專利名稱：枯草桿菌蛋白酶變異體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的羰基水解酶變異體，其氨基酸序列中相應(yīng)于前體羰基水解酶的多個氨基酸殘基，尤其是那些對應(yīng)于或相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草桿菌蛋白酶+76位置的殘基并結(jié)合一個或多個選自下組的殘基+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，被不同的氨基酸所取代。一般，這種突變/變異羰基水解酶的獲得是通過體外修飾編碼天然或重組羰基水解酶的前體DNA序列，使其僅編碼前體氨基酸序列中取代的多個氨基酸殘基，或同時還編碼前體氨基酸序列中的其它取代、插入或缺失。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶是羰基水解酶的一個亞類。它們包括一組不同的、具有廣譜特異性和生物學(xué)功能的酶。參見Stroud，R.Sci.Amer.，13174—88。盡管它們功能各異，但是絲氨酸蛋白酶的的催化機制已由對至少兩類遺傳學(xué)上截然不同家族酶的研究所提出枯草桿菌蛋白酶和相關(guān)的哺乳動物胰凝乳蛋白酶以及同源的細菌絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶和S.gresius胰蛋白酶)。這兩個家族的絲氨酸蛋白酶具有非常類似的催化機制。參見Kraut，J.(1977)，Ann.Rev.Biochem.，46331—358。此外，盡管這兩類酶家族的一級結(jié)構(gòu)不相關(guān)，但是它們的三級結(jié)構(gòu)都形成由絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸組成的保守性催化三氨基酸結(jié)構(gòu)。
枯草桿菌蛋白酶是一種絲氨酸內(nèi)切蛋白酶(分子量27,500)，各種不同桿菌屬種和其他微生物都大量分泌該酶。已經(jīng)確定了至少4種不同桿菌屬種的枯草桿菌蛋白酶的蛋白質(zhì)序列。參見Markland，F(xiàn).S.，et al.(1983)，Honne—Seyler′s Z.Physiol.Chem.，3641537—1540。已經(jīng)報道了分辨率為2.5埃的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的三維晶體結(jié)構(gòu)。參見Wright，C.S.，et al.(1969)Na-ture，221235—242；Drenth，J.，et al.(1972)，Eur.J.Biochem.，26177—181。這些研究表明，盡管枯草桿菌蛋白酶與哺乳動物絲氨酸蛋白酶在遺傳學(xué)上是不相關(guān)的，但是具有類似的活性部位結(jié)構(gòu)。含有共價相連的肽抑制劑的枯草桿菌蛋白酶(Robertus，J.D.，et al.(1972)，Biochemistry，112439—2449)或產(chǎn)物復(fù)合物(Robertus，J.D.，et al.(1976)，J.Biol Chem.，2511097—1103)的X射線晶體結(jié)構(gòu)提供了有關(guān)枯草桿菌蛋白酶活性部位和假設(shè)的底物結(jié)合裂隙的信息。此外，已報道了大量枯草桿菌蛋白酶動力學(xué)和化學(xué)修飾方面的研究(Philipp，M.，et al.(1983)，Mol.Cell.Biochem..，515—32；Svendsen，B.(1976)，Carlsberg Res.Comm.，41237—291；Markland，F(xiàn).S.Id.)，而且至少有一則報道說枯草桿菌殘基222處的甲硫氨酸側(cè)鏈被過氧化氫轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸亞砜(Stauffer，D.C.，et al.(1965)，J.Biol.Chem.，2445333—5338)，并且殘基221處的絲氨酸側(cè)鏈用化學(xué)修飾法轉(zhuǎn)變成半胱氨酸(Polgar，et al.(1981)，Biochimica et Biophsica Acta，667351—354.)。
美國專利4,760,025(RE 34,606)公開了對枯草桿菌蛋白酶氨基酸殘基的修飾，這些殘基對應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶位置中的酪氨酸—1、天冬氨酸+32、天冬酰胺+155、酪氨酸+104、甲硫氨酸+222、甘氨酸+166、組氨酸+64、甘氨酸+169、苯丙氨酸+189、絲氨酸+33、絲氨酸+221、酪氨酸+217、谷氨酸+156和丙氨酸+152。美國專利5,182,204公開了解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中氨基酸殘基+224及其他枯草桿菌蛋白酶中相應(yīng)位置的修飾情況，其中是通過取代、插入或缺失而進行修飾而且可以與美國專利4,760,025(RE 34,606)所述的殘基修飾結(jié)合以形成有用的枯草桿菌蛋白酶突變體或變異體。美國專利5,155,033公開了類似的突變型枯草桿菌蛋白酶，其中它在相應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+225位有修飾。美國專利5,185,285和5,204,015公開了在+123和/或+274位有修飾的突變型枯草桿菌蛋白酶。這些專利的公開內(nèi)容在此引用作為參考，同時引用作為參考的還有美國專利申請07/898，382。該申請公開了枯草桿菌蛋白酶中許多氨基酸殘基的修飾情況，具體包括+99、+101、+103、+107、+126、+128、+135、+197和+204。所有這些專利/申請都是共同擁有的。美國專利4,914,031公開了某些枯草桿菌蛋白酶類似物，包括在+76位被修飾的枯草桿菌蛋白酶。該專利的公開內(nèi)容也在此引用作為參考。但是，本文指明的特定殘基和/或此處提出權(quán)利要求的具體組合并沒有在這些文獻中提及。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種羰基水解酶(最好是枯草桿菌蛋白酶)變異體，它含有DNA編碼的前體羰基水解酶中多個取代的氨基酸殘基，這些取代對應(yīng)于或相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶殘基+76位置的殘基并結(jié)合一個或多個選自下組的殘基+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，被不同的氨基酸所取代。與衍生出該變異體氨基酸的羰基水解酶前體比較，這些變異體通常至少有一種不同于前體相應(yīng)特性的性質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼該羰基水解酶變異體的DNA序列，以及含有該突變DNA序列的表達載體。
此外，本發(fā)明的另一目的是提供用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，以及能夠表達該DNA從而能在胞內(nèi)或胞外產(chǎn)生羰基水解酶變異體的宿主細胞。
列出上述文獻僅僅是因為它們是在本申請的申請日之前公開的，并不意味著本發(fā)明的發(fā)明人不能憑借先發(fā)明或基于更早申請的優(yōu)先權(quán)而位于這些公開文獻之前。發(fā)明概述本發(fā)明包括非天然產(chǎn)生的羰基水解酶變異體，與衍生出該變異體氨基酸的前體羰基水解酶比較，它們具有不同的蛋白水解活性、穩(wěn)定性、底物特異性、pH分布圖和/或工作性能。前體羰基水解酶可以是天然產(chǎn)生的羰基水解酶或重組的羰基水解酶。具體地，這種羰基水解酶變異體具有自然界沒有發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，它是通過用不同的氨基酸置換前體羰基水解酶的多個氨基酸衍生而得。前體酶的這些多個氨基酸殘基對應(yīng)于+76位并結(jié)合一個或多個選自下組的殘基+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，其中編號位置對應(yīng)于天然解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶或相應(yīng)于其他羰基水解酶或枯草桿菌蛋白酶如透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的氨基酸殘基。本發(fā)明的羰基水解酶變異體含有氨基酸殘基+76處的置換并結(jié)合一個或多個其他修飾。較佳地，本發(fā)明的變異酶含有下列組合氨基酸殘基的取代、缺失或插入76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222。最佳地，本發(fā)明的變異酶含有下列殘基組合的氨基酸殘基取代、缺失或插入解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。
本發(fā)明還包括編碼這種羰基水解酶或枯草桿菌蛋白酶變異體的變異DNA序列。這些變異DNA序列衍生自編碼天然存在的或重組前體酶的前體DNA序列。變異DNA序列是通過修飾前體DNA序列使其編碼一個或多個具體取代的氨基酸殘基而得到，其中這些被前體DNA序列編碼的氨基酸殘基對應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌中76、99、101、103、104、107、123、27、105、109、126、128、135、156、166、195、197、204、206、210、216、217、218、222、260、265和/或274或其任何組合。盡管確定的被修飾氨基酸殘基與可應(yīng)用于解淀粉芽孢桿菌的編號相同(這種編號方法已成為確定所有枯草桿菌蛋白酶中殘基位置的常規(guī)方法。)，但是用于本發(fā)明的優(yōu)選前體DNA序列是如圖6所示的透鏡狀芽孢桿菌的DNA序列(SEQ ID No.11)。
本發(fā)明的變異DNA序列編碼76位插入或取代的氨基酸殘基并結(jié)合一個或多個其他修飾。較佳地，變異DNA序列編碼下列組合的取代或插入氨基酸殘基76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222。最佳地，變異DNA序列編碼下列組合修飾的殘基76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。這些重組DNA序列編碼的羰基水解酶變異體具有新的氨基酸序列，而且與前體羰基水解酶DNA序列編碼的酶相比，通常至少有一種基本上不同于前體酶相應(yīng)特性的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括蛋白水解活性、底物特異性、穩(wěn)定性、改變的pH分布圖和/或增強的工作性能。
