專(zhuān)利名稱(chēng)：新的限制性核酸內(nèi)切酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶，其可以識(shí)別雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)分子中7堿基的嚴(yán)格序列并在嚴(yán)格位點(diǎn)上裂解所述的DNA分子。
限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別DNA分子中特異性堿基序列并在特異性位點(diǎn)上裂解DNA鏈的核酸內(nèi)切酶。迄今發(fā)現(xiàn)了多種限制性核酸內(nèi)切酶。隨著分子遺傳學(xué)和生物化學(xué)的進(jìn)展，DNA已被證明是遺傳信息的載體，自那時(shí)起限制性核酸內(nèi)切酶已廣泛用于多種目的，如在基因操作方面搞清遺傳病等上的應(yīng)用。
其中，II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶可識(shí)別特異性DNA序列和特異性地消化序列中的DNA鏈，這種酶極為重要，主要應(yīng)用于遺傳工程技術(shù)。
盡管已分離出300多種II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶，但仍有許多不具同源限制性核酸內(nèi)切酶的DNA序列(其不能被任何已知的限制性核酸內(nèi)切酶所識(shí)別)有待發(fā)現(xiàn)。因而，需要作出始力以便發(fā)現(xiàn)具有識(shí)別和消化這些序列能力的新的II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶，這樣研究者就有更多的機(jī)會(huì)在適用于各項(xiàng)試驗(yàn)的位置上切割其DNA。
另外，具有低切割頻率的限制性核酸內(nèi)切酶更便于高分了量DNA的結(jié)構(gòu)分析，如幾種生物的基因組分析方案，并且需要發(fā)現(xiàn)能識(shí)別6個(gè)堿基以上的長(zhǎng)DNA序列的II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶。
本發(fā)明的目的在于提供一種新的II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶，它具有識(shí)別和切割新DNA序列的能力，適用于遺傳工程研究(包括對(duì)高分子量DNA的分析)。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種限制性核酸內(nèi)切酶，該酶可嚴(yán)格地識(shí)別DNA分子中下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式1的核苷酸序列并在箭頭所示位點(diǎn)上嚴(yán)格地裂解所述的核苷酸序列，[化學(xué)結(jié)構(gòu)式1] 其中A、G、T和C分別代表腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種生產(chǎn)上述限制性核酸內(nèi)切酶的方法，該方法包括培養(yǎng)一種屬于鏈霉菌屬并具有鏈霉菌種YH8647(FERM BP-5022)所有鑒別特性的微生物，該微生物能產(chǎn)生上述限制性核酸內(nèi)切酶，并從培養(yǎng)液中回收所生成的限制性核酸內(nèi)切酶。
本發(fā)明中的II類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶可以是能?chē)?yán)格地識(shí)別和裂解上述核苷酸序列的任何限制性核酸內(nèi)切酶，該限制性核酸內(nèi)切酶可通過(guò)下述方法得到培養(yǎng)能產(chǎn)生限制性核酸內(nèi)切酶的菌株或該菌株的突變體，或?qū)τ煞蛛x所述限制性核酸內(nèi)切酶生產(chǎn)的編碼基因并用普通遺傳操作技術(shù)將其轉(zhuǎn)化到不同種類(lèi)的宿主生物中而制備出的重組體進(jìn)行培養(yǎng)。
