōu)镵mR(-Xho)。
用于完成此任務的四種寡核苷酸列表如下。寡核苷酸Ⅰ: GGCCAGTGAATTCTCGAGCAGTTGGTG寡核苷酸Ⅱ: TGGAATTTAATCGCGGCCCCTAGCAAGACG寡核苷酸Ⅲ: TTACGCCAAGCTTGGCTGC寡核苷酸Ⅳ: TTCAACGGGAAACGTCTTGCTAGGGGCCGCpUCKm6(圖12)為pUC9的衍生物。寡核苷酸Ⅰ的一部分和整個寡核苷酸Ⅲ根據(jù)pUC9多接頭區(qū)域的序列(Sambrook，等，1989)合成。
pUCKm6的上述的遺傳操作不僅導致了KmR編碼區(qū)XhoⅠ限制位點的缺失，而且在pUCKm6的KmR編碼序列和EcoRⅠ位點之間插入XhoⅠ限制位點。將得到的質粒命名為pUCKm(-XhoⅠ)(+XhoⅠ)。添加XhoⅠ位點至KmR編碼序列下游以利于插入實驗例1中所述5S rDNA片段至新開發(fā)的質粒pUCKm(-Xho)(+Xho)中。
實施例5質粒pLNH-ST的構建實施例4中所述的質粒pUCKm(-XhoⅠ)(+XhoⅠ)用于構建pLNH-ST，如圖9中所示。首先，從pKS-5S rDNA(XhoⅠ)中分離含有5S rDNA(XhoⅠ)的SalⅠ片段并且插入pUCKm(-XhoⅠ)(+XhoⅠ)的XhoⅠ位點。得到的質粒命名為pUCKm-rDNA(5S)。對于后者的質粒，將含有從啤酒糖酵母分離的有效ARS(根據(jù)實施例3中所述方法)的EcoRⅠ片段插入到pUCKm-5S rDNA的EcoRⅠ位點中，并將得到的質粒命名為pUCKm-5S rDNA-ARS。對于后者的質粒，將含有融合至酵母乙醇脫氫酶啟動子(XR)和丙酮酸激酶啟動子(用于XD和XK)克隆的XR、XD和XK來自pKS(-)-KK-AR-KD-3的XhoⅠ片段插入到位于克隆5S rDNA序列中心的XhoⅠ位點中。將得到的質粒，pUCKm-rDNA(5S)(KDR)-ARS也命名為pLNH-ST，顯示于圖9中。
實施例6用pLNH-ST轉化融合酵母1400并且篩選穩(wěn)定的轉化子1400(LNH-ST)在用于通過質粒pLNH32和pLNH33轉化菌株1400的條件下(國際公開No.95/13362,1995年5月18日，公開國際申請No.PCT/US94/12861,1994年11月8日提交)通過電穿孔轉化融合菌株1400。簡言之，將培養(yǎng)至早對數(shù)期的50ml酵母細胞(Klett單位(KU)140-190)離心以去除培養(yǎng)基，以冷水洗2次，以冷的1M山梨糖醇洗1次。并且重懸于200μl 1M的山梨糖醇中。將60μl的細胞轉移入4ml預先滅菌的塑料管(帶蓋)中并且向其中加入1μg質粒DNA。將50μl得到的細胞和質?；旌衔镛D移至具有0.2cm電極間距的預冷的基因脈沖儀小池中并將小池中的內容物通過基因脈沖儀以脈沖控制器(伯樂)以2.0KV,25μF,200 ohms施以脈沖。
立即，將50ml YEPD加入到小池中。將小池的內容物轉移至新的4ml的無菌塑料管中并于30℃孵育1小時。將100μl的此細胞鋪板于含有YEPD和40μg/ml G418(遺傳霉素)的瓊脂板上。篩選快速生長的菌落并于含有相同培養(yǎng)基的另一平板上復制。篩選出的菌落進行氨芐青霉素測試(Chevallier和Aigle,1979)直至鑒定出陽性的菌落。上述的電穿孔方法是基于Becker和Guarenk報導的方法(1971)。
一旦通過青霉素霉測試鑒定轉化子為陽性，將其維持于YEPX(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％木糖)的平板上。起初，這些轉化子不穩(wěn)定。如果培養(yǎng)于YEPD培養(yǎng)基中超過20代，則它們喪失其木糖發(fā)酵能力。然而，通過在YEPX平板上繼續(xù)將這些轉化子培養(yǎng)至穩(wěn)定期，并且反復將它們轉移至新鮮YEPD平板上，這些轉化子相對于其發(fā)酵木糖能力逐漸變得穩(wěn)定。一旦穩(wěn)定，這些轉化子可培養(yǎng)于非選擇性培養(yǎng)基中幾百代或更多并且仍能夠共發(fā)酵葡萄糖和木糖。
