專利名稱：：預(yù)防雞巨型艾美耳球蟲的免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有預(yù)防雞巨型艾美耳球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，屬于生物獸藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。是該疫苗含有雞巨型艾美耳球蟲(五^er^moxZ附fl)子孢子階段抗原EmTFP250的部分基因和雞白細(xì)胞介素-2基因(chlL-2)，并包含有多個T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件。技術(shù)背景雞球蟲病是一種嚴(yán)重危害集約化養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)的、全球性流行的寄生原蟲病，每年因此而導(dǎo)致的經(jīng)濟損失高達20億英鎊以上(WilliamsRB.Acompartmentalizedmodelforestimationofthecostcoccidiosistotheworld'schickenproductionindustry.IntJParasitol,1999,29:1209-1229)。雞巨型艾美耳球蟲(￡.wax/wa)是誘發(fā)雞球蟲病的4種常見球蟲之一，各種年齡的雞均可感染，主要發(fā)生于較大日齡的肉仔雞和產(chǎn)蛋雞，引起亞臨床球蟲病，使雞的飼料轉(zhuǎn)化率、增重和產(chǎn)蛋量受到影響。雞巨型艾美耳球蟲具有很好的免疫原性，對其它幾種雞球蟲有部分交叉免疫力(査紅波，蔣金書，孫玉杰等.巨型艾美耳球蟲在免疫雞體內(nèi)發(fā)育的組織學(xué)觀察.中國獸醫(yī)科技，1998，28(9):3-5.;胡景輝，趙水前，李紅斌.布氏艾美耳球蟲早熟蟲株的免疫原性及毒力.中國獸醫(yī)學(xué)報，1998，18(5):483-485.)。并且雞巨型艾美耳球蟲感染雞產(chǎn)生的抗體，可以作為母源抗體傳遞給后代，對子代產(chǎn)生幾乎完全的保護力，這種保護力可持續(xù)3個月之久(WallachM,SmithNC.,PetraccaM,etal.￡7mm'a附ax/附agametocyteantigens:potentialuseinasubunitmaternalvaccineagainstcoccidiosisinchickens.Vaccine,1995,4(13》347-354.;WicombeDM,BelliSI,Wallachetal.MolecularcharacterizationofEmTFP250:anovelmemberoftheTRAPproteinfamilyinE7附en.a附ax/附a.InternationalJournalforParasitology,2003,33:691-702.;WicombeDM.FergusonDJP,BelliSI,etal.五/附enawax/附aTRAPfamilyproteinEmTFP250:subcellularlocalizationandinductionofimmuneresponsesbyimmunizationwitharecombinantC-terminalderivative.InternationalJournalforParasitology,2004,34:861-872.)。目前抗球蟲藥仍是防治雞球蟲病的主要手段，隨著雞球蟲抗藥性問題的日趨嚴(yán)重以及人們對食品安全的日益關(guān)注，人們期待用更理想的方法代替抗球蟲藥的使用。球蟲活疫苗的成功研制和應(yīng)用提供了一種可代替藥物控制雞球蟲病的技術(shù)手段。但活疫苗不可避免地存在成本高、難保存、散毒及潛在的致病威脅等缺點。隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，DNA疫苗以其獨特的優(yōu)勢顯示其在未來畜禽疫病控制中的誘人前景，它與傳統(tǒng)疫苗相比，具有安全性高、在體內(nèi)維持時間長、制備簡單、具有良好的熱穩(wěn)定性、便于貯藏和運輸、省時省力等優(yōu)點。雞球蟲保護性抗原基因的克隆是基因工程疫苗及核酸疫苗研究的基礎(chǔ)。雞球蟲的生活史復(fù)雜、基因組龐大，不同發(fā)育階段的免疫原性和抗原構(gòu)成都有差異。Jeurissen等(1996)研究表明子孢子是免疫有關(guān)的最重要的發(fā)育階段(JeurissenSHM,JanseEM，VeraieulenAN,etal.加e〃ainfectionsinchickens:aspectsofhost-parasite:interaction.VetImmunolImmunopathol1996;54:231-238.)。EmTFP250是雞巨型艾美耳球蟲子孢子階段抗原，是TRAP(thrombospondin-relatedanonymousprotein)(TSP相關(guān)蛋白)家族的一員，屬于微線蛋白。基因序列全長79卯bp，開放閱讀框7083bp，預(yù)測其編碼246kDa的蛋白。它是雞巨型艾美耳球蟲的一種保護性抗原，在巨型艾美耳球蟲的子孢子和裂殖子階段都能夠表達。