專利名稱：一種制備、分離與純化乙酰乳酸合成酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶蛋白的制備，分離與純化，特別涉及的是乙酰乳酸合成酶的制備，分離與純化。
為建立一種新的，分子水平的離體農(nóng)藥篩選方法，選用乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，以下簡稱ALS酶)為催化劑。ALS酶是一種黃素蛋白，在國際分類法中屬4，它以高度的專一性和極高的催化效率催化丙酮酸為乙酰乳酸，并放出二氧化碳。存在于細(xì)菌或植物組織中的ALS酶，豐度低，不穩(wěn)定，保存期短，國內(nèi)外均無標(biāo)準(zhǔn)物銷售。本發(fā)明是從植物組織中提取ALS酶。經(jīng)初步檢索，美國專利US 5,084,086公開了除草劑對抗性作物的效果,US 5,206,135公開了氧敏感電極測ALS酶活性，兩份專利涉及的是ALS酶的一般性論述及除草抗性和變異方面的問題。與本發(fā)明相近似的文獻(xiàn)有[1]Shaner D.L.，Plant.Physiol.，植物生理學(xué)76，545-546(1984)[2]Giuseppe Forlanl，Weed Science雜草科學(xué)39，553-557(1991)[3]Oda Y.，J.Gen.Microobiol.，普通微生物學(xué)雜志128，1211-1216(1982)文獻(xiàn)[1]，[2]中與ALS酶制備，分離，純化有關(guān)的流程和組成參數(shù)歸納如下。1)原料與均勻化溶液之比為1克∶5毫升；均勻化溶液中，假底物選用的是乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，濃度為1,000-5,000μM；磷酸氫二鉀緩沖液的濃度是50mM；輔酶用的是頡氨酸，亮氨酸；鹽析富集只進(jìn)行一步；所用硫酸鹽的飽和度為20—50％；酶團(tuán)溶解液中的底物丙酮酸濃度20mM；離心分離一步，27,000轉(zhuǎn)/分。從上述各參數(shù)關(guān)系反映原料與均勻化溶液比值不合理，造成勻漿中含的ALS酶少。均勻化溶液和酶團(tuán)溶解液中的底物含量又過大，致使分離純化過程中酶促反應(yīng)速率加快，降低了ALS酶的質(zhì)量。另外工藝流程也不盡合理，勻漿過濾后，在濾渣中還有很多酶未被提取就直接進(jìn)行離心分離。一步離心分離，速度又很快，有很多粗酶含在濾渣中而被棄去。鹽析富集也僅一步，又不是在最佳鹽析點(diǎn)下工作，工藝流程不夠精細(xì)。由于以上原因，造成獲得的酶質(zhì)量不高，正如文獻(xiàn)[3]和其它文獻(xiàn)零星記載的，用一般方法獲得ALS酶比活值為1—2μM/mg·hr，并指出在4℃下儲存24小時，與原來相比活性降低46％，還有的記載保存期僅12小時—幾天，這些參數(shù)都較低，不能滿足分子水平的離體農(nóng)藥篩選方法中生物催化劑的實用規(guī)格要求。
本發(fā)明的目的是應(yīng)用現(xiàn)代分子酶學(xué)理論進(jìn)行系列科學(xué)實驗，從禾本科，豆科，莧科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，錦葵科，澤瀉科植物中培養(yǎng)的乙酰乳酸合成酶在制備，分離與純化時，優(yōu)化出最適宜均勻化溶液的比例，組成，濃度及制定最佳的技術(shù)流程，獲得最高比活值，最佳半衰期，最長保存期及穩(wěn)定性好的ALS酶。該酶能滿足新的，分子水平的離體農(nóng)藥篩選方法中作為生物催化劑的實用規(guī)格要求。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1.