專利名稱：細胞損傷應答元件及其用途的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明主要涉及癌癥化學治療的分子生物學和藥理學。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新型細胞損傷應答元件及其用途。
有關技術說明用基因毒性藥物處理哺乳動物細胞會引起許多“損傷應答”基因mRNA水平增高(參見Holbrook和Fornace(1))。許多這類基因也可以用佛波酯處理來誘導。其中對佛波酯處理沒有反應的那些細胞，有此可被腫瘤抑制物基因p53，例如WAF1和GADD45(2,3)激活?？墒牵匀挥性S多DNA損傷誘導基因其激活信號是未知的，GADD153就是其中之一。GADD153特別受到注意，因為細胞損傷之后GADD153mRNA的增加量高于大多數(shù)其它“損傷應答”基因。
GADD153起初是從正在增殖的中國倉鼠卵巢細胞中去除UV處理產生的雜交而克隆得到的。GADD153是如下基因的一個亞組，這類基因可用UV照射或其它形式的DNA損傷來誘導，但不被熱休克或佛波酯處理所誘導(4)。發(fā)現(xiàn)這一亞組的基因受許多損傷DNA或誘導細胞周期終止藥物的協(xié)同調節(jié)(5)?，F(xiàn)在它們的人類相應物已被克隆并定位于第12號染色體的12q13.1-q13.2區(qū)域(6)。該基因是高度保守的，人基因表現(xiàn)出與倉鼠基因78％的核苷酸一致性。
GADD153基因產物的作用還沒有完全確定，但有一些證據表明它們在細胞損傷應答期間在細胞周期的控制上起著一定的作用。當轉染細胞后在組成型活潑啟動子調控下，GADD153的表達阻止了人卵巢癌細胞增殖形成集落的能力。Zhan等報道，GADD153-表達載體與含有可選擇性新霉素抗性基因的載體共轉染，使H1299和HeLa細胞的接種效率減低至單用新霉素質粒所得接種率的30％(7)。Barone等給細胞微注射含有GADD153編碼區(qū)的表達質粒或純化的GADD153蛋白(8)。據5-溴脫氧尿苷摻入法測定，該質粒和純化蛋白都阻止了細胞從G1期進入緊接著的S期。這此結果引起的以下爭論，即GADD153基因的產物也許涉及DAN損傷或其它類型細胞損傷后，導致中止G1/S過度的細胞機制。
此前已在細胞系和異源移植體中證明，GADD153信號增加的程度與化療藥物順鉑和paclitaxel導致的細胞損傷程度密切相關，這兩種藥物以不同的信號傳導途徑轉錄激活GADD153啟動子(9)。要更詳細地確定這此途徑的起始步驟，必須分析GADD153啟動子，明確paclitaxel產生轉錄激活所必須的成份。
現(xiàn)有技術中缺乏對paelitaxel激活GADD153啟動子所需的細胞損傷應答元件(CIRE)的驗定和特征描述。本發(fā)明填補了該領域長期以來的這一需求。
發(fā)明概述paclitaxel誘導的損傷在轉錄水平激活GADD153啟動子。啟動子中從轉錄起始位點起的-786至-85堿基對的缺失對激活作用沒有明顯影響，但是缺失至TATA盒則破壞了該啟動子。將-74至TATA盒的39個堿基(細胞損傷應答元件；CIRE)置于腺病毒E4 TATA盒的上游，就提供了paclitaxel誘導性。存在于細胞損傷應答元件內唯一目前已知的共有序列是Sp1位點；該位點的突變將抑制paclitaxel的激活作用。paclitaxel不能激活含有5個Sp1序列的SV40驅動的熒光素酶結構，GADD153啟動子內更為上游的Sp1位點是激活作用非必須的。純Sp1和非損傷細胞及paclitaxel損傷細胞核提取物，保護非編碼鏈-62至-48堿基，和編碼鏈-74至-53堿基之相同區(qū)域。在凝膠遷移試驗中，核提取物使細胞損傷應答元件遷移的程度與純Sp1相同，但是對Sp1位點突變的細胞損傷應答元件沒有作用。Sp1的免疫缺失不發(fā)生遷移；抗Sp1的抗體產生超遷移。以上信息表明，paclitaxel通過組成型方式占據-61堿基的Sp1位點來激活GADD153啟動子。
本發(fā)明證明，一段短的39個堿基對DNA序列已獲鑒定，它在人細胞和組織中起著誘導性啟動子的作用。該啟動子可明顯地被某些類型的細胞損傷，包括癌癥化療藥物和UV照射引起的損傷所激活。該序列已被鑒定稱為“細胞損傷應答元件(CIRE)”。該DNA片段與一報告基因偶連后可在體外測試系統(tǒng)中用于檢測和定量細胞損傷的程度(不僅如此)。
已經明確細胞損傷激活所需序列的最小長度，以及激活需要細胞損傷應答元件內完整Sp1結合位點。動物模型的研究已經完成，顯示，以細胞損傷應答元件為其關鍵性功能元件的全長GADD153啟動子，可用于體內定量檢測細胞損傷的程度。此外，一項臨床試驗也已完成，證明，在頭頸癌患者中，GADD153啟動子的誘導程度可預示臨床反應。
對細胞損傷應答元件的認識，可作為開發(fā)與癌癥治療及基因療法廣闊領域相關的診斷策略的基礎?？赡艿挠猛景ǖ幌抻谝韵滤黾毎麚p傷應答元件可用來確定和引導抗癌新藥的開發(fā)。臨時性或永久性轉染報告基因與細胞損傷應答元件連續(xù)結構的細胞，可用于大量篩選天然產物、新類型藥物以及現(xiàn)有藥物的類似物。報告基因的代表性例子對本領域一般技術人員來說是眾所周知的。
細胞損傷應答元件可用來篩檢藥物的細胞毒性。臨時性或永久性轉染了和報告基因連鎖的細胞損傷應答元件結構的細胞，可用于大量篩檢以去除引起細胞損傷的藥物。
細胞損傷應答元件可用于激活有助于細胞從損傷中恢復的基因。已知，此基因在表達后能夠防止受損細胞的死亡。利用現(xiàn)有的基因治療技術，此細胞損傷應答元件可與這些保護基因偶聯(lián)插入正常組織(例如骨髓)以幫助抵抗諸如癌癥化療藥物或放射治療之類的傷害性。這些保護性基因的代表性的實例包括胰島素、G-CSF或血小板生成素(的基因)。
此細胞損傷應答元件可用來放大損傷信號，使得細胞僅受輕微損傷即死亡。如果細胞損傷應答元件與一毒素基因偶聯(lián)，那么即使很輕微的損傷也能令細胞死亡。這可以用作治療癌癥的基因療法的一部分，它包括將細胞損傷應答元件-毒素基因結構插入惡性細胞，來放大無論是常規(guī)化療或放療所引起的損傷。這種毒素基因的代表性實例包括gelonin、蓖麻毒蛋白和皂角苷，以及其它本領域普通技術人員所知的藥物。
本發(fā)明實施方案之一中，提供了一載體，該載體包含編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列，所述啟動子包含GADD153轉錄起始位點起-74至-35位的核苷酸，所述載體能在宿主內復制，它操作性連接有a)復制起始點；b)啟動子；c)編碼所述啟動子的DNA序列。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供了一種被本發(fā)明載體轉染的宿主細胞，所述載體表達細胞損傷應答元件啟動子，所述啟動子包含GADD153轉錄起始位點起-74至-35位的核苷酸。
