專利名稱：生產(chǎn)無病毒蛇麻草根莖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)無病毒蛇麻草(Humulus lupulus L.)根莖的方法，該無病毒根莖能穩(wěn)定貯存，當(dāng)被種植時，可有效地長出根和芽。
目前尚無有關(guān)通過培養(yǎng)而成功生產(chǎn)蛇麻草冬眠芽無性繁殖組織(下文稱為“蛇麻草根莖”)的報道。
在此之前，蛇麻草無性系是根據(jù)下列方法進行無性繁殖的1.利用蛇麻草根莖的方法在秋季切除帶有冬眠芽的蛇麻草必要的地下莖，貯存之，然后在苗圃或植物栽培田里種值。因為根莖是具有冬眠芽的無性繁殖組織，故而它能被貯存，其特征在于它被栽種后能有效地長出根，并生長良好。2.栽種蛇麻草插枝的方法切除蛇麻草的出芽莖、必要的地上莖或側(cè)枝，種植具有至少一個或多個節(jié)的插枝使之長出根，然后將如此出根的插枝在苗圃田里生長一年，再將長成的一年生植物移植到植物栽種田里。3.組織培養(yǎng)法經(jīng)無病毒技術(shù)培養(yǎng)蛇麻草的苗端，并使所培養(yǎng)的無病毒植株得以進一步的離體培養(yǎng)和增殖。然后將增殖的植株移種于花盆中和苗圃田里，再以上述栽種蛇麻草插枝相同的方法移植于植物栽種田。
已有很多關(guān)于在栽種帶有各種病毒的蛇麻草植物過程中存在污染之危險的報道。在根插利用根莖的方法或種植蛇麻草插枝的方法進行無性繁殖過程中，傳染給原始蛇麻草植物的病毒被強加于增殖的蛇麻草植物上。這類在此之前已在日本知曉的病毒包括蘋果花葉病毒(ApMV)、蛇麻草潛伏病毒(HLA)、蛇麻草花葉病毒(HMV)、紫紅色壞死的環(huán)形斑點病毒(PNRV)等。
當(dāng)經(jīng)莖端培養(yǎng)獲得的無病毒蛇麻草植株一旦從所用的試驗試管中取出，并然后種植于花盆或田中，所生長的植物就很有可能通過載體(如蚜蟲、線蟲等)或通過修剪植物時落下的蛇麻草籽苗汁傳染病毒。因此，為了防止栽種的無病毒蛇麻草植株遭受病毒傳染，需要進行大量的勞動以提供一塊完全隔離的無病毒田，嚴(yán)格地消滅并控制載體，并不時地進行必要的試驗以證實在去除那些在早期傳染了病毒的植株時所存在的植株不帶病毒。
當(dāng)因引進新品種和因試驗栽培而進行國際傳輸蛇麻草植物時，需要對其進行檢疫以防止傳染了有害蠕蟲等的蛇麻草植物輸入。最近，許多國家通過法律手段對蛇麻草植物的進口施加影響，籍此，待進口的蛇麻草植物須被證明不帶有所指定種類的病毒。
蛇麻草植物中病毒的檢查是用ELISA法進行。然而，剛被病毒傳染后的蛇麻草植物通常只具有較低的病毒濃度，致使值物的病毒檢查產(chǎn)生陰性結(jié)果。因此，一般很難證明經(jīng)利用蛇麻草根莖或種植蛇麻草插枝的常規(guī)方法獲得的蛇麻草植物實質(zhì)上不帶病毒。
從理論上講，這個問題可以通過經(jīng)莖端培養(yǎng)獲得的試管中的無病毒植物得以解決。然而，應(yīng)用這類培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植物涉及其它問題。一個問題是當(dāng)植物要進行國際運輸，生長的小植物要在花盆或在植物栽培田里種植時，需要特殊的儀器設(shè)備。另外一個問題是，在需要長時間的國際運輸過程中，由培養(yǎng)的植物長成的小植物不能在花盆或植物栽培田里有效生成，則需要賦予被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植物更多的關(guān)注。
本發(fā)明的目的在于消除被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植物遭受病毒傳染的危險，提供能穩(wěn)定貯存的無病毒蛇麻草根莖，它在被種植時可有效地生長并長出根和芽，籍此，上述有關(guān)被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株的問題都得以解決。
本申請人特別在根據(jù)蛇麻草根莖生長條件調(diào)查其離體生產(chǎn)情況的同時從事蛇麻草植物的育種和培養(yǎng)的研究多年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不具有上述問題的無病毒蛇麻草根莖的生產(chǎn)可以是首先在生根培養(yǎng)基中制備足以長出根的被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株，然后在含有高糖濃度的、生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基(下文稱為生產(chǎn)蛇麻草根莖培養(yǎng)基)中繼續(xù)培養(yǎng)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果完成了本發(fā)明。