實施例7以1400(LNH-ST)共發(fā)酵葡萄糖和木糖葡萄糖和木糖的混合物(約10％葡萄糖和5％木糖)由菌株1400(LNH-ST)在下述的條件下加以發(fā)酵。將1400和1400(LNH-ST)的種子培養(yǎng)物有氧培養(yǎng)于液體YEPD培養(yǎng)基中直至中-對數(shù)期(400-500Klett單位(KU)之間)并且貯藏于4℃。通過轉移2ml培養(yǎng)物至50ml新鮮YEPD中并按上述培養(yǎng)而每月1次制備新的種子培養(yǎng)物。將2ml的1400(LNH-ST)種子培養(yǎng)物接種至300ml具有側臂的Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中的100ml YEPD培養(yǎng)基中，這允許通過Klett比色計直接監(jiān)測酵母培養(yǎng)物的生長。將培養(yǎng)物于30℃和200rpm有氧孵育于搖床中。
當細胞濃度達到中-對數(shù)期(400-450KU)時，將200ml(50％)葡萄糖和10ml(50％)木糖加入到培養(yǎng)瓶中。徹底混合后，從培養(yǎng)瓶中取出1ml培養(yǎng)混合物用作零樣品。然后以Saran包裹膜密封培養(yǎng)瓶以使發(fā)酵在無氧下進行。以適當?shù)拈g隔(每6小時)取出1ml發(fā)酵培養(yǎng)基樣品以用作通過實施例9中所述的HPLC在發(fā)酵期間測定葡萄糖、木糖、木糖醇和甘油含量的樣品。圖11中所示的結果表明遺傳工程的酵母1400(LNH-ST)可在30小時中共發(fā)酵10％葡萄糖和5％木糖中的大部分至乙醇。此發(fā)酵在正常的條件下完成，無需特殊的培養(yǎng)基或pH，并且也無需酵母生長至高的細胞濃度。因此，遺傳工程的1400(LNH-ST)可有效地共發(fā)酵高濃度的葡萄糖和木糖至乙醇，產生很少量的木糖醇作為副產物，與顯示于圖2和3中的重組糖酵母1400(pLNH32)和1400(pLNH33)相比，1400(LNH-ST)較2種以前開發(fā)的酵母在一定速度上更好地同時共發(fā)酵葡萄糖和木糖。
實施例8培養(yǎng)于非選擇性培養(yǎng)基中4、20或40代后在共發(fā)酵葡萄糖和木糖方面穩(wěn)定的菌株1400(LNH-ST)與1400(LNH32)和1400(LNH33)的比較如實施例7中所述，將2ml 1400(LNH-ST)、1400(LNH32)和1400(LNH33)的每種種子培養(yǎng)物接種至分別位于具有側臂的250mlErlenmeyer培養(yǎng)瓶中的50ml YEPD中。細胞培養(yǎng)至400-500KU時，將每個培養(yǎng)瓶中的2ml新鮮培養(yǎng)物轉入新的培養(yǎng)瓶中。該方法對于1400(LNH-ST)重復10次并且對于1400(LNH32)和1400(LNH33)重復5次。在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)4、20和40代的1400(LNH-ST)培養(yǎng)物(每次轉移被看作為培養(yǎng)于非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)的4代)用于在與實施例7中所述類似的條件下共發(fā)酵葡萄糖和木糖。與實施例7中所述的一致方式采集和分析發(fā)酵樣品。類似地，在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)4和20代的1400(LNH32)和1400(LNH33)培養(yǎng)物用于共發(fā)酵葡萄糖和木糖。發(fā)酵開始后再次以適當?shù)拈g隔采集樣品用于通過HPLC的分析并且在圖4至6中作比較。這些結果清楚地表明地非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)大于40代后，1400(LNH-ST)在維持其木糖發(fā)酵能力方面要遠較1400(LNH32)和1400(LNH33)穩(wěn)定。