為了公開本發(fā)明，以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行說明，本發(fā)明的其它內容、特征和優(yōu)點將由此可見。
附圖簡述為了清晰、得到和詳細理解以上所述的本發(fā)明特點、優(yōu)點和目標，參照本文有


的某些實施方案，可以對以上簡要歸納的本發(fā)明進行更具體的描述。這些附圖屬于說明書的一部分。但需要指出的是，

的是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所以，不能將其理解為對本發(fā)明范圍的限定。
圖1顯示paclitaxel處理后，GADD153啟動子活性和內源mRNA水平的相對升高。用pGADD-LUC脂質轉染細胞，用paclitaxel處理，24小時后測定熒光素酶活性(圓形，1)或內源GADD153 mRNA水平(方塊，n)。每個數(shù)據點代表一式二份實驗的平均值±SEM。
圖2顯示缺失突變對paclitaxel激活GADD153啟動子作用的影響。采用PCR為基礎的方法產生GADD153啟動子pGADD-LUC內的缺失突變，脂質轉染到2008細胞內。用70nM的paclitaxel處理該細胞，24小時后測定熒光素酶活性。通過以CCTAGA替換野生型的CCGCCC來產生Spl突變。每個數(shù)據點代表至少一式三份實驗的平均值+SD。
圖3顯示paclitaxel對置于一異源啟動子上游的細胞損傷應答元件的激活作用。細胞損傷應答元件被置于腺病毒E4早期啟動子TATA(轉錄起始位點起的第-33至+17位堿基)驅動的熒光素酶結構體的5’端，脂質轉染到2008細胞內。用70nM的paclitaxel處理該細胞，24小時后測定熒光素酶活性。實心柱表示含有細胞損傷應答元件和TATA區(qū)的結構體，空心柱表示僅含TATA區(qū)的結構體。每根柱都表示一式二份實驗的平均值±SD。
圖4顯示70nM的paclitaxel對其它含Spl的啟動子的激活作用。受GADD153啟動子、GADD153的TATA區(qū)、SV40早期啟動子和細胞色素p45驅動的熒光素酶報告結構體被脂質轉染到2008細胞系內，用70nM的paclitaxel處理細胞，24小時后測定熒光素酶活性。每根柱表示一式三份實驗的平均值±SD。
圖5顯示細胞損傷應答元件的DNAseⅠ足跡。轉錄起始位點起-185至+21位堿基的GADD153啟動子區(qū)，在編碼鏈SEQ.ID.NO:1或非編碼鏈SEQ.ID.NO:2上用32p標記，與單純緩沖液(無蛋白質)、2足跡單位的純化Sp1蛋白(純Sp1)、10微克未處理細胞的核提取物(未處理)或70nM paclitaxel處理細胞的核提取物(paclitaxel)孵育24小時。各復合物與DNAseⅠ孵育1分鐘，用苯酚/氯仿萃取DNA，在6％聚丙烯酰胺/脲凝膠上分離。通過雙脫氧測序法來確定位置。Sp1共有位點加以下劃線。
圖6顯示接頭掃描突變對paclitaxel激活pGADD-LUC(-185)的影響。用PCR產生在DNAse足跡試驗Ⅰ中被保護區(qū)域的接頭掃描突變。圖6A的SEQ.ID.NO:1,SEQ.ID.NO:2和SEQ.ID.NO:3顯示了細胞損傷應答元件內的突變部位。大寫的堿基是在核提取物的DNAseⅠ消化中被保護的，Sp1位點加了下劃線，突變以粗體表示。圖6B展示了所述突變的影響。這些突變脂質轉染到2008細胞內，用70nM的paclitaxel處理細胞，24小時后測試熒光素酶活性。每個數(shù)據點都代表一式二份實驗的平均值±SD。
圖7顯示細胞損傷應答元件和CIRE-Sp1突變體的凝膠遷移率遷移試驗。用32p末端標記細胞損傷應答元件(泳道1至6)和CIRE-Sp1突變體(泳道7至12)，與無蛋白(泳道1和7)、純Spl(泳道2和8)、未處理細胞的核提取物(泳道2,4,9和10)和經paclitaxel處理細胞的核提取物(泳道5,6,11和12)孵育，然后在4％聚丙烯酰胺/0.5％TBE凝膠上分離。
圖8顯示用免疫缺失了Spl的核提取物進行的細胞損傷應答元件的超遷移和凝膠遷移率遷移試驗。如上所述，用32P末端標記細胞損傷應答元件，與無蛋白(泳道1和2)、未處理細胞的核提取物(泳道3和4)、或paclitaxel處理細胞的核提取物(泳道5和6)、和非特異性家兔抗體(泳道1,3和5)或家兔α-Sp1抗體(泳道2，4和6)孵育。還將細胞損傷應答元件與模擬缺失核提取物(泳道7)和Sp1-缺失核提取物(泳道8)一起孵育。
發(fā)明詳細說明根據本發(fā)明，在此可能用到本領域技能中的分子生物學、微生物學和重組DNA技術。這些技術在文獻中有全面的說明。參見，例如，Maniatis,Fritsh&Sambrook,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；“DNA Cloning:APractical Approach,”第Ⅰ卷和第Ⅱ卷(D.N.Glover編輯，1985)；“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait編輯，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames&S.J.Higgins編輯(1985)]；“Transcription and Translation”[B.D.Hames 8 S.J.Higgins編輯(1984)]“Animal Cell Culture”[R.I.Freshney編輯(1986)]；ImmobilizedCells and Enzymes[IRL Press(1986)]；B.Perbal,“A Practical Guide To MolecularCloning”(1984)。
所以，在此出現(xiàn)的術語具有以下定義。
在此所述的氨基酸以“L”異構體形式的為佳。但是，“D”異構體形式的殘基可取代任何L-氨基酸殘基，只要該多肽保留了所需的功能性質。NH2指多肽氨基末端的游離氨基。COOH指多肽羧基末端的游離羧基。為與標準多肽命名保持一致，以下表格中列出了氨基酸殘基的相應縮寫(J Biol Chem,243:3552-59,1969)
對應表格代碼 氨基酸單字母 三字母YTyr 酪氨酸GGly 甘氨酸FPhe 苯丙氨酸MMet 甲硫氨酸AAla 丙氨酸SSer 絲氨酸IIle 異亮氨酸LLeu 亮氨酸TThr 蘇氨酸VVal 纈氨酸PPro 脯氨酸KLys 賴氨酸HHis 組氨酸QGln 谷胺酰胺EGlu 谷氨酸WTrp 色氨酸RArg 精氨酸DAsp 天冬氨酸NAsn 天冬酰胺CCys 半胱氨酸應當注意的是，本文所有的氨基酸殘基序列都按照從左到右為從氨基末端到羧基末端的常規(guī)方向表示。而且，應當指出，氨基酸殘基序列開頭或末尾的短劃表示肽另與一個或多個氨基酸殘基序列連續(xù)。以上表格將單字母命名與三字母命名相對應，它們可能在本文中交替出現(xiàn)。