本發(fā)明包括在指定的氨基酸殘基位置處的19種天然L—氨基酸的任何取代。這種取代可以在任何前體枯草桿菌蛋白酶上進行(原核的、真核的、哺乳動物的等)。較佳地，取代是在各確定的氨基酸殘基位置進行，包括(但并不限于)這些位置76位的取代包括D、H、E、G、F、K、P和N；99位的取代包括D、T、N、Q、G和S；101位的取代包括G、D、K、L、A、E、S和R；103位的取代包括Q、T、D、E、Y、K、G、R、S和A；76位的取代包括D、H、E、G、F、K、P和N；104位的取代包括所有19種天然氨基酸；107位的取代包括V、L、M、Y、G、E、F、T、S、A、N和I；123位的取代包括N、T、I、G、A、C和S；27位的取代包括K、N、C、V和T；105位的取代包括A、D、G、R和N；107位的取代包括A、L、V、Y、G、G、T、S和A；109位的取代包括S、K、R、A、N和D；126位的取代包括A、F、I、V和G；128位的取代包括G、L和A；135位的取代包括A、F、I、S和V；156位的取代包括D、E、A、G、Q和K；166位的取代包括所有19種天然氨基酸；195位的取代包括E；197位的取代包括E；204位的取代包括A、G、C、S和D；206位的取代包括L、Y、N、D和E；210位的取代包括L、I、S、C和F；216位的取代包括V、E、T和K；217位的取代包括所有19種天然氨基酸；218位的取代包括S、A、G、T和V；222位的取代包括所有19種天然氨基酸；260位的取代包括P、N、G、A、S、C、K和D；265位的取代包括N、G、A、S、C、K、Y和H；和274位的取代包括A和S。在各位置上特別優(yōu)選的取代氨基酸列于表I。盡管在表I中列出了具體的氨基酸，但是應(yīng)理解，所確定的殘基可用任何氨基酸進行取代。
表I氨基酸殘基 優(yōu)選的取代/插入氨基酸+76D，H+99D，T，N，G+101 R，G，D，K，L，A，E+103 A，Q，T，D，E，Y，K，G，R+104 I，Y，S，L，A，T，G，F(xiàn)，M，W，D，V，N+107 V，L，Y，G，F(xiàn)，T，S，A，N+123 S，T，I+27K+105 A，D+109 S，K，R+126 A，I，V，F(xiàn)+128 G，L+135 I，A，S
+156 E，D，Q+166 D，G，E，K，N，A，F(xiàn)，I，V，L+195 E+197 E+204 A，G，C+206 L+210 I，S，C+216 V+217 H，I，Y，C，A，G，F(xiàn)，S，N，E，K+218 S+222 A，Q，S，C，I，K+260 P，A，S，N，G+265 N，A，G，S+274 A，S此外，本發(fā)明包括含有該變異體羰基水解酶DNA序列的表達載體及用該載體轉(zhuǎn)化的、能夠產(chǎn)生該變異體的宿主細胞。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明羰基水解酶變異體的去垢劑組合物。
附圖簡述

圖1A-C是解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的DNA和氨基酸序列以及該基因(SEQ ID No.6)的部分限制酶圖譜。
圖2顯示了解淀粉芽孢桿菌(BPN′)和透鏡狀芽孢桿菌(野生型)的枯草桿菌蛋白酶中保守氨基酸殘基。
圖3A和3B顯示了4種枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列。最上面一行是解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(有時也稱為枯草桿菌蛋白酶BPN′)的氨基酸序列(SEQ ID No.7)。第二行是枯草桿菌(Bacil-lus subtilis)的枯草桿菌蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID No.8)。第三行是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的枯草桿菌蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID No.9)。第四行是透鏡狀芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶(在PCT WO89/06276中也稱為枯草桿菌蛋白酶309)氨基酸序列(SEQ ID No.10)。符號“*”表示與枯草桿菌BPN′相比，缺失特定的氨基酸殘基。
圖4是質(zhì)粒GGA274的構(gòu)建圖。
圖5是質(zhì)粒GGT274的構(gòu)建圖，該質(zhì)粒是本申請中所用的某些表達質(zhì)粒的中間質(zhì)粒。
圖6A和6B是透鏡狀芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的DNA和氨基酸序列(SEQ ID No.11)。成熟的枯草桿菌蛋白酶由從對應(yīng)于Ala的密碼子GCG(334—336)開始的密碼子所編碼。
圖7A和7B是本發(fā)明的一個優(yōu)選例子(N76D/S103A/V104I)的DNA和氨基酸序列(SEQ ID No.12)。該圖中的DNA用所述的方法進行修飾，從而編碼76位的天冬氨酸、103位的丙氨酸和104位的異亮氨酸。成熟的枯草桿菌蛋白酶變異體由從對應(yīng)于Ala的密碼子GCG(334—336)開始的密碼子所編碼。
圖8是載體pBCDAICAT的構(gòu)建圖。
圖9是載體pUCCATFNA的構(gòu)建圖。
圖10顯示了在液態(tài)去垢劑配方中，與野生型相比，優(yōu)選的突變酶的穩(wěn)定性。
發(fā)明詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對透鏡狀芽孢桿菌中相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+76位的氨基酸殘基進行體外突變，可以產(chǎn)生穩(wěn)定性與前體枯草桿菌蛋白酶不同(例如改變的自我蛋白水解穩(wěn)定性)的枯草桿菌蛋白酶變異體(見表IV和VI)。
還發(fā)現(xiàn)，對相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274位的殘基進行體外突變，無論單獨或互相組合的突變，以及以任何與+76位突變組合一起進行，則產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶變異體具有不同的蛋白水解活性、不同的熱穩(wěn)定性、不同的pH分布圖、不同的底物特異性和/或不同的工作性能。
羰基水解酶是水解含有 鍵的化合物的酶，其中，X為氧或氮。它們包括天然存在的羰基水解酶和重組羰基水解酶。天然存在的羰基水解酶主要包括水解酶，例如肽水解酶如枯草桿菌蛋白酶或金屬蛋白酶。肽水解酶包括α-氨?；乃饷?、肽基(peptidyl)氨基酸水解酶、酰氨基水解酶、絲氨酸羧肽酶、金屬羧肽酶、巰基蛋白酶、羧基蛋白酶和金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、巰基蛋白酶和酸性蛋白酶被包括在內(nèi)，還包括內(nèi)切和外切蛋白酶。
“重組羰基水解酶”指這樣的羰基水解酶，其中編碼天然羰基水解酶的DNA序列被修飾以產(chǎn)生編碼羰基水解酶氨基酸序列中一個或多個氨基酸取代、插入或缺失的突變型DNA序列。合適的修飾方法公開于本文、美國專利4,760,025(RE 34,606)、美國專利5,204,015和美國專利5,185,258中，這些文獻在此引用作為參考。
枯草桿菌蛋白酶是細菌或真菌的羰基水解酶，它們一般切除蛋白質(zhì)或肽的肽鍵。如本文所用，“枯草桿菌蛋白酶”指天然存在的枯草桿菌蛋白酶或重組的枯草桿菌蛋白酶。已知各種微生物會產(chǎn)生和分泌一系列天然存在的枯草桿菌蛋白酶。這一系列中的各成員的氨基酸序列并不完全同源。但是，該系列中的枯草桿菌蛋白酶具有相同或相似類型的蛋白水解活性。這類絲氨酸蛋白酶具有共同的確定催化的三元結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，該催化性三元結(jié)構(gòu)使其與胰凝乳蛋白酶相關(guān)類的絲氨酸蛋白酶區(qū)分開。枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶兩者都具有由天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸組成的催化性三元結(jié)構(gòu)。在枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的蛋白酶中，這些氨基酸的相對次序從氨基端到羧基端依次為天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸。但是，在胰凝乳蛋白酶相關(guān)的蛋白酶中，相對次序為組氨酸—天冬氨酸—絲氨酸。因此，本文中枯草桿菌蛋白酶指具有枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的蛋白酶的催化性三元結(jié)構(gòu)的絲氨酸蛋白酶。具體例子包括(但不限于)圖3所示的枯草桿菌蛋白酶。
“重組枯草桿菌蛋白酶”指這樣的枯草桿菌蛋白酶，其中編碼枯草桿菌蛋白酶的DNA序列被修飾從而產(chǎn)生編碼天然存在枯草桿菌蛋白酶氨基酸序列中一個或多個氨基酸的取代、缺失或插入的變異(或突變)DNA序列。用于產(chǎn)生這種修飾的合適方法，以及可以與此處公開的方法結(jié)合使用的方法，包括在下列文獻中公開的方法美國專利4,760,025(RE34,606)、美國專利5,204,015和美國專利5,185,258。
“非人體羰基水解酶”及其編碼DNA可以從眾多原核和真核有機體中獲得。原核有機體的合適例子包括革蘭氏陰性有機體如大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas)，革蘭氏陽性細菌如微球菌(Micro-cocuus)或桿菌(Bacillus)?？色@得羰基水解酶及其基因的真核有機體的例子包括酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，真菌如曲霉屬(Aspergillus sp.)和人以外的哺乳動物如牛，從中可以獲得編碼羰基水解酶凝乳酶的基因。與枯草桿菌蛋白酶相同，從各種相關(guān)物種中可以獲得一系列羰基水解酶，它們的氨基酸序列在該系列中的各成員之間并不完全同源，但是卻具有相同或相似類型的生物活性。因此，此處所用的非人體羰基水解酶具有一個功能上的定義，即與原核和真核來源直接或間接相關(guān)的羰基水解酶。
“羰基水解酶變異體”的氨基酸序列衍生自“前體羰基水解酶”的氨基酸序列。前體羰基水解酶(如枯草桿菌蛋白酶)包括天然存在的羰基水解酶(枯草桿菌蛋白酶)和重組羰基水解酶(枯草桿菌蛋白酶)。羰基水解酶變異體的氨基酸序列是通過前體氨基酸序列中一個或多個氨基酸的取代、缺失或插入而從前體蛋白酶氨基酸序列衍生而得。這種修飾是對編碼前體羰基水解酶(枯草桿菌蛋白酶)的“前體DNA序列”進行的，而不是對前體羰基水解酶(枯草桿菌蛋白酶)本身進行修飾。合適的對前體DNA序列進行操作的方法包括此處公開的方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如參見，EP0328299，WO89/06279和那些在此引用的美國專利和申請。)。
對應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶+76位并結(jié)合一個或多個選自下組位置+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274的特定殘基被用于突變。較佳地，修飾的殘基選自下列組合76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222；最佳地是76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。這些氨基酸位置的編號對應(yīng)于圖1中給出的成熟解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的編號。但是，本發(fā)明并不局限于這個特定枯草桿菌蛋白酶的突變，還延伸包括在“相當(dāng)于”解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中各確定殘基的位置處具有氨基酸殘基的前體羰基水解酶的突變形式。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例子中，前體枯草桿菌蛋白酶是透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶，而取代、缺失或插入是在透鏡狀芽孢桿菌中相當(dāng)于上述位置的氨基酸殘基處進行的。
