專利名稱：通過(guò)修飾淀粉生物合成酶基因的表達(dá)而得到的新型淀粉的制作方法
背景技術(shù)：
淀粉的特征及商業(yè)用途淀粉是兩種多糖-直鏈淀粉和支鏈淀粉的混合物。直鏈淀粉是由多達(dá)幾千個(gè)α-D-吡喃葡萄糖單位通過(guò)α-1,4糖苷鍵連接而成的不分支的鏈。支鏈淀粉是一種高度分支的分子，是由多達(dá)50,000個(gè)α-D-吡喃葡萄糖殘基通過(guò)α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接而成的。支鏈淀粉中有大約5％的糖苷鍵是α-1,6鍵，它會(huì)產(chǎn)生聚合物的分支結(jié)構(gòu)。
由直鏈淀粉和支鏈淀粉分子組成貯存在質(zhì)體中的顆粒。大多數(shù)植物所產(chǎn)生的淀粉粒有15-30％的直鏈淀粉和70-85％的支鏈淀粉。直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例和支鏈淀粉的分支度影響著淀粉的物理和功能特性。諸如明膠化淀粉的粘性和穩(wěn)定性的功能特性決定著其用途，以及淀粉在食品及工業(yè)用途中的價(jià)值。當(dāng)需要特定的功能特性時(shí)，獲自諸如玉米、稻或馬鈴薯的各種作物的淀粉或許可以滿足這種功能性要求。如果一種淀粉不能滿足需要的功能特性，例如，假設(shè)它必須在高溫和酸性條件下具有穩(wěn)定的粘性，則通過(guò)對(duì)該淀粉進(jìn)行化學(xué)改性有時(shí)可取得上述功能性。在淀粉工業(yè)中，采用了各種類型和各種程度的化學(xué)改性，而標(biāo)記和化學(xué)改性淀粉的使用必須滿足政府的規(guī)定。
在含有淀粉的植物器官內(nèi)，直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例和支鏈淀粉的分支度是受遺傳控制的。例如，帶有純合隱性的Waxy(wx)基因的植株缺少顆粒結(jié)合淀粉合成酶，它能產(chǎn)生將近100％的支鏈淀粉。帶有純合隱性直鏈淀粉伸長(zhǎng)(ae)基因的植株可以產(chǎn)生含有高達(dá)90％直鏈淀粉的淀粉顆粒(參見(jiàn)美國(guó)專利US5,300,145)。業(yè)已證實(shí)dull基因可以影響淀粉合成酶和淀粉分支酶的活性水平。
大部分谷類作物均被作為商品，而且工業(yè)上和動(dòng)物飼料對(duì)這些作物的大部分要求均可由被廣泛種植并大量生產(chǎn)的普通品種滿足。不過(guò)，目前，具有無(wú)法由標(biāo)準(zhǔn)組成的谷類滿足的特殊最終用途特性的作物的市場(chǎng)正日益擴(kuò)大。最常見(jiàn)的是，特種玉米和“普通”玉米(又被稱為大田玉米)的區(qū)別在于，它具有改變了的胚乳特性，例如在蠟質(zhì)或高直鏈淀粉玉米中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例的總體變化，在甜玉米中有較多的糖類積累，或在諸如食品級(jí)玉米或爆裂玉米中的胚乳硬度的改變(Glover,D.V.和E.T.Mertz,(1987)見(jiàn)Corn:NutritionalQuality of Cereal Grains；Genetics And Agronomic Improvement,R.A.Olsen和K.J.Frey編，American Society of Agronomy,MadisonWiscousin pp.183-336。Rooney,L.W.和S.D.Serna-Saldivar,(1987)Food Uses of Whole Corn and Dry-milled Fractions，見(jiàn)Corn:Chemistryand Technology,S.A.Watson和P.E.Ramstead編，American Associationof Cereal Chemists,Inc.,St.Paul.Minnesota,pp399-429)。本發(fā)明為特種玉米用戶提供了一種具有不同于蠟質(zhì)淀粉的特性的淀粉來(lái)源，并為農(nóng)民提供了種植比普通玉米或蠟質(zhì)玉米有更高附加值的作物的機(jī)會(huì)。
通過(guò)粉磨處理，能從植物中獲取純化淀粉。玉米淀粉是通過(guò)濕粉磨工藝從其種子中提取的。濕粉磨法是一種多步驟工藝，包括浸泡和研磨種子，以及分離淀粉、蛋白、油和纖維組分。S.R.Eckhoff在“第4屆玉米應(yīng)用大會(huì)匯編(1992年，6月24-26日，St.Louis,M.O，由National Corn Growers Association,CIBA-GEIGY Seed Division和theUnited States Department ofAgriculture印刷)中對(duì)玉米濕粉磨工藝作了綜述。淀粉被用于食品和工業(yè)目的，而且是人類食物中碳水化合物的主要來(lái)源。通常是將淀粉和水混合，并烹制成粘稠的凝膠。淀粉的3個(gè)重要特性是其熬煉溫度，所述凝膠可以達(dá)到的粘度，和長(zhǎng)期保存時(shí)該凝膠粘度的穩(wěn)定性。未改性的淀粉在加熱及冷卻期間的物理特性限制了它在很多場(chǎng)合的應(yīng)用。因此，為了克服淀粉的上述缺陷，并拓寬淀粉在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，需要相當(dāng)大的人力及資金，以期對(duì)淀粉進(jìn)行化學(xué)改性。
在Modified Stavches:Properties and Uses,O.B.Wurzburg編，(1986)CRC Press Inc.,Boca Raton,FL中披露了未改性淀粉的某些局限和改性淀粉的特性。未改性淀粉在食品上的應(yīng)用極為有限，因?yàn)槠涞矸哿Ｈ菀着蛎洸㈤_(kāi)裂，由此形成易碎的、不理想的凝膠體?；瘜W(xué)改性可被用于穩(wěn)定淀粉粒，從而使該淀粉適用于數(shù)千種食品和工業(yè)用途，其中包括嬰兒食品、粉狀咖啡乳、醫(yī)用撒用粉、紙和紗線上漿劑和粘合劑。常用的化學(xué)改性包括交聯(lián)，其中，引入化學(xué)鍵作為淀粉分子之間的穩(wěn)定鍵；還包括取代，其中，將諸如羥乙基、羥丙基或乙酰基的取代基引入淀粉分子中。
化學(xué)改性淀粉在美國(guó)的應(yīng)用受食品與藥品管理署(FDA)的管理?！笆称返矸鄹男缘摹钡矸劭捎糜谑称分校仨殱M足規(guī)定的處理限制，而“工業(yè)淀粉改性的”淀粉可用于諸如與食品接觸的容器的制品中，但是，也必須滿足規(guī)定的處理要求；Code of Federal Regulations，Title 21,Chapter l,Part172,Food Additives Permitted in Food for HumanConsumption,Section172,892,Food Starch Modified,U.S.GovermentPrinting Office,Washington,D.C.1981；(a)Part178,Indirect FoodAdditives、Sect.178.3520,Industrial Starch-Modified。上述規(guī)定通過(guò)限定可用于化學(xué)改性步驟的最大化學(xué)試劑量來(lái)限制化學(xué)改性的程度。對(duì)于由所述改性工藝得到的淀粉中的副產(chǎn)品的含量也有所規(guī)定。例如，特別關(guān)注羥丙基淀粉中的丙氯代醇?xì)埢?Tuschhoff,J.V.(1996)Hydroxypropylated Starches，見(jiàn)Modified Starches:Properties and Uses,D.B.Wurzburg編，CRC Press,Boca Raton,FL,pp.55-57)。