實施例9發(fā)酵樣品的HPLC分析將從培養(yǎng)物中取出的含有發(fā)酵培養(yǎng)基的樣品(0.6ml至1.0ml)保存于1.5ml的Eppendort管中。通過在微離心管(microfuge)中(高速)離心10分鐘而去除細胞和其它殘余物。將上清稀釋10倍。根據(jù)下面的條件用Hitachi系統(tǒng)通過高效液相色譜(HPLC)分析得到稀釋樣品的乙醇-葡萄糖、木糖、木糖醇和甘油含量。
柱伯樂HPX-87H移動相0.005M H2SO4
流速0.8ml/分鐘檢測RI檢測器溫度60℃注射體積20μl實施例10來自穩(wěn)定轉化子1400(LNH-ST)染色體DNA的遺傳特征根據(jù)限制和PCR分析，如圖9B中所示，已測定存在于pLNH-ST中克隆基因KK、AR、KD和5S rDNA的遺傳圖譜(順序和方向)。設計實驗以測定是否這些基因(KK、AR和KD)已整合入5S rDNA的位點中。如果這些基因按預期已在5S rDNA的位點整合入酵母染色體中，含有部分或完整基因如5S rDNA-KK；5S rDNA-KD；KK-AR和AR-KD下面組合的DNA片段的正確大小應該通過用1400(LNH-ST)染色體DNA作為模板并且用顯示于遺傳圖譜(圖9B)上的寡核苷酸作為引物以通過PCR完成DNA合成而加以獲得。如果這些基因沒有整合入酵母染色體中，沒有這些基因或基因片段的這種組合應通過上述的實驗來獲得。如果這些基因整合入酵母染色體中的別處而不是5S rDNA的位點，這些基因或基因片段的一些上述組合應該用上述的實驗加以獲得，但是含有5S rDNA片段的那些基因不應該用上述的實驗加以獲得；如5S rDNA-KK和5S rDNA-KD。為了完成上述的實驗，用Qiagen,Chatsworth,CA提供的方法從1400(LNH-ST)中分離染色體DNA。用下面的引物對(見圖9):Oligo25和Oligo369；Oligo26和Oligo369；Oligo370和Oligo96；Oligo97和Oligo99；Oligo982和Oligo27根據(jù)PCR合成獲得陽性結果。因此，根據(jù)這些分析，含有KK-AR-KD的DNA片段似乎的確在其5S rDNA位點處整合入1400酵母染色體中。
參考文獻下面的文獻表示本領域技術人員所掌握的技術水平并且每篇文獻在此引用僅供參考，類似單獨引用供參考和完全地提出。1．Chan,C.S.M.和B.-K.Tye(1980)，“啤酒糖酵母中的自主復制序列”，美國國家科學院院報，77(11),6329-6333。2．Cregg,J.M.,K.J.Barringer,A.Y.Hessler，和K.R.Madden(1985)，“作為轉化宿主系統(tǒng)的巴斯德畢赤酵母”，分子和細胞生物學，5,3376-3385。3．D′Amore,T.,G.Celotto,I.Russell，和G.G.Stewart(1989)，“適于在40°乙醇制備的酵母的篩選和優(yōu)化”酶.微生物.技術11,411-416。4．D′Amore,T.,J.P.,Chandra,I.Russell，和G.G.Stewart(1990)，“酵母中乙醇耐受力的研究”生物技術關鍵綜述9,287-304。5．Ho.N.W.Y.，和Tsao,G.T,.“能夠同時有效發(fā)酵葡萄糖和木糖的重組酵母”，國際公開No.95/13362,1995年5月18日，公開國際申請No.PCT/US 94/12861,1994年11月8日提交。6．Kudla,B.，和A.Nicolas(1992)，“用于啤酒糖酵母的多位點整合套”，基因。119,49-56。7．Kurtz,M.B.,M.W.Cortelyou，和D.R.Kirsch(1986)，“用克隆的念珠菌ADE2基因整合轉化白色念珠菌”，分子和細胞生物學，142-149。8．