能夠產(chǎn)生對巨型艾美球蟲感染的抵抗力(SmithNC，WallachM，MillerCM，etal.Maternaltransmissionofimmunityto附oxfwia:westernblotanalysisofprotectiveantibodiesinducedbyinfection.InfectImmun,1994,62:4811-4817.)。球蟲感染雞后，既可引起體液免疫應(yīng)答也可引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，體液免疫主要通過腔上囊B淋巴細(xì)胞實現(xiàn)，細(xì)胞免疫主要是通過依賴胸腺的T淋巴細(xì)胞實現(xiàn)。分別摘除胸腺和腔上囊的實驗結(jié)果表明抗體作用居于次要地位，而細(xì)胞免疫居于主要地位。T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)在球蟲免疫應(yīng)答中處于核心地位，T細(xì)胞反應(yīng)與整個抗球蟲免疫效應(yīng)的表達過程密切相關(guān)。近年來的研究表明，作為控制雞球蟲病的新型策略---DNA免疫能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生長期的體液和細(xì)胞免疫抵抗多種疾病，包括球蟲病。雞感染球蟲后會產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子多數(shù)在體內(nèi)或體外有抑殺球蟲的作用，研究較多的是雞Y干擾素(chIFN-Y)和雞白介素2(chlL-2)。雞Y干擾素的產(chǎn)生及其活性雖然沒有特異性，但據(jù)Kaspers的研究(KasperB，LillehojHS,JenkinsMC,etal.Chickeninterferon-mediatedinductionofmajorhistocompatibilitycomplexClassIIantigensonperipheralbloodmonocytes.VetImmunolImmunopathol1994;44:71-84.)，它可以通過激活淋巴細(xì)胞和促進主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類抗原的表達來調(diào)節(jié)特異性免疫。雞Y干擾素在體外可抑制雞成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)五.fe"e/Zfl的發(fā)育。雞IL-2是另一個重要的細(xì)胞因子，雞初次和再次感染"cen;M""a，脾和十二指腸的IL-2mRNA顯著增多，也使十二指腸TCR1細(xì)胞的百分比升高。Gaarter等(CaarterLL,etal.RegulationofTcellsubsetsfronmnativetomemory.JImmunol.1998;21(3):181-187.)報道在感染第3天和第5天給雞注射IL-2可使卵囊排出量降低。這些結(jié)果提示球蟲抗原對雞IL-2的產(chǎn)生具有潛在的刺激作用，而這種細(xì)胞因子具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能，若能誘導(dǎo)它們大量產(chǎn)生，則對宿主抗球蟲感染十分有利。本發(fā)明選擇EmTFP250基因的1071個核苷酸，命名為Em8，該片段位于EmTFP250基因的第6240位到7310位核苷酸，編碼357個氨基酸，具有較高的抗原指數(shù)和集中的T細(xì)胞表位。并利用雞IL-2基因作為佐劑連接到球蟲抗原基因上，旨在增強DNA疫苗的免疫效果。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種有預(yù)防或治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗。該DNA疫苗編碼雞巨型艾美耳球蟲子孢子階段抗原，編碼的抗原具有較高的免疫原性，含有集中的T細(xì)胞表位。并且連接有chlL-2基因作為免疫佐劑。將chlL-2基因與球蟲保護性基因一起引入真核質(zhì)粒，能夠進一步增強所述球蟲保護基因的免疫保護效果。本發(fā)明提供一種有預(yù)防或治療雞球蟲病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，該疫苗包含其中插入雞巨型艾美耳球蟲子孢子表面抗原EmTFP250的一個基因片段Em8，其核苷酸序列為SEQIDNO.l的第1-1071個堿基。該DNA疫苗還包含雞白細(xì)胞介素-2(chlL-2)基因，其核苷酸序列分別為SEQIDNO.l的1090-1521第個堿基，并在chlL-2基因的5'端引入了一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.l的第1072-1089個堿基。chlL-2基因、chlL-2基因的5，端引入的一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因與子孢子抗原基因片段Em8連接在一起組成一融合表達載體pVAX-Em8-IL-2。所述的真核質(zhì)粒載體為pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。