通過(guò)對(duì)含有淀粉的植物進(jìn)行分子遺傳學(xué)操作改變淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)已知淀粉分支或聚合度的差異可導(dǎo)致淀粉生理生化特性的改變。業(yè)已證實(shí)，為特殊目的而訂制的淀粉可以通過(guò)改變支鏈淀粉分子的支鏈分布、直鏈淀粉與支鏈淀粉的相對(duì)比例或直鏈淀粉的聚合度而產(chǎn)生。不過(guò)，要實(shí)現(xiàn)淀粉組成的表型改變一直是有問(wèn)題的；盡管淀粉生物合成的關(guān)鍵酶已經(jīng)確定，但其確切作用仍然不明確。因此，特定酶活性與淀粉結(jié)構(gòu)的特定分子特征的相關(guān)性，以致與食品和工業(yè)制品中淀粉功能的相關(guān)性也一直難于確定。盡管可以預(yù)見(jiàn)理想淀粉可能需要的理想的功能特性，但是對(duì)于該淀粉的分子結(jié)構(gòu)是如何實(shí)現(xiàn)上述目的的原理僅有大致的了解，而且對(duì)于特定的淀粉生物合成酶是如何具體影響上述參數(shù)的了解也相當(dāng)少。例如，每一種酶在決定分支方式和分支長(zhǎng)度方面的作用尚不清楚，而且，由于對(duì)淀粉分支酶和淀粉合成酶的相互作用缺乏了解而使這一問(wèn)題復(fù)雜化。
WO94/09144討論了在高溫下具有改善了的合成淀粉能力的植物的生產(chǎn)。該文獻(xiàn)提出，在高溫下谷粒灌漿的限制因素是某些淀粉生物合成酶，特別是淀粉合成酶(SS)和淀粉分支酶(SBE)的不穩(wěn)定性。將編碼其活性具有較高的最佳溫度的酶或?qū)峋哂休^高耐性的酶的基因?qū)胫参?，可以提高淀積在玉米種子里的淀粉量。而且，已提出可將該方法用于產(chǎn)生具有改變了的精細(xì)結(jié)構(gòu)的淀粉，這種改變是由于導(dǎo)入了供體基因而造成的，該基因的表達(dá)可以改變不同淀粉生物合成酶之間的平衡。所推薦的供體基因包括那些編碼與其內(nèi)源酶相比具有改善的動(dòng)力學(xué)或別構(gòu)特性的酶的基因，或所述內(nèi)源基因的一個(gè)額外拷貝，它可以彌補(bǔ)因熱不穩(wěn)定性所致的酶活性的損失。WO94/09144還提出了用有義和反義基因改變受體植物中不同淀粉合成酶和淀粉分支酶的天然比例作為一種改變淀粉結(jié)構(gòu)的方法。該文獻(xiàn)披露了溫度對(duì)某些淀粉生物合成酶的催化活性和酶穩(wěn)定性的影響，不過(guò)，沒(méi)有提供證明所提出的分子方法的數(shù)據(jù)。
最近，由Virgin等在第4屆國(guó)際植物分子學(xué)大會(huì)(the 4thInternational Congress of Plant Moleculer Biology)(1994,6月)上和由Christensen等和Kossman等在植物多糖專題討論會(huì)(the PlantPolysaccharide Symposium)(1994,7月)上報(bào)導(dǎo)了試圖用反義方法在馬鈴薯中抑制SBE表達(dá)的結(jié)果。在任何情況下、雖SBE活性幾乎被完全消除，但直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例依然未改變。Virgin等和Kossman等均報(bào)導(dǎo)支鏈淀粉結(jié)構(gòu)未改變。不過(guò)，Christensen等報(bào)導(dǎo)了支鏈淀粉分子上支鏈分布的變化，其長(zhǎng)的分支數(shù)量增加了。
在馬鈴薯上取得的結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)閮H從其中提純了一種淀粉分支酶，而且，即使在低嚴(yán)緊度條件下，在馬鈴薯基因組DNA的Southern印跡上也僅能檢測(cè)到一個(gè)基因(Kooshnoodi,J.等(1993)FEBS Letters 332:132-138；Kossman.J.，等(1991)Mol.Gen.Genet,230:39-44)。因此，預(yù)計(jì)可導(dǎo)致酶含量明顯降低以及隨之而來(lái)的淀粉分支酶活性下降的馬鈴薯中單一淀粉分支酶的反義抑制，會(huì)導(dǎo)致淀粉組成及淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的可檢測(cè)的、可再現(xiàn)的變化。在文獻(xiàn)中所報(bào)導(dǎo)的相互矛盾的、不一致的結(jié)果表明，與所鑒定的基因有較小同源性的其它淀粉分支酶基因在決定馬鈴薯支鏈淀粉結(jié)構(gòu)方面也許起著一定作用?；蛘撸R鈴薯的淀粉分支酶活性可能由一個(gè)基因編碼，但是，該酶蛋白存在很大余量，以致當(dāng)該酶的活性有90％以上受到抑制時(shí)支鏈淀粉的數(shù)量或結(jié)構(gòu)仍不受影響。
由于已鑒定出了3種SBE同工型而使得玉米中淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化復(fù)雜化。在玉米胚乳中，具有淀粉分支酶活性的3種同工型是SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb。在直鏈淀粉伸長(zhǎng)(ae)突變型中，已發(fā)現(xiàn)缺少SBEⅡb活性，而在dull(du)突變型中，觀察到了SBEⅡa含量的降低(Boyer,C.D.and Preiss,J.(1981)Plant Physiol,67:1141-1145)。對(duì)玉米淀粉分支酶的催化特性所作的研究表明，上述同工型在底物選擇性及其所轉(zhuǎn)移的葡聚糖鏈長(zhǎng)度方面有差異。當(dāng)?shù)孜餅橹辨湹矸蹠r(shí)，SBEⅠ活性較高，且其優(yōu)先轉(zhuǎn)移較長(zhǎng)的糖鏈。對(duì)分支程度更高的底物如支鏈淀粉，則SBEⅡ同工型表現(xiàn)出更高的活性。SBEⅡ優(yōu)先轉(zhuǎn)移較短的葡聚糖鏈(Guan等，(1993)Plant Physiol,102:1269-1273；Takeda等(1993)Carbohydrate Res 240:253-263)。
業(yè)已克隆了一種玉米SBⅠcDNA，并對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序(Baba等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94；Fisher等(1995)Plant Physiol,108:1313-1314)。另外，已分離出一種玉米SBEⅡcDNA克隆，而且，該克隆的核苷酸序列也已公開(kāi)(Fisher等(1993)Plant Physiol.102:1045-1046)。該cDNA克隆定位于ae基因座，證實(shí)了該基因座編碼玉米SBEⅡb的結(jié)構(gòu)基因(Stinard等(1993)Plent Cell5:l553-1566)。
已知從ae突變型中提取的淀粉在結(jié)構(gòu)上不同于從馬齒型玉米中提取的淀粉(Baba等(1984)Agric Biol.Chem.48:1763-1775)。已對(duì)ae等位基因?qū)Φ矸厶匦缘挠绊懽鬟^(guò)研究(Yamada等(1978)Starke30:145-148)。在Waxy(WX)背景中加大ae的劑量可使其凝膠化溫度提高，因此，對(duì)于純合突變型來(lái)說(shuō)，即使在95℃的溫度下也可觀察到淀粉的蒸煮仍不充分。上述作者證實(shí)，與ae wx淀粉相關(guān)的粘度提高是十分理想的，并提出了一種具有介于wx和ae wx之間的特性的“目標(biāo)”淀粉。盡管會(huì)影響玉米SBEⅡa和SBEⅡb含量的突變是已知的，但SEBⅠ結(jié)構(gòu)基因的突變尚有待證實(shí)。SEBⅠ突變型的缺乏可能表明，這種淀粉分支酶同工型對(duì)植物是致死的?；蛘撸琒BEⅠ無(wú)效突變可能會(huì)導(dǎo)致察覺(jué)不到的種子表型的變化，或者這種變化不容易與現(xiàn)有的淀粉突變型區(qū)分開(kāi)。