確切地說，本發(fā)明提供了生產(chǎn)無病毒蛇麻草根莖的方法，包括在生根培養(yǎng)基中生長被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株，使之長出根，繼而在含高糖濃度的生產(chǎn)蛇麻草根莖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以形成蛇麻草根莖。對于本發(fā)明方法的第一實施方案，生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有選自葡萄糖、果糖和蔗糖的一種或多種糖化物。對于本發(fā)明方法的第二實施方案，含高濃度糖的生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有濃度為0.15—1M的單糖。對于本發(fā)明方法的第三實施方案，含高濃度糖的生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有濃度為0.1—0.5M的二糖。對于本發(fā)明方法的第四實施方案，含高濃度糖的生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有濃度為0.15—1M的莆萄糖。對于本發(fā)明方法的第五實施方案，含高濃度糖的生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基包括向其中加入濃度為0.15—1M葡萄糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基。對于本發(fā)明方法的第六實施方案，被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株是經(jīng)分生培養(yǎng)獲得的。
獲得用于本發(fā)明中經(jīng)培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株可以通過在約35℃培養(yǎng)蛇麻草植物(即使已經(jīng)傳染了病毒)10—18天，然后采集1—5cm莖梢培養(yǎng)。然而，作為獲得該植株更簡便更精確的方法，可以從蛇麻草苗梢采集生長的尖端組織，再經(jīng)分生培養(yǎng)獲得預(yù)期的、經(jīng)培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株。
為了證實如此獲得的蛇麻草植株中不存在病毒，該植株要根據(jù)如上所述的ELISA法進行病毒檢查。
植物的頂生芽和腋生芽通常都有稱作生長尖端或苗端組織的苗端分生組織。生長尖端或苗端組織的培養(yǎng)是指分生培養(yǎng)。
苗端組織一般存在于芽的最里層部分，它主要由葉或小鱗片包裹而無菌。此外，據(jù)說在該組織尖端0.3mm部幾乎不存在病毒。因此，有可能經(jīng)切除并培養(yǎng)這部分組織生產(chǎn)無病毒的蛇麻草組織。根據(jù)這種分生培養(yǎng)，不僅可將病毒排除于被培養(yǎng)的組織之外，而且還可能獲得其中無真菌無細(xì)菌的純凈組織。
下面介紹一種具體的分生培養(yǎng)法。切除適宜大小含頂生芽或腋生芽的蛇麻草組織部分，收集之。然后，借助置于潔凈臺階上的立體顯微鏡去掉覆蓋苗端的鱗片和葉組織使苗端組織暴露出來，再用無菌快刀(如外科刀等)將如此暴露的苗端組織切成0.15—0.3mm厚的小塊，收集之。
當(dāng)這些小塊組織在刀端時將其收集起來，立即放入培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基可以是通常用于植物組織培養(yǎng)的普通種類，例如包括Murashige-Skoog(下文稱為MS)培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、Lins-maier-Skoog培養(yǎng)基、Nitsch培養(yǎng)基等。最常用的是已加入植物激素(如植物生長素、細(xì)胞分裂素等)的MS瓊脂培養(yǎng)基。一個優(yōu)選的實施例介紹的是包含基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基，其中加入了2.0mg/L芐基腺嘌呤(BA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)和20g/L葡萄糖(pH5.8；瓊脂含量8g/L)。
置于培養(yǎng)基的苗端組織在室溫下培養(yǎng)一個月，其上苗端組織生長成能夠分為大約10個無性系(即該組織生長成具有大約10個頂生芽或腋生芽的培養(yǎng)植株)。培養(yǎng)一個多月后，分出的無性系進一步繁殖各產(chǎn)生大約10個無性系。培養(yǎng)物的增殖根據(jù)所需的無性系數(shù)目進行。例如，如果需要1000個無性系，置于培養(yǎng)基上的苗端組織將培養(yǎng)約3個月；而如果需要10000個無性系，則要培養(yǎng)大約4個月。
如此獲得的組織要按照ELISA法進行病毒檢查，籍此證實這些組織不帶病毒。進一步培養(yǎng)被繁殖的無性系，生長一個月后進行生長培養(yǎng)。
接下來，無病毒組織進行生長培養(yǎng)以促進頂端優(yōu)勢期的生長。即培養(yǎng)植株的孤生分枝期有效地轉(zhuǎn)化為頂端優(yōu)勢期。對于這一培養(yǎng)過程，優(yōu)先使用的是上述MS瓊脂培養(yǎng)基，其中已加入0.2mg/L吲哚乙酸和20g/L葡萄糖(pH5.8；瓊脂含量8g/L)。
生長培養(yǎng)在室溫下進行大約2個月。在證實如此培養(yǎng)的組織已轉(zhuǎn)入頂端優(yōu)勢期后，然后將組織進行根培養(yǎng)。
利用已加入0.2mg/L吲哚丁酸和20g/L葡萄糖(pH5.8；瓊脂含量8g/10的MS瓊脂培養(yǎng)基進行根培養(yǎng)。具體說來，將培養(yǎng)的組織置于培養(yǎng)基上，再于室溫培養(yǎng)2周至大約一月，使組織足以長出根來。
如此培養(yǎng)的無病毒蛇麻草(即已長出根的)在生產(chǎn)蛇麻草根莖培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)，以獲得無病毒蛇麻草根莖。