如果前體羰基水解酶的殘基(氨基酸)與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定殘基或殘基部分是同源的(即在一級或三級結(jié)構(gòu)中位置對應(yīng))或類似的(即具有相同或相似的結(jié)合、反應(yīng)或化學(xué)作用等功能)，那么它與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的殘基是相當(dāng)?shù)摹?br> 為了確立與一級結(jié)構(gòu)的同源性，前體羰基水解酶的氨基酸序列與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的一級序列直接進行比較，尤其與一系列在已知序列的枯草桿菌蛋白酶中已知的不變殘基進行比較。圖2顯示了解淀粉芽孢桿菌和透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶之間的保守殘基。將保守殘基排列好之后，其中允許必要的插入和缺失以維持排列(即避免通過任意的缺失和插入而導(dǎo)致消除保守殘基)，便可確定與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶一級序列中特定氨基酸相當(dāng)?shù)臍埢?。保守殘基的排列最?00％地保留這種殘基。但是，大于75％或少至50％的排列也已足以確定相當(dāng)?shù)臍埢?。催化性三元結(jié)構(gòu)即Asp32/His64/Ser221的保守性應(yīng)保留。
例如，在圖3中，來自解淀粉芽孢桿菌、枯草桿菌、地衣芽孢桿菌(carlsbergensis)和透鏡狀芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列被排列在一起以提供序列間最大程度的同源性。這些序列間的比較表明，在各序列中都含有一些保守殘基。這些保守殘基(BPN′和透鏡狀芽孢桿菌之間)在圖2中指明。
因此，這些保守殘基可用于確定解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶在其他羰基水解酶如來自透鏡狀芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶(PCT出版物No.WO89/06279，1989年7月13日出版)(此處優(yōu)選的枯草桿菌蛋白前體酶)或稱為PB92的枯草桿菌蛋白酶(EP0328299)(它與優(yōu)選的透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶高度同源)中對應(yīng)的相當(dāng)氨基酸殘基。在圖3A和3B中排列了某些這種枯草桿菌蛋白酶和解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列，以顯示保守殘基的同源性最大。從中可以看出，與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶相比，透鏡狀芽孢桿菌的序列中有一些缺失。因此，例如在解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中Val165的相當(dāng)氨基酸在透鏡狀芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中為異亮氨酸。
因此，例如在解淀粉芽孢桿菌和透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中+76位的氨基酸都是天冬酰胺(N)。但是，在本發(fā)明的優(yōu)選枯草桿菌蛋白酶變異體中，相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中+76的氨基酸可以用天冬氨酸(D)取代。出于闡述目的，在表II中列出了此處指明的被取代的某些氨基酸殘基和各位置的最佳取代之間的比較情況。
表II+76 +99 +101 +103 +104 +107 +123液化性淀粉桿菌 NDSQ Y I N(野生型)透鏡狀芽孢桿菌 NSSS V I N(野生型)最佳取代DDRAI/YV S對于三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)用X射線晶體法確定的前體羰基水解酶，也可以通過比較三級結(jié)構(gòu)的同源性而確定相當(dāng)?shù)臍埢?。相?dāng)?shù)臍埢亩x是，在排列之后，前體羰基水解酶和解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的一個特定氨基酸殘基的兩個或多個主鏈原子的原子坐標(biāo)(N對N，CA對CA，C對C和O對O)在0.13nm之內(nèi)，更佳地在0.1nm之內(nèi)的殘基。在最佳模型被取向和定位以給出該羰基水解酶的非氫蛋白質(zhì)原子與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的原子坐標(biāo)間最大重迭后，便完成了排列。最佳模型是在最高分辨率下使試驗衍射數(shù)據(jù)的R因子最低的晶體模型。 與解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定殘基在功能上類似的相當(dāng)殘基被定義為前體羰基水解酶的這種氨基酸，它們采用某種構(gòu)象使得它們或者改變、修飾或?qū)Φ鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或催化等起作用，并且按照解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的特定殘基所限度或歸屬的方式進行。此外，它們是前體羰基水解酶(已獲得X晶體衍射圖)中這樣的氨基酸，它們占據(jù)一個類似位置使得殘基的至少兩個側(cè)鏈原子的原子坐標(biāo)在對應(yīng)的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的側(cè)鏈原子的0.13nm之內(nèi)，盡管給定的殘基的主側(cè)鏈原子沒有滿足基于占據(jù)同源位置的相當(dāng)殘基標(biāo)準(zhǔn)。解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)顯示在EPO出版物No.0251446(對應(yīng)于美國專利申請08/212,291，其公開內(nèi)容在此引用作為參考)中，可如上所述用其確定三級結(jié)構(gòu)水平的相當(dāng)殘基。
指定被取代、插入或缺失的殘基中，一些是保守殘基，而另一些不是保守殘基。當(dāng)殘基不是保守性的時，一個或多個氨基酸的置換被限定于這樣的取代，它們導(dǎo)致產(chǎn)生具有不同于自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的變異體。當(dāng)殘基是保守的時，這種置換不應(yīng)產(chǎn)生天然存在的序列。本發(fā)明的羰基水解酶變異體包括羰基水解酶變異體的成熟形式，以及這種水解酶變異體的原(pro-)或前原(prepro-)形式。前原形式是優(yōu)選的，因為這便于羰基水解酶變異體的表達、分泌和成熟化。
“原序列”指與成熟形式的羰基水解酶的N末端部分相連的氨基酸序列，但它被去除時便出現(xiàn)成熟的羰基水解酶。許多在自然界發(fā)現(xiàn)的蛋白水解酶是轉(zhuǎn)譯時的原酶產(chǎn)物，并且以這種形式表達而不經(jīng)過翻譯后加工。優(yōu)選的產(chǎn)生羰基水解酶變異體、尤其是枯草桿菌蛋白酶變異體的原序列是假設(shè)的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的原序列，盡管也可以使用其它枯草桿菌蛋白酶原序列。在實施例1和2中，使用透鏡狀芽孢桿菌(ATCC21536)的枯草桿菌蛋白酶的原序列。
“信號序列”或“前序列”指與羰基水解酶的N末端部分相連或與原水解酶的N末端部分相連的任何氨基酸序列，它參與成熟或原形式的水解酶的分泌。信號序列的定義是一種功能性的序列，包括由枯草桿菌蛋白酶基因或其他可分泌羰基水解酶的N末端編碼的所有氨基酸序列，這些序列參與實現(xiàn)自然條件下枯草桿菌蛋白酶或其他羰基水解酶的分泌。本發(fā)明采用這種序列以實現(xiàn)此處定義的羰基水解酶變異體的分泌。優(yōu)選的用于實施例的信號序列包括解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶信號序列的前7個氨基酸殘基，它與透鏡狀芽孢桿菌(ATCC21536)的枯草桿菌蛋白酶信號序列的其余部分融合在一起。
羰基水解酶變異體的“前原”形式由具有可操作地連于水解酶氨基端原序列的水解酶成熟形式和可操作地連于原序列氨基端的“前”或“信號”序列組成。
“表達載體”指這樣的DNA構(gòu)建物，它含有可操作地連于合適的調(diào)控序列的DNA序列，并能夠在合適的宿主中實現(xiàn)該DNA的表達。這種調(diào)控序列包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；蚓褪菨撛诘幕蚪M插入子。一旦轉(zhuǎn)入合適宿主，載體會獨立于基因組而進行復(fù)制并發(fā)揮功能，或者在某些情況下整合入基因組。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時可互換使用，因為質(zhì)粒是目前最常用的載體形式。但是，本發(fā)明包括其他形式的起相當(dāng)功能的，以及本發(fā)明中已知或?qū)⒁阎谋磉_載體。
用于本發(fā)明的“宿主細胞”一般是原核或真核宿主，最好是用美國專利4,760,025(RE34,606)公開方法進行操作從而使其不能分泌具有酶活性的內(nèi)切蛋白酶。優(yōu)選的表達枯草桿菌蛋白酶的宿主細胞是桿菌屬菌株BG2036，它缺乏具有酶活性的中性蛋白酶和堿性蛋白酶(枯草桿菌蛋白酶)。菌株BG2036的構(gòu)建在美國專利5,264,366中有詳細描述。其他表達枯草桿菌蛋白酶的宿主細胞包括枯草桿菌I168(在美國專利4,760,025(RE34,606)和美國專利5,264,366中有描述，這些專利的內(nèi)容在此引用作為參考。)以及任何合適的桿菌屬菌株如地前芽孢桿菌、透鏡狀芽孢桿菌等。
用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞。這種轉(zhuǎn)化的宿主細胞能夠復(fù)制編碼羰基水解酶變異體的載體，或者能夠表達所需的羰基水解酶變異體。當(dāng)載體編碼前—或前原—形式的羰基水解酶變異體時，這種變異體(表達時)通常是以宿主細胞分泌到宿主細胞培養(yǎng)基中。
用“可操作地相連”描述兩個DNA區(qū)域的關(guān)系時，就表明它們在功能上是相互相關(guān)的。例如，原序列與肽可操作地相連，如果它作為信號序列參與成熟形式的蛋白質(zhì)分泌，其中最可能涉及信號序列的切除。啟動子與編碼序列是可操作地相連的，如果它控制序列的轉(zhuǎn)錄；核糖體結(jié)合位點與編碼序列是可操作地相連的，如果它被置于允許翻譯的位置。