與更傳統(tǒng)的植物育種方法相比，生產(chǎn)具有改變了的精細(xì)結(jié)構(gòu)的玉米淀粉的分子遺傳學(xué)方法有明顯的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)反義抑制或共抑制方法特異抑制一種或幾種SBE同工型的表達(dá)，可以導(dǎo)致淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的改變。一種反義或共抑制構(gòu)建體可以作為基因活性的顯性負(fù)調(diào)節(jié)物。盡管常規(guī)突變可以導(dǎo)致基因活性的負(fù)調(diào)控，但這種作用更像是隱性的。從育種角度看，由轉(zhuǎn)基因方法實(shí)現(xiàn)的顯性負(fù)調(diào)控可能更為可取。另外，通過(guò)采用特異啟動(dòng)子將改變了的淀粉表型的表達(dá)局限于植物的生殖組織，可以產(chǎn)生比常規(guī)突變好的農(nóng)藝性狀，常規(guī)突變可影響到其中有突變基因正常表達(dá)的所有組織。最后，由染色體位置效應(yīng)所導(dǎo)致的可變水平的反義抑制或共抑制，能夠產(chǎn)生范圍比由玉米胚乳中突變型等位基因的劑量效應(yīng)所致的范圍更寬的淀粉表型。
玉米胚乳中淀粉分支酶組構(gòu)的復(fù)雜性及所報(bào)導(dǎo)的馬鈴薯方面的結(jié)果，使得通過(guò)抑制已知玉米同工型之一的基因表達(dá)而操作淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的嘗試無(wú)法預(yù)測(cè)。所報(bào)導(dǎo)的科學(xué)證據(jù)表明，一個(gè)淀粉分支酶基因的表達(dá)抑制和可檢測(cè)的淀粉分支酶活性的降低，并不預(yù)示著淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的相應(yīng)變化。而且，反義技術(shù)本身也具有不確定性，表現(xiàn)在不了解或不能預(yù)測(cè)究竟是整個(gè)基因或是特異片段以及一個(gè)基因的哪一個(gè)片段在介導(dǎo)強(qiáng)的反義抑制方面影響力最大。某些結(jié)果已表明所述反義基因的強(qiáng)表達(dá)是必須的；不過(guò)，反義轉(zhuǎn)錄物的良好表達(dá)不一定與反義表型的出現(xiàn)及其強(qiáng)度相關(guān)(Bourque,J.(1995)Plant Sci.105:125-149)。盡管已提出了幾種解釋共抑制現(xiàn)象的理論(Flavell R.B.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)91:3490-3496)，但顯而易見(jiàn)的是，用一種機(jī)制似乎不足以解釋觀察到的所有結(jié)果。迄今，已在煙草、Canola、大豆、番茄和擬南芥中報(bào)道過(guò)共抑制作用，上述植物均為雙子葉植物。還沒(méi)有報(bào)導(dǎo)表明這種現(xiàn)象可用于單子葉植物的資料。
雖然能夠抑制SBE基因在玉米中的表達(dá)，但所產(chǎn)生的淀粉表型變化依然無(wú)法預(yù)測(cè)。盡管其酶促步驟是已知的，但淀粉生物合成的分子細(xì)節(jié)尚不十分了解。尚不清楚3種SBE同工型是在淀粉生物合成中起著相同的作用，還是每種同工型在組裝支鏈淀粉分子時(shí)，在獨(dú)立的步驟循專有途徑起著特殊作用。鑒于淀粉分支酶與影向葡聚糖鏈延長(zhǎng)的多種淀粉合成酶之間可能存在相互作用，可基于每種同工型的催化特性對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)做出預(yù)測(cè)。
發(fā)明概述本發(fā)明披露了將一種cDNA克隆用于構(gòu)建能抑制玉米穎果或胚乳中淀粉分支酶酶促活性的有義和反義基因的用途。更具體地講，本發(fā)明涉及一種控制玉米淀粉的支鏈淀粉的支鏈分布、直鏈淀粉與支鏈淀粉的相對(duì)比例和直鏈淀粉組分的聚合度的方法，包括(1)制備一種嵌合基因，該基因包括一個(gè)編碼一種淀粉分支酶結(jié)構(gòu)基因或其片段的核酸片段，該片段的上游沿其有義或反義方向可操作地連接于編碼能指導(dǎo)玉米胚乳組織中基因表達(dá)的啟動(dòng)子的核酸片段上，而其下游可操作地連接于編碼控制轉(zhuǎn)錄終止的合適調(diào)控序列的核酸片段上，和(2)用該嵌合基因轉(zhuǎn)化玉米，其中，與源于不具備該嵌合基因的玉米淀粉的支鏈淀粉分子組分的支鏈分布相比，該嵌合基因的表達(dá)可導(dǎo)致源于所述轉(zhuǎn)化玉米穎果的淀粉的支鏈淀粉分子組分的支鏈分布改變。本發(fā)明還涉及用上述方法通過(guò)轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的玉米品種，從用上述方法產(chǎn)生的一個(gè)玉米品種的穎果中提取的淀粉，以及一種制備增稠的食品的方法，該方法包括混合一種食品、水和有效量的自用上述方法產(chǎn)生的一個(gè)玉米品種的穎果中提取的淀粉，還包括蒸煮所得到的組合物，這一步驟是生產(chǎn)所述增稠食品所必須的。附圖簡(jiǎn)述及序列描述通過(guò)下面的詳細(xì)說(shuō)明和構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的附圖及序列描述，可以更充分地理解本發(fā)明。


圖1是帶有一個(gè)cDNA插入片段的質(zhì)粒pBE240的限制圖，該插入片段包括78bp的5′非翻譯DNA，一個(gè)編碼玉米SBEⅡb編碼區(qū)的2397bp的可讀框，和190bp的3′非翻譯DNA。
圖2是質(zhì)粒pBE44的限制圖，它包括一個(gè)相對(duì)玉米27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子為反義方向的上述pBE240插入片段的414bp的3′片段。
圖3是質(zhì)粒pML103的限制圖，它在構(gòu)建本發(fā)明的嵌合基因時(shí)被用作中間克隆載體。
圖4是特別編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒p35/Ac的限制圖。將該質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞和組織后可以使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和組織產(chǎn)生對(duì)諸如膦絲菌素的除草用谷氨酰胺合酶抑制劑產(chǎn)生抗性。
圖5對(duì)源于普通馬齒形玉米種子、直鏈淀粉伸長(zhǎng)基因(ae)純合的種子的淀粉的RVA曲線和源于pBE44構(gòu)建體純合的種子的淀粉的RVA曲線進(jìn)行了比較，測(cè)定了以攪拌數(shù)量單位(SNU)為單位的粘度和溫度(℃)，并作為時(shí)間(分鐘)的函數(shù)進(jìn)行作圖。
圖6是質(zhì)粒pBE43的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)pBE240插入片段的507bp 5′片段，該片段相對(duì)玉米27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子為反義方向。