“復制子”是在體內起DNA自主復制單位作用的基因元件(例如質粒、染色體、病毒)，即，能夠在自己的調控下復制。
“載體”是一種復制子，例如質粒、噬菌體或粘粒(cosmid)，可將其它DNA片段與之連接以引起所連DNA片段的復制。
“DNA分子”指單鏈形式或雙鏈螺旋形式的脫氧核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。此術語僅指分子的一級和二級結構，不限定于任何具體的三級形式。所以，該術語具體包括在線性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、質粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA，等。在本文討論結構時，根據常規(guī)，只沿DNA非轉錄鏈(即，序列與mRNA相同的鏈)的5’至3’方向給出序列。
“復制起始點”指參與DNA合成的DNA序列。
DNA“編碼序列”是雙鏈DNA序列，在體內，它在合適的調控序列控制下，經轉錄和翻譯成為多肽。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端的一個起始密碼子和3’(羧基)末端的一個翻譯終止密碼子確定。編碼序列包括但不限于原核序列、來自真核mRNA的cDNA、來自真核生物(例如哺乳動物)的基因組DNA序列，甚至是合成的DNA序列。聚腺苷酸信號和轉錄終止序列通常位于編碼序列的3’末端。
控制轉錄和翻譯的序列即DNA調控序列，例如啟動子、增強子、聚腺苷酸信號、終止子等，它們使得編碼序列在宿主細胞內得以表達。
“啟動子序列”是一種能夠結合蛋白質復合物的DNA調控區(qū)，起著啟動下游(3’方向)編碼序列轉錄的作用。為了明確本發(fā)明，啟動子在其3’端與轉錄起始位點連接，向上游(5’方向)延伸，至包括啟動可測水平的(高于背景)轉錄所必需的最少數(shù)量的堿基或元件。啟動子序列內是一轉錄起始位點(通常利用核酸酶Sl酶切圖譜法確定)，和蛋白質結合結構域(共有序列)，該結構域結合組裝轉錄起始復合物所需的RNA聚合酶和蛋白質。真核生物啟動子經常但不總是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核生物啟動子除-10至-35位的共有序列之外，還含有Shine-Dalgarno序列。
“表達調控序列”是控制和調節(jié)另一段DNA序列的轉錄和翻譯的一段DNA序列。在細胞內，當RNA聚合酶將編碼序列轉錄成mRNA，然后后者被翻譯成由編碼序列編碼的蛋白質時，則稱編碼序列“在轉錄和翻譯調控序列調控之下”。
“信號序列”可以包括在編碼序列之前。該序列編碼一信號肽，位于多肽其它結構域的N末端，它向宿主細胞發(fā)出信息，將多肽引向細胞表面或分泌到培養(yǎng)基中，而且，在蛋白質離開細胞前，該信號肽被宿主細胞切除。
本文用的術語“寡核苷酸”指本發(fā)明的探針，即包含兩個或更多個，最好是三個以上核糖核酸的分子。它的確切大小取決于多種因素，這些因素又取決于該寡核苷酸的最終功能和用途。
本文用的術語“引物”指天然存在于純化的限制性酶消化產物中的，或者合成的一段寡核苷酸，它能夠在誘導引物延伸產物(與某核酸鏈互補)合成的條件下(即存在核苷酸和DNA聚合酶之類的誘導劑和在適當?shù)臏囟群蚿H下)，起到合成起始位點的作用。引物可以是單鏈或雙鏈的，長度必須足夠在誘導劑存在下引導所需延伸產物的合成。引物的確切長度取決于許多因素，包括溫度、引物來源和使用方法。例如，就診斷性用途而言，取決于目標序列的復雜性，寡核苷酸引物一般含15至25個或更多個核苷酸，雖然它也可含少一些的核苷酸。
本文選出的引物是與不同的具體目標DNA序列鏈“基本”互補的。即，引物必須具有足夠的互補性與其對應的鏈雜交。所以，引物序列不需要反映模板的準確序列。例如，一段非互補性核苷酸片段可以接在引物的5’端，而引物序列的其余部分與此鏈是互補的。或者，非互補性堿基或較長的序列可以插在引物中間，只要引物序列與該序列具有足夠的互補性，或可以與之雜交，由此形成合成延伸產物用的模板。
本文用的“限制性核酸內切酶”或“限制性酶”，指細菌的酶，這兩種酶各自能在某一特定核苷酸序列處或附近切斷雙鏈DAN。
當外源或異源性DAN被引入細胞后，就稱該細胞被所述DNA“轉化”。轉化DNA可能，也可能不整合(共價連接)到細胞的基因組中。例如在原核細胞、酵母和哺乳動物細胞中，轉化DNA可能保持在質粒之類游離體上。就真核細胞而言，穩(wěn)定轉化的細胞即轉化DNA整合到染色體中，由此通過染色體復制而被子代細胞所繼承。真核細胞能夠形成由一群含有轉化DNA的子代細胞組成的細胞系或克隆，可證明這種穩(wěn)定性?！翱寺　笔怯蓡蝹€細胞或一個共同的祖細胞有絲分裂形成的一群細胞?！凹毎怠笔且粋€原代細胞克隆，能夠在體外穩(wěn)定生長許多代。
兩段DNA序列中有一定長度的DNA序列(至少約75％，較好至少80％，最好至少90％或95％)的核苷酸相互匹配則稱為“基本同源”。序列是否基本同源可以用序列信息庫中的標準軟件通過序列比較，或在就具體系統(tǒng)而言的嚴謹條件下，作Southern雜交實驗來確定。確定合適的雜交條件是本領域的常規(guī)技術。參見，Maniatis等，(同上)；DNA Cloning，第Ⅰ和Ⅱ卷，(同上)；核酸雜交，(同上)。
DNA結構的“異源”區(qū)指大DNA分子中一段可辨認的節(jié)段，該節(jié)段在天然情況下不與該大DNA分子相聯(lián)。這樣，當異源區(qū)編碼一個哺乳動物基因時，該基因兩側通常不是源生物基因組中哺乳動物基因組DNA兩側的DNA。在另一例子中，編碼序列是一結構體，編碼序列本身不是天然存在的(例如，包括內含子的基因組編碼序列的cDNA，或具有不同于天然基因的密碼子合成序列)。等位變異或天然突變都不產生本文所述的DNA異源區(qū)。
所述研究中最常用的標記是放射性元素、酶、接觸紫外光而發(fā)熒光的化合物或其它物質。有許多熒光物質是已知的，可用作標記。例如，其中包括，熒光素、羅丹明、金色胺、Texas紅、AMCA藍和螢光素黃。一種特殊的檢測材料是在山羊中制備并通過異硫氰酸鹽與熒光素偶聯(lián)的的抗-家兔抗體。