能產(chǎn)生識(shí)別上述七核苷酸序列的限制性核酸內(nèi)切酶的實(shí)際菌株為鏈霉菌種YH 8647。該菌株分離自收集并貯存于發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中的土壤。其細(xì)菌學(xué)特性如表1所示。[表1]細(xì)胞壁類(lèi)型 類(lèi)型IL，L-二氨基庚二酸 +內(nèi)消旋—二氨基庚二酸 -二氨基丁酸 -甘氨酸 +天冬氨酸 -鳥(niǎo)氨酸 -賴(lài)氨酸 -阿拉伯糖*1-半乳糖*1+苯醌 MK-9(H8)，MK-9(H6)氣生菌絲體*2+孢子連鎖*2+*1 利用硫酸的全細(xì)胞水解來(lái)實(shí)施。*2 通過(guò)微孢子進(jìn)行檢驗(yàn)。
細(xì)胞壁組成分析如下列三種文獻(xiàn)如述進(jìn)行日本放線(xiàn)菌學(xué)會(huì)(日本放線(xiàn)菌學(xué)會(huì)秘書(shū)處，1985)的Housenkin No doutei jikkenhou(第一版，放線(xiàn)菌鑒定的實(shí)驗(yàn)方法)；K.Komagata(Gakkai Syup-pan中心，1982)的Biseibufu no kagaku bunrui jikkenhou(第一版，微生物化學(xué)鑒定的實(shí)驗(yàn)方法)；E.Yabuuti等人(Saikon syuppan，1987)的Afarashii bunruigaku ni hansou suru Saikin douteihou(第一版，新分類(lèi)中的微生物鑒定)。該菌株的細(xì)胞壁類(lèi)型被確定為I型。對(duì)苯醌組分的分析表明，該菌株具有甲基萘醌類(lèi)，在多異戊二烯基鏈有6或8個(gè)飽和氯的9個(gè)異戊二烯單位。另外，從形態(tài)學(xué)觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，該菌株具有氣生菌絲體和孢子連鎖。從以上分析可以看出，該菌株可確定為屬于鏈霉菌屬的一個(gè)菌種。
本菌株被稱(chēng)為鏈霉菌種YH8647。依據(jù)布達(dá)佩斯條約該菌株于1993年9月29日保藏于日本工業(yè)科技院生物科學(xué)及人類(lèi)技術(shù)國(guó)立研究所中(1-3，Higashi，chome Tsukuba-shi Ibaraki-kan 305，日本)，注冊(cè)號(hào)為FERMBP-5022。
分離自具有7個(gè)堿基的識(shí)別序列的鏈霉菌種YH8647的限制性核酸內(nèi)切酶具有如上所述的特性，被稱(chēng)為Sse8647I。
下面詳述生產(chǎn)限制性核酸內(nèi)切酶Sse8647I的方法。
可將所用菌株能同以來(lái)生產(chǎn)Sse8647I的任何營(yíng)養(yǎng)物加入到培養(yǎng)基中。可用葡萄糖、麥芽糖、甘油等物作碳源，而用醋母膏、胨、玉米漿、肉湯等物作氮源。另外，也可以加入礦物質(zhì)和金屬鹽、如磷酸鹽、鉀鹽和鎂鹽。
Sse8647 I的產(chǎn)量因培養(yǎng)條件的變化而不同。良好的結(jié)果通常在溫度范圍為20-35℃和PH值范圍為6-8條件下獲得。可通過(guò)在通氣、攪拌下培養(yǎng)1-3天達(dá)到最高產(chǎn)量。不用說(shuō)，應(yīng)根據(jù)所使用的菌株和培養(yǎng)基的組成來(lái)酌情選擇最適培養(yǎng)條件。
用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶Sse8647 I主要在微一物細(xì)胞中濃集?？赏ㄟ^(guò)諸如離心等方法從培養(yǎng)液中分離出生長(zhǎng)細(xì)胞。使用通常用于限制性核酸內(nèi)切酶的已知技術(shù)能夠分離和純化所形成的限制性核酸內(nèi)切酶。例如，將所收集的微生物細(xì)胞分散于緩沖液中，然后通過(guò)超聲波處理打碎細(xì)胞而提取限制性核酸內(nèi)切酶。
在利用超速離心法除去細(xì)胞碎片后，例如，將所得到的上清液溶于緩沖液A(含20mM磷酸鉀、PH7.5、10mM2-巰基乙醇和5％的甘油)或緩沖液B(含20mM Tris-Hcl、PH7.5、10mM 2-巰基乙醇)中，將溶液對(duì)同樣的緩沖液透析。然后通過(guò)離子交換色譜法、分子篩色譜法或親和色譜法來(lái)提純透析液，由此得到本發(fā)明的限制性核酸內(nèi)切酶。例如，向提取液中加入硫酸銨進(jìn)行鹽析，將發(fā)離出的沉淀物溶于緩沖液A或緩沖液B中，將溶液對(duì)同樣的緩沖液透析。利用離子交換色譜法，分子篩色譜法或親和色譜法來(lái)提純透析液，由此得到本發(fā)明的限制性核酸內(nèi)切酶。