Lopes,T.S.,J.Klootwijk,A.E.Veenstra,P.C.van der Aar,H.van Heerikhuiaen,H.A.Raué和R.J.Planta(1989)，“向啤酒糖酵母的核糖體DNA中的高拷貝數(shù)整合；用于高水平表達的新載體”，Elsevier科學出版社，79,199-206。9．Lopes,T.S.,Gert-Jan A.J.Hakkaart,B.L.Koerts,H.A.Raué，和R.J.Planta(1991)，“高拷貝數(shù)整合pMIRY-型載體至啤酒糖酵母核糖體DNA中的機制”，Elsevier科學出版社，105,83-90。10．Orr-Weaver,T.L.,J.W.Szostak和R.J.Rothstein(1981)，“酵母轉化用于重組研究的模型系統(tǒng)”，自然科學院院報，78(10),6354-6358。11．Orr-Weaver,T.L.，和J.W.Szostak(1983)，“多重串聯(lián)質粒整合入啤酒糖酵母中”，分子和細胞生物學，3(4),747-749。12．Romanos,M.A.,C.A.Scorer，和J.J.Clare(1992)，“外源基因在酵母中的表達綜述”，John Wiley和Sons有限公司.，8,423-488。13．Rossolini,M.，M.L.Riccio,E.Gallo，和C.L.Galeotti(1992)，“作為通過同源重組多重整合靶子的Saccharomyces lactis rDNA”,Elsevier科學出版社，75-81。14．Rothstein,R.J.(1981)，“酵母中的一步基因斷裂”，酶學方法，101,202-211。15．Rothstein,R.J.(1991)，“定向、斷裂、替代和等位基因拯救(AlleleRescue)酵母中的整合DNA轉化”，酶學方法，194,281-301。16．Sakai,A.,Y.Shimizu，和F.Hishinuma(1990)，“用酵母反轉錄轉座子Ty的Δ序列整合異源基因至啤酒糖酵母的染色體中”，應用微生物學生物技術，33,302-306。17．Sakai,A.,F.Ozawa,T.Higashizaki,Y.Shimizu和F.Hishinuma(1991)，“用先進的d-整合系統(tǒng)增強人神經生長因子在啤酒糖酵母中的分泌”，生物/技術，9,1382-1385。18．Stinchcomb,D.T.,M.Thomas,J.Kelly,E.Selker，和R.W.Davis(1980)，“能夠在酵母中自主復制的真核DNA片段”，自然科學院院報.，77(8),4559-4563。19．Struhl,K.,D.T.Stinchcomb,S.Scherer，和R.W.Davis(1979)，“酵母的高頻轉化雜合DNA分子的自主復制”，自然科學院院報76(3),1035-1039。20．Szostak,J.W.，和R.Wu(1979)，“遺傳標記向酵母核糖體DNA中的插入”，質粒，2,536-554。21．Valenzuela,P.,G.I.Bell,A.Venegas,E.T.Sewell,F.R.Masiarz,L.J.DeGennaro,G,Weinberg，和W.J.Rutter(1977)，“啤酒糖酵母的核糖體RNA基因Ⅱ,5S核糖體RNA基因和相鄰基因間區(qū)域的物理圖譜和核苷酸序列”，生物化學雜志，252(22),8126-8135。22．Chevaller,M.R.和M.Algle(1979)，“由帶有嵌合酵母-腸桿菌(Coli)質粒的酵母菌株所產生青霉素的定量測定”，F(xiàn)ebs通迅，108,179-180。23．Ho,N.W.Y.,H.C.Gao,J.J.Huang,P.E.Stevis,S.F.Chang(1984)，“用于念珠菌種類克隆系統(tǒng)的開發(fā)”生物技術，生物工程專題討論會No.14,295-301。24．Ward,A.C.(1990)，“從酵母中單步純化用于高頻反向轉化(back-transformation)大腸桿菌的穿梭載體”，核酸研究，18,5319。