編碼天然存在前體羰基水解酶的基因可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的通用方法獲得。這些方法通常包括合成具有假定的編碼感興趣的水解酶區(qū)域的標(biāo)記探針，從表達水解酶的有機體制備基因組文庫，以及通過與探針的雜交在文庫中篩選感興趣的基因。對陽性雜交克隆作圖譜分析和測序。用于實施例的透鏡狀芽孢桿菌基因是按美國專利5,185,258中實施例1所述的方法進行克隆的，該專利的公開內(nèi)容在此引用作為參考。用于實施例5的BPN′基因是按RE34,606中實施例1所述的方法進行克隆的，該專利的公開內(nèi)容在此引用作為參考。
克隆的羰基水解酶接著被用于轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達水解酶。然后水解酶基因被連入高拷貝數(shù)的質(zhì)粒。該質(zhì)粒在宿主中復(fù)制，只要它含有質(zhì)粒復(fù)制所需的、眾所周知的元件可操作地連于感興趣基因的啟動子(如果能被宿主識別(即轉(zhuǎn)錄)，那么也可以使用基因本身的同源啟動子。)、轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化區(qū)域(在某些真核宿主細胞中，對于宿主中從水解酶基因轉(zhuǎn)錄下來的mRNA穩(wěn)定性是必須的。)，該區(qū)域可以是外源的，或由水解酶基因的內(nèi)源終止區(qū)域提供，同時更佳地有選擇基因如抗生素抗性基因(它能夠通過在含抗生素的培養(yǎng)基中生長而連續(xù)培養(yǎng)維持被質(zhì)粒感染的宿主細胞)。高拷貝數(shù)質(zhì)粒還可含有在宿主中復(fù)制的起始點，從而能夠不受染色體的限制而在細胞質(zhì)中產(chǎn)生大量的質(zhì)粒。但是，將多拷貝的水解酶基因整合入宿主基因組中也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這對于特別適合同源重組的原核或真核有機體而言很方便。
用于實施例的基因是天然透鏡狀芽孢桿菌基因和天然解淀粉芽孢桿菌基因?；蛘?，可產(chǎn)生編碼天然存在或突變前體羰基水解酶(枯草桿菌蛋白酶)的合成基因。在這種方法中，應(yīng)確定前體羰基水解酶(枯草桿菌蛋白酶)的DNA和/或氨基酸序列。隨后合成多個重迭的合成單鏈DNA片段，然后通過雜交和連接而形成編碼前體水解酶的合成DNA。合成基因構(gòu)建物的一個例子是美國專利5,204,015實施例3中所述的構(gòu)建物，該專利的公開內(nèi)容在此引用作為參考。
一旦天然存在或合成的前體羰基水解酶基因被克隆，便可以進行一系列的修飾，從而在合成天然存在前體羰基水解酶之外，更廣泛地使用基因。這種修飾包括如美國專利4,760,025(RE 34,606)和EPO出版物No.0251446中所述的那樣產(chǎn)生重組羰基水解酶，以及如此處所述的那樣產(chǎn)生羰基水解酶變異體。
下列盒式誘變方法可用于協(xié)助構(gòu)建和鑒別本發(fā)明的羰基水解酶變異體，盡管也可使用其他方法如定點誘變。首先，獲得天然存在的編碼水解酶的基因，進行全長或部分測序。然后，掃描序列，在編碼的酶中找出需要產(chǎn)生一個或多個氨基酸突變(缺失、插入或取代)的位置。評估該位置兩側(cè)的序列是否存在限制性位點，以便用寡核苷酸混合物(oligonucleotide pool)置換某個基因短片段，這些寡核苷酸混合物被表達時會編碼不同的突變型。這種限制性位點較佳地是水解酶基因中的唯一位點，以便置換基因片段。然而，在水解酶基因中并不過多的任何方便的限制性位點都可使用，只要限制性消化產(chǎn)生的基因片段能夠按適當(dāng)?shù)拇涡蛑匦卵b配在一起。如果從選定的位置起在方便的距離(10—15個核苷酸)內(nèi)沒有限制性位點，那么限制性位點可通過取代基因中一些核苷酸而產(chǎn)生，其中取代時不會在最終的構(gòu)建中改變閱讀框或編碼的氨基酸?？砂闯Ｒ?guī)方法，通過M13引物延伸而使基因發(fā)生突變從而改變其序列成為所需序列。確定合適的兩側(cè)區(qū)域以及衡量為了具有兩個方便的限制性位點序列而所需改變等工作是常規(guī)性的，因為有遺傳密碼子的兼并性，基因限制性內(nèi)切酶圖譜和大量不同的限制性內(nèi)切酶。應(yīng)注意，如果存在一個方便的側(cè)向限制性位點，那么僅需對不含有限制性位點的側(cè)向區(qū)域使用上述方法。
一旦天然存在DNA或合成DNA被克隆，那么在待突變位置兩側(cè)的限制性位點可用同族限制性酶進行消化，然后將多種末端互補寡核苷酸盒連入基因。該方法簡化了誘變過程，因為可合成所有的寡核苷酸使其具有相同的限制性位點，從而不需要合成接頭來產(chǎn)生限制性位點。
如此處所用，蛋白水解活性被定義為每毫克活性酶水解肽鍵的速率。有許多熟知的程序可測量蛋白水解活性(K.M.Kalisz，“Mi-crobial Proteinases，”Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，A.Fiechter ed.，1988)。除了具有改變的蛋白水解活性之外，本發(fā)明的變異酶還可有其他改變性能如Km、Kcat、Kcat/Km比率和/或改變的底物特異性和/或改變的pH活性分布圖。可以對酶進行改造使其適應(yīng)預(yù)計會存在的特定底物，例如在制備肽中存在的底物，或者適應(yīng)水解過程例如沖洗使用。
本發(fā)明的一方面目的是為了獲得與前體羰基水解酶相比，蛋白水解活性有所改變的變異羰基水解酶，因為增加這種活性(數(shù)值上更大)可以使酶更有效地作用于靶底物。此外，與前體相比，熱穩(wěn)定性和/或底物特異性改變的變異酶也是感興趣的。較佳地，被突變的羰基水解酶是枯草桿菌蛋白酶。在實施例中給出了用于從枯草桿菌蛋白酶型羰基水解酶獲得這種效果的具體氨基酸，它們相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶殘基+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，或其組合。在某些情況下，更低的蛋白水解活性是有利的，例如蛋白水解活性的下降在需要羰基水解酶合成活性的場合(如用于合成肽)是有用的。人們可能希望降低會破壞合成產(chǎn)物的蛋白水解活性。相反，在某些情況下，與前體相比增加變異酶的蛋白水解活性是有利的。此外，增加或減少(改變)變異體的穩(wěn)定性，無論是堿性穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性，都可能是有利的。Km，Kcat或Kcat/Km的增加或降低對用來確定這些動力學(xué)參數(shù)的底物是特異的。
在本發(fā)明的另一方面，已確定枯草桿菌蛋白酶中相當(dāng)于+76的殘基與大量其他修飾的組合對于調(diào)節(jié)酶的整體穩(wěn)定性和/或蛋白水解活性是至關(guān)重要的。因此，如實施例中所述，在優(yōu)選例子中，在透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中相當(dāng)于+76位上的天冬酰胺(N)可以用天冬氨酸(D)取代并結(jié)合一個或多個下列氨基酸殘基的修飾+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，從而產(chǎn)生穩(wěn)定性更好和/或活性更好的突變酶。
本發(fā)明的最佳例子在實施例中給出。這些例子包括下列取代殘基的特定組合N76D/S99；N76D/V104I；N76D/S99D/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V和N76D/S101R/S103A/V104I。所有在本發(fā)明中提出權(quán)利要求的突變組合都在實施例中有描述。這些取代最好是在透鏡狀芽孢桿菌(重組的或天然的)枯草桿菌蛋白酶上進行，盡管也可在任何桿菌屬枯草桿菌蛋白酶上進行取代。
根據(jù)這種以及其他變異枯草桿菌蛋白酶的結(jié)果，似乎羰基水解酶(較佳地是枯草桿菌蛋白酶)中相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶殘基+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274的殘基，對于酶的蛋白水解活性、工作性能和/或穩(wěn)定性以及變異酶的清洗或沖洗性能是至關(guān)重要的。
本發(fā)明的許多羰基水解酶變異體，尤其是枯草桿菌蛋白酶，可用于配制各種去垢劑組合物。有大量已知化合物是能用于含有本發(fā)明的羰基水解酶突變型的組合物的合適表面活性劑。其中包括非離子型、陰離子型、陽離子型或兩性離子型洗滌劑，比如參見Barry J.Anderson的US4,404,128及Jiri Flora等人的US4,261,868。一種合適的去垢劑配方是在美國專利5,204,015(前面引用作為參考)實施例7中描述的配方。對于可用作清洗組合物的各種不同配方，本領(lǐng)域是很熟悉的。除了典型的清洗組合物，很清楚本發(fā)明的枯草桿菌變異體也可用于任何使用天然或野生型枯草桿菌蛋白酶的場合。因此，這些變異體可以用于例如條狀或液體肥皂、洗碗劑、隱形眼鏡清洗液或產(chǎn)品、肽水解、廢物處理、織物應(yīng)用以及蛋白質(zhì)生產(chǎn)中用作切割融合的酶。在去垢劑組合物中，本發(fā)明的變異體可有增強的性能(與前體相比)。如本文所用，在去垢劑中的增強性能的定義是，在標(biāo)準(zhǔn)洗滌過程后，用通常的評估方法所確定的某些酶敏感污跡如草或血的清洗效果提高。
本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶可配制成熟知的粉末狀或液體去垢劑，其濃度為約0.01—5重量％(較佳地為0.1—0.5％)時pH為6.5—12.0。這些去垢清洗組合物還可含有其他酶如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂酶或內(nèi)糖苷酶以及助洗劑和穩(wěn)定劑。
在常規(guī)清洗組合物中加入本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶并不會形成任何特殊的使用限制。換言之，對去垢劑合適的任何溫度和pH也適用于本發(fā)明的組合物，只要pH在上述范圍內(nèi)而溫度低于所述的枯草桿菌蛋白酶變性溫度。此外，本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶可用于不含去垢劑的清洗組合物，同樣可僅含有該酶或者同時含有助洗劑和穩(wěn)定劑。
