專利名稱：重組人淋巴毒素α衍生物a的構建與純化工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組人淋巴毒素α衍生物a構建及其生物工程制備方法。
淋巴毒素α(簡稱LTα)是淋巴細胞激活后產(chǎn)生的一種淋巴因子。它和腫瘤壞死因子α(簡稱TNFα)是哺乳動物體內(nèi)迄今發(fā)現(xiàn)的細胞因子中對病毒感染細胞和腫瘤細胞有直接殺傷作用的僅有的兩個。它們在基因結構、生物學功能上有許多相似之處，所以有人又稱LTα為TNFβ。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)兩者之間也有許多不同之處，例如TNFαLTα體內(nèi)主要來源巨噬細胞 淋巴細胞體內(nèi)半衰期 20分鐘 幾天膜結合方式 信號肽 LTβ受體 TNF RI、II TNF RI、II和LTβR活性形式 同源三聚體 同源三聚體、LTα1LTβ2、LTα2LTβ1基因剔除小鼠表現(xiàn) 對細菌感染敏感外周淋巴組織不發(fā)育自1984年人LTαcDNA被克隆、細菌表達以來，由于重組產(chǎn)物不溶給分離純化帶來極大困難，影響了它的應用開發(fā)。試劑級重組LTα也是近幾年才上市的，價格比FNFα貴。近兩年動物試驗結果表明TNFα和LTα在同樣劑量下對某些腫瘤生長抑制的效果幾乎相仿，但毒性作用LTα比TNFα低，兩者抑瘤譜也不完全一致(LTβ受體)，LTα的體內(nèi)半衰期比TNFα長許多，因此有希望成為腫瘤治療的藥物。
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人淋巴毒素α衍生物及其純化工藝，以便進一步開發(fā)成毒副作用低、治療效果好的抗腫瘤藥物。
人淋巴毒素α(hLTα)活性形式是三聚體，單體由171個氨基酸組成，分子量為18.8kDa左右。hLTα的N端對其活性不重要，而且編碼hLTαN端氨基酸的核苷酸序列大大影向hLTαcDNA在細菌里的表達效率。國外根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子全合成hLTαcDNA或合成N端十幾個氨基酸的核苷酸序列再與hLTαcDNA剩余部分拼接來實現(xiàn)rhLTα的細菌表達。
本發(fā)明根據(jù)hLTα融合蛋白能在細菌里高表達和N端氨基酸對hLTα生物學活性不重要的結論，構建了一種重組人淋巴毒素α衍生物a(生物學符號為rhLTαDa)，它是由改變?nèi)肆馨投舅卅?hLTα)一級結構而得到的一種淋巴因子，該淋巴因子N端缺失27個氨基酸，包括附加上的第一個甲硫氨酸共145個氨基酸，分子量為15kD左右。
構建本發(fā)明的rhLTαDa，包括從人基因文庫中克隆人淋巴毒素α(hLTα)基因，從人T細胞cDNA文庫PCR(聚合酶鏈式反應)擴增得到編碼人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA和引物設計、克隆、表達重組人淋巴毒素α衍生物a，其中，1)編碼人淋巴毒素α(hLTα)成熟蛋白的cDNA核苷酸序列中第26位氨基酸是Thr(ACC)，不同于其它文獻報道中的Asn(AAC)；2)PCR擴增重組人淋巴毒素α衍生物a(rhLTαDa)cDNA的引物設計如下aa29aa33aa34N端引物5’ACA CAT ATG AAA CCG GCT GCT CAC CTG ATC GGA(33mer) Ndcl(T) (C) (T)C端引物5’CCG AAT TCT ACA GAG CGA AGG CTC CAA AG(29mer) EcoRIrhLTαDacDNA與hLTα原型比較，其特點是N端缺失27個氨基酸，加上一個甲硫氨酸密碼子，第29位、33位和34位氨基酸的密碼子改為大腸桿菌偏愛的密碼子。N端引物下方括號內(nèi)的堿基為原密碼子。
PCR擴增的模板來自我們從人T細胞cDNA文庫克隆得到編碼hLTα成熟蛋白的cDNA。幾個PCR產(chǎn)物克隆的核苷酸序列分析都表明第26位的氨基酸是Thr密碼子為ACC，和文獻報道的Asn(AAC)比較有一個核苷酸的差別。
hLTαDacDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoRI雙酶切后插入質(zhì)粒pUC118N轉(zhuǎn)化DH5α受體菌，抽提重組質(zhì)粒作核苷酸序列分析，結果與設計要求符合。
hLTαDacDNA插入表達載體pRSETC的NdeI/EcoRI位點，轉(zhuǎn)化BL-21受體菌。單菌落過夜培養(yǎng)物1∶100接種LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)至Klette讀數(shù)為90時加表達誘導試劑IPTG至終濃度0.4mM，37℃繼續(xù)培養(yǎng)四小時，離心收集菌體，SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)表明rhLTαDa表達量占菌體總蛋白的60-80％。rhLTαDa在大腸桿菌中以包涵體形式存在。