25．Becker,D.M和L.Guavente,(1991)，“通過電穿孔對酵母的高頻轉化”，酶學方法194,182-187。26．Ho.S.N.,Hunt,H.D.,Horton,R.M.,Pullen,J.K.，和Pease,L.R(1989)，“用聚合酶鏈式反應通過重疊延伸的定點誘變”，基因，77,51。27．Kunkel,T.A.,(1985)，美國自然科學院院報82,488。28．Kunkel,T.A.,Roberts,J.D.和Zakour,R.A.,(1987)，酶學方法.，154,367。29．Sambrook,J.,E.F.Fritsch，和T.Maniatis,(1989)，“分子克隆”，冷泉港實驗室出版社出版，4.10-4.11。
權利要求
1．將木糖發(fā)酵為乙醇的酵母，包括在酵母多個重復核糖體DNA位點的每個位點具有整合基因的酵母，所述的基因編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶。
2．權利要求1的酵母，也將葡萄糖發(fā)酵為乙醇。
3．權利要求2的酵母，為糖酵母屬。
4．權利要求3的酵母，其中所述的位點為非轉錄DNA位點。
5．權利要求1的酵母，其中所述的基因融合到不受葡萄糖抑制的啟動子上并且該酵母同時將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇。
6．權利要求5的酵母，其中的啟動子無需木糖誘導。
7．權利要求3的酵母，其中的基因融合至不受葡萄糖抑制的啟動子上并且該酵母同時將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇。
8．權利要求4的酵母，其中的基因融合至不受葡萄糖抑制的啟動子上并且該酵母同時將葡萄糖和木糖發(fā)酵為乙醇，這些啟動子也無需木糖用于誘導。
9．權利要求6的酵母，其中的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因來自將木糖發(fā)酵為乙醇的天然酵母。
10．權利要求9的酵母，其中的天然酵母為休哈塔假絲酵母、具柄畢赤酵母或Pachysolen tannophilus。
11．權利要求9的酵母，其中的木酮糖激酶基因來自酵母或細菌。
12．權利要求11的酵母，其中的木酮糖激酶基因來自休哈塔假絲酵母、具柄畢赤酵母、Pachysolen tannophilus、啤酒糖酵母、粟酒裂殖糖酵母或大腸桿菌。
13．具有在酵母的至少約10個核糖體DNA位點整合的所述基因的權利要求1的酵母。
14．用于整合多拷貝外源DNA至細胞重復染色體DNA中的方法，包括(a)以具有包括第一種篩選標記外源DNA的復制和整合性質粒轉化細胞；和(b)反復復制步驟(a)的細胞以制備許多代的子代細胞同時篩選包括此篩選標記的細胞，從而促進該復制和整合性質粒在隨后子代細胞中的保留并且制備具有多拷貝整合外源DNA的子代細胞。
15．權利要求14的方法，其中的質粒DNA也包括用于篩選包括此質粒細胞的第二種篩選標記。
16．權利要求14的方法，其中的細胞為酵母或真核細胞，并且其中的方法進一步包括反復復制步驟(b)的子代細胞的步驟從而在對于包括此篩選標記的細胞無選擇的條件下制備許多代的子代細胞，從而促進該質粒在隨后子代細胞中的丟失并且回收每個含多拷貝整合到其染色體DNA中外源DNA的酵母細胞。
17．權利要求16的方法，其中的細胞為酵母細胞并且外源DNA包括編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因，它們同時用作第一種篩選標記。
18．權利要求14的方法，其包括(ⅰ)從具有包括篩選標記的外源DNA的復制性質粒轉化酵母細胞，該外源DNA的每個側翼端為與宿主DNA重復序列同源的DNA序列；(ⅱ)反復復制步驟(ⅰ)的轉化酵母細胞以制備許多代的子代細胞同時篩選包括該篩選標記的細胞，從而促進該復制性質粒在隨后子代細胞中保留并得到每個含有多拷貝整合外源DNA的子代細胞；和(ⅲ)復制步驟(ⅱ)的子代細胞以在對于包括該篩選標記的細胞缺乏選擇的條件下制備許多代子細胞，從而促進該質粒在隨后子代細胞中的丟失并且回收每個含多拷貝整合到其染色體DNA中外源DNA的酵母細胞。