下面通過實施例描述本發(fā)明，這些實施例不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1構(gòu)建在枯草桿菌中表達GG36基因為了表達透鏡狀芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶基因而進行的克隆和構(gòu)建，基本上是按照美國專利5,185,258所述的方法進行。質(zhì)粒GGA274(見圖4)進一步按圖5所示的方式進行修飾。在構(gòu)建GGA274中引入的PstI位點通過下述的寡核苷酸定點誘變而切除，其中寡核苷酸序列如下5′-GAAGCTGCAA CTCGTTAAA-3′(SEQ ID NO1)帶下劃線的“A”殘基消除了限制性酶PstI的識別序列，并將274位的相應(yīng)氨基酸殘基從Ala變?yōu)門hr。274位的蘇氨酸是最初在克隆的透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因序列中發(fā)現(xiàn)的野生型殘基。從質(zhì)粒GGA274或其衍生物(圖5中的GGT274)中通過EcoRI和BamHI消化而切下編碼枯草桿菌蛋白酶的DNA片段。將DNA片段亞克隆至細菌噬菌體M13類型載體如MP19以便誘變。誘變后，進行EcoRI和HindIII消化，隨后克隆，從而將突變的枯草桿菌蛋白酶基因重新連入諸如GGA274之類的表達載體以便表達和回收突變枯草桿菌蛋白酶蛋白質(zhì)。實施例2寡核苷酸定點誘變寡核苷酸定點誘變按照Zoller，M.et al.(1983)，MethodsEnzymol.，100486—500所述的方法進行。一個例子是，用人工合成的序列5′-GCTGCTCTAG ACAATTCG-3′(SEQ ID NO2)寡核苷酸將76位的氨基酸殘基從天冬酰胺(N)變?yōu)樘於彼?D)，即N76D。帶下劃線的“G”和“C”殘基表示從野生型基因序列改變而來。CA保留了+75位的亮氨酸，同時改變了氨基酸序列從而引入XbaI限制性酶的識別位點(TCTAGA)，而GAC的改變使+76天冬酰胺變?yōu)樘於彼帷?br> 對于99、101、103和104位的誘變，可使用不同的寡核苷酸，這取決于所需的突變組合情況。例如，序列5′GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT-3′(SEQ ID NO3)寡核苷酸可用于在單個枯草桿菌蛋白酶分子中同時產(chǎn)生下列改變S99D；S101R；S103A和V104I。類似地，序列5′-TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG-3′(SEQ ID NO4)和5′-CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG-3′(SEQ ID NO5)可分別用于產(chǎn)生I107V和N123S。同樣，帶下劃線的殘基表示從野生型序列改變而來，以用于產(chǎn)生所需的氨基酸序列或限制性酶識別序列的改變。實施例3枯草桿菌蛋白酶變異體的蛋白水解活性按照實施例2的方法，制得表III中列出的變異體。每種枯草桿菌蛋白酶變異體的蛋白水解活性都列在表III中。用P.Bonneau，etal.(1991)J.Am.Chem.Soc.，Vol.113，No.3，p.1030中所述的方法，通過水解合成肽底物琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對硝基酰苯胺而測量動力學(xué)參數(shù)Kcat，KM和Kcat/KM。簡言之，將一少量枯草桿菌蛋白酶變異體原液加入1厘米的小試管中，試管中含有溶解于0.1M Tris-HClpH 8.6緩沖液中的底物并保溫于25℃。反應(yīng)后，用光譜分光光度法測量在410nm處反應(yīng)產(chǎn)物對硝基酰苯胺的吸收值。用非線性回歸算法獲得動力學(xué)參數(shù)，使各反應(yīng)的反應(yīng)速度和產(chǎn)物濃度與Michaelis-Menten方程式相符。
表III對透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和突變蛋白測得的動力學(xué)參數(shù)Kcat，KM和Kcat/KM酶 Kcat(s-1) KM(M) Kcat/KM(s-1M-1)透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶 170 0.00078 2.18×105N76D 219 0.0008 2.74×105M76D/S99D 88 0.00061 1.44×105N76D/S103A 400 0.0014 2.86×105N76D/V104I 459 0.0011 4.17×105N76D/I107V 219 0.0011 1.99×105N76D/N123S 115 0.0018 6.40×104N76D/S99D/S101R 146 0.000383.84×105N76D/S99D/S103A 157 0.0012 1.31×105N76D/S99D/V104I 247 0.000972.55×105N76D/S101R.S103A 405 0.000695.90×105N76D/S101R/V104I 540 0.000491.10×106N76D/S102A/V104I 832 0.0016 5.20×105N76D/V104I/I107V 497 0.000451.10×106N76D/V104Y/I107V 330 0.000171.90×106N76D/V104I/N123S 251 0.0026 9.65×104N76D/I107V/N123S 147 0.0035 4.20×104N76D/S99D/S101R/S103A242 0.000743.27×105N76D/S99D/S101R/V104I403 0.000725.60×105N76D/SS99D/S103A/V104I 420 0.0016 2.62×105N76D/S101R/S103A/V104I 731 0.000651.12×106N76D/S103A/V104I/N123S 321 0.0026 1.23×105N76D/V104I/I107V/N123S 231 0.003 7.70×104N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 624 0.000986.37×105N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 194 0.0043 4.51×104N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S311 0.0023 1.35×105表III中列出的數(shù)據(jù)表明，所有測試的枯草桿菌蛋白酶變異體都保留了蛋白水解活性。此外，仔細分析數(shù)據(jù)揭示，相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌中76、99、101、103、104、107和123位的氨基酸殘基的各種取代組合，會明顯改變透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的蛋白水解活性。實施例4枯草桿菌蛋白酶變異體的熱穩(wěn)定性對于透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶及用實施例2方法制得的變異體，觀察比較其熱穩(wěn)定性，結(jié)果列于表IV。將純化的酶(15μg/ml于0.1M甘氨酸，0.01吐溫(％Tween—80)pH10.0中，含有或不含50mM CaCl2)一份份地裝入各小試管中，在10℃保溫5分鐘，10—60℃1分鐘，60℃20分鐘。然后將試管置于冰上10分鐘。分析各試管中樣品的酶活性，即將其加入1厘米的小試管中，試管中含有溶解于0.1M Tris-HClpH 8.6緩沖液中的底物琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對硝基酰苯胺并保溫于25℃。在最初線性反應(yīng)速度之后，用光譜分光光度法測量在410nm處反應(yīng)產(chǎn)物對硝基酰苯胺的吸收值，以時間作為函數(shù)。數(shù)據(jù)為加熱前活性的百分比。列于表IV中的數(shù)據(jù)表明，在加入50mM CaCl2的測試條件下，絕大多數(shù)變異體(26個中的24個)的熱穩(wěn)定性與透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性相近。在不加入50mM CaCl2的測試條件下，絕大多數(shù)變異體(26個中的19個)比透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶明顯地更具熱穩(wěn)定性。此外，在不加入50mM CaCl2的測試條件下，變異體N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V和N76D/S101R/S103A/V104I比單個取代的N76D變異體明顯地更穩(wěn)定。
表IV對透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和突變蛋白測得的熱穩(wěn)定性(pH 10，60℃，+/-50mM CaCl2)酶 最初活性的殘留百分比-CaCl2+CaCl2透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶 2 96N76D34 97N76D/S99D 49 98
N76D/S103A 2692N76D/V104I 5898N76D/I107V 3296N76D/N123S097N76D/S99D/S101R 30100N76D/S99D/S103A 36100N76D/S99D/V104I 4897N76D/S101R/S103A 26100N76D/S101R/V104I 38100N76D/S103A/V104I 58100N76D/V104I/I107V 6097N76D/V104Y/I107V 4874N76D/V104I/N123S 098N76D/I107V/N123S 16100N76D/S99D/S101R /S103A 38100N76D/S99D/S101R/V104I33100N76D/S99D/S103A/V104I3898N76D/S101R/S103A/V104I 4099N76D/S103A/V104I/N123S198N76D/V104I/I107V/N123S399N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 3699N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 295N76D/S99D/S10IR/S103A/V104I/N123S 0100實施例5用噬菌粒(phagemid)產(chǎn)生的單鏈DNA模板進行寡核苷酸定點誘變A.構(gòu)建透鏡狀芽孢桿菌變異體誘變方案與上面實施例2所述的方法基本相同。用噬菌粒方法產(chǎn)生單鏈DNA模板。為了構(gòu)建用于產(chǎn)生單鏈DNA模板的噬菌粒，我們首先構(gòu)建載體pBCDAICAT。載體構(gòu)建流程圖示于圖8。首先，來自pC194質(zhì)粒(Horinouchi，S.and Weisblum，B.，J.Bacteriol.，1508—15，1982)的編碼CAT基因的ClaI—ClaI片段被克隆入pUC19(New England BioLabs，Beverly，MA)多接頭區(qū)域的AccI位點中，形成質(zhì)粒pUCCHL。來自GG36DAI編碼DNA5′端的0.6KB EcoRI—DraI片段被克隆入pBSKS質(zhì)粒(Stratagene，Inc.，San Diego，CA)的EcoRI和EcoRV位點，形成質(zhì)粒pBC2SK5。質(zhì)粒pBC2SK5的單個EcoRI位點的去除是通過EcoRI消化、隨后用T4 DNA聚合酶催化填平再重新連入形成不含EcoRI位點質(zhì)粒pBC2SK—5R。被克隆入pBC2SK—5R的EcoRI—DraI片段以PstI—HindIII片段形式分離出，然后克隆入pUCCHL的PstI—HindIII位點(pUC19的多接頭部分)形成質(zhì)粒pUCCHL5R。GG36DAI基因的編碼序列以EcoRI—BamHI片段形式切下，克隆入pUCCHL5R的EcoRI—BamHI位點，形成pUCCAT。pUCCAT的大EcoRI—HindIII片段接著被克隆入BS2KS+的EcoRI和HindIII位點，形成質(zhì)粒pBCDAICAT。
為了產(chǎn)生單鏈DNA，按照Russel，M.，Kidd，S.and Kelley，M.R.，GENE45333—338，1986的方法，用噬菌體R408(得自Stratagene，Inc.，San Diego，CA)感染含有pBCDAICAT的大腸桿菌。一旦形成單鏈DNA模板，就進行實施例2所述的標(biāo)準(zhǔn)誘變方法。某些突變型的構(gòu)建在下面詳細給出以便闡述。