圖7是質(zhì)粒pBE45的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)2165bp的接近pBE240插入片段全長(zhǎng)的片段，該片段相對(duì)玉米27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子為反義方向。
圖8是質(zhì)粒pBE96的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)2087bp的接近pBE240插入片段全長(zhǎng)的片段，該片段相對(duì)玉米27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子為反義方向。
圖9是質(zhì)粒pBE68的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)373bp的片段，該片段是pBE65上的玉米SBEⅠcDNA插入片段的3′末端(序列13)，沿反義方向連接于玉米的27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子上。
圖10是質(zhì)粒pBE69的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)570bp的片段，該片段是pBE65上的玉米SBEⅠcDNA插入片段的5′末端，沿反義方向連接于玉米的27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子上。
圖11是質(zhì)粒pBE72的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)2487bp的接近pBE65插入片段全長(zhǎng)的片段，該片段相對(duì)玉米27kd玉米醇溶蛋白為反義方向。
圖12是質(zhì)粒pBE108的限制圖，該質(zhì)粒包括pBE72的一種潮霉素抗性變體。
圖13是質(zhì)粒pBE97的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)1865bp的接近pBE65的SBEⅠcDNA插入片段全長(zhǎng)的片段(序列20)，該片段沿有義方向連接于27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子上。
圖14是質(zhì)粒pBE110的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)編碼全長(zhǎng)SBEⅠ的2565bpcDNA片段，該片段沿相對(duì)玉米10kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子的有義方向連接。
圖15是質(zhì)粒pBE111的限制圖，該質(zhì)粒包括一個(gè)編碼截短了的SBEⅠ的1810bpcDNA片段，該片段沿相對(duì)玉米27kd玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子的有義方向連接。
圖16比較了源于蠟質(zhì)種子、直鏈淀粉伸長(zhǎng)基因(ae)和蠟質(zhì)基因純合的種子的淀粉的RVA曲線和源于含有pBE44構(gòu)建體+蠟質(zhì)基因的種子的淀粉的RVA曲線。測(cè)定了以攪拌數(shù)量單位(SNU)為單位的粘度和溫度(℃)，并作為時(shí)間(分鐘)的函數(shù)作圖。
序列1表示質(zhì)粒pBE240上的cDNA插入片段的核苷酸序列，以及相應(yīng)的完整玉米SBEⅡb酶的氨基酸序列。
序列2表示pBE44的414bp插入片段的核苷酸序列。
序列3和4表示用于制備pBE44的414bp插入片段的PCR引物BE41和BE42。
序列5表示pBE43的507bp插入片段的核苷酸序列。
序列6和7表示用于制備pBE43的507bp插入片段的PCR引物BE39和BE40。
序列8表示pBE45的2165bp插入片段的核苷酸序列。
序列9表示pBE96的2087bp插入片段的核苷酸序列。
序列10和11表示用于制備分離pBE65的2772bp插入片段所用探針的PCR引物BE14和BE15。BE15(序列11)還被用于制備質(zhì)粒pBE79的插入片段。
序列12表示pBE65的2772bp插入片段的核苷酸序列。
序列13表示pBE68的373bp插入片段的核苷酸序列。
序列14和15表示用于制備pBE68的373bp插入片段的PCR引物BE43和BE52。
序列16表示pBE69的571bp插入片段的核苷酸序列。
序列17和18表示用于制備pBE69的571bp插入片段的PCR引物BE46和BE50。
序列19表示pBE72的2487bp插入片段的核苷酸序列。
序列20表示pBE97的1865bp插入片段的核苷酸序列。
序列21表示用于制備pBE83的805bp插入片段的PCR引物BE67。
序列22和23表示用于制備pBE110的PCR引物BE101和BB3。
序列24表示pBE110的2565bp插入片段的核苷酸序列。
序列25表示pBE111的1809bp插入片段的核苷酸序列。
序列描述中用來(lái)表征核苷酸序列的單字母密碼和氨基酸的3字母密碼的定義與公開(kāi)于Nucleic Acids Research 13:3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2):345-373(1984)中的IUPAC-IYUB標(biāo)準(zhǔn)一致，上述文獻(xiàn)被收作本文的參考資料。
詳述本文所披露的內(nèi)容中，使用了很多術(shù)語(yǔ)。在本文中，“淀粉”一詞是指由α-D-(1,4)葡聚糖組成的多糖，它可以含有各種比例的α-D-(1,6)分支。在本文中，“淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)”一詞是指淀粉聚合物的分子結(jié)構(gòu)、聚合物中α-D-(1,6)鍵的存在、豐度和分布，以及分支和不分支的α-D-(1,4)葡聚糖的存在、豐度和長(zhǎng)度。淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)由支鏈淀粉的支鏈分布或直鏈淀粉與支鏈淀粉的相對(duì)比例或直鏈淀粉的聚合度表示。上述結(jié)構(gòu)性分子組分中任一種的變化均可導(dǎo)致淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的改變?？梢韵嗷オ?dú)立地改變上述3種參數(shù)中的一種，兩種或全部?！熬酆隙取币辉~是指一個(gè)分子中或諸如支鏈淀粉的一個(gè)支鏈的一個(gè)分子的特定部分中的α-D-吡喃葡萄糖單位的數(shù)量。
在本文中，“支鏈分布”一詞是指α-1,4連接的葡聚糖鏈的分布，這種分布是在用異淀粉酶消化支鏈淀粉，接著通過(guò)大小排阻層析分離釋出的支鏈之后測(cè)出的。可以按照支鏈的大小和其分布在完整分子上的結(jié)晶區(qū)(存在很多α-1,6-鍵(即分支點(diǎn))的區(qū)域)的數(shù)目對(duì)支鏈進(jìn)行分類。A鏈?zhǔn)遣环种У牟⒖缭揭粋€(gè)結(jié)晶區(qū)。B1鏈也跨越一個(gè)結(jié)晶區(qū)，但它是分支的。B2、B3和B4+鏈?zhǔn)欠种У?，并分別跨越2，3和4或更多的結(jié)晶區(qū)(Hizukuri(1986)Carbohydrate Res.147342-347)。淀粉粒中重復(fù)的結(jié)晶和非晶態(tài)單位的長(zhǎng)度相對(duì)有規(guī)則，從源于多種植物種的淀粉中觀察到的重復(fù)距離均為9nm(Jenkins(1993)Starch/Starke 45:417-420)。因此，A和B1鏈的長(zhǎng)度不足9nm,B2和B3鏈的長(zhǎng)度為18～27nm，而B(niǎo)4+鏈的長(zhǎng)度大于36nm。