19．由權利要求18的方法制備的酵母細胞。
20．權利要求19的酵母細胞，其中的外源DNA包括編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因，并且此酵母細胞發(fā)酵木糖至乙醇。
21．權利要求20的酵母細胞，其中所述的基因融合至無需木糖誘導并且不受葡萄糖抑制的啟動子上，并且其中的酵母細胞同時發(fā)酵葡萄糖和木糖至乙醇。
22．根據(jù)權利要求21的酵母細胞，它們在非選擇條件下培養(yǎng)至少20代時基本上維持其發(fā)酵木糖至乙醇的能力。
23．發(fā)酵木糖至乙醇的酵母，包括具有多拷貝整合入該酵母染色體DNA中外源DNA的酵母，該外源DNA包括編碼融合至不受葡萄糖抑制啟動子上的木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的基因，該酵母同時發(fā)酵葡萄糖和木糖至乙醇并且當在非選擇條件下培養(yǎng)至少20代時仍然基本上維持其發(fā)酵木糖至乙醇的能力。
24．權利要求23的酵母，其中所述的啟動子無需木糖誘導。
25．發(fā)酵木糖至乙醇的酵母，包括具有多拷貝導入的含有編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因DNA的酵母，該酵母發(fā)酵木糖至乙醇并且當在非選擇條件下培養(yǎng)至少20代時仍然基本上維持其發(fā)酵木糖至乙醇的能力。
26．權利要求25的酵母，其中的啟動子無需木糖誘導。
27．用于發(fā)酵木糖至乙醇的方法，包括用權利要求1、22、23、24、25或26的酵母發(fā)酵含有木糖的培養(yǎng)基以制備乙醇。
28．用于整合包括第一種篩選標記的外源DNA序列至靶酵母細胞染色體DNA中的質粒載體，該質粒載體含有有功能的酵母DNA復制起點和外源DNA，后者的每個側翼端為與靶酵母細胞的重復核糖體DNA序列同源的DNA側翼序列，該質粒在此DNA側翼序列之間以外的位置進一步包括第二種篩選標記。
29．用于整合外源DNA序列至酵母中以形成發(fā)酵木糖至乙醇的穩(wěn)定整合體的質粒載體，該質粒載體含有有功能的酵母DNA復制起點和包括編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶基因的外源DNA，后者的每個側翼端為與靶酵母細胞的重復DNA序列同源的DNA側翼序列。
30．用于形成具有多拷貝整合外源DNA片段細胞的方法，包括復制具有重復基因組DNA并且含有具有外源DNA的復制和整合性質粒的細胞以制備多代的子代細胞同時篩選包括篩選標記的細胞，從而促進該復制和整合性質粒在隨后子代細胞中的保留并且制備具有多拷貝整合外源DNA的子代細胞。
全文摘要
所述的為將木糖發(fā)酵為乙醇并且在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代時仍維持其這樣做能力的重組酵母。優(yōu)選的酵母含有多拷貝融合至不受葡萄糖抑制并且無需木糖來誘導啟動子上且編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的整合的基因。同時描述的為通過以復制性/整合性載體轉化細胞并且然后在選擇壓力下將該細胞復制多次以促進該載體在后代中保留而將多拷貝外源DNA整合入宿主細胞的優(yōu)選方法。因此復制的載體用于將多拷貝外源DNA在整個復制/篩選期內整合至宿主細胞中。然后可去除選擇壓力以促進該載體在后代中的丟失,從而得到了外源DNA的穩(wěn)定整合體。
文檔編號C12N9/12GK1225125SQ97196195
公開日1999年8月4日 申請日期1997年5月6日 優(yōu)先權日1996年5月6日
發(fā)明者N·W·Y·霍, 陳正道 申請人:普渡研究基金會