同樣，酶標記也可使用，可用目前的比色法、分光光度法、熒光分光光度法、電流測定法或氣體定量法來檢測。通過與碳化二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛之類的橋連分子反應，將酶與選定的顆粒偶聯(lián)。許多用于此類程序的酶都是已知，可以使用。較好的是過氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加過氧化物酶和堿性磷酸酶。有關其它標記材料和方法的例子，可參見美國專利3,654,090,3,850,752和4,016,043所公開的內容。
本領域開發(fā)和使用的一種特殊的試驗系統(tǒng)是受體試驗。在受體試驗中，待測物質被適當標記，然后定量與某種細胞測試集落一起孵育，然后進行結合研究以確定標記物質與細胞受體結合的程度。如此可以確定物質間的親和力差異。
所以，本發(fā)明是涉及包含編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列的載體，所述載體包含GADD153啟動子的轉錄起始位點起第-74至-35位核苷酸，所述載體能夠在宿主內復制，它連鎖地包含a)復制起始點；b)啟動子；c)編碼所述啟動子的DNA序列。較好的是，該載體選自逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體和質粒。具體地說，該載體含有序列如SEQ ID NO:9所示的啟動子。
本發(fā)明還涉及用權利要求1所述的載體轉化的宿主細胞，所述載體表達細胞損傷應答元件啟動子，所述啟動子包含GADD153啟動子的轉錄起始位點起第-74至-35位核苷酸。較好的是，宿主細胞選自細菌細胞、哺乳動物細胞和昆蟲細胞。
本發(fā)明新的CIRE可用來激活編碼分泌激素、生長因子、細胞因子、趨化因子或其它多肽的基因的表達。例如，可將載體插入某機體細胞，含有的CIRE驅動一個基團，該基團產物是某種有用蛋白(例如胰島素、G-CSF或血小板生成素)。然后可以調節(jié)所產生蛋白的量，并用局部加熱，照射(UV、微波、γ)，或者甚至可能用機械創(chuàng)傷，輕微損傷含插入載體的細胞，使蛋白質釋放到機體的其余部分。
在另一種方法中，本發(fā)明的CIRE可用來激活產物為轉錄因子，或能調節(jié)其它基因、基因族表達，分化路徑或代謝通路的其它蛋白質的基因表達。所以，CIRE可用來啟動調控蛋白的表達，該調節(jié)蛋白能夠調節(jié)全組基因或全部通路的活性。CIRE的啟動機制與前文所述的相同(加熱，照射等)。在該實施方案中，可以激活(1)生物合成通路，例如，用以產生更多的甾體類分子，或(2)降解途徑，例如代謝去除體內累積的毒素。而且，CIRE可用來啟動導致細胞增殖的轉錄因子的表達(例如E2F-1或myc)。這樣就能夠在將插入了CIRE-基因結構的細胞輸回機體后外部控制該細胞群的繁殖速度。
本發(fā)明的另一實施方案是用CIRE啟動黑色素合成途徑中限速酶的合成，由此，一旦細胞受到UV照射(日曬)，它將通過啟動黑色素合成來自動地保護自己。
在本發(fā)明另一實施方案中，CIRE被用來啟動編碼細胞表面和胞內受體的基因的表達。CIRE與受體基因偶聯(lián)，當細胞略受損傷時即表達該受體，從此對環(huán)境中存的激素、生長因子等變得能產生應答反應。這可能是另一種控制細胞繁殖的方法。例如，如果啟動VEGF受體的表達，就可以使得細胞在新生血管部位增殖。如果啟動甾體受體基因的表達，就能使細胞對糖皮質激素等產生應答。
以下實施例是為了說明本發(fā)明的各種實施方式，但不是對本發(fā)明任何形式的限定。
實施例1化合物Paclitaxel得自Calbiochem(San Diego,CA)。蟲熒光素得自AnalyticalLuminescence(San Diego,CA)。DNAseⅠ得自Sigma(St.Louis,MO)。
實施例2細胞培養(yǎng)物人卵巢癌細胞2008(10)在潮濕的37℃。5％CO2孵育箱內，在添加了5％胎牛血清和2mM谷胺酰胺的RPMI1640中形成呈指數(shù)生長的單層細胞。
實施例3載體的構建pGADD-LUC，受GADD153啟動子驅動的熒光素酶受體結構，是如下構建的將含有倉鼠GADD153啟動子的p9000(由Dr.N.J.Holbrook贈與，NIA,NIH,Baltimo,MD)的ClaⅠ/HindⅢ片段連接到pB-LUC(11)的AccⅠ/HindⅢ位點。pB-LUC含有連接在pBluescript KS(Dr.Linda Quattrochi贈與)的BamHⅠ位點的螢火蟲熒光素酶基因。用以PCR為基礎的方法產生缺失突變。用含有XhoⅠ接頭的引物和pBluescript多克隆區(qū)內的一反義引物，來產生該啟動子的缺失片段。這些片段用XhoⅠ和Hind Ⅲ剪切，并接入pB-LUC的XhoⅠ/Hind Ⅲ位點。自轉錄起始位點起算-59位，用TCC TAG ACC替代TCC CGC CCC產生Sp1結合位點內的突變。用含有Sp1突變(上述)，或含轉錄起始位點起算-61位3’突變(CCTCTC TAG替換CCA AAA GAG)的有義和反義取向的引物，產生接頭掃描突變。所產生的片段從突變位置至pBluescript的克隆區(qū)，和從突變位置至轉錄起始位點起算-185位(具有XhoⅠ接頭)。將這些片段混合，用作模板，與從-185位(具有XhoⅠ接頭)至pBluescript克隆區(qū)的引物反應。這些片段用XhoⅠ和HindⅢ剪切，并接入pB-LUC的XhoⅠ/HindⅢ位點。
實施例4熒光素酶試驗按Rose等所述方法(12)的改進法，用pGADD-LUC結構轉染細胞。將細胞鋪平板，每35mm的培養(yǎng)皿3×105個細胞，18小時后在37℃與5微克質粒DNA和30微升脂質體一起培養(yǎng)在1毫升RPMI1640中。3小時后，去除脂質，用paclitaxel處理細胞24小時。在100至500微升裂解緩沖液(25mM N-甘氨酰甘氨酸，pH7.8,15mM MgSO4,4mM EGTA,1％Triton X-100,1mM二硫蘇糖醇)中裂解細胞。對Brasier等所述的方法(13)加以改進，用以測定熒光素酶的活性。將50微升細胞裂解液加入反應緩沖液(加入15mM磷酸鉀，pH7.8，和2mM ATP的裂解緩沖液)。在裂解液/反應液混合物中注入100微升螢光素后，用Monolight2001(Analytical Luminescence,San Diego,CA)測量光發(fā)射。