本發(fā)明對rhLTαDa的分離純化建立了一套簡單有效的工藝路線，包括rhLTαDa包涵體溶解、復性和柱洗脫等步驟，其特征是離心收集菌體，將其懸浮于8-15倍體積的Tris緩沖鹽溶液TBS(TBS的配方為0.2mol/L NaCl，0.1mol/L Tris、50mmol/L EDTA，pH7.5)，經(jīng)超聲破碎后，離心收集包涵體，重新懸浮在無菌水中，滴入0.1mol/L NaOH至懸液澄清后，再加40-60mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH9.0)至溶液的pH值為9.0-9.5。復性后的樣品過經(jīng)40-60mmol/L Tris-HCl(pH9.0)預平衡的DE52柱，40-60mmol/L Tirs-HCl，pH9.0-7.0梯度洗脫，收集pH近7.0時的洗脫峰。
洗脫得到的樣品作15％SDS-PAGE，呈現(xiàn)一條帶，分子量約15KD。
HPLCC4柱分析呈現(xiàn)單一的峰，純度在95％以上。等電點在pH6.5左右。
用小鼠L929細胞株細胞檢測rhLTαDa的細胞毒活性，以殺死50％細胞時所用的rhLTαDa的量定為一個活性單位。幾批純化樣品的比活性均高于2×108國際單位/毫克蛋白質(zhì)。
抗hTNFα的抗體不能中和樣品的細胞毒活性。用鼠抗人LTα抗體的Western印跡顯示一條帶。能被抗hLT的單抗中和表明樣品是rhLTα。重組蛋白N端15個氨基酸的序列測定結果與設計相符為(Met)Lys Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser離體試驗表明rhLTαDa對人胃癌細胞株MKN-28和MKN-45生長有抑制作用。
活體試驗對接種于雄性昆明種小鼠的小鼠s180和EC腫瘤細胞的生長抑制率為35％。
實施例根據(jù)本發(fā)明構建獲得rhLTαDa，并對其分離純化，離心收集菌體，將其懸浮于10倍體積的TBS(0.2mol/L NaCl，0.1mol/L Tris，50mmol/L EDTA，pH7.5)，經(jīng)超聲破碎后，離心收集包涵體，重新懸浮在無菌水中，滴入0.1mol/L NaOH至懸液澄清后，再加50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH9.0)至溶液的pH值為9.5。復性后的樣品過經(jīng)50mmol/LTris-HCl(pH9.0)預平衡的DE52柱，50mmol/L Tirs-HCl，pH9.0-7.0梯度洗脫，收集pH為7.0時的洗脫峰。洗脫得到的樣品作15％SDS-PAGE，呈現(xiàn)一條帶，分子量約15KD。HPLCC4柱分析呈現(xiàn)單一的峰，純度為97％。用小鼠L929細胞株細胞檢測rhLTαDa的細胞毒活性，純化樣品的比活性為2.8×108國際單位/毫克蛋白質(zhì)。
權利要求
1.一種由改變?nèi)肆馨投舅卅烈患壗Y構得到的淋巴因子重組人淋巴毒素α衍生物a，其特征為N端缺失27個氨基酸，包括附加上的第一個甲硫氨酸共145個氨基酸，分子量為15kD左右。
2.一種重組人淋巴毒素α衍生物a的構建，包括從人基因文庫中克隆人淋巴毒素α基因，從人T細胞cDNA文庫PCR擴增得到編碼人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA和引物設計、克隆、表達重組人淋巴毒素α衍生物a，其特征在于1)編碼人淋巴毒素α成熟蛋白的cDNA核苷酸序列中第26位氨基酸是Thr(ACC)；2)PCR擴增重組人淋巴毒素α衍生物acDNA的引物設計如下N端引物5’ACA CAT ATG AAA CCG GCT GCT CAC CTG ATC GGA(33mer)C端引物5’CCG AAT TCT ACA GAG CGA AGG CTC CAA AG(29mer)rhLTαDacDNA與hLTα原型比較，N端缺失27個氨基酸，加上一個甲硫氨酸密碼子，第29位、33位和34位氨基酸的密碼子改為大腸桿菌偏愛的密碼子。
3.一種重組人淋巴毒素α衍生物a的純化工藝，包括rhLTαDa包涵體溶解、復性和柱洗脫等步驟，其特征在于離心收集菌體，并將其懸浮于8-15倍體積的Tris緩沖鹽溶液TBS，TBS的配方為0.2mol/LNaCl，0.1mol/L Tris，50mmol/L EDTA，pH7.5，再經(jīng)超聲破碎，離心收集包涵體，重新懸浮于無菌水中，滴入0.1mol/L NaOH至懸液澄清后，再加40-60mmol/L Tris-HCl(pH9.0)緩沖液至溶液的pH值為9.0-9.5，復性后的樣品過經(jīng)40-60mmol/L Tris-HCl(pH9.0)預平衡的DE52柱，40-60mmol/L Tris-HCl pH9.0-7.0梯度洗脫，收集pH近7.0時的洗脫峰。
全文摘要
本發(fā)明的rhLT α Da是以hLT α為原型進行結構改造而獲得的基因工程產(chǎn)物。其核苷酸序列編碼第26位氨基酸的密碼子是ACC(Thr)。以原型hLT α cDNA為模板,經(jīng)PCR擴增獲得rhLT α Da cDNA。引物設計的特征是N端缺失27個氨基酸,將第29、33和34位氨基酸的密碼子改為大腸桿菌偏愛密碼子。rhLT α Da在大腸桿菌中以包涵體形式存在,表達量占菌體總蛋白的60—80%。建立了簡便、有效的rhLT α Da純化工藝,得到的rhLT α Da純度在95%以上,比活高于2×10
文檔編號C12N15/19GK1175638SQ9710660
公開日1998年3月11日 申請日期1997年9月10日 優(yōu)先權日1997年9月10日
發(fā)明者李昌本, 趙壽元, 李平 申請人:復旦大學