該DNA疫苗可以在制備預(yù)防或治療雞球蟲病的藥物制劑中應(yīng)用。有益效果本發(fā)明部分建立在本實驗室下列發(fā)現(xiàn)之上含有巨型艾美耳球蟲子孢子表面抗原EmTFP250的一個基因片段Em8的真核質(zhì)粒載體能夠為雞提供針對巨型艾美耳球蟲的有效免疫保護；將chlL-2基因與球蟲保護性基因一起引入真核質(zhì)粒，能夠進一步增強所述球蟲保護基因的免疫保護效果。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種生產(chǎn)雞巨型艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法。簡而言之，其技術(shù)路線如下1.克隆巨型艾美爾球蟲抗原Em8并進行測序。2.構(gòu)建雞巨型艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2(構(gòu)建流程見附圖2-5)3.重組質(zhì)粒在雞體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的檢測4.雞免疫保護性實驗本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果1.該疫苗是DNA疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比，具有安全性高、在體內(nèi)維持時間長、制備簡單、熱穩(wěn)定性良好、便于貯藏和運輸、使用省時省力等優(yōu)點。2.在雞球蟲的一個生活周期中，子孢子階段和裂殖子階段蟲體對宿主的病理損傷最為嚴(yán)重，該階段抗原的免疫原性也最強。在巨型艾美耳球蟲的子孢子和裂殖子階段都能夠表達。該疫苗包含的雞巨型艾美耳球蟲基因Em8在巨型艾美耳球蟲的子孢子和裂殖子階段都能夠表達，因此該疫苗能夠誘導(dǎo)全面的、強烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)。3.T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)在抗球蟲免疫應(yīng)答中處于核心地位。該疫苗所選用的基因片段，編碼集中的T細(xì)胞表位，能夠特異性地誘導(dǎo)抗球蟲T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。4.雞感染球蟲后會產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，包括chlL-2。這些細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，并且多數(shù)在體內(nèi)或體外有抑殺球蟲的作用。該疫苗含有chlL-2基因，增強了該疫苗的免疫保護效果。試驗證明，免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2在抗球蟲感染中，具有良好的免疫保護效果。圖1為本發(fā)明雞巨型艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2的結(jié)構(gòu)示意2為重組質(zhì)粒pMD18-T-Em8的構(gòu)建流程3為重組質(zhì)粒pMD18-T-IL-2的構(gòu)建流程4為重組質(zhì)粒pVAX-IL-2的構(gòu)建流程5為重組質(zhì)粒pVAX-Em8-IL-2的構(gòu)建流程6為RT-PCR法檢測免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2疫苗在肌肉中的轉(zhuǎn)錄M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000;8.RT-PCR法檢測DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2在肌肉中的轉(zhuǎn)錄(Em8基因引物)具體實施方式基礎(chǔ)材料1.孢子化卵囊江蘇株雞巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊(索勛，李國清.雞球蟲病學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998.)，每三個月經(jīng)雞體復(fù)壯并孢子化，孢子化率在80%以上。2.實驗動物0日齡試驗雞購自南京種雞場，自出殼至實驗結(jié)束時飼養(yǎng)在嚴(yán)格消毒，無球蟲的環(huán)境中，自由采食和飲水。3.質(zhì)粒與菌種宿主菌五.co/ZDH5a、BL21(Invitrogen公司)，真核表達載體pVAXl、(Invitrogen公司)；pMD18-Tvector克隆載體，購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司.pcDNA3.1b-TA4-IL-2質(zhì)粒(QianmingXu，XiaokaiSong,LixinXu,RuofengY叫MohammedAliA.Shah,XiangruiLi.VaccinationofchickenswithachimericDNAvaccineencodingEimeriatenellaTA4andchickenIL-2inducesprotectiveimmunityagainstcoccidiosis.VeterinaryParasitology,2008，156(3-4):319-323)。