實施例5核蛋白的提取沉淀出108個細胞，重懸在A緩沖液(10mM HEPES,pH7.9,1.5mM MgCl2,10mM KCl和1mM DTT)中制備核提取物。細胞置冰上平衡10分鐘，500×g離心5分鐘收集。置冰上，在B緩沖液(在A緩沖液中加入0.2％Nonidet P-40(乙基苯基聚乙二醇)，1mM PMSF,10微克/毫升亮抑蛋白酶肽和10微克/毫升抑蛋白酶肽)中裂解細胞10分鐘。1000×g離心10分鐘來收集細胞核。將細胞核重懸在C緩沖液(20mM HEPES,pH7.9,20％乙二醇，100mM KCl,0.2mM EDTA,1mM二硫蘇糖醇，1mM苯甲基磺酰氟，10微克/毫升亮抑蛋白酶肽和10微克/毫升抑蛋白酶肽)中，然后將KCl最終濃度調至0.4M,4℃振蕩30分鐘進行裂解。在Beckman臺式離心機中以65,000RPM(175,000×g)離心40分鐘沉淀出基因組DNA。回收含細胞核蛋白質的上清液，加入乙二醇至終濃度40％。與抗人Sp1蛋白520-538氨基酸的家兔多克隆抗體(PEP2,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)在4℃孵育1小時，從提取物中免疫去除Sp1。用蛋白A/Sepharose(Sigma,St.,Louis,MO)澄清裂解液。
實施例6DNAseⅠ足跡利用PCR產生一段與轉錄起始位點起-185至+21位堿基相對應的DNA片段。用XhoⅠ或EcoRⅤ剪切該片段，去除一個引物，利用T4聚核苷酸激酶(Promega,Madison,WI)在單鏈上進行32P標記，沉淀去除沒被標記的核苷酸，然后重懸。將10微克提取物、2足跡單位的純化Sp1(Promega,Madison,WI)，或無蛋白對照，用Z緩沖液(25mM HEPES,pH7.5,100mM KCl,12.5mM MgCl2,10μM ZnSO4,20％乙二醇，0.1％Nonidet P-40)稀釋至25微升。將25微升含10微升10％聚乙烯醇(Sigma,St.Louis,MO),1毫克聚dI/dC和≥10,000cpm(10-25fmol)標記的DNA，加入蛋白質混合物中，室溫下孵育15分鐘。加入50微升5mM CaCl2/10 MgCl2混合物，孵育1分鐘。然后，加入2微升DNAseⅠ(Sigma,10mg/ml，稀釋度從1∶2000至1∶100,000)，再孵育1分鐘。加入90微升終止液(20mM EDTA,pH8.0,1％SDS,0.2M NaCl,250μg/ml糖原)來停止反應。用5微升10mg/ml的蛋白激酶K消化蛋白質，并用苯酚萃取將其去除。DNA沉淀并重懸在3微升甲酰胺上樣緩沖液中。在6％聚丙烯酰胺/脲測序凝膠上進行條帶的分離，暴光于Biomax MS膠片。利用適用于末端標記引物的方案，以Promega Femptomole測序試劑盒(Promega,Madison,WI)進行測序。
實施例7凝膠遷移轉移試驗在University of California,San Diego分子生物學核心室構建出與細胞損傷應答元件對應的寡核苷酸，在65℃加熱5分鐘一齊退火，并在10mM Tris pH7.8,0.1M NaCl和lmM EDTA中37℃孵育過夜。用乙醇沉淀雙鏈細胞損傷應答元件(或突變的Spl細胞損傷應答元件)，重懸在水中并用T4聚核苷酸激酶(Promega,Madison,WI)32p末端標記，沉淀去除未摻入的核苷酸，然后重懸至500pg/μl(約50,000CPM/μl)中。
將50,000CPM細胞損傷應答元件，1μg聚dI/dC,10μg核提取物或2足跡單位人Spl蛋白(Promega,Madison,WI)懸浮在12.5mM HEPES,pH7.8,50mM KCl,6.25mM MgCl2,5μM ZnSO4,10％乙二醇和0.05％Nonidet P-40中，室溫孵育30分鐘。在4％聚丙烯酰胺/0.5×TBE(45mM Tris-硼酸鹽，10mM EDTA)凝膠上進行條帶分離，干燥，用Molecular Imager System(Bio-Rad,Hercules,CA)顯現(xiàn)。如上在孵育30分鐘后加入0.05g抗Spl抗體(PEP2,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)或非特異性兔抗體到該反應混合物中，再孵育30分鐘，其余如上所述，進行超遷移試驗。
實施例8Northern印跡提取全細胞RNA，按標準方法(14)用MagnaGraph尼龍薄膜(MSI,Westboro,MA)制備Northern印跡。用Molecutar Imager System(Bio-Rad,Hercules,CA)定量測定雜交程度。人GADD153探針由Dr.J.J.Holbrook(NIA,NIH,Baltimore,MD)提供。通過與β肌動蛋白探針相同的雜交印跡比較來校正泳道的上樣量差異。
實施例9paclitaxel對GADD153啟動子和內源性GADD153mRNA的作用在卵巢癌細胞系2008中研究paclitaxel對GADD153啟動子驅動的熒光素酶結構和內源性GADD153mRNA的作用。用5微克pGADD-LUC轉染細胞，然后與paclitaxel接觸24小時，此刻測定熒光素酶的活性和內源GADD153mRNA的水平。如圖1所示，paclitaxel誘導了GADD153啟動子活性和內源GADD153mRNA水平二者的濃度依賴性提高，提高的數(shù)量級相同。
如圖2所示，用PCR產生了GADD153啟動子內的缺失。將這些結構轉染到2008細胞內，測定其在與70nMpaclitaxel接觸后的可誘導性(與只用云載體處理的細胞比較)。從轉錄起始位點起-786至-85的缺失對paclitaxel激活GADD153啟動子沒有明顯影響。至-74堿基對的缺失則提高了可誘導性近2倍，提示-74位5’端的11個堿基含有轉錄抑制物。啟動子進一步缺失至-35位堿基(只剩下TATA盒)則降低paclitaxel誘導性2.2倍。這提示，從-74位至TATA盒的39堿基對中含有負責paclitaxel誘導的GADD35啟動子活性提高的元件。僅含TATA盒的結構體被激活2倍，這一發(fā)現(xiàn)提示paclitaxel誘導的損傷對基本轉錄機制有輕微正效應。
實施例10將paclitaxel-應答元件轉移到異源啟動子作中為了確定從-74位至TATA盒的39堿基是否足以使其它啟動子具有對paclitaxel的應答性，這些堿基被轉移到含腺病毒E4-TATA盒的啟動子中。這39個堿基與-TATA盒的相應位置保持一致。如圖3所示，這39個堿基使E4-TATA區(qū)具有了paclitaxel誘導性，誘導的程度與用-74GADD-LUC結構產生的相似。將此39堿基對區(qū)確定為細胞損傷應答元件(CIRE)。CIRE的序列為SEQ ID NO:9:
AGG CTC CTG GGT CCC GCC CCC CAA AAG AGG GGA CGG GCC完整啟動子源序列見Luethy等，J.Biol.Chem,(265(27))16521-26(1990)。
實施例11CIRE內的Sp1位點突變從-74至-35的細胞損傷誘導元件區(qū)內只含有一個已知轉錄因子識別序列，即Sp1結合位點。用基于PCR的系統(tǒng)將該位點從CCCGCCCC突變成CCTAGACC，并測試該結構的活性。如圖2下方所示，該突變使paclitaxel激活啟動子的能力由20.0倍降低至5.3倍，表明，Sp1位點是提供paclitaxel敏感性的序列中的必需部分。