為了構(gòu)建透鏡狀芽孢桿菌(GG36)N76D/S103A/V104I/L217H，用編碼GG36 N76D/S103A/V104I的EcoRI—BamHI片段構(gòu)建pUCCAT(見圖8)，形成質(zhì)粒pBCDAICAT。一旦形成單鏈DNA模板，就按照上述方案，用如下序列的誘變引物形成L217H
* *** **x ClaI5′TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT-3′(SEQ ID NO13)與前面相同，帶下劃線的殘基表示被改變的核苷酸，而xClaI表示原存在的ClaI位點在誘變后被消除。誘變方案描述于實施例2。在誘變后，首先篩選質(zhì)粒DNA是否消除了ClaI位點，那些缺少ClaI位點的克隆通過DNA序列分析以確定217位氨基酸殘基從L變?yōu)镠的DNA序列。B.BPN′變異體的構(gòu)建及其在枯草桿菌中的表達解淀粉芽孢桿菌(BPN′)N76D/Q103A/Y104I/Y217L構(gòu)建按類似的方式進行，除了兩個連續(xù)步驟。首先將N76D引入BPN′Y217L中形成BPN′N76D/Y217L，然后進行第二次誘變將BPN′N76D/Y217L變?yōu)锽PN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L。為了產(chǎn)生用于第一次誘變的單鏈DNA模板，用編碼BPN′Y217L枯草桿菌蛋白酶的EcoRI—BamHI片段(衍生自Wells，J.，et al.，PNAS，84，5167，1087中所述的Y217L質(zhì)粒)構(gòu)建質(zhì)粒pUCCATFNA(見圖9)。用含有BPN′Y217L的pUCCATFNA質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒pBCF-NACAT(圖9)。如上產(chǎn)生單鏈DNA。為了產(chǎn)生BPN′N76D/Y217L，用如下序列的寡核苷酸引物形成N76D變化* *** **x XbaI5′-C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G-3′(SEQ ID NO14)然后用含有BPN′N76D/Y217L的質(zhì)粒pBCFNACAT(N76D誘變后的質(zhì)粒pBCFNACAT)制備單鏈DNA，并用另一如下序列的寡核苷酸引物形成BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L* *** **x PvuII5′GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT-3′(SEQ ID NO15)所有克隆、制備單鏈DNA、誘變和篩選突變型的步驟都按上述方法進行。
BPN′基因及其變異體的表達是通過將質(zhì)粒DNA(含有不同變異BPN′基因的pBCFNACAT)直接整合入RE34,606中所述的缺少蛋白酶的枯草桿菌菌株。
按實施例2和5所述的方法制備各種變異體。對這些變異都測其動力學(xué)數(shù)據(jù)和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。動力學(xué)數(shù)據(jù)是用實施例3的方法獲得的，列于表V。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的獲得如下所述。結(jié)果列于表VI。熱穩(wěn)定性測試程序純化的酶是在0.1M甘氮酸pH10.0，0.01％Tween—80中進行緩沖液交換(buffer—exchanged)，即將酶上柱于Sephadex G—25柱，該柱已用緩沖液平衡過，然后用相同緩沖液將酶從柱中洗脫出來。
向含有0.1M甘氮酸，0.01％Tween—80 pH10.0并保溫于60℃的試管中，加入緩沖液交換過的酶，使最終酶濃度為15μg/ml。
按不同時間從60℃保溫中取出一份樣品，立刻測試其酶活性，即將其加入1厘米的小試管中，試管中含有溶解于0.1M Tris—HCl pH8.6緩沖液中的1.2mM人工合成肽底物琥珀酰—L—Ala—L—Ala—L—Pro—L—Phe—對硝基酰苯胺并保溫于25℃。在最初線性反應(yīng)速度之后，用光譜分光光度法測量在410nm處反應(yīng)產(chǎn)物對硝基酰苯胺的吸收值，以時間作為函數(shù)。
以60℃保溫時間作為函數(shù)，根據(jù)反應(yīng)速度的一級坐標(biāo)圖確定半衰期(即50％酶失去活性所需的時間)。
表VI中的數(shù)據(jù)是在相同條件下測得的透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(GG36)半衰期的百分比。
表V酶 KcatKMKcat/KM(s-1)(mM) (s-1M-1)透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶 1700.78 2.20E＋05N76D/S103G/V104I*3801.4 2.70E＋05N76D/S103A/V104F 7300.33 2.20E＋06N76D/S103A/V104N 7902.8 2.80E＋05N76D/S103A/V104S 1700.83 2.00E＋05N76D/S103A/V104T 3701.9 2.00E＋05N76D/S103A/V104W 8800.31 2.80E＋06N76D/S103A/V104Y 6900.5 1.40E＋06K27R/N76D/V104Y/N123S 5001.2 4.20E＋05N76D/S101G/S103A/V104I*6201.3 4.80E＋05N76D/S103A/V104I/S105A*5501.3 4.20E＋05N76D/S103A/V104I/S105G*4401.7 2.60E＋05N76D/S103A/V104T/I107A*1205.7 2.10E＋04N76D/S103A/V104T/I107L*3103.2 9.70E＋04N76D/S103A/V104I/L126A 90 2.2 4.10E＋04N76D/S103A/V104I/L126F 1801.9 9.50E＋04N76D/S103A/V104I/126I 1002.4 4.20E＋04N76D/S103A/V104I/L126V 64 3.2 2.00E＋04N76D/S103A/V104I/S128G*5601.7 3.30E＋05N76D/S103A/V104I/S128L*4303.8 1.10E＋05N76D/S103A/V104I/L135A 1400.76 1.80E＋05N76D/S103A/V104I/L135F 3900.69 5.70E＋05N76D/S103A/V104I/L135I 1100.73 1.50E＋05N76D/S103A/V104I/L135V 1400.86 1.60E＋05N76D/S103A/V104I/S156E*1702.6 6.50E＋04N76D/S103A/V104I/S166D*1603.5 4.60E＋04N76D/S103A/V104I/D197E 5101.4 3.60E＋05N76D/S103A/V104I/N204A*5301.1 4.80E＋05N76D/S103A/V104I/N204G*5801.4 4.10E＋05N76D/S103A/V104I/N204C*3701.3 2.90E＋05N76/S103A/V104I/P201I*5001.2 4.20E＋05N76D/S103A/V104I/L217H*80 0.631.30E＋05N76D/S103A/V104I/M222A 70 3.1 2.30E＋04N76D/S103A/V104I/M222S 80 3.1 2.60E＋04N76D/S103A/V104I/T260P 6601.5 4.40E＋05N76D/S103A/V104I/S265N 5901.3 4.50E＋05K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S2201.4 1.60E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E4301.1 3.90E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C4001.1 3.60E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L4401.2 3.70E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V4401.2 3.70E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S7600.987.80E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P4101.2 3.40E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A3901 3.90E＋05N76D/S103A/V104I/1126F/S265N 1702.1 8.10E＋04N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*40 6.3 6.40E＋03K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 4100.984.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 5400.668.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 7700.799.80E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 6100.996.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 5800.787.40E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 6601 6.60E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 5900.896.60E＋05K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A5201 5.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S4600.657.10E＋05液化性淀粉桿菌枯草桿菌蛋白酶(BPN′) 50 0.14 3.60E＋05BPN′-N76D/Y217L*3800.46 8.30E＋05*這些突變型是按實施例5方法制備，其他所有的是按實施例2方法制備。