根據(jù)下述方法來(lái)確定該限制性核酸內(nèi)切酶的活性。
制備組成如表2所示的底物溶液。[表2]10mM Tris-HCl，pH9.110mM MgCl27mM2-巰基乙醇1.0μg 腺病毒-2DNA
將該溶液(48ml)預(yù)熱至37℃，然后加入所要測(cè)試的Sse8647I(2μl)樣品使酶反應(yīng)此溫度下進(jìn)行，10分鐘后加入5μl終止溶液(1％ SDS、5％甘油和0.02％溴酚藍(lán))使反應(yīng)停止。
將反應(yīng)混合液施于0.7％的醇脂糖平板凝膠上，在10V/cm恒壓下進(jìn)行電泳約1-2小時(shí)。電泳所用緩沖液為含2.5mM EDTA的90mM Tris-硼酸鹽緩沖液(PH8.3)。如果事先向凝膠中加入0.5Mg/ml溴化乙錠，則可通過(guò)紫外輻射來(lái)檢測(cè)DNA帶。當(dāng)DNA片段帶的數(shù)目和強(qiáng)度不再變儀時(shí)，認(rèn)為電泳已進(jìn)行完全。
將37℃下反應(yīng)1小時(shí)后確保1μg腺病毒-2DNA(由Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))完全消化的限制性核酸內(nèi)切酶活性定義為一個(gè)單位。
限制性核酸內(nèi)切酶Sse8647 I具有如下所述的物理化學(xué)特性。
(1)作用和底物特異性此限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式1的核苷酸序列并在箭頭所示位點(diǎn)上將其裂解。[化學(xué)結(jié)構(gòu)式1] 如下所述確定限制性核酸內(nèi)切酶Sse8647 I所識(shí)別的核苷酸序列。
限制性核酸內(nèi)切酶Sse8647 I在8個(gè)位點(diǎn)上裂解腺病毒-2DNA，但不能裂解λ-DNA、PUC18、M13mp18、SV40、C01EI、PBR322和φX173 DNA。
除了上述的DNA分子切割頻率之外，根據(jù)每一個(gè)所消化的DNA片段的大小，該限制性核酸內(nèi)切酶可望識(shí)別DNA分子中下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式2的核苷酸序列。 上示7堿基核苷酸序列包括Ava II限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的5個(gè)堿基(化學(xué)結(jié)構(gòu)式3)。 因此進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，其中腺病毒-2 DNA在用Sse8647 I消化前先用AvaII消化。這些DNA片段所形成的電泳圖譜與Sse8647 I單一消化的電泳圖譜完全相同。從這些結(jié)果可以得示以下結(jié)論限制性核酸內(nèi)切酶Sse8647 I可識(shí)別化學(xué)結(jié)構(gòu)式2所示的核苷酸序列。
為了確定Sse8647 I的裂解位置，含有腺病毒-2 DNA之HpaI-BglII片段的M13RF衍生物是通過(guò)將該片段插入M13mp18(由Takara Shu20有限公司生產(chǎn))的SmaI-BamHI位點(diǎn)而構(gòu)建。上述HpaI-BglII片段之核苷酸序列(包括Sse8647 I的一個(gè)識(shí)別序列)如SEQ ID NO1所示。通過(guò)常用方法由M13 RF衍生物制備出單鏈DNA。M13引物M4(由Takara Shuzo有限公司生產(chǎn))如SEQ ID NO2所示，其結(jié)合于M13 RF的多克隆位點(diǎn)附近的位點(diǎn)上，利用熒光化合物在5’未端對(duì)其進(jìn)行未端標(biāo)記。用如上制備的單鏈DNA對(duì)該引物進(jìn)行退火，并用來(lái)自芽孢擴(kuò)菌屬B.caldote-nax的DNA聚合酶(BcaBEST DNA聚合酶，由Takara Shuzo有限公司生產(chǎn))將其延長(zhǎng)。用Sse8647 I消化所生成的雙鏈DNA，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分析所消化的DNA片段的大小。經(jīng)檢測(cè)上述消化反應(yīng)的產(chǎn)物為在下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式4箭頭所示位點(diǎn)上消化的帶?！?′-AGGACCT-3′另外，利用T4 DNA聚合酶(由Takare Shuzo有限公司生產(chǎn))來(lái)鈍反未端便消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槿龎A基長(zhǎng)產(chǎn)物。由這些實(shí)臨得示以下結(jié)論Sse8647 I可識(shí)別化學(xué)結(jié)構(gòu)式1所示的核苷酸序列，可在化學(xué)結(jié)構(gòu)式4箭頭所示位點(diǎn)上消化DNA。