在本文中，“核酸”一詞是指一種大分子，可以是單鏈或雙鏈的，由含有糖、磷酸和嘌呤或嘧啶的單體(核苷酸)組成?！昂怂崞巍笔侵敢环N特定核酸分子的一部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)參與DNA中信息向蛋白的傳遞?！盎蚪M”是一種生物中每個(gè)細(xì)胞中所含的全部遺傳物質(zhì)?！昂塑账嵝蛄小笔侵敢环NDNA或RNA聚合物，它可以是單鏈或雙鏈的，可任何含有能摻入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改變了的核苷酸堿基。
在本文中，“基本上類似”是指可能發(fā)生了堿基變化，但不會(huì)導(dǎo)致其所編碼的氨基酸改變的DNA序列，或發(fā)生了能改變一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的堿基變化，但不會(huì)影響由其所編碼的蛋白的功能特性的DNA序列。因此，可以這樣理解，本發(fā)明包括具體示例性序列以外的序列。同樣可行的是能產(chǎn)生沉默突變的序列修飾，如發(fā)生在序列上的缺失、插入或取代，這種修飾不會(huì)明顯影響所產(chǎn)生的蛋白分子的功能特性。例如，體現(xiàn)遺傳密碼簡(jiǎn)并的基因序列改變或?qū)е略谔囟ㄎ稽c(diǎn)產(chǎn)生化學(xué)上等同氨基酸的基因序列改變是可行的；因此，編碼一種疏水氨基酸丙氨酸的密碼子可以被編碼諸如甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的另一種疏水氨基酸殘基的密碼子所取代。類似地，能導(dǎo)致一種帶負(fù)電荷的殘基取代另一種帶負(fù)電荷的殘基，如由天冬氨酸取代谷氨酸的變化，或能導(dǎo)致一種帶正電荷的殘基取代另一種帶正電荷的殘基，如由賴氨酸取代精氨酸的變化，預(yù)計(jì)也可以產(chǎn)生一種生物學(xué)意義上的等同產(chǎn)物。能導(dǎo)致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化同樣可以期望其不會(huì)改變?cè)摰鞍椎幕钚?。在某些?chǎng)合，可能正好希望產(chǎn)生序列的某些突變，以研究這種改變對(duì)蛋白生物學(xué)活性的影響。所提出的修飾的每一種均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，編碼產(chǎn)物保留的生物學(xué)活性的測(cè)定亦為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，本發(fā)明所涉及的“基本上類似的”序列也可以通過(guò)其在嚴(yán)緊條件下(0.1×SSC,0.1％SDS,65℃)與本文列舉的序列雜交的能力確定。
“基因”是指編碼一種特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括該編碼區(qū)前面(5′非編碼區(qū))和后面(3′非編碼區(qū))的調(diào)控序列。“天然基因”是指具有其自身的調(diào)控序列的天然狀態(tài)的基因?！扒逗匣颉笔侵赴ó愒凑{(diào)控序列和編碼序列的基因。“內(nèi)源基因”是指正常存在于其在基因組中的天然基因座上的天然基因?！巴庠椿颉笔侵刚Ｇ闆r下宿主生物中沒(méi)有的、通過(guò)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入的基因。“外源基因”還可以是指正常存在于宿主生物中的，但又被重新導(dǎo)入其基因組中其天然基因座之外的另一基因座的基因，這種變化會(huì)導(dǎo)致一種內(nèi)源基因的編碼序列的一個(gè)或幾個(gè)額外拷貝的出現(xiàn)。
“編碼序列”是指編碼一種特定蛋白的，除非編碼序列以外的DNA序列。
“起始密碼子”和“終止密碼子”是指編碼序列上由3個(gè)相鄰的核苷酸組成的一個(gè)單元，分別由它們規(guī)定蛋白合成(mRNA翻譯)的起始和終止?！翱勺x框”是指由翻譯起始和終止密碼子之間的編碼序列編碼的氨基酸序列。
“RNA轉(zhuǎn)錄物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是該DNA序列的完全互補(bǔ)的拷貝時(shí)，被稱為“初級(jí)轉(zhuǎn)錄物”，它也可以是由初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工所產(chǎn)生的RNA序列?！靶攀筊NA(mRNA)”是指能由細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA?！癱DNA”是指雙鏈DNA，其中的一條鏈互補(bǔ)于mRNA，并由該mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)?！坝辛x”RNA是指一種包括全部或部分mRNA的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”是指一種互補(bǔ)于一種目標(biāo)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分的RNA轉(zhuǎn)錄物，它能通過(guò)干擾目標(biāo)基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRMA的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和/或翻譯而抑制其表達(dá)。反義RNA的互補(bǔ)性可以是針對(duì)特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分的；即5′非編碼序列、3′非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列。另外，在本文中，反義RNA可以包括核酶序列的區(qū)段，它可以增強(qiáng)反義RNA抑制基因表達(dá)的效率?！昂嗣浮笔侵敢环N催化性RNA，它包括序列特異性的內(nèi)切核糖核酸酶。
在本文中，合適的“調(diào)控序列”是指位于編碼序列上游(5′)、中間、和/或下游(3′)的核苷酸序列，由它控制該編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。所述調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸化序列。在人工DNA構(gòu)建體中，調(diào)控序列還可以控制反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性。
“啟動(dòng)子”是指基因上的一段DNA序列，通常位于其編碼序列上游，由它通過(guò)識(shí)別RNA聚合酶和正確轉(zhuǎn)錄所需的其它因子而控制該編碼序列的表達(dá)。啟動(dòng)子還可以含有參與蛋白因子結(jié)合的DNA序列，所述蛋白因子根據(jù)生理或發(fā)育狀態(tài)控制轉(zhuǎn)錄起始效率。它還可以含有增強(qiáng)子元件。