提供一種制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，縮寫ALS)的方法，主要包括以下順序步驟(1)提供禾本科，豆科，莧科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，錦葵科，澤瀉科植物中任意一種含乙酰乳酸合成酶的芽和胚組織為原料，與用ALS酶的底物，輔酶，穩(wěn)定劑和緩沖液配制成的均勻化溶液，在常溫常壓下混合攪切制成組織勻漿，其中底物用丙酮酸鈉，其濃度為10—30μM，原料與均勻化溶液之比為1克∶0.2—2.0毫升；(2)將組織勻漿過濾，濾渣用均勻化溶液反復(fù)浸取多次，合并濾液獲得粗酶；(3)粗酶濾液分兩步離心分離，離心速度第二步高于第一步，獲得離心酶；(4)將離心酶分兩步鹽析富集，每步都在低溫下加入硫酸鹽，飽和度為30-70％，沉淀離心30分鐘，離心速度16,000—20,000轉(zhuǎn)/分，獲得離心酶沉淀；(5)用ALS酶的底物，輔酶，緩沖液制成酶團(tuán)溶解液溶解離心酶沉淀，獲得的沉淀酶溶解液可用層析法，也可用透析反透析法純化，由此得到高純度的純化酶，酶團(tuán)溶解液中的底物用丙酮酸鈉，其濃度為1—5mM。
2.原料的制備是將禾本科，豆科，莧科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，錦葵科，澤瀉科植物中任意一種的種子在冷水中浸泡后，均勻地放在鋪有潮濕細(xì)沙或鋸末上放尼龍網(wǎng)的培養(yǎng)盤中，蓋上紗布，在室溫下發(fā)芽，剛出芽時，加蓋黑布避光培養(yǎng)。
3.均勻化溶液中的輔酶是選用氯化鎂，硫胺素焦磷酸(TPP)，和黃素腺嘌吟雙核苷酸(FAD)，這三種輔酶的濃度分別控制在0.3—1.0mM，0.3—1.0mM，和10—50μM范圍；緩沖溶液是選用磷酸氫二鉀，其濃度控制在50—150mM范圍；再加入10—30％的丙三醇做穩(wěn)定劑。
4.第一步離心分離速度是6,000—8,000轉(zhuǎn)/分，第二步離心分離速度是14,000—20,000轉(zhuǎn)/分，每次離心時間為20分鐘。
5.鹽析富集時的硫酸鹽是硫酸銨，最佳飽和度是50％，所述的低溫是0—4℃，沉淀離心，離心速度16,000—20,000轉(zhuǎn)/分。
6.酶團(tuán)溶解液中的輔酶選用氯化鎂，濃度為0.3—1.0mM；緩沖溶液選用磷酸氫二鉀，濃度為30—100mM；丙酮酸鈉濃度為1—5mM。
7.配制的酶團(tuán)溶解液可用做層析法中的淋洗液和透析法中的透析液。
根據(jù)上述步驟所確定的最佳技術(shù)流程如

圖1所示。
做為生物催化劑的酶，要具有高的比活值才能提高催化反應(yīng)的靈敏度，要有最佳半衰期，最長的保存期，才有使用價值，并且在使用中才能保持較平穩(wěn)的靈敏度，避免提取的酶幾天內(nèi)就失效而造成損失。
根據(jù)現(xiàn)代分子酶學(xué)理論，酶與底物似“誘導(dǎo)適合”關(guān)系，即，為表現(xiàn)出酶的活性必需有底物和輔酶的存在，底物濃度的選擇，既影響酶的活性，又涉及酶的保存。酶促反應(yīng)在非適宜的條件下，也在緩慢發(fā)生而永不停止，直到酶活性完全喪失為止，所以底物濃度不宜太大。底物濃度大，酶促反應(yīng)速率快，酶的活性喪失快，保存期也就短。因此適宜的底物濃度是獲得最高比活值，最佳半衰期，和最長保存期的一個重要因素。再者，酶促反應(yīng)是在輔酶的協(xié)同作用下進(jìn)行的。輔酶是小的非蛋白分子和金屬離子。本發(fā)明選用硫胺素焦磷酸(TPP)，黃素腺嘌呤雙核苷酸(FAD)，鎂離子為輔酶。若選用ZnSO4，MnSO4，雖能制備酶，但效果不好。TPP能使丙酮酸脫羧，并活化縮合反應(yīng)所必須的中間產(chǎn)物。FAD能防止羥乙基—TPP中間產(chǎn)物質(zhì)子化，鎂離子能使酶全部活化，使ALS酶與TPP徐徐形成可逆絡(luò)和物。下面實驗了從三種不同組成的均勻化溶液中提取ALS酶對比活的影響，見表1。
表1.從三種不同組成的均勻化溶液中提取ALS酶對比活的影響
由表1說明，輔酶和少量底物或假底物的存在對保持酶活性是極其重要的。由此，通過大量實驗確定了本發(fā)明在分離和純化時溶液最適宜的組成及濃度。