(2)酶活性的最適條件(I)最適溫度Sse8647 I之最適溫度約為30℃。
(II)是適PHSse8647 I之最適PH范圍為7.5～9.5。
(III)鹽濃度Sse8647 I之最適鹽濃度范圍為omM KCl或NaCl。
(IV)MgCl2濃度在MgCl2濃度范圍為5mM-20mM時(shí)活化Sse8647 I的酶反應(yīng)。
(3)分子量的確定可利用平衡密度梯度離心來(lái)確定天然蛋白質(zhì)之Sse8647 I的分子量。利用表3所示的緩沖液中的甘油來(lái)制備密度梯度。10mM Tris-HCl，pH7.510mM 2-巰基乙醇100mMKCl10-25％ 甘油在5ml的試管中，制備出4.8ml連續(xù)10-25％(從上至下)梯度，在200μl的同樣緩沖液中的Sse8647 I蛋白質(zhì)通過(guò)梯度沉降。作為對(duì)比，標(biāo)記蛋白質(zhì)CSDS-PAGE分子量標(biāo)準(zhǔn)低范圍，由Bio-Rad股分有限公司實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))通過(guò)相同梯度沉降。
在搖擺式旋轉(zhuǎn)器中以45,000rpm對(duì)梯度進(jìn)行離心，溫度為4℃，時(shí)間為21小時(shí)。
離心以后，從梯度上部收集250μl部分，部分計(jì)數(shù)為1-20。
測(cè)定這些部分的酶活性。在第12部分測(cè)到最高活性。從沉降后經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行標(biāo)記蛋白質(zhì)分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)內(nèi)推Sse8647 I蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)。
對(duì)Sse8647 I近天然分子量進(jìn)行計(jì)算，約為60,000-75,000。
下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1(1)Sse8647 I的制備制備如表4所示的培養(yǎng)基。將含有20ml該培養(yǎng)基的容積為100ml的一個(gè)燒瓶和含有500ml該培養(yǎng)基的容積為2L的4個(gè)燒瓶用常用方法進(jìn)行滅菌。
在上述100ml燒瓶中，鏈霉菌種YH8647(FERM BP-5022)在震蕩下生長(zhǎng)48小時(shí)，溫度為30℃。將此培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至2L的燒瓶中(每瓶5ml)，繼續(xù)震蕩48小時(shí)，溫度為30℃。對(duì)這些培養(yǎng)液進(jìn)行冷凍離心，收獲得到43.3g細(xì)胞。甘油 17.5g多胨 3.5g肉膏 3.5g酵母膏3.5gNaCl 2.0gK2HPO41.0gMgSO40.5g水 11pH7.2-7.4將上面得到的43.3g微生物細(xì)胞懸浮于130ml的緩沖液B(20mM Tris-HCl，PH7.5、10mM2-巰基乙醇)中，用超聲壓碎機(jī)對(duì)懸浮液進(jìn)行處理以破碎細(xì)胞壁，對(duì)所得混合液進(jìn)行離心(100,000xg，1小時(shí))以除去殘?jiān)Ｏ蛩玫降纳锨逡?148ml)中加入KCl至0.2M，然后將該溶液吸附于70ml磷酸纖維素P11(由Whetman公司生產(chǎn))填充柱上，P11預(yù)先曾用含0.2M KCl的緩沖液B平稀過(guò)。用上述相同緩沖液沖洗后，用含0.2M-0.8MKCl的緩沖液B對(duì)吸附部分進(jìn)行洗脫(線(xiàn)性濃度梯度技術(shù))。
將如此得到的活性部分混合起來(lái)，將混合液對(duì)緩沖液B透析，將透析物再次吸附于8.5ml DEAE-纖維素DE52(由Whatman公司生產(chǎn))填充柱上，DE52預(yù)先曾用緩沖液B平衡過(guò)。在用上述同樣緩沖液徹底沖洗后，用含OM-0.8M KCl的緩沖液B對(duì)所吸附部分進(jìn)行洗脫(線(xiàn)性濃度梯度技術(shù))。
另外，將這樣得到的活性部分混合起來(lái)，將混合液對(duì)緩沖液B透析4小時(shí)，將透析物再次吸附于2ml肝素瓊脂糖(由Pharmacia生物技術(shù)公司生產(chǎn))填充柱上，瓊脂糖預(yù)先曾用緩沖液B平衡過(guò)。在用上述同樣緩沖液徹底沖洗后，用含有OM-0.8M KCl的緩沖液B對(duì)吸附部分進(jìn)行洗脫(線(xiàn)性濃度梯度技術(shù))，得到限制性核酸內(nèi)切酶Sse8647 I的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
該標(biāo)準(zhǔn)樣品沒(méi)有任何非特異性脫氧核糖核酸酶或磷酸酶。
上述純化方法從43.3g微生物濕細(xì)胞中給出600單位的活性。
本發(fā)明提供了一種新的限制性核酸內(nèi)切酶，其能夠識(shí)別和裂解雙鏈ONA分子中7堿基序列。本發(fā)明的核酸內(nèi)切酶在遺傳工程領(lǐng)域中具有重大利用價(jià)值，例如可用于長(zhǎng)鏈DNA分子的分析及其它用途。序列目錄SEQ ID NO1長(zhǎng)度253類(lèi)型核酸鏈次雙鏈拓?fù)鋵W(xué)純性分子類(lèi)型基因組DNA序列描述SEQ ID NO1AACCTACACC AGTGTAAAAG AGGTATCTTT TGTGTGGTCA AGCAGGCCAA ACTTACCTAC 60GAAAAAACCA CTACCGGCAA CCGCCTCAGC TACAAGCTAC CCACCCAGCG CCAAAAACTG120GTGCTTATGG TGGGAGAAAA ACCTATCACC GTCACCCAGC ACTCGGCAGA AACAGAGGGC180TGCCTGCACT TCCCCTATCA GGGTCCAGAG GACCTCTGCA CTCTTATTAA AACCATGTGT240GGTATTAGAG ATC 253SEQ ID NO2長(zhǎng)度17類(lèi)型核酸鏈次單鏈拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性分子類(lèi)型其它核酸(合成DNA)序列描述SEQ ID NO2GTTTT CCCAG TCACGAC 1權(quán)利要求
1.一種限制性核酸內(nèi)切酶，其可以嚴(yán)格地識(shí)別雙鏈脫氧核糖核酸中下列化學(xué)結(jié)構(gòu)式1的核苷酸序列，并在箭頭所示位點(diǎn)上嚴(yán)格地裂解上述核苷酸序列， 其中，A、G、T和C分別代表腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。
2.如權(quán)利要求1所定義的限制性核酸內(nèi)切酶，其中所述限制性核酸內(nèi)切酶為Sse 8647 I，其具有下列物理化學(xué)特性(a)最適溫度約30℃(b)最適PH7.5-9.5(c)分子量60,000-75,000。
3.生產(chǎn)如權(quán)利要求1或2所述的限制性核酸內(nèi)切酶的方法，該方法包括培養(yǎng)一種屬于鏈霉菌屬，具有鏈霉菌種YH8647(FERM BP-5022)所述鑒別特性，可以產(chǎn)生所述限制性核酸內(nèi)切酶的菌株，并從培養(yǎng)液中回收上述限制性核酸內(nèi)切酶。
全文摘要
一種限制性核酸內(nèi)切酶，其可以識(shí)別雙鏈DNA上列化學(xué)結(jié)構(gòu)式1的核苷酸序列，并在箭頭所示位點(diǎn)上嚴(yán)格裂解上述核苷酸序列。核酸內(nèi)切酶可通過(guò)培養(yǎng)能產(chǎn)生它的鏈霉菌屬的菌株(FERMBP-5022)來(lái)制備。
文檔編號(hào)C12N9/16GK1120069SQ9510899
公開(kāi)日1996年4月10日 申請(qǐng)日期1995年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月28日
發(fā)明者野村佳子, 石野良純, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社