作為生產(chǎn)蛇麻草根莖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所用的可以是上述任何一種普通的植物組織培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，如液體MS培養(yǎng)基。用于本發(fā)明中的生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有高濃度的糖化物。具體說來，它含有一種或多種選自葡萄糖、果糖和蔗糖等的糖。對于單糖如葡萄糖、果糖等而言，培養(yǎng)基中的糖濃度可以是0.15—1M，優(yōu)選的是0.2—0.4M；對于雙糖如蔗糖等而言，糖濃度可以是0.1—0.5M，優(yōu)選的是0.1—0.2M。如果糖濃度低于指定范圍，培養(yǎng)基中預(yù)期的蛇麻草根莖產(chǎn)率明顯降低，即使被培養(yǎng)的植株仍然存活其中。相反，如果糖濃度高于指定范圍，培養(yǎng)植株的生長受阻或植株死亡。
培養(yǎng)基的一個優(yōu)選例子包括液體的MS培養(yǎng)基，它含有0—2.0g/L吲哚丁酸，優(yōu)選的是0.1—0.2mg/L，和30—150g/L葡萄糖，優(yōu)選的是40—60g/L，培養(yǎng)基的pH值為5.8。
培養(yǎng)基可以有pH5.5—6.0，優(yōu)選的是pH5.7—5.8。
培養(yǎng)在試驗試管中進行，試管的大小為大約10×80－30×200mm，優(yōu)選的是大約15×90－25×120mm。這是因為在小于上述給定范圍的試管中培養(yǎng)的蛇麻草植株不可能充分地生長，而且未充分生長的植株即使被種植也只產(chǎn)生小的蛇麻草根莖。另一方面，如果培養(yǎng)的蛇麻草植株在大于指定范圍的試管中生長，那么預(yù)期的蛇麻草根莖的產(chǎn)率也不理想。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株移種于試管的培養(yǎng)基上，并于20—30℃，優(yōu)選25℃，一直在3,000—25,000勒克司光照下作進一步培養(yǎng)，或者在頭14—20小時于20—30℃，優(yōu)選25℃，3,000—25,000勒克司光照下進一步培養(yǎng)，然后于10—20℃，優(yōu)選15℃且無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4—10小時。在這些條件下，當(dāng)在后一種情況下重復(fù)循環(huán)時植株培養(yǎng)1—3月。被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株將在生根培養(yǎng)基完全從植株中去掉后移種于培養(yǎng)基中。
如此培養(yǎng)約1月后，植株開始在其主干底部以上的任何部位增厚。大約2個月后，幾乎所有被培養(yǎng)的植株都長出根莖。在這一階段，被培養(yǎng)植株的頂干和葉子開始枯萎，而如此生產(chǎn)的根莖在進一步增厚。大約3個月后，可以允許冬眠仔苗的產(chǎn)率不再顯著增加，培養(yǎng)過程結(jié)束。
根據(jù)上述方法培養(yǎng)的植株中有70～100％的在主干底部以上的任何位點產(chǎn)生增厚的根莖。
借助下面的實施例本發(fā)明得以更詳細(xì)的描述，然而，下面的實施例無意于限定本發(fā)明的范圍。實施例1收集厚度為0.2mm的蛇麻草莖端的分生組織(生長點組織)，并將其置于17×105mm大小的試管中，該試管已裝有包括基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基含有由下列成分組成的組合物370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，1900mg/LKNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L K2HPO4，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L煙酸，0.5mg/L鹽酸吡哆醇，0.1—1mg/L鹽酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，并向其中加入2.0mg/L芐基腺嘌吟，0.2mg/L赤霉酸和20g/L葡萄糖。培養(yǎng)基的pH值為5.8，瓊脂含量是8g/L。在循環(huán)條件下經(jīng)莖端培養(yǎng)法在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)那些苗端大約3個月。一個培養(yǎng)循環(huán)為于25℃、光照16小時(5,000—20,000勒克司)然后無光照18小時的條件下培養(yǎng)頂端。在栽種過程中，用ELISA法證明被培養(yǎng)的植株不帶病毒。如此培養(yǎng)的無病蛇麻草植株被分開、移植并亞培養(yǎng)二次，以再生產(chǎn)100個無病毒蛇麻草無性系。它們被再培養(yǎng)1個多月以進一步生長。
然后，將這100個無病毒蛇麻草無性系置于含有上述基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，其中已加入了0.2mg/L吲哚乙酸和20g/L葡萄糖。該培養(yǎng)基pH5.8，瓊脂量為8g/L。它們于室溫下培養(yǎng)大約2月，促進其中的頂端優(yōu)勢期的生長。