表VI酶 熱穩(wěn)定性(天然酶半衰期的百分比)透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶100N76D590N76D/S99D 840N76D/S103A 390N76D/V104I 660N76D/I107V 710N76D/N123S 70N76D/S99D/S101R 610N76D/S99D/S103A 590N76D/S99D/V104I 910N76D/S101R/S103A930N76D/S101R/V104I500N76D/S103A/V104I460N76D/S103G/V104I*370N76D/S103A/V104F480N76D/S103A/V104N230N76D/S103A/V104S230N76D/S103A/V104T370N76D/S103A/V104W280N76D/S103A/V104Y400N76D/V104I/I107V940N76D/V104Y/I107V 820N76D/V104I/N123S 80N76D/I107V/N123S 150K27R/N76D/V104Y/N123S 100N76D/S99D/S101R/S103A 570N76D/S99D/S101R/V104I 1000N76D/S99D/S103A/V104I 680N76D/S101G/S103A/V104I*390N76D/S101R/S103A/V104I470N76D/S103A/V104I/S105A*360N76D/S103A/V104I/S105D*370N76D/S103A/V104T/1107A*270N76D/S103A/V104T/I107L*230N76D/S103A/V104I/N123S110N76D/V104I/I107V/N123S220N76D/S103A/V104I/L126A270N76D/S103A/V104I/L126F950N76D/S103A/V104I/L126I410N76D/S103A/V104I/L126V320N76D/S103A/V104I/S128G*640N76D/S103A/V104I/S128L*760N76D/S103A/V104I/L135A230N76D/S103A/V104I/L135F200N76D/S103A/V104I/L135I510N76D/S103A/V104I/L135V500N76D/S103A/V104I/S156E*120N76D/S103A/V104I/S166D*590N76D/S103A/V104I/D197E460N76D/S103A/V104I/N204A*230N76D/S103A/V104I/N204G*240N76D/S103A/V104I/N204c*500N76D/S103A/V104I/P2101*1370N76D/S103A/V104I/L217H*60N76D/S103A/V104I/M222A520N76D/S103A/V104I/M222S490N76D/S103A/V104I/T260P490N76D/S103A/V104I/S265N360K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 210K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 120K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 110K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 380K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 140K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 270K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P 40K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 60N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 590N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 110N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 810N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*220K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 90K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 250K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 270K27R/N76D/V104Y/N123S/C204C/N218S 460K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 1400K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P310K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A180N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S90K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A 230K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 240液化性淀粉桿菌枯草桿菌蛋白酶(BPN′) 100BPN′-N76D/Y217L*420*這些突變型是按實施例5方法制備，其他所有的是按實施例2方法制備。實施例6洗滌性能測試在前面實施例中描述過的變異體洗滌性能的評估是通過從EMPA116布塊(Testfabrics，Inc.，Middlesex，NJ 07030)上去除污跡(布上的血/牛奶/碳黑)情況進行的。
6塊被切成3×4.5英寸、邊緣為鋸齒狀的EMPA116布塊，被置于7243S型Terg—O—Tometer(United States Testing Co.，Inc.，Hoboken，NJ)的各個盆中，其中含有1000毫升水、硬度為159pg(Ca++∶Mg++∷3∶1∷w∶w)，7克去垢劑和適當(dāng)?shù)拿?。去垢劑基料是wfk-Testgewebe GmbH(Adlerstrasse 42，Postfach 130762，D—47759 Krefeld，Germany)的WFK1去垢劑。
組份終配方百分比沸石A 25％硫酸鈉 25％蘇打粉 10％線性烷基苯磺酸鹽8.8％醇乙氧化物(7—8EO) 4.5％鈉皂3％硅酸鈉(SiO2∶Na2O∷3.3∶1)3％
向該基本去垢劑中，加入下列組份組份終配方百分比過硼酸鈉一水合物13％共聚物(Sokalan CP5) 4％TAED(Mykon ATC Green)3％酶 0.5％增白劑(Tinopal AMS—GX) 0.2％過硼酸鈉一水合物是從Degussa Corporation，Ridgefield—Park，NJ07660獲得的。Sokalan CP5是從BASF Corporation，Par-sippany，NJ07054獲得的。Mykon ATC Green(TAED，四乙?；叶?是從Warwick International，Limited，Mostyn，Holywell，Clwyd CH8 9HE，England獲得。Tinopal AMSGX是從Ciba—Geigy Corporation，Greensboro，NC27419獲得的。
6塊EMPA116布塊在去垢劑中用酶在60℃洗30分鐘，然后在1000毫升水中漂洗5分鐘二次。加入的酶終濃度對標(biāo)準(zhǔn)曲線為0.05—1ppm，常規(guī)分析為0.25ppm。干燥并壓平布塊，用Minolta ChromaMeter，Model CR—200(Minolta Corporation，Ramsey，NJ07446)L*a*b刻度上的L值測量布塊的反射系數(shù)。性能以透鏡狀芽孢桿菌(GG36)蛋白酶性能的百分比表示，用透鏡狀芽孢桿菌(GG36)蛋白酶的數(shù)量除以得到同樣污跡去除效果所需的變異體蛋白酶的數(shù)量，然后乘以100。數(shù)據(jù)列于表VII。
表VII酶清洗性能透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶100N76D310N76D/S103A 230N76D/V104I 130N76D/I107V 160N76D/S99D/S101R 370N76D/S99D/S103A 290N76D/S101R/S103A130N76D/S101R/V104I300N76D/S103A/V104I320N76D/S103G/V104I160N76D/S103A/V104F210N76D/S103A/V104N110N76D/S103A/V104T170N76D/V104I/I107V210N76D/S99D/S101R/S103A 220N76D/S99D/S101R/V104I 140N76D/S101G/S103A/V104I 170N76D/S101R/S103A/V104I 150N76D/S103A/V104I/S105A 170N76D/S103A/V104T/I107A 120N76D/S103A/V104T/I107L 110N76D/S103A/V104I/L126F 110N76D/S103A/V104I/S128G 280N76D/S103A/V104I/L135I 160
N76D/S103A/V104I/L135V 160N76D/S103A/V104I/D197E 170N76D/S103A/V104I/N204A 160N76D/S103A/V104I/N204G 150N76D/S103A/V104I/P210I 470N76D/S103A/V104I/M222A 100N76D/S103A/V104I/T260P 280N76D/S103A/V104I/S265N 190實施例7在液體去垢劑配方中蛋白酶的穩(wěn)定性對透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶及其變異酶N76D/S103A/V104I，根據(jù)此處所述的程序比較它們在液體去垢劑配方中的蛋白酶穩(wěn)定性(導(dǎo)致失活)。用于研究的去垢劑配方是市場上出售的瓶裝Tide Ultra液體洗衣去垢劑(美國的Procter& Gamble Company制造)。為了使原來的酶失活，必須對去垢劑制劑進行熱處理。這通過將去垢劑在96℃保溫4.5小時而實現(xiàn)。然后在室溫下，將透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶和N76D/S103A/V104I變異體的濃制劑(20克酶/升)加入熱處理過的Tide Ultra中，使去垢劑制劑中的終濃度為0.3克酶/升。將帶有加入酶的、熱處理去垢劑在50℃水浴中保溫。在0，24，46，76和112小時時從保溫試管中取出各份樣品，測試其酶活性，即將其加入1厘米的小試管中，試管中含有溶解于0.1M Tris—HClpH 8.6緩沖液中的底物琥珀酰—L—Ala—L—Ala—L—Pro—L—Phe—對硝基酰苯胺并保溫于25℃。在最初線性反應(yīng)速度之后，用光譜分光光度法測量在410nm處反應(yīng)產(chǎn)物對硝基酰苯胺的吸收值，以時間作為函數(shù)。如圖10所示，觀察到N76D/S103A/V104I變異體的抗失活穩(wěn)定性遠大于天然透鏡狀芽孢桿菌酶。在特定的測試條件下，估計在Tide Ultra去垢劑制劑中兩種酶的失活半衰期是，透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶為45小時，而N76D/S103A/V104I變異體是125小時。
在整個申請中，通用的單字符和三字符表示各種氨基酸。這些字符可參見Dale，J.W.(1989)，Molecular Genetics of Bacteria，John Wiley & Sons，Ltd.，Appendix B.