實施例12paclitaxel對其它含Spl啟動子的作用既然Sp1看來是paclitaxel誘導啟動子活性最大增加所需要的，故對paclitaxel是否激活所有含Sp1的啟動子進行了測定。用含5個功能性Sp1位點的SV40即刻早期啟動子，和也含5個Sp1位點的細胞色素p450 CYPlAl啟動子對比進行了研究(15)。如圖4所示，paclitaxel對這些結構體中的啟動子只提高活性2倍，這與僅含一個TATA盒的啟動子所見的提高相同。所以，雖然知道Sp1是paclitaxel激活作用所需要的，但并不充分，相對TATA盒的Sp1位點的確切定位可能是至關重要的。
實施例13GADD153啟動子的DNAseⅠ足跡分析為了確定細胞損傷應簽元件中哪些堿基參與了對paclitaxel的應答，進行了DNAseⅠ保護試驗。轉錄起始位點起-185至+21堿基的GADD153啟動子區(qū)以32P作末端標記，與單純緩沖液、或與2足跡單位純Sph蛋白，10微克未處理細胞的核提取物，或與10微克70nMpaclitaxel處理細胞的核提取物孵育24小時。
如圖5所示，純Sp1和未處理和處理細胞的核提取物，都保護非編碼鏈上從-62至-48堿基的相同區(qū)域。核提取物保護編碼鏈上-74至-53堿基；純Sp1的保護方式類似，保護第-71至-53堿基。兩條鏈上的被保護區(qū)域包含了始于-61位堿基的Sp1位點。該信息揭示，Sp1，一種含Sp1的蛋白質復合物，或一種結合特性與Sp1相同的蛋白與細胞損傷應答元件組成型地結合。
實施例14對在足跡試驗中被保護位點的接頭掃描突變?yōu)榱舜_定在DNAse保護試驗中，被保護的各位點是否是paclitaxel激活GADD153啟動子所需要的，還是簡單地以非特異性方式被保護，使用接頭掃描法對Sp1位點和Sp1位點3’方向的堿基進行了突變。圖6上部列出了細胞損傷應答元件和所構建的突變的序列。如圖6下部所示，Sp1位點的突變使這些結構的可誘導性減低至僅含TATA盒的-35pGADD-LUC的水平。Sp1位點3’方向的堿基突變對paelitaxel激活啟動子沒有明顯的影響。這些信息表明，paclitaxel激活GADD153啟動子所需要的是Sp1位點，而不是Sp1位點3’方向的被保護位點。
實施例15凝膠遷移轉移試驗為了進一步證明細胞損傷應答元件與未處理和paclitaxel處理細胞核蛋白之間的相互作用，進行了凝膠遷移轉移試驗。核提取物與32P標記的細胞損傷應答元件一起孵育，在0.5×TBE/4％聚丙烯酰胺凝膠上分離。如圖7所示，5微克和10微克未處理或paelitaxel處理細胞的核提取物，使細胞損傷應答元件和純化Sp1蛋白發(fā)生相同程度的遷移(以Ⅰ標識，泳道2至6)。但是，當核提取物與Sp1突變細胞損傷應答元件一起孵育時，沒有觀察到遷移(在圖7和圖8中以A標識，在圖7和圖8中一條非特異性遷移條帶以A標識)。所以，負責細胞損傷應答元件凝膠遷移的蛋白質的結合，依賴于細胞損傷應答元件內功能性Sp1位點的存在。
既然表觀分子量遷移依賴于功能性Sp1位點，那么與核提取物孵育后，對Sp1是否與細胞損傷應答元件結合進行了測定。如圖8所示，將接觸核提取物的細胞損傷應答元件與免抗人Sp1蛋白520-538氨基酸(PEP2)的多克隆抗體共同孵育，引起了超遷移，并提高了遷移復合物的表觀分子量(以Ⅱ標識，泳道4和6)，而非特異性兔抗體對復合物的遷移率沒有影響(以Ⅰ標識，泳道3和5)。這表明，Sp1蛋白是引起細胞損傷應答元件遷移的復合物的一部分。
為了確定Sp1蛋白是否是形成引起細胞損傷應答元件遷移的復合物形成所需要的，利用PEP2抗Sp1抗體從核提取物中免疫去除Sp1。該模擬缺失的提取物使細胞損傷應答元件遷移的程度與未處理核提取物引起的相同(泳道7)。然而，Sp1免疫缺失不引起遷移(泳道8)。所以，Sp1蛋白是形成引起細胞損傷應答元件遷移的復合物所需要的。
本發(fā)明證明，用化療藥物paclitaxel治療卵巢癌細胞，至通過一個鑒定為細胞損傷應答元件(CIRE)的成分激活了GADD153啟動子，該成分不到39個堿基，緊靠TATA盒的5’端。有三條證據確認，本發(fā)明的細胞損傷應答元件對于轉錄激活該啟動子是必需而且充分的。首先，細胞損傷應答元件的缺失去除了paclitaxel激活GADD153啟動子的能力，不超過用僅含TATA盒的啟動子所觀察到的水平。其次，該元件內關鍵性的Sp1位點的突變抑制了paclitaxel激活該啟動子的能力。第三，將細胞損傷應答元件轉移到異源啟動子的5’端產生了paclitaxel誘導性。
Sylvester等的工作揭示，用脂多糖處理后轉錄激活GADD153啟動子，需要轉錄因子與啟動子內轉錄起始位點起-332至-323的C/EBP元件結合(15)。不過，該元件似乎不參與細胞對paclitaxel的應答。這一信息與此現(xiàn)象一致，即多條路徑可介導GADD153的誘導，路徑的不同取決于生長抑制刺激物種類的不同(9,16)。
介導paclitaxel轉錄激活作用的細胞損傷應答元件，含有一個位于轉錄起始位點起-61堿基處的Sp1共有序列(CCCGCC)。如直接突變和接頭掃描突變所示，該位點是paclitaxel激活啟動子所需要的，而該啟動子內更靠5’方向的3個Sp1位點顯然是不需要的，而且不能取代細胞損傷應答元件內的那個Sp1位點。細胞損傷應答元件內的Sp1位點的特殊性還進一步被以下事實所證明paclitaxel不能激活sv40早期啟動子，表明僅僅Sp1位點不足以引起完全的激活作用。該結果為以下結論提供了強有力的證據，即負責paclitaxel激活GADD153啟動子的轉錄因子是Sp1，或是一種極密切相關蛋白質。在DNAesⅠ保護試驗中，純Sp1的足跡與該啟動子區(qū)域內的核提取物的相似。核提取物中的一個蛋白或幾個蛋白結合了細胞損傷應答元件，使得DNA的遷移程度與純Sp1蛋白的相同，但不能使Sp1位點內含有突變的細胞損傷應答元件遷移。針對Sp1的抗體引起核提取物/細胞損傷應答元件復合物的超遷移，這表明Sp1是該復合物的一部分。是這一結合所必需的，因為從核提取物中免疫去除Sp1不能引起凝膠遷移。這些實驗強有力地提示Sp1是結合細胞損傷應答元件的蛋白。另有一種很小的可能性，即某種與Sp1抗體交叉反應的蛋白是結合細胞損傷應答元件的蛋白。最近的證據揭示有一個蛋白質家族，它們可結合Sp1共有序列(17-20)，可是PEP2抗Sp1抗體是高度特異性的而且不與其它家族內成員交叉反應這個事實，使該家族內其它已知成員參與此事是不可能的。