“增強(qiáng)子”是能夠激發(fā)啟動(dòng)子活性的DNA序列。它可以是啟動(dòng)子的天然元件或是插入的外源元件，能提高啟動(dòng)子的含量和/或組織特異性?！敖M成型”啟動(dòng)子是指能在幾乎所有組織中指導(dǎo)基因表達(dá)并表現(xiàn)出很小的時(shí)序和發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。在本文中，“器官特異”或“發(fā)育特異”啟動(dòng)子分別是指幾乎僅能在諸如葉或種子的特定器官或在某一器官的特定發(fā)育階段，如胚胎發(fā)育前期或后期指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
“可操作地連接”是指一個(gè)核酸分子上的若干核酸序列，這些序列相互聯(lián)系，使其中一個(gè)序列的功能受另一個(gè)序列的影響。例如，當(dāng)一個(gè)啟動(dòng)子能夠影響一個(gè)結(jié)構(gòu)基因(即一個(gè)編碼一種淀粉分支酶的基因)的表達(dá)時(shí)，該啟動(dòng)子與該結(jié)構(gòu)基因是可操作地連接的(即該結(jié)構(gòu)基因是受該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)。
在本文中，“表達(dá)”一詞意指由一個(gè)基因編碼的功能性最終產(chǎn)物的產(chǎn)生。更具體地講，“表達(dá)”是指由本發(fā)明的核酸片段轉(zhuǎn)錄成有義(mRNA)或反義RNA，該RNA與細(xì)胞的蛋白質(zhì)裝置結(jié)合，使蛋白產(chǎn)物的含量發(fā)生變化?！胺戳x抑制”是指反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生能夠抑制目標(biāo)蛋白表達(dá)?！俺勘磉_(dá)”是指一種基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物中的產(chǎn)量超過(guò)其在正?；蚍寝D(zhuǎn)基因生物中的產(chǎn)量。“共抑制”是指基本上類似于一個(gè)內(nèi)源基因的基因的表達(dá)可導(dǎo)致該異位基因和內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制。“改變了的含量”是指一種基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物中的產(chǎn)生，在數(shù)量或比例上不同于正常或非轉(zhuǎn)化生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明所期望的表型效應(yīng)，即玉米淀粉中支鏈分布的改變，可以通過(guò)改變，可以通過(guò)改變轉(zhuǎn)基因生物中所產(chǎn)生的基因產(chǎn)物相對(duì)正常的或非轉(zhuǎn)化生物中該基因產(chǎn)物的含量而實(shí)現(xiàn)；包括由反義抑制或共抑制介導(dǎo)的基因表達(dá)的減弱，和由超量表達(dá)介導(dǎo)的基因表達(dá)的加強(qiáng)。
“3L非編碼序列”是指一個(gè)基因的DNA序列部分，包括一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)和任何能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)控信號(hào)。聚腺苷酸化信號(hào)通常以影響向mRNA前體的3′末端加入聚腺苷酸片段為特征。
“轉(zhuǎn)化”是指一種核酸片段轉(zhuǎn)入一種宿主生物的基因組中，導(dǎo)致遺傳學(xué)上穩(wěn)定的遺傳。含有所述轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物被稱作“轉(zhuǎn)基因”生物。
“糊化”一詞是指淀粉?；虻矸哿腋∫旱囊环N不可逆轉(zhuǎn)的物理變化，其特征是淀粉粒膨脹和水化、懸浮液粘度的迅速提高和由該懸浮液生成一種溶膠。這種變化也被稱作蒸煮或明膠化?？s略語(yǔ)“SNU”是指攪拌數(shù)量單位，大致等于10厘泊，它是一種粘度單位。為了轉(zhuǎn)換成SI單位(帕斯卡秒)，用厘泊乘以1000，即，1PaSec=1000cp。因此，1SNU=0.01PaSec?！叭苣z”一詞是指一種流體膠體系統(tǒng)?！罢扯取币辉~是指一種流體的內(nèi)部摩擦參數(shù)，可將其視為流體的稠度(consistency或thickness)。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因玉米植物的構(gòu)建，其中，對(duì)編碼參與淀粉分支的酶的基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，以實(shí)現(xiàn)支鏈淀粉的支鏈分布、直鏈淀粉與支鏈淀粉的相對(duì)比例和淀粉中直鏈淀粉聚合度的變化。上述淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的改變，可導(dǎo)致自所述轉(zhuǎn)基因玉米植物中提取的淀粉的物理特性的變化。淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的這種變化可導(dǎo)致具有有利于食品及工業(yè)應(yīng)用特性的新型淀粉的產(chǎn)生。
業(yè)已分離出很多編碼糖類分支酶的基因，并進(jìn)行了測(cè)序。其中包括源于下列生物的糖原分支酶釀酒酵母(Thon等(1992)J.Biol.Chem.267:15224-15228)、大腸桿菌(Baecker等(1986)J.Biol Chem.261:8738-8743)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Kiel等(1991)Mol.Gen.Genet.230:136-144)、熱溶芽胞桿菌(Kiel等(1992)DNA Seq 3:221-232)、人類(Thon等(1993)J.Biol.Chem.268:7509-7513)、構(gòu)巢曲霉(Kiel等(1990)Gene89:77-84)、天藍(lán)色鏈霉菌(EMBL入藏編號(hào)X73903)、金霉素鏈霉菌(Homerova,D.和Kermanec,J.(1994)Biochem.Biopgys.Acta 1200:334-336)，還包括源于玉米(Baba等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94；Fisher等(1993)Plant Physiol.102:1045-1046)；Fisher等(1995)Plant Physiol.108:1313-1314)、豌豆(Burton等(1995)Plant J.7:3-15)、馬鈴薯(Poulsen,P.和Kreiberg,J.D.(1993)Plant Physiol.102:1053-1054)、木薯(Salehuzzaman等(1992)Plant Mol.Biol.20:809-819)、稻(Kawasaki等(1993)Mol.Gen.Genet.237:10-16；Mizuno等(1993)J.Biol.Chem.268:19084-19091)和擬南芥(EMBL入藏編號(hào)為U18817和U22428)的淀粉分支酶。其中，優(yōu)選玉米淀粉分支酶基因。當(dāng)目的基因的核苷酸序列已知或源于另一種生物的同源基因的序列是已知的時(shí)，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所慣于采用的方法分離該基因?？蓪⒛康幕虻男蛄匈Y料用于制備用來(lái)從合適的基因文庫(kù)中鑒定并分離完整分支酶基因的寡核苷酸探針。該文庫(kù)可以是一個(gè)基因組文庫(kù)，其中，其編碼區(qū)可包含于一個(gè)DNA片段上或包含于幾個(gè)不同的DNA片段上。而且，可以由一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)含子隔離編碼該分支酶的兩個(gè)或兩個(gè)以上的外顯子。另外，所述文庫(kù)還可以是cDNA文庫(kù)，其中，分離到包括作為一個(gè)連續(xù)序列的完整編碼區(qū)的cDNA克隆的可能性較大。在任何情況下，均可通過(guò)與相應(yīng)于目的基因的一個(gè)或幾個(gè)部分的探針的DNA-DNA雜交鑒定合適的克隆。另外，可以制備寡核苷酸引物，并將其用作PCR引物，以便擴(kuò)增并在隨后從基因組DNA或從上述基因組或cDNA文庫(kù)中分離全部或部分分支酶編碼區(qū)。
