專利名稱：制備生物殺鼠劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殺生物劑領(lǐng)域，尤其是以工業(yè)規(guī)模獲得可用于害鼠控制的微生物源殺鼠物質(zhì)的方法及通過此方法得到的物質(zhì)。
在世界各地害鼠引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。它們不僅毀壞莊稼，食品和工業(yè)儲備品，也是傳染性疾病的攜帶者。
因此，對抗這些動物具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，并且也在預(yù)防它們傳播的疾病中起著重要的作用。
鼠害控制有不同的方法，但最常用的是機(jī)械的、化學(xué)的和生物的方法(微生物方法包括在后者中)。
以陷阱，誘餌等為基礎(chǔ)的機(jī)械方法可成功地應(yīng)用于小面積地區(qū)，但它們在大面積區(qū)域效果較差。
化學(xué)方法是以含不同類型毒藥的誘餌的使用為基礎(chǔ)的。上述的一些產(chǎn)品(例如磷化鋅、單氟乙酸鈉1080)具有很明顯的作用，且攝入后會引起立即死亡，但由于必須使用高濃度的非選擇性毒物，它們對其它品種毒性很高。
抗凝物質(zhì)是經(jīng)常使用的化學(xué)方法。第一代的上述物質(zhì)出現(xiàn)在五十年代，其中最常用的是3-α-芐基丙酮基-4-羥香豆素(殺鼠靈)，殺鼠迷，氯鼠酮和敵鼠。當(dāng)使用這些化合物時，鼠死亡發(fā)生在攝取之后5至7天，所以不出現(xiàn)對誘餌的排斥或反應(yīng)。但為了更有效的控制，在處理地區(qū)保持大量誘餌是必要的，因?yàn)檫@些物質(zhì)只在反復(fù)服藥之后才能發(fā)揮其作用，并且鼠必須在幾天之內(nèi)攝取誘餌以達(dá)到致死劑量。
在六十年代中期，對傳統(tǒng)抗凝劑的抗性問題開始出現(xiàn)。這導(dǎo)致了第二代抗凝劑的發(fā)展，如溴敵隆和溴鼠隆(klerat)。
通常，化學(xué)方法的缺點(diǎn)在其重復(fù)作用之后表現(xiàn)出來，鼠不能本能地攝取誘餌，這減低了產(chǎn)品的有效性。另一方面，這些產(chǎn)品對人，家畜和有益的動物群是有害的。
生物方法是以使用控制鼠種群的天敵為基礎(chǔ)的。通常，它們基于用引起傳染性疾病的微生物進(jìn)行鼠類的人工感染，導(dǎo)致動物致死的流行病。這些方法中，特殊的有機(jī)物是對每個動物品種有用的。
為了得到抗鼠的單致病菌株，使用了不同的培養(yǎng)基，其中包括肉胨肉湯，面包和啤酒酵母，牛奶，豌豆，血液，水解血清(肉粉水解液和酵母肉湯水解液)，它們用于培養(yǎng)微生物接種物，上述接種物以后將用于生產(chǎn)主要培養(yǎng)物以得到谷粒制劑。
從谷粒得到的細(xì)菌制劑是在鼠中引起斑疹傷寒的細(xì)菌菌株培養(yǎng)物，其生長在不同的谷物上，其中包括小麥，大麥，大米、燕麥或黑麥。這種在固體培養(yǎng)基上的發(fā)酵比用液體培養(yǎng)基能得到較多的微生物生長量。
本發(fā)明的目的是提供制備用于害鼠控制的高效微生物殺鼠劑的方法。此方法使我們得到使用的較高滴度的病菌，其保證終產(chǎn)品的高有效性，以及制備時間的減少。本申請的另一目的是用此方法得到的殺鼠化合物。其對鼠類具有高的致病性和病毒性，可引起致命的動物流行病。
本發(fā)明為具殺生物活性的制劑的制備，有三個主要的成分1.腸炎沙門氏菌株。
2.增效的溶液。
3.發(fā)酵用培養(yǎng)基，完全由大米組成。
上述三個組成制劑的成分通過兩個相當(dāng)連貫的步驟而一體化；a.制備含增效物質(zhì)的無菌大米基礎(chǔ)底物并調(diào)節(jié)其pH。
b.得到腸炎沙門氏菌接種物并在a中接種。
通常，步驟開始時選擇并洗滌將用作底物的大米。第一步是分離出在所選大米中的不純物。將13％含水量的大米先于80℃的熱水中洗近20分鐘，并且排干洗滌用水。接著對此底物進(jìn)行消毒步驟，于121℃，1.2巴壓力，消毒35至45分鐘。之后立即冷卻底物并干燥直至其達(dá)含水量20至30％和溫度37℃，然后與含0.9％氫氧化鈉和0.1％殺鼠靈鈉鹽(3-α-芐基丙酮基-4-羥香豆素)的混合溶液混合，邊搖晃邊加入，需15分鐘的時間，其用作制備物致死作用的增強(qiáng)劑。