4.工具酶與試劑Trizol試劑為Promega公司產(chǎn)品；DEPC為Amresco公司產(chǎn)品；p-巰基乙醇為Fluka公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、01igo(dT)18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000、T4DNALigase、限制性內(nèi)切酶，水飽和酚、瓊脂糖膠回收試劑盒均為大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。5.主要儀器設(shè)備冷凍臺式離心機(Eppendorfcentriftige5417R);紫外可見分光光度計(Bio-Rad);PCR儀(HYBAID公司)；空氣浴搖床(THZ，江蘇太倉市實驗設(shè)備廠)；紫外分析儀(WD-9304C型，北京市六一儀器廠)；電泳儀(DYY-11B，北京市六一儀器廠)。實施例l.Em8基因的制備1.1合成引物利用DNAStar軟件對巨型艾美耳球抗原基因EmTFP250(基因登錄號AY239227)進行抗原性分析和T細(xì)胞表位預(yù)測，選定抗原指數(shù)較高和T細(xì)胞表位比較集中的一段序列，命名為Em8，該序列有1071個核苷酸(為SEQIDNO.l的第1-1071個堿基)，編碼357個氨基酸，位于EmTFP250基因的第6240位到7310位。利用軟件primerpremier5.0設(shè)計Em8基因片斷的引物P1、P2，并送往大連寶生物(TaKaRa)合成引物。序列如下Pl:5'-TAAGCTTATGCGTGAGGACACCGCT-3';P2:5'-AGGATCClCCTACCCTCGAl1CTGAATGTCGCCG-3'其中下劃線部分分別為引入的酶切位點HindIII和^/mHI。為構(gòu)建串聯(lián)細(xì)胞因子的重組質(zhì)粒，加入凝血因子Xa特異性水解序列編碼核苷酸序列(方框部分)。1.2雞巨型艾美耳球蟲子孢子總RNA的提取采用一步法提取孢子化卵囊總RNA，具體操作步驟如下取純化的雞巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊約107個分別置于用DEPC處理過的無核酸酶的玻璃勻漿器中，加入lmlTrizol試劑，迅速研磨5分鐘。將勻漿后溶液置于1.5mlEppendorf管中，室溫下溫育5min，加入200nL氯仿，劇烈震蕩混勻靜置10min;4°C，12000r/min離心15min，分三相，吸取上層水相轉(zhuǎn)至新的Eppendorf管中，加入500pL異丙醇，混勻室溫靜置10min沉淀RNA，隨后4°C12000r/min離心15min,去上清，加入75%乙醇洗滌沉淀兩次，然后12000r/min離心5min。棄去液體待管壁稍干燥后加入用25pL無RNA酶DEPC處理的超純水水溶解沉淀。紫外分光光度計測定RNA的含量及純度。1.3cDNA的合成以上述的總RNA為模板，用oligodT18為引物進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20^L:總RNA7nL，oligodTpL，混勻后75。C變性5min，迅速冰浴5min，再加入下列成分5xRTBuffer4^L，MgCl2(25mM)2.0nL，dNTP(10mM)2.0pL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/nL)1.0nL，RNasin(40U/pL)l.OpL，無RNase水補至20pL。充分混勻，42°C反應(yīng)lh。95°C5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。1.4Em8基因PCR擴增以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用以下反應(yīng)體系進行PCR:cDNA模板2.5pL，10xPCRBuffer2.5nL，MgCl2(25mM)1.5nL，上游引物Pl(50pM)0.5^L，下游引物P2(50pM)0單，dNTP(2.5mM)l攀，Taq酶(5U"L)0.5^iL,補加滅菌超純水至25pL，充分混勻，于PCR儀上94。C預(yù)變性3min，94。C變性45sec，56。C退火45sec，72。C延伸60sec，30個循環(huán)，72。C延伸10min。1.5Em8基因的克隆(圖2)取上述獲得的PCR產(chǎn)物25pl，1%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，反應(yīng)體系如下PCR回收產(chǎn)物4.5nlpMD18-T載體0.5plLigationsolutionI5.0(ol總體積nnp-將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后16。C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆菌，提取質(zhì)粒，用BamHI和HindUJ雙酶切鑒定為陽性。