起初認為Sp1是僅涉及基因的組成型表達的一個普遍存在的轉錄因子(21)，然而最近的證據提示在有些情況下，Sp1對調控表達十分重要。為了獲得組織特異性表達，Sp1可與一種細胞特異性蛋白一齊起作用。Sp1和甾醇調控結合蛋白Ⅰ，都是低密度脂蛋白受體啟動子的正常甾醇-介導調控所需要的(22)。該調節(jié)方法還被用于TF-1紅白血病細胞系中。在該系統(tǒng)中，Sp1在粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子刺激后與p53復合，這在不改變總Sp1蛋白水平的情況下導致了Spl與其共有序列結合的增加(23,24)。Sp1參與組織特異性轉錄的第三個實例是，對髓細胞整合蛋白CD11b啟動子的接頭掃描突變證明，Sp1位點的突變破壞了髓細胞特異性啟動子的活性(25)。有趣的是，使用體外足跡法，發(fā)現(xiàn)Sp1與HeLa細胞和髓細胞內的這種共有序列都結合，但是Sp1位點僅在髓細胞內的體內足跡法中受到保護。在單核細胞系內也證明了相似的發(fā)現(xiàn)。單核細胞標記基因CD14內的Sp1位點突變降低了單核細胞啟動子的活性，并且對HeLa細胞的此種活性只有很小的作用(26)。所以，現(xiàn)在有數(shù)個轉錄激活啟動子的例子，其中Sp1是必須成份，然而涉及的是調控型而非組成型表達。
盡管證據表明細胞損傷應答元件內的Sp1結合位點是paclitaxel誘導GADD153啟動子活化所必需的，但paclitaxel并不改變Sp1與共有序列的表觀結合。采用來自未處理和接觸過paclitaxel的兩種細胞的核提取物，Sp1都存在于這兩種細胞的核提取物與paclitaxel細胞損傷應答元件形成的復合物中。在體外DNAseⅠ保護實驗中兩種細胞的核提取物都產生與Sp1相一致的足跡?？墒?，有證據表明這樣的組成型結合存在于幾種其它Sp1依賴性誘導系統(tǒng)中。成視網膜細胞瘤蛋白通過成視網膜細胞瘤調節(jié)了元件(RCE)調控許多基因的表達，其中包括c-fos,c-jun,c-myc,IGF-Ⅱ和TGF1(27,28)。在IGF-Ⅱ和c-jun啟動子中，Sp1蛋白與RCE組成性地結合(27,28)。在c-jun啟動子內，這種結合的量在對RB的表達應答中增加，這可能是通過RB蛋白與Sp1結合抑制物的相互作用，但是在IGF-Ⅱ啟動子中，用凝膠遷移或DNAseⅠ足跡法測量都沒有觀察到在RB表達之后，SPI結合的改變(27)。
顯然，在GADD153啟動子中，必需有Sp1位點并且含有Sp1的復合物的形成，這些本身并不足以激活此啟動子，提示激活還需要其它過程，例如Sp1本身的磷酸化，或其與之聯(lián)合的一種TAF的磷酸化。最近的信息提示，paclitaxel可激活許多蛋白質激酶(29,30)。已經表明，paclitaxel可引起巨噬細胞TNF釋放的增加和TNF受體的上調(31)。對細菌LPS低反應的小鼠缺乏這種效應，提示paclitaxel和LPS作用于相同的效應物。最近發(fā)現(xiàn)，paclitaxel和LPS激活巨噬細胞相同的基因，可能是通過41KD和42KD蛋白的酪氨酸磷酸化(32)。Liu等記載道，paclitaxel通過誘導凋亡殺死細胞(30)，并且在凋亡反應過程中，抑制物bcl-2減少。染料木黃酮(genistein)或除莠霉素(herbamycin)可阻斷凋亡的增加和bcl-2表達的減少，提示paclitaxel是通過酪氨酸激酶起著這樣的作用。Haldar和Croce已經證明，paclitaxel處理使bcl-2磷酸化并失活，所以激活了凋亡反應(29)。用100nMpaclitaxel處理24小時，增加了組蛋白H3的磷酸化(未給出數(shù)據)。所以，paclitaxel處理激活許多不同的激酶，這些激酶負責Sp1組成性結合DNA后轉錄的激活。
有證據表明，Sp1的磷酸化會改變它的轉錄活性。岡田軟海綿酸通過Sp1位點刺激HIV LTR，但是Sp1與啟動子的結合特性并不改變(33)。利用Western印跡法發(fā)現(xiàn)，岡田軟海綿酸處理造成Sp1由低磷酸化狀態(tài)(95kD)完全轉化成高磷酸化狀態(tài)(105kD)。為了確定Sp1的磷酸化是否引起與TBP或與TBP相連的蛋白(TAFs)相互作用的變化，TATA盒被換以非TBP結合性TATA盒。這一改變極大地降低了岡田軟海綿酸的誘導性。作者假設，Sp1的磷酸化加強了與TBP或TAFs的相互作用，這導致了轉錄活性的提高。
可能Sp1組成性地結合位于轉錄起始位點起-61位的Sp1位點，然后在paclitaxel處理后，發(fā)生了翻譯后修飾作用，這令Sp1激活了轉錄。由于paclitaxel處理不改變Sp1的磷酸化依賴性電泳遷移率，所以，可能，如果涉及磷酸化的話，那可能基本目標是一種TAFs。或者，活化作用是由于Sp1內磷酸化位點分布的改變，這種改變不改變Sp1的電泳遷移率。這種磷酸化的改變使得與Sp1相作用的TAF(例如TAFⅡ110(34))既結合Sp1也結合TATA結合蛋白，從而引發(fā)轉錄。另一種解釋是，paclitaxel處理對Sp1蛋白沒有作用，但修飾了TAFⅡ110或另一種TAFs，使得它們能夠與Sp1和TBP結合，加強轉錄。雖有其它提示Sp1可能作為誘導性基因的轉錄因子的觀察所見，但不知道為什么同一啟動子內某一Sp1位點可引發(fā)轉錄激活，而其它Sp1位點則不然。GADD153啟動子內-61位的Sp1位點具有某些特殊性質，對于它的闡明將有助于解答以上困惑。
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本文提及的所有專利或出版物都反映了本發(fā)明所述領域技術人員的水平。本文對這些專利或出版物進行了相同程度的引用和參考，比如，每一出版物都被具體和單獨地列出過作為參考一樣。
本領域技術人員很容易理解，本發(fā)明可以很好的實現(xiàn)本發(fā)明的目的，并獲得所提及的以及隱含的那些結果和好處。本文就方法、程序、處理、分子和具體化合物所舉的例子代表了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，它們是范例性的，而不是要限定本發(fā)明的范圍。對本領域技術人員來說，對本發(fā)明的改動和其它應用，都包括在本發(fā)明權利要求的宗旨和范圍之內。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人研究發(fā)展基金會(ⅱ)發(fā)明名稱新的細胞損傷應答元件(ⅲ)序列數(shù)量6(ⅳ)通訊地址(A)收件人James F.Weiler，律師(B)街道One Rieverway,Suite 1560(C)城市Houston(D)州Texas(E)國家USA(F)郵政編碼77056(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒質類型DS,HD1.44Mb/1.44Mo(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect 6.0(ⅵ)目前申請信息(A)申請?zhí)?B)申請日期(C)分類(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Weiler,James F.