此時，進(jìn)行混合物的pH調(diào)節(jié)，其應(yīng)在7.4至8之間。
之后立即用腸炎沙門氏菌腸道亞種1亞類，D組菌株(其保藏于這些微生物的可得到的保藏單位)接種得到的底物。此接種以這樣的方式進(jìn)行，使混合物中原始濃度為108菌群形成單位(CFU)/mL的微生物終濃度在以固體狀態(tài)短暫發(fā)酵4小時之后變成109CFU/mL。
為了得到前述步驟的接種物，我們開始進(jìn)行微生物的預(yù)培養(yǎng)，以待發(fā)酵體積1至1.5％的比率將其轉(zhuǎn)移至100L含有營養(yǎng)肉湯的發(fā)酵器中，調(diào)節(jié)發(fā)酵條件為溫度37℃，pH7.4至7.6，在400至600r.p.m.下振蕩和在0.1至1.0v.v.m下通氣。發(fā)酵時間3至5小時并且最終得到滴度在1至2×1010菌群形成單位(CFG)的接種物。
在5至9℃的溫度下，我們最終得到一批殺鼠產(chǎn)品，待加以包裝并儲存；在這些條件下產(chǎn)品的穩(wěn)定性能長時間保持。
上述產(chǎn)品是含用作誘餌的谷粒(小麥，大米、黑麥，燕麥，小米等)的殺鼠化合物。其也含用作增效劑的物質(zhì)，增效劑由氫氧化鈉和3-α芐基丙酮基-4-羥香豆素的混合溶液和滴度為106至109CFU的腸炎沙門氏菌腸道亞種，亞類1，D組菌株接種物組成。
隨后將這樣得到的物料包裝并儲存。
終產(chǎn)品的生物試驗(yàn)顯示出100％致死率，死亡發(fā)生在鼠攝取之后4至12天，這表明了其有效性方面的生物性質(zhì)明顯增加，這主要是由于得到的產(chǎn)品的病毒性和致病性。
作為其主要的性質(zhì)，所述的產(chǎn)品有較高的有效性，以及穩(wěn)定性，可冷凍保存一年，5至15℃保存6個月，在室溫保存30天。
由于本發(fā)明提供了為獲得殺鼠化合物而能擴(kuò)大至工業(yè)水平的方法，為了得到有合適質(zhì)量和穩(wěn)定性的大批量產(chǎn)品其方法限定了足夠的操作和參數(shù)，因此，通過使用本領(lǐng)域已知的機(jī)械設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)上述工業(yè)水平的生產(chǎn)規(guī)模。
實(shí)施例
實(shí)施例1制備接種物將一微滴深度冷凍的腸炎沙門氏菌，腸道亞種，1亞類，D組菌株的培養(yǎng)物加入到富集液體培養(yǎng)基中，將其在180r.p.m.的篩機(jī)中于37℃培養(yǎng)4小時，由此培養(yǎng)得到1010CFU滴度的預(yù)培養(yǎng)物，之后將其轉(zhuǎn)移至含營養(yǎng)肉湯的液體培養(yǎng)基發(fā)酵器中，肉湯組成是細(xì)菌學(xué)胨-5.0g/L營養(yǎng)提取物-1.0g/L酵母提取物-2.0g/LElna -5.0g/L實(shí)施例2殺鼠化合物的機(jī)械化制備作為誘餌和致病菌生長底物的大米是可以散裝提供的，或袋裝的清潔大米。
不純物從大米中分離出來后，將大米放入儲存干凈大米的桶中，每個桶容積17M.T.。
如果大米以干凈的袋包裝提供，將其裝在獨(dú)輪車中送至貨運(yùn)電梯上，電梯將它們直接送至磨粉機(jī)漏斗，地窖中的散裝大米也將用電梯和傳送帶送到那里。
定量的磨粉機(jī)漏斗能裝入容量650kg的大米，控制和保證對所述方法必要的大米的重量，每批以每1小時和5小時交替著進(jìn)行。
含水量13％的大米從定量的磨粉機(jī)漏斗卸到一個容器中，在該容器中將進(jìn)行組成殺鼠化合物的不同組分的整個加工過程。
之后立即注入去礦物質(zhì)的水并在80℃加熱，直至水覆蓋全部大米，保持35分鐘。同時隨著水的注入起動混合機(jī)械裝置。
此機(jī)械作用使在20分鐘內(nèi)洗滌大米成為可能。然后排干用于洗滌的水。