大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司測序表明，擴增得到Em8基因。實施例2.免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2的構(gòu)建的構(gòu)建2.1重組質(zhì)粒pMD18-T-IL-2的構(gòu)建2丄1引物合成根據(jù)雞IL-2(chlL-2)公開的核苷酸序列(GenBank登記號AF000631)，利用軟件primerpremier5.0設(shè)計特異性引物P3、P4，并送往大連寶生物(TaKaRa)合成引物。序列如下P3:5'-CTGGATCCATGTGCAAAGTACTGAT-3';P4:5'-TTCTAGATTATTTTTGCAGATATCTCAC-3'其中下劃線部分分別為引入的酶切位點5amHI和Xbal。2.1.2IL-2基因的PCR擴增在薄壁PCR管中加入下列成分進行PCR擴增質(zhì)粒pcDNA3.1b-TA4-IL-21.0^12.5mmol/LdNTP2羊P1(P3)(50pmo1)l単P2(P4)(50pmol)LOpl10xPCRbuffer2.5pl25mmol/LMgCL22.5plTaqDNA聚合酶(5U4iD0.5^dddH2014.5pl-將上述成分離心混勻后，于PCR儀上94。C變性3min;94°C45sec,60°C45sec,72°C45sec,共30個循環(huán)；然后72"延伸10min。2丄3IL-2基因的克隆(圖3)取上述獲得的PCR產(chǎn)物25pl，1%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接，反應(yīng)體系如下PCR回收產(chǎn)物4.5^1pMD18-T載體0.5^LigationsolutionI5.0jxl總體積nnp將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后16'C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ct，挑取陽性克隆菌，提取質(zhì)粒，用BamHI和XbaI雙酶切鑒定。2.2重組質(zhì)粒pVAX-IL-2的構(gòu)建(圖4)分別用BamHI和Xbal雙酶切克隆質(zhì)粒載體pMD18-T-IL-2和pVAXl，回收IL-2目的基因和pVAXl大片段，按照合適比例進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用BamHI和XbaI雙酶切鑒定，確定為pVAX-IL-2。2.3重組質(zhì)粒pVAX-Em8-IL-2的構(gòu)建(圖5)分別用HindIII和BamHI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pMD18-T-Em8和pVAX-IL-2，回收Em8目的基因和pVAX-IL-2大片段，按照合適比例進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用HindIII和BamHI雙酶切鑒定，確定為pVAX-Em8-IL-2。實施例3.RT-PCR檢測疫苗pVAX-Em8-IL-2在雞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄大量提取pVAX-Em8-IL-2重組質(zhì)粒，經(jīng)胸部肌肉注射14日齡雛雞(10(^g/只)，7天后分別取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)。一步法提取肌肉總RNA，加入DNaseI除去殘余的重組質(zhì)粒和基因組DNA，用RT-PCR法擴增目的基因。結(jié)果表明DNA疫苗在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)錄(見圖6)。實施例4.免疫保護性實驗4.1實驗設(shè)計對14日齡實驗雞逐只稱重，淘汰偏重和偏輕的個體，隨機分組并調(diào)整個實驗組間的總體重或平均體重。使他們接近一致，每組30只。使各組雞的體重接近且均勻分布，所有雞自由采食和飲水。14日齡首次免疫，劑量為100ug/雞，21日齡進行加強免疫，劑量同上。兩次免疫部位均為雞腿部肌肉注射。28日齡稱重后經(jīng)口服感染巨型艾美爾球蟲江蘇株孢子化卵囊，劑量為10萬個/羽。35日齡剖殺所有試驗雞，稱重、小腸病變記分、分離小腸中的卵囊、記數(shù)各組的OPG。另設(shè)感染非免疫和非感染非免疫兩個對照組。4.2免疫保護效果的觀察4.2.1增重效果注射重組質(zhì)粒前，逐羽稱雞體重，然后分別在接種卵囊時和宰殺時(即接種卵囊后第7天)逐羽稱重，觀察注射后至接種卵囊前、以及接種卵囊后到宰殺時雞體重變化情況，然后計算平均增重和相對增重。平均增重1=攻蟲時重一首免時重平均增重2=宰殺時重一攻蟲時重相對增重率=(試驗組增重率/非感染非免疫組增重率)X100%4.2.2卵囊計數(shù)按麥克馬斯特法計算卵囊，具體為攻卵囊后第7天，宰殺全部試驗組雞，逐羽取其小腸中段內(nèi)容物，各取2g，加10mL水?dāng)噭蛑瞥?0倍稀釋液，然后再加50mL飽和食鹽水，混勻后立即取糞液充滿兩個計數(shù)室，靜止12mins，鏡檢計數(shù)兩個計數(shù)室的卵囊數(shù)。