本發(fā)明選用硫酸銨固體加入方式進(jìn)行兩步鹽析富集。根據(jù)酶在低鹽濃度下的溶解度隨鹽溶液濃度升高而增加，此后，當(dāng)鹽濃度再緩慢上升酶溶解度開始下降，繼而沉淀析出的特點(diǎn)，確定了酶的最佳鹽析點(diǎn)是硫酸鹽飽和度為50％。
本發(fā)明所用原料及試劑在市場上均可購到。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)及顯著效果
1.本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)①在植物良種培養(yǎng)時采取的各項措施能有效地控制植物發(fā)芽，不發(fā)霉，不腐爛，并可獲得最高含量的ALS酶。
②優(yōu)選出最適宜的提取溶液組成和濃度。主要表現(xiàn)在ALS酶底物選取適宜的濃度，輔酶的配制，穩(wěn)定劑的加入，原料與均勻化溶液的合理比例，和酶團(tuán)溶解液的配制及濃度。這些都是提高酶的活性及保存期的有力措施。
③精細(xì)工藝流程的制定，如濾渣的反復(fù)浸取，兩步離心，第一步離心速度低于第二步，兩步鹽析富集，這些都是防止酶夾雜在渣中而損失。以及使酶充份地沉淀析出，獲得高活性，高濃度酶的有力措施。
2.本發(fā)明方法帶來的顯著效果①由于在制備，分離與純化階段采取了以上各種措施，因此使用本發(fā)明方法可獲得優(yōu)質(zhì)酶，表現(xiàn)為A.ALS酶比活值高。離心酶比活測定值為10—12μM/mg·hr，純化后可達(dá)223.44μM/mg·hr。酶的比活是其質(zhì)量規(guī)格的一個指標(biāo)。比活高，意味酶具有的催化效率也高。
B.ALS酶的保存期長，可保存30天。ALS酶離體后，由于其固有的不均勻性，不穩(wěn)定性，很難貯藏。以至于在12小時到幾天內(nèi)完全失活，無法提供用于分子水平的離體農(nóng)藥篩選。本發(fā)明在提取分離過程中創(chuàng)造出一個與ALS酶在活體中相類似的環(huán)境。保存期間有適宜的底物濃度，既能穩(wěn)定酶的活性中心，又能最大限度地降低酶促反應(yīng)速率，所以保存期長。
C.ALS酶半衰期長由于ALS酶的比活值高，保存期長，所以半衰期長達(dá)7—8天。因而提高了實際利用價值，同時由ALS酶所創(chuàng)建的抑制劑篩選方法附加值高。
②在創(chuàng)制新農(nóng)藥中，新除草劑的開發(fā)是一個重要方面。對此，本發(fā)明提供的ALS酶是一種重要的實用型酶。由于采用本方法制備的ALS酶達(dá)到了篩選方法中做為生物催化劑的實用規(guī)格要求，即有高的比活值才能提高基于催化反應(yīng)速率的測定方法的靈敏度；半衰期長和保存期長才能提供實際使用。因此為ALS酶抑制劑的篩選提供了有利保證。實踐也證明了，用本法制備的ALS酶做靶標(biāo)，在篩選各類化合物過程中，已發(fā)現(xiàn)了兩種與氯磺隆具有同等抑制活性的新先導(dǎo)化合物。(此點(diǎn)在乙酰乳酸合成酶抑制劑篩選方法申請案中有詳述。)③提供了富集純化酶的流程和最佳條件，使獲得的純化酶比活高達(dá)223μM/mg·hr，這為進(jìn)一步對ALS酶做深入研究創(chuàng)造了條件。
以下通過實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步介紹圖1.本發(fā)明技術(shù)流程圖；圖2.Sephadex G-25凝膠層析柱的洗脫譜圖；圖3.酶的保存期及半衰期。
實施例1依據(jù)本發(fā)明確定的最佳技術(shù)流程進(jìn)行介紹，如圖1所示(1)ALS酶的培養(yǎng)以豌豆做豆科植物的代表。將良種豌豆在冷水中浸泡24小時，均勻放在鋪有1厘米厚的潮濕細(xì)砂或鋸末上放尼龍網(wǎng)的培養(yǎng)盤中，種子上蓋紗布，在室溫下發(fā)芽，剛出芽時，加蓋黑布避光培養(yǎng)，取1-3厘米高的含乙酰乳酸合成酶的芽和胚組織作為提取ALS酶的原料。