再次保持真空5分鐘，注入80℃的熱水225L。在此期間混合機(jī)保持工作。同時，壓力控制在1.2巴，溫度在121℃，向所述的容器直接注入氣體。當(dāng)在容器中達(dá)到上述參數(shù)時，進(jìn)行無菌處理45分鐘。
然后冷卻大米并干燥直到含水量27％至28％，溫度37℃。
之后立即向容器注入含0.9％氫氧化鈉和0.1％殺鼠靈鈉鹽的混合溶液。當(dāng)注入所述的混合溶液282L時，繼續(xù)此操作60分鐘。繼續(xù)用混合溶液對大米進(jìn)行冷卻處理直到溫度37℃。然后調(diào)節(jié)混合物pH直至7.4到8。
之后，立即注入稀釋的接種物141L，與前面用混合溶液處理的大米混合，直至混合物最終均一。此步驟結(jié)束時，樣品送質(zhì)檢。
然后，裝在容器內(nèi)的產(chǎn)品送至填充機(jī)的磨粉機(jī)漏斗。全部上述循環(huán)必須在6小時內(nèi)完成，使得到1125kg殺鼠化合物成為可能。
權(quán)利要求
1.使用谷物作為誘餌，活性成分是單致病微生物和抗凝劑的微生物殺鼠化合物的制備方法，其特征在于通過在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵腸炎沙門氏菌，腸道亞種1亞類、D組得到高濃度接種物，接著將其用來接種事先與混合溶液混合的誘餌，混合溶液由氫氧化鈉和殺鼠靈鈉鹽(3-α-芐基丙酮基-4-羥基香豆素)組成，混合溶液作為所述化合物的增強(qiáng)劑。
2.根據(jù)權(quán)利村要求1的方法，在37℃，pH7.4至7.6，以400至600r.p.m.振蕩和0.1至1.0v.v.m.通氣條件下，用適當(dāng)?shù)囊后w營養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵3至5小時，得到腸炎沙門氏菌株、腸道亞種、1亞類、D組的高濃度接種物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中預(yù)先選擇并用熱水洗滌含水量13％的大米，于121℃和1.2巴下進(jìn)行35至45分鐘滅菌處理，冷卻并干燥至含水量20至30％和溫度37℃，之后，將大米與含0.9％氫氧化鈉和0.1％殺鼠靈鈉鹽(3-α-芐基丙酮基-4-羥香豆素)混合溶液混合，邊搖晃邊加入混合溶液，混合進(jìn)行15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中隨后再次冷卻混合物并干燥至含水量20至25％，溫度近37℃，將其pH調(diào)節(jié)至7至8。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中以這樣的方法接種底物使得在混合物中微生物的起始濃度是108CFU/mL的底物，在固體狀態(tài)下短暫發(fā)酵4小時之后微生物的最終濃度成為109CFU/mL。
6.用在上述權(quán)利要求中所描述方法制備的殺鼠化合物，其中包括用作誘餌的含水量50至56％的約62.5％谷物，約12.5％的腸炎沙門氏菌腸道亞種、1亞類、D組接種物，將其稀釋使在最終化合物中得到約109CFU的微生物濃度，和約25％含殺鼠靈鈉鹽作為增強(qiáng)劑的混合溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及殺生物劑領(lǐng)域,尤其是以工業(yè)規(guī)模制備微生物源殺鼠物質(zhì)的方法。本發(fā)明提供的方法基于制備所用的物質(zhì),及其用腸炎沙門氏菌株發(fā)酵的方法標(biāo)準(zhǔn)化,上述菌株被用作控制鼠害的殺生物物質(zhì)。本發(fā)明還使用增強(qiáng)所述微生物致死效果的抗凝劑化合物。
文檔編號C12R1/42GK1194781SQ9711164
公開日1998年10月7日 申請日期1997年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月4日
發(fā)明者A·J·阿萊曼阿古斯逖, E·福斯特斯米利安, J·A·夫拉加卡斯特羅, R·艾斯皮諾萊里納, J·G·伯諾特羅麥羅, O·蒙特斯迪奧卡希格勒 申請人:生物醫(yī)藥研究所