如此培養(yǎng)的100個無性系被放于含有基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上，其中已加入0.2mg/L吲哚乙酸和20g/L葡萄糖。該培養(yǎng)基pH5.8，瓊脂量8g/L。這些無性系在培養(yǎng)基中于室溫下培養(yǎng)2周至大約一月，使之充分長生根。
接下來，在無菌條件下小心地去除附著在生根的無病毒蛇麻草無性系的根及其它部分上的培養(yǎng)基。這100個無性系用于在下一步中生產(chǎn)無病毒蛇麻草根莖。具體說來，無病毒無性系被移植到17×105mm大小的試管中，每一試管含有4ml包括基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基(pH5.8)，其中加入了0.2mg/L吲哚乙酸和40g/L葡萄糖，在循環(huán)條件下培養(yǎng)。一個培養(yǎng)循環(huán)為無性系先在25℃、光照(5,000—20,000勒克司)在培養(yǎng)16小時，然后于15℃、無光照條件下培養(yǎng)8小時。
如此培養(yǎng)1月后，無性系開始在其主干底部以上的任何位點增厚。2月后，發(fā)現(xiàn)82％的無性系生成了根莖。到此階段，被培養(yǎng)無性系的頂莖和葉子開始枯萎，而所產(chǎn)生的根莖進一步增厚。3個月后，可以接受不再有根莖產(chǎn)率的顯著增加，培養(yǎng)可以結(jié)束，收集如此生產(chǎn)的根莖。所產(chǎn)生的根莖的平均鮮重是0.26g(最小的重0.14g，最大的重0.42g)。實施例2重復(fù)實施例1中同樣的方法，除了莖端培養(yǎng)在25×120mm大小的試管中進行和生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)也在25×120mm的試管中進行外。結(jié)果，79％被培養(yǎng)的無性系在3個月內(nèi)產(chǎn)生了蛇麻草根莖，所產(chǎn)生根莖的平均鮮重是0.51g。實施例3重復(fù)實施例1中同樣的方法，除了莖端培養(yǎng)在30×200mm大小的試管中進行和生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)也在30×200mm的試管中進行外，結(jié)果，26.7％被培養(yǎng)的無性系在3個月內(nèi)產(chǎn)生了蛇麻草根莖，所產(chǎn)生根莖的平均鮮重是0.79g。
本發(fā)明在上文，尤其是有關(guān)優(yōu)選實施方案中進行了詳細(xì)描述，在耕地中收集的無病毒蛇麻草根莖有可能通過載體或在其耕種過程中又遭病毒傳染。但是，根據(jù)本發(fā)明在無菌條件下生產(chǎn)的無病毒蛇麻草根莖沒有受病毒、病原蠕蟲或寄生蟲傳染的危險，因而是極安全的。此外，它們可以很好地貯存，在被種值時，能有效地長出根和芽。
在本發(fā)明被詳細(xì)描述并根據(jù)具體的實施方案進行說明后，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下對此作出各種改變和修飾對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)無病毒蛇麻草根莖的方法，包括在生根培養(yǎng)基中生長被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株，使之在培養(yǎng)基中生根，再在含高濃度糖的生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中形成根莖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基中的糖是選自葡萄糖、果糖和蔗糖中的一種或多種糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有濃度為0.15—1M單糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有濃度為0.1—0.5M二糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基含有濃度為0.15—1M的葡萄糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基包括其中加入了濃度為0.15—1M葡萄糖的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株得自莖端培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產(chǎn)無病毒蛇麻草根莖的方法，包括在生根培養(yǎng)基中生長被培養(yǎng)的無病毒蛇麻草植株，使之在其中生根，然后通過在含有高濃度糖的生產(chǎn)蛇麻草根莖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以形成蛇麻草根莖。在無菌條件下生產(chǎn)無病毒的蛇麻草根莖，它們沒有受病毒、病原蠕蟲或寄生蟲傳染的危險。該植物具有極大的安全性，能被妥善貯存。當(dāng)被種植時，它們能有效地長出根和芽。
文檔編號C12M3/00GK1121766SQ95108989
公開日1996年5月8日 申請日期1995年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月28日
發(fā)明者系賀裕, 須田成志 申請人:札幌啤酒株式會社