(2)ALS酶的制備首先用水配制均勻化溶液，其中含K2HPO4100mM；底物丙酮酸鈉10μM，輔酶氯化鎂0.5mM，硫胺素焦磷酸(TPP)0.5mM，黃素腺嘌呤雙核苷酸10μM；穩(wěn)定劑丙三醇15％。按芽(克)∶溶液(毫升)＝1∶0.5的關(guān)系，稱取200克原料與100ml的均勻化溶液，常溫常壓下混合。在加工機(jī)中攪切5分鐘后制成組織勻漿。
(3)ALS酶的分離與純化將組織勻漿經(jīng)10層紗布，2層尼龍布過濾。過濾后的濾渣用均勻化溶液反復(fù)浸取3次，與上述濾液合并，獲得粗酶溶液，濾渣棄去。
粗酶濾液分兩步離心分離后獲得離心酶。第一步離心速度為7,000轉(zhuǎn)/分，第二步離心速度為15,000轉(zhuǎn)/分，每次離心20分鐘，離心后的濾渣棄去。
將離心酶分兩步鹽析富集，獲得離心酶沉淀。操作在0—4℃下進(jìn)行，硫酸銨固體加入，飽和度為50％。ALS酶蛋白不斷沉淀析出，靜置2小時后，再以20,000轉(zhuǎn)/分的速度離心分離30分鐘，溶液棄去。此時初步實現(xiàn)富集分離純化的目的。
(4)ALS酶的進(jìn)一步純化首先用水配制酶團(tuán)溶解液，其中含ALS酶的底物丙酮酸鈉1mM，輔酶氯化鎂0.5mM，緩沖液磷酸氫二鉀50mM。
用酶團(tuán)溶解液溶解離心酶沉淀，再溶解的酶需要脫鹽去除硫酸根離子，脫鹽技術(shù)可用層析法，也可用透析反透析法實現(xiàn)，由此得到高純度的酶。
(ⅰ)凝膠層析法用直徑為1厘米，高為100厘米的帶水套的玻璃柱做層析柱，以SephadexG-25交聯(lián)葡聚糖凝膠做柱填料。
稱20克Sephadex G-25交聯(lián)葡聚糖凝膠在200毫升蒸餾水中浸泡3小時，除去水及表面懸浮小顆粒，用200毫升0.5M NaOH和0.5M NaCl溶液在室溫下浸半小時，抽濾洗堿至中性，用抽氣方式去除氣泡。
再用排水方式裝柱。用100毫升的酶團(tuán)溶解液做淋洗液平衡洗柱。柱頂進(jìn)樣3毫升的沉淀酶溶解液，以25滴/分鐘的流速淋洗，使ALS酶緩慢通過凝膠層析柱分離。從柱下端出口收集酶活最高時的洗脫液，就是本發(fā)明要制備的純化酶，見圖2。圖中○○○所示為蛋白曲線；●●●所示為酶活曲線；▲▲▲所示為硫酸根離子曲線。蛋白用Folin法測定；硫酸根離子用離子色譜法測定。
用100毫升水洗脫柱子，硫酸根可全部洗出，柱子待下次使用。
(ⅱ)透析反透析法選擇透析值12,000—14,000，扁寬1.0英寸的透析袋，截取35厘米長，水中浸泡24小時，裝入沉淀酶溶解溶液50毫升，二頭扎緊封口。放入1000毫升透析液中。透析液選用的是酶團(tuán)溶解液。在0-4℃下透析四次，每次5小時。取出放在聚乙二醇(PEG)6000中進(jìn)行反透析，見透析袋縮小時為止。袋中的酶就是本發(fā)明要制備的純化酶。
依據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行制備，分離與純化，得到各種酶的比活測定結(jié)果見表2，其最高比活值為223.44μM/mg·hr。
表2.各種酶的比活
ALS酶的保存期從提取離心酶之日起進(jìn)行監(jiān)測，得到最長保存期為30天，最佳半衰期為7天，其結(jié)果見圖3，圖中A％為殘活％。
實施例2選用大麥為禾本科植物代表。
實施例3選用玉米為禾本科植物代表。
實施例4選用莧草為莧，藜，蓼，旋花，十字花，茜草，菊，莎草，唇形，錦葵，和澤瀉各科植物(農(nóng)田雜草)的代表。
上述2，3，4三例的制備，分離與純化的方法及依據(jù)的技術(shù)流程均和實施例1相同，所用化合物的組成也相同，各組成的濃度及有關(guān)參數(shù)不同，見表3。
表3.實施例1—4中使用的各項參數(shù)(采用原料100—500克)
表3. 續(xù)
權(quán)利要求