可以用幾種不同的分析方法測(cè)分支酶的活性。在磷酸化酶激發(fā)試驗(yàn)(Boyer,C.D.和Preiss,J.(1978)Carbohydr Res.61:321-334)中，活性是根據(jù)分支酶激發(fā)磷酸酶a由葡萄糖-1-磷酸生成α-D-葡聚糖的能力而間接測(cè)定的。碘染色試驗(yàn)是基于葡聚糖-多碘化物復(fù)合物的吸收值降低，這種現(xiàn)象是直鏈淀粉或支鏈淀粉分支的結(jié)果(同上)。在第三種試驗(yàn)，即分支鍵試驗(yàn)中，將還原的直鏈淀粉用作底物，而酶的活性是在用異淀粉酶消化產(chǎn)物后通過(guò)測(cè)定還原末端的產(chǎn)生而測(cè)出的(Takeda等(1993)Carbohydr.Res.240:253-262)。Guan和Preiss((1993)Plant Physiol.102:1269-1273)將碘染色試驗(yàn)和分支鍵試驗(yàn)用于區(qū)分玉米中3種淀粉分支酶的催化特性。SBE1在使直鏈淀粉分支方面具有較高活性，而SBEⅡa和SBEⅡb表現(xiàn)出以支鏈淀粉為底物的較高分支速率?？梢愿鶕?jù)其所轉(zhuǎn)移的α-1,4-葡聚糖鏈的長(zhǎng)度進(jìn)一步區(qū)分其同工型SBEⅠ優(yōu)先轉(zhuǎn)移較長(zhǎng)的葡聚糖鏈，而SBEⅡa和SBEⅡb傾向于轉(zhuǎn)移較短的鏈。因此，測(cè)定酶活性的試驗(yàn)可用于確定蛋白的功能活性，基于氨基酸水平的同源性或DNA水平的雜交作用，已將該蛋白確認(rèn)為淀粉或糖原分支酶。還可將其用于鑒定淀粉或糖原分支酶，這種酶用誘變方法做過(guò)處理，該誘變方法是為了鑒定或改變?cè)跊Q定催化特性方面起著一定作用的氨基酸殘基而設(shè)計(jì)的。另外，利用Guan和Preiss的發(fā)現(xiàn)(同上)，可基于底物或產(chǎn)物選擇性將天然或誘變酶分成SBEⅠ或SBEⅡ-樣。
為了改變玉米的淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了一種嵌合基因，其中，編碼淀粉分支酶的基因的表達(dá)受適于在以下場(chǎng)合表達(dá)所述基因的調(diào)控元件的控制1)在希望的植物組織中，2)在能產(chǎn)生最大目的效果的發(fā)育階段，和3)在基因表達(dá)水平上，它會(huì)導(dǎo)致淀粉分支酶功能的改變，使所述表達(dá)影響淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的可檢測(cè)到的、明顯的變化。
外源基因在植物中的表達(dá)方法已相當(dāng)完善(De Blaere等(1987)Meth.Enzymol.143:277-291)。有義或反義分支酶基因在玉米中的適當(dāng)表達(dá)水平可能需要采用使用了不同調(diào)控元件的不同嵌合基因。而且，通過(guò)共抑制或反義抑制而對(duì)內(nèi)源分支酶基因表達(dá)所作的有效調(diào)控，可能需要構(gòu)建包括分支酶有義或反義序列不同區(qū)段的嵌合基因。共抑制和反義方法的廣為人知的不可預(yù)測(cè)性表明，即使使用不同的遺傳構(gòu)建體，但為了鑒定具有理想表型的植株必須對(duì)很多植株進(jìn)行篩選。
用于在轉(zhuǎn)基因植物中啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子可來(lái)自很多來(lái)源，只要所選擇的啟動(dòng)子具有足夠的轉(zhuǎn)錄活性，可通過(guò)在希望的宿主組織中表達(dá)可翻譯的mRNA或反義RNA而完成本發(fā)明即可。例如，用于在多種植物器官中表達(dá)的啟動(dòng)子包括在花椰菜花葉病毒中指導(dǎo)19S和35S轉(zhuǎn)錄物(Odell等(1985)Nature 313:810-812；Hull等(1987)Virology 86:482-493)、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亞基(Morelli等(1985)Nature 315:200-204；Broglie等(1984)Seience 224:838-843；Hererra-Estrella等(1984)Nature 310:115-120；Coruzzi等(1984)EMBO J.3:1671-1679；Faciotti等(1985)Bio/Technology 3:241)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白(Lamppa等(1986)Nature 316:750-752)的啟動(dòng)子。
根據(jù)應(yīng)用目的，可能希望選擇可以在植物一種或幾種器官中表達(dá)的啟動(dòng)子。其例子包括核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亞基的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子(如果希望在光合器官中進(jìn)行表達(dá)的話)，或?qū)ｉT在種子中起作用的啟動(dòng)子。
優(yōu)選的啟動(dòng)子為可以在種子中進(jìn)行特異表達(dá)的啟動(dòng)子。這一點(diǎn)是特別有用的，因?yàn)榉N子是長(zhǎng)期淀粉積累的主要場(chǎng)所。另外，種子特異性表達(dá)可以避免分支酶調(diào)控可能對(duì)非種子器官造成的任何潛在損害作用。種子特異性啟動(dòng)子的例子包括，但不限于種子貯存蛋白啟動(dòng)子。種子貯存蛋白是受到嚴(yán)格調(diào)控的，幾乎僅能在種子中以高度器官特異和階段特異的方式表達(dá)(Higgings等(1984)Ann.Rev.Plant Physiol.35:191-221；Goldberg等(1989)Cell 56:149-160；Thompson等(1989)BioEssays 10:108-113)。而且，不同的種子貯存蛋白可以在種子發(fā)育的不同階段表達(dá)。