(B)注冊號16,040(C)參考/卷宗號D5890(ⅸ)電訊信息(A)電話713-626-8646(B)電傳713-963-5853(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GGCAGGCTCC TGGGTCCCGC CCCCCAAAAG AGGG34(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型
(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CCGTCCGAGG ACCCAGGGCG GGGGGTTTTC TCCC34(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3GGCAGGCTCC TGGGTCCCGC CCCCCAAAAG AGGG34(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:CCGTCCGAGG ACCCAGGGCG GGGGGTTTTC TCCC34(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GGCAGGCTCC TGGGTCCCTA CACCCAAAAG AGGG34(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CCGTCCGAGG ACCCAGGGAT CTGGGTTTTC TCCC34(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:GGCAGGCTCC TGGGTCCCGC CCCCCTCTCT AGGG 34(9)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度34(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:CCGTCCGAGG ACCCAGGGCG GGGGGAGAGA TCCC 34(10)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度39(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型(A)描述其它核酸(ⅲ)推定否(ⅳ)反義否(ⅵ)最初來源
(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)育階段(F)組織類型(G)細胞類型(H)細胞系(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:AGG CTC CTG GGT CCC GCC CCC CAA AAG AGG GGA CGG GCC39
權利要求
1．一種載體，具有編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列，所述啟動子包含GADD153啟動子內轉錄起始位點起-74至-35位的核苷酸，它操作性地連鎖有a)復制起始位點；b)啟動子；和c)編碼所述啟動子的DNA序列。
2．根據權利要求1所述的載體，其中所述的載體選自逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體和質粒。
3．根據權利要求1所述的載體，其中所述的啟動子具有SEQ ID NO.9所示序列。
4．根據權利要求1所述的載體，其中所述的編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列與報告基因連鎖。
5．根據權利要求1所述的載體，其中所述的編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列與編碼一個蛋白質的基因連鎖，該蛋白質選自分泌的激素、生長因子、細胞因子和趨化因子。
6．根據權利要求1所述的載體，其中所述的蛋白選自胰島素、G-CSF和血小板生成素。
7．根據權利要求1所述的載體，其中所述的編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列與編碼轉錄因子的基因連鎖。
8．根據權利要求1所述的載體，其中所述的編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列與編碼黑色素的基因連鎖。
9．根據權利要求1所述的載體，其中所述的編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列與編碼細胞表面受體的基因連鎖。
10．根據權利要求9所述的載體，其中所述的表面受體是表皮生長因子受體。
11．根據權利要求1所述的載體，其中所述的編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列與編碼胞內受體的基因連鎖。
12．根據權利要求11所述的載體，其中所述的胞內受體是甾體類激素受體。
13．根據權利要求1所述的載體，其中所述的編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列與毒素基因連鎖。
14．根據權利要求13所述的載體，其中所述的毒素基因選自gelonin、蓖麻毒蛋白和皂角苷。
15．用權利要求1所述載體轉染的宿主細胞，所述的載體表達細胞損傷應答元件啟動子，所述啟動子具有GADD153啟動子內轉錄起始位點起-74至-35位的核苷酸。
16．根據權利要求15所述的宿主細胞，其中所述的細胞選自細菌細胞、哺乳動物細胞和昆蟲細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種載體,它具有編碼細胞損傷應答元件啟動子的DNA序列,所述DNA序列為GADD153啟動子內轉錄起始位點起－74至－35位的核苷酸。該載體包括與編碼所述啟動子的DNA序列操作性連鎖的復制起始位點。此外,宿主細胞以所述的載體轉染,并表達細胞損傷應答元件啟動子。
文檔編號C12N15/09GK1224428SQ97196165
公開日1999年7月28日 申請日期1997年2月21日 優(yōu)先權日1996年6月11日
發(fā)明者D·P·蓋特利, S·B·豪厄爾 申請人:研究發(fā)展基金會