1.一種制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Syn-thase，縮寫ALS)的方法，其特征在于主要包括以下順序步驟(1)提供禾本科，豆科，莧科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，錦葵科，澤瀉科植物中任意一種含乙酰乳酸合成酶的的芽和胚組織為原料，與用ALS酶的底物，輔酶，穩(wěn)定劑和緩沖液配制成的均勻化溶液，在常溫常壓下混合攪切制成組織勻漿，其中底物用丙酮酸鈉，其濃度為10—30μM，原料與均勻化溶液之比為1克∶0.2—2.0ml；(2)將組織勻漿過濾，濾渣用均勻化溶液反復(fù)浸取多次，合并濾液獲得粗酶；(3)粗酶濾液分兩步離心分離，離心速度第二步高于第一步，獲得離心酶；(4)將離心酶分兩步鹽析富集，每步都在低溫下加入硫酸鹽，飽和度為30—70％，沉淀離心30分鐘，離心速度16,000—20,000轉(zhuǎn)/分，獲得離心酶沉淀；(5)用ALS酶的底物，輔酶，緩沖液制成酶團(tuán)溶解液溶解離心酶沉淀，獲得的沉淀酶溶解液可用層析法，也可用透析反透析法純化，由此得到高純度的純化酶，酶團(tuán)溶解液中的底物用丙酮酸鈉，其濃度為1—5mM。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于原料的制備是將禾本科，豆科，莧科，藜科，蓼科，旋花科，十字花科，茜草科，菊科，莎草科，唇形科，錦葵科，澤瀉科植物中任意一種的種子在冷水中浸泡后，均勻地放在鋪有潮濕細(xì)沙或鋸末上放尼龍網(wǎng)的培養(yǎng)盤中，蓋上紗布，在室溫下發(fā)芽，剛出芽時，加蓋黑布避光培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于均勻化溶液中的輔酶是選用氯化鎂，硫胺素焦磷酸(TPP)，和黃素腺嘌呤雙核苷酸(FAD)，這三種輔酶的濃度分別控制在0.3—1.0mM，0.3—1.0mM，和10—50μM范圍；緩沖溶液是選用磷酸氫二鉀，其濃度控制在50—150mM范圍；再加入10—30％的丙三醇做穩(wěn)定劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于第一步離心分離速度是6,000—8,000轉(zhuǎn)/分，第二步離心分離速度是14,000—20,000轉(zhuǎn)/分，每次離心時間為20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于鹽析富集時的硫酸鹽是硫酸銨，最佳飽和度是50％，所述的低溫是0—4℃，沉淀離心，離心速度16,000—20,000轉(zhuǎn)/分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于酶團(tuán)溶解液中的輔酶選用氯化鎂，濃度為0.3—1.0mM；緩沖溶液選用磷酸氫二鉀，濃度為30—100mM；丙酮酸鈉濃度為1—5mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備，分離與純化乙酰乳酸合成酶的方法，其特征在于配制的酶團(tuán)溶解液可用做層析法中的淋洗液和透析法中的透析液。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙酰乳酸合成酶(ALS)的制備，分離與純化。從禾本，豆、莧、藜，蓼，旋花，十字花，茜草，菊，莎草，唇形，錦葵，澤瀉各科植物中培養(yǎng)ALS酶。經(jīng)實驗，優(yōu)化出最佳原料與均勻化溶液的比值，組成和濃度，制定了勻漿過濾，浸取，兩步離心，兩步鹽析，層析或透析脫鹽的精細(xì)技術(shù)流程。獲得了最高比活值為223μm/mg·hr的ALS酶，半衰期7-8天，保存期30天，滿足分子水平的離體農(nóng)藥篩選方法中做為生物催化劑的實用規(guī)格要求。
文檔編號C12N9/00GK1119212SQ9510982
公開日1996年3月27日 申請日期1995年8月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月29日
發(fā)明者曹殿芳, 周家駒, 駱元章 申請人:中國科學(xué)院化工冶金研究所