計數(shù)室容積為lXlX0.15=0.15mL，0.15mL內(nèi)含糞便2X0.15/(10+50)=0.005g，兩個計數(shù)室則為O.Olg，所得卵囊數(shù)乘100即為OPG值。4.2.3小腸病變計分攻卵囊后第7天，宰殺全部試驗雞，逐羽觀察小腸中段病變，并進行小腸病變記分。即將小腸病變分為0-+4五個等級。0分正常，無肉眼病變；+1分小腸中段漿膜面隱約可見出血點，腸腔中有少量桔黃色粘液，腸管形狀不見異常；+2分小腸中段漿膜有多量出血點，腸腔中見有多量桔黃色粘液，腸壁增厚；+3分小腸充氣，腸壁增厚，粘膜面粗糙，小腸內(nèi)容物含有小血凝塊和粘液；+4分小腸充氣明顯，腸壁高度增厚，腸內(nèi)容物含有大量血凝塊和紅褐色血液。死亡雞只也記+4分。4.2.4抗球蟲指數(shù)(ACI)ACI是包括存活率、增重、病變、卵囊產(chǎn)量等多項參數(shù)，綜合評定后作為判定球蟲耐藥性或藥物效力的指標(biāo)，也可用于球蟲疫苗保護效果檢測的指標(biāo)。但是，不同的研究者在計算ACI采用的參數(shù)指標(biāo)、計算方法和判定標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，我們采用如下ACI判定公式進行判定ACI=(存活率+相對增重率)一(病變值+卵囊值)存活率=(試驗結(jié)束時存活雞只數(shù)/試驗組雞只數(shù))X100%相對增重率=(試驗組增重率/非感染非免疫組增重率)X100%病變值(040)=各試驗組的平均病變記分(04)X10卵囊值(040)，換算標(biāo)準(zhǔn)見表l。以ACIS180為保護效果明顯，ACI=160179為保護效果一般，ACK160為無保護效果。表1卵囊數(shù)換算為卵囊值的標(biāo)準(zhǔn)各試驗組腸內(nèi)容物卵囊數(shù)/感染非免疫組腸內(nèi)容物卵囊數(shù)(％)卵囊值小于1.00<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.3免疫保護效果分析從表2中可以看出，感染非免疫組的ACI值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于160，說明這組未產(chǎn)生任何保護效果。而免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2的ACI值達到了172.75，具有較好的免疫保護效果。表2免疫雞攻￡.wo3dma后的抗球蟲指數(shù)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>用pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax代替真核質(zhì)粒載體為pVAXl本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易做到。大家都知道，作DNA疫苗，真核表達載體差別不是太重要，關(guān)鍵是目的基因，有了pVAX-Em8-IL-2，就很容易得到pcDNA3.0-Em8-IL-2，pcDNA3.1-Em8-IL-2和pcDNA4/ffisMax-Em8-IL-2，而且免疫保護效果不會差別太大。序列表<110〉南京農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉預(yù)防雞巨型艾美耳球蟲的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗〈130〉說明書〈140〉00<141〉2008—11—08〈160〉6<170〉Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉1521<212>DNA<213〉融合〈220〉〈221〉疫苗表達載體pVAX-Em8-IL-2〈222〉(1)..(1521)〈223〉<400〉13tgCgtg8ggacaccgcttgcggcgtgacggeigtscgaggagtgc3gc肌gccggcgaac60aacgcctttgtctgcacaccttggagtg^tgctcgg卿卿8gg3gCgg卿8CgtgC120accatccgcaa犯acggtcttgttcagacacgtc肌gaattcagaacatgcagtgtagax:180atcgccacaacttgcggcgatttcggcgcatggtctgaatgcaacgctgagggcttgcat240cagcgcagtctcgagaaatgccccgacgtc3tCg3ggtCgcaacttgcggC3gtg3gg3t300tgcccgccattcggcgagtggactgaatgcggcgttccaggcgttctcgc360caacgcattgactgcgttgaatctgcagcctgccagtgcagagctgcttc420gacaccgaattgcaccccatccceigcccccggtacgg犯acaggcgaagg聊ggg卿g480accga^caggcg肌ggcgsaactggtg肌gc服gtggcgagg卿gcgagcaaBC3gga540g犯ggcg卿tgcagccccc卿柳卿gcttcctgggg3g服tgtaactgagcctgag600g卿agcctggaggttactg郷Ctg3gggt660gagggt^ctcagcctgaggagacacctgagcagcctgttg3gggt3C720ggcaagcaggagtctgaggctgcccccgaaactcctgccgtccagccaaaacca印ggag780ggtcacgaacgcccagaacccgat柳ggagg娜卿卿cggcggcttc840ccaacagctgcagtggcagg鄉(xiāng)tgttggtggtgtgttgctcatagctgctgtaggtggt900ggtgttgC3gccttcactagcggcggaggtggcgctggcgC3C3gg3ggCagaacaggtc恥0ggigttcg卿gag犯ga^ccggagragcaactgccgagacacctgaagccgatacagtt1020atcgacatcacagacgai8g3cgactactgggccgacagcggcgacattca1080agg卿tCCELtgatgtgcaa3g"ta^tg3tctttggctgtatttcggtegcaatgctaatg1140actacagctt3tgg3gcatctctatcatcagaaaaatggsaaactcttcaaacattaata1200aaggatttsgatctcgagct1260etctgagacccccagcaaaictctgcagtgtt獄tggg卿agtggttact1320a^ctg朋gatgacactg肌aatttgtaactgctattcaa1380agaacctca^gagtcttacgggtctaaatcacaccggsagtg33tgC肌g1440atctgtgaagctaacaacaag船aa3atttcctgattttctccatgaactgaccaacttt1500gtgagatatctgcaa^aata1521〈210〉2〈211〉506〈212〉PRT<213>融合〈220〉〈221〉Em8--Xa-IL-2氨基酸序列〈222〉(1)..(506)〈223〉〈400〉2Met1LysGluGinCys65GinGlyProAlaHis145ThrGluGlyGluGin225GlyLysLysValPhe305GluAlaSerLeuGly385LysArgProLysThr50GlyArgSerGluAla130ProGluGinGluGlu210ProLysProLysGly290ThrPheAspGlylie370AlaAspGluAlaLys35ArgAspSerGluGlu115CyslieThrThrSer195GluGluGinGluGlu275GlySerGluThrAsp355PheSerLeuAspAsn20GluGinPheLeuAsp100GlyGinProGlyGly180ValValGluGluGlu260GluValGlyGlyVal340lieGlyLeuGluThr5AsnArgGluGlyGlu85CysMetCysAlaGlu165GluThrThrThrSer245GlyGlyLeuGlyGlu325lieGinCysSerlie405AlaAlaArgPheAla70LysProArgThrPro150GlyGlyGluGluPro230GluHisGlyLeuGly310AspAsplielieSer390LeuCysPheThrArg55TrpCysProSerGlu135GlyGluGluProPro215GluAlaGluGlylie295GlyThrlieGluSer375GluGluGlyValCys40ThrSerProPheArg120ValThrThrValGlu200GluGinAlaArgPhe280AlaAlaGlyThrGly360ValLysAsnValCys25ThrCysGluAspGly105GinGluGluGlyGin185GluGluProProPro265ProAlaGlyAlaAsp345ArgAlaTrplieThr10ThrlieSerCysVal90GluArgSerThrGlu170ProLysLysValGlu250GluThrValAlaAla330GluGlyMetLysLys410GluProArgValAsn75lieTrplieCysGly155AlaProProProGlu235ThrProAlaGlyGin315ThrAspSerLeuThr395AsnTyrTrpLysAsp60AlaGluThrAspPhe140GluGlyGluGluGlu220GlyProGluAlaGly300GluAlaAspMetMet380LeuLysGluSerAsn45lieGluValGluCys125AspGlyGlyGluGlu205GluThrAlaGluVal285GlyAlaGluTyrMet365ThrGinlieGluGlu30GlyAlaGlyAlaCys110ValThrGluGluGlu190GluGlyGluValGlu270AlaValGluThrTrp350CysThrThrHisCys15CysLeuThrLeuThr95GlyGluGluGlyGlu175LeuLeuValGluGin255GluGlyAlaGinPro335Ala■LysAlaLeuLeu415SerSerValThrHis80CysValSerLeuGlu160GlyProProThrGlu240ProGluGlyAlaVal320GluAspValTyrlie400GluLeuTyrThrProThrGluThrGinGluCysThrGinGinThrLeuGin420425430CysTyrLeuGlyGluValValThrLeuLysLysGluThrGluAspAsp435440445lieLysGluGluPheValThrAlalieGinAsnlieGluLys455460ThrGlyLeuAsnHisThrGlySerGluCysLys470475480AsnAsnLysLysLysPheProAspPheLeuHisGlu485490495ValArgTyrLeuGinLys505ThrGlu450AsnLeu465lieCysLysGluGluLysSerLeuGluAlaLeuThrAsnPhe500325DNA人工合成Em8基因片斷的引物Pl(l)..(25)<210〉<211><212><213〉<220><221><222><223><400>3taagcttatgcgtgaggacaccgct25<210>432DNA人工合成Em8基因片斷的引物P2(l)..(32)<211><212><213>〈220>〈221><222><223><400>4aggatxccctaccctcgatctgaatgtcgceg32<210>5<211>25〈212〉DNA<213>人工合成<220><221>引物P3〈222>(1).(25)〈223〉<400>5ctggatccatgtgcaaagtactgat25<210>628DNA人工合成〈211><212>〈213><220>〈221〉<222〉〈223〉<400>引物P4(1)…(28)6ttctagattatttttgeagatatctcac28權(quán)利要求1、一種雞巨型艾美耳球蟲免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，該疫苗包含其中插入的雞巨型艾美耳球蟲子孢子表面抗原EmTFP250的一個基因片段Em8，其核苷酸序列為SEQIDNO.1的第1-1071個堿基。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其中進一步還包含雞白細(xì)胞介素-2即chlL-2基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.l的第1090-1521個堿基，并在chlL-2基因的5'端引入了一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因，其核苷酸序列為SEQIDNO.l的第1072-1089個堿基。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA疫苗，其中chlL-2基因、chlL-2基因的5'端引入的一段凝血因子Xa特異性水解序列的編碼基因與權(quán)利要求1所述雞巨型艾美耳球蟲子孢子表面抗原EmTFP250的一個基因片段Em8連接在一起，組成疫苗表達載體pVAX-Em8-IL-2，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。4、根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的DNA疫苗，其中所述的真核質(zhì)粒載體為pVAXl、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA4/HisMax。5、權(quán)利要求1-4中任一項所述的DNA疫苗在制備預(yù)防或治療雞球蟲病的藥物制劑中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種雞巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)DNA疫苗，屬于生物獸藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆出了雞巨型艾美耳球蟲子孢子階段抗原EmTFP250的一個基因片段Em8，該片段具有較高的抗原指數(shù)和集中的T細(xì)胞表位。將該基因片段和雞白細(xì)胞介素-2(chIL-2)基因進行串連，構(gòu)建了疫苗表達載體pVAX-Em8-IL-2。該疫苗包含有多個T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件，具有安全性高、在體內(nèi)維持時間長、制備簡單、熱穩(wěn)定性良好、便于貯藏和運輸、使用省時省力等優(yōu)點。試驗證明，免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX-Em8-IL-2在抗巨型艾美耳球蟲感染中，具有良好的免疫保護效果。文檔編號A61K39/012GK101396556SQ20081023498公開日2009年4月1日申請日期2008年11月12日優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日發(fā)明者嚴(yán)若峰,宋小凱,宋鴻雁,徐立新,李祥瑞,雷晨昱申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)