目前已有很多用于在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行種子貯存蛋白的種子特異性表達(dá)的例子。其中包括來(lái)自單子葉植物的基因，如編碼大麥β-大麥醇溶蛋白(Marris等(1988)Plant Mol.Biol.10:359-366)和小麥麥谷蛋白(Colot等(1987)EMBO J.6:3559-3564)的基因。另外，可操作地連接于嵌合基因構(gòu)建體的異源編碼序列上的種子特異基因的啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因植物中也保持其時(shí)序及空間表達(dá)方式。上述例子包括將方扁豆蛋白或擬南芥屬2S自蛋白啟動(dòng)子連接于巴西果2S白蛋白編碼序列上，并在煙草、擬南芥或蔓菁中表達(dá)該結(jié)構(gòu)(Altenbach等(1989)Plant Mol.Biol.13:513-522；Altenbach等(1992)Plant Mol.Biol.18:235-245；De Clercq等(1990)Plant Physiol.94:970-979)，用豆類凝集素和豆類β-云扁豆蛋白啟動(dòng)子表達(dá)螢光素酶(Riggs等(1989)Plant Sci.63:47-57)，和用小麥麥谷蛋白啟動(dòng)子表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Colot等(1987)EMBO J.6:3559-3564)。
特別適合于表達(dá)本發(fā)明核酸片段的啟動(dòng)子是來(lái)自幾種已作過(guò)深入研究的玉米種子貯存蛋白基因的啟動(dòng)子，如源于10kD玉米醇溶蛋白基因(Kirihara等(1988)Gene 71:359-370)、15kD玉米醇溶蛋白基因(Hoffman等(1987)EMBO J.6:3213-3221；Schernthaner等(1988)EMBO J.7:1249-1253；Williamson等(1988)Plant Physiol.88:1002-1007)、27kD玉米醇溶蛋白基因(Prat等(1987)Gene 52:51-49；Gallardo等(1988)PlantSci.54:211-281)和19kD玉米醇溶蛋白基因(Marks等(1985)J.Biol.Chem.260:16451-16459)的胚乳特異性啟動(dòng)子。已報(bào)導(dǎo)的上述啟動(dòng)子在玉米中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性(Kodrzyck等(1989)PlantCell1:105-114)可以作為選擇用于在玉米上使用的嵌合基因構(gòu)建體的啟動(dòng)子的依據(jù)。另外，啟動(dòng)編碼淀粉生物合成的酶的基因表達(dá)的啟動(dòng)子可用來(lái)實(shí)踐本發(fā)明。其中，包括蔗糖合成酶基因的5′調(diào)控序列(Yang,N.,-S.和Russell,D.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:4144-4148)和蠟質(zhì)或顆粒結(jié)合淀粉合成酶Ⅰ基因的5′調(diào)控序列(Unger等(1991)Plant Physiol.96:124)。啟動(dòng)子元件可源于其它淀粉合成酶(顆粒結(jié)合及可溶性異構(gòu)型)基因(如果可行的話)，并可源于sh2(Bhave等(1990)Plant Cell2:581-588)和bt2(Bae等(1990)Maydica 35:317-322)基因，該基因的產(chǎn)物構(gòu)成一種酶，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶?？梢杂孟嚓P(guān)的cDNA克隆(Baba等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94；Fisher等(1993)Plant Physiol.102:1045-1046)作為探針實(shí)現(xiàn)編碼淀粉分支酶基因的基因組克隆的分離。這將為分離上述基因的啟動(dòng)子片段提供有用的開(kāi)端。為了組裝SBE構(gòu)建體，其上游序列可以由關(guān)聯(lián)SBEⅡ基因或由SBEⅠ基因提供。
預(yù)計(jì)，將增強(qiáng)子或增強(qiáng)子樣元件導(dǎo)入其它啟動(dòng)子構(gòu)建體之后也可產(chǎn)生較高水平的初級(jí)轉(zhuǎn)錄，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。其中，包括諸如存在于35S啟動(dòng)子上的病毒增強(qiáng)子(Odell等(1988)Plant Mol.Biol.10:263-272)、源于冠癭堿基因的增強(qiáng)子(Fromm等(1989)Plant Cell1:977-984)、或源于任何其它來(lái)源的、在插入可操縱地連接于本發(fā)明核酸片段上的啟動(dòng)子后能產(chǎn)生較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄作用的增強(qiáng)子。
自玉米Adh-1和Bz-1基因中分離的內(nèi)含子(Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)，和玉米Shrunken-1(sh-1)基因的內(nèi)含子1和外顯子1(Maas等(1991)Plant Mol.Biol.16:199-207)也可用于加強(qiáng)導(dǎo)入基因的表達(dá)。用玉米醇脫氫酶(Adh-1)基因的第一內(nèi)含子獲得的結(jié)果表明，當(dāng)把該DNA元件插入異源基因的轉(zhuǎn)錄單位后，mRNA含量可比正常含量提高6.7倍。用玉米肌動(dòng)蛋白基因的內(nèi)含子3觀察到了類似的內(nèi)含子增強(qiáng)水平(Luehrsen,K.R.和Walbot,V.(1991)Mol.Gen.Genet.225:81-93)。還注意到了由Adh1內(nèi)含子6產(chǎn)生的基因表達(dá)增強(qiáng)作用(Oard等(1989)Plant Cell Rep 8:156-160)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，玉米sh-1基因的外顯子1和內(nèi)含子1在玉米懸浮培養(yǎng)物中可分別將報(bào)告基因的表達(dá)提高10倍和100倍。當(dāng)組合使用時(shí)，發(fā)現(xiàn)上述元件可將報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)提高1000倍(Maas等(1991)PlantMol.Biol.16:199-207)。
能夠產(chǎn)生聚腺苷酸化信號(hào)的任何3′非編碼區(qū)及正確表達(dá)所必須的其它調(diào)控序列均可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。其中包括源于任何貯存蛋白的3′末端，如10kd、15kd、27kd和α-玉米醇溶蛋白基因的3′末端，豆類云扁豆蛋白基因3′末端，大豆b-conglycinin基因3′末端；源于病毒基因的3′末端，如35S或19S花椰菜花葉病毒轉(zhuǎn)錄物的3′末端；源于冠癭堿合成基因的3′末端；核酮糖1,5-二磷酸羧化酶或葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因的3′末端；或來(lái)自任何來(lái)源的3′末端，使所采用的序列在其核酸序列中產(chǎn)生必要的調(diào)控信息，導(dǎo)致與它可操縱的連接的啟動(dòng)子/編碼區(qū)組合結(jié)構(gòu)的正確表達(dá)。本領(lǐng)域中有很多介紹不同3′-非編碼區(qū)用途的例子(例如，參見(jiàn)Ingelbrecht等(1989)Plant Cell1:671-680)。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，有多種將一個(gè)DNA序列(即轉(zhuǎn)化DNA序列)導(dǎo)入高等植物的真核細(xì)胞的方法(參見(jiàn)EPO
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