盡管上面描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，很明顯本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員在完整地領(lǐng)會本發(fā)明之后，可對本發(fā)明進行各種改變或各種相應(yīng)改動，這些都在所附權(quán)利要求書所限定的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請人Genencor International，Inc.
(ii)發(fā)明名稱枯草桿菌蛋白酶變異體(iii)序列數(shù)目15(iv)通信地址(A)地址Genencor International，Inc(B)街道180 Kimball Way(C)城市So.San Francisco(D)州CA(E)國家USA(F)郵編94080(v)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朠CT/US94/11562(B)申請日13—OCT—1994(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Horn，Margaret A.
(B)登記號33，401(C)參考/案卷號GC235—2PCT(ix)通訊信息(A)電話(415)742—7536
(B)傳真(415)742—7217(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1GAAGCTGCAA CTCGTTAAA 19(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2GCTGCTCTAG ACAATTCG 18(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度39堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT 39(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO4TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG 33(2)SEQID NO5的信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO5CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG 22(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征
(A)長度1497堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6GGTCTACTAA AATATTATTC CATACTATAC AATTAATACA CAGAATAATC TGTCTATTGG 60TTATTCTGCA AATGAAAAAA AGGAGAGGAT AAAGAGTGAG AGGCAAAAAA GTATGGATCA 120GTTTGCTGTT TGCTTTAGCG TTAATCTTTA CGATGGCGTT CGGCAGCACA TCCTCTGCCC 180AGGCGGCAGG GAAATCAAAC GGGGAAAAGA AATATATTGT CGGGTTTAAA CAGACAATGA 240GCACGATGAG CGCCGCTAAG AAGAAAGATG TCATTTCTGA AAAAGGCGGG AAAGTGCAAA 300AGCAATTCAA ATATGTAGAC GCAGCTTCAG TCACATTAAA CGAAAAAGCT GTAAAAGAAT 360TGAAAAAAGA CCCGAGCGTC GCTTACGTTG AAGAAGATCA CGTAGCACAT GCGTACGCGC 420AGTCCGTGCC TTACGGCGTA TCACAAATTA AAGCCCCTGC TCTGCACTCT CAAGGCTACA 480CTGGATCAAA TGTTAAAGTA GCGGTTATCG ACAGCGGTAT CGATTCTTCT CATCCTGATT 540TAAAGGTAGC AAGCGGAGCC AGCATGGTTC CTTCTGAAAC AAATCCTTTC CAAGACAACA 600ACTCTCACGG AACTCACGTT GCCGGCACAG TTGCGGCTCT TAATAACTCA ATCGGTGTAT 660TAGGCGTTGC GCCAAGCGCA TCACTTTACG CTGTAAAAGT TCTCGGTGCT GACGGTTCCG 720GCCAATACAG CTGGATCATT AACGGAATCG AGTGGCGGAT CGCAAACAAT ATGGACGTTA 780TTAACATGAG CCTCGGCGGA CCTTCTGGTT CTGCTGCTTT AAAAGCGGCA GTTGATAAAG 840CCGTTGCATC CGGCGTCGTA GTCGTTGCGG CAGCCGGTAA CGAAGGCACT TCCGGCAGCT 900CAAGCACAGT GGGCTACCCT GGTAAATACC CTTCTGTCAT TGCAGTAGGC GCTGTTGACA 960GCAGCAACCA AAGAGCATCT TTCTCAAGCG TAGGACCTGA GCTTGATGTC ATGGCACCTG 1020GCGTATCTAT CCAAAGCACG CTTCCTGGAA ACAAATACGG GGCGTACAAC GGTACGTCAA 1080TGGCATCTCC GCACGTTGCC GGAGCGCCTG CTTTGATTCT TTCTAAGCAC CCGAACTGGA 1140CAAACACTCA AGTCCGCAGC AGTTTAGAAA ACACCACTAC AAAACTTGGT GATTCTTTGT 1200ACTATGGAAA AGGGCTGATC AACGTACAAG CGGCAGCTCA GTAAAACATA AAAAACCGGC 1260CTTGGCCCCG CCGGTTTTTT ATTATTTTTC TTCCTCCGCA TGTTCAATCC GCTCCATAAT 1320CGACGGATGG CTCCCTCTGA AAATTTTAAC GAGAAACGGC GGGTTGACCC GGCTCAGTCC 1380CGTAACGGCC AACTCCTGAA ACGTCTCAAT CGCCGCTTCC CGGTTTCCGG TCAGCTCAAT 1440GCCATAACGG TCGGCGGCGT TTTCCTGATA CCGGGAGACG GCATTCGTAA TCGGATC 1497(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度275氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度275氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala
35 40 45Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser130 135 140Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly145 150 155 160Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala180 185 190Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr225 230 235 240Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr245 250 255Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度274氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala35 40 45Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 110Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg130 135 140Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser145 150 155 160Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val165 170 175Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly180 185 190Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr195 200 205Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro210 215 220His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu225 230 235 240Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu245 250 255Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala260 265 270Ala Gln(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度269氨基酸(B)類型氨基酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala85 90 95Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser115 120 125Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile180 185 190Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr195 200 205Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 265(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度1140堿基對(B)類型核酸
(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO11ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT60AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT120GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT180CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT240TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT300TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC360CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT420GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT480GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG540ATTGCTGCTT TAAACAATTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC600GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGTTCGGTCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG660GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA720AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG780GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG840GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG900CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC960AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA1020CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG1080AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC1140(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度1140堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO12ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT60AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT120GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT180CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT240TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT300TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC360CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT420GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT480GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG540ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC600GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGCGCCATCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG660GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA720AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG780GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG840GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG900CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATCCC960AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA1020CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG1080AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC1140(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO13TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT30(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度31堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO14CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T 31(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度33堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT3權(quán)利要求
1.一種羰基水解酶變異體，其特征在于，它具有衍生自前體羰基水解酶的、在自然界沒有發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列，它在該前體羰基水解酶中相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶中+76位上的多種氨基酸殘基被不同氨基酸所取代，并結(jié)合一個或多個相當(dāng)下列位置的氨基酸殘基的取代解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的+99，+101，+103，+104，+107，+123，+27，+105，+109，+126，+128，+135，+156，+166，+195，+197，+204，+206，+210，+216，+217，+218，+222，+260，+265和/或+274。
2.如權(quán)利要求1所述的變異體，其特征在于，該前體羰基水解酶是枯草桿菌蛋白酶。
3.如權(quán)利要求2所述的枯草桿菌蛋白酶變異體，其特征在于，取代組合是在相當(dāng)于下列的位置上進行76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/101/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123，76/99/101/103/104/123，76/103/104/126，76/103/104/135，76/103/104/197，76/103/104/222，76/103/104/260，76/103/104/265，76/103/104/126/265，27/76/104/123/274，27/76/104/109/123/274，27/76/104/123/218/274，27/76/104/123，27/76/104/107/123，27/76/104/109/123，27/76/104/109/123/218/274，27/76/104/123/197，27/76/104/123/204，27/76/104/123/206，27/76/104/123/216，27/76/104/123/218，27/76/104/123/260，27/76/104/123/195/197，27/76/104/123/195/218，27/76/104/123/197/218，27/76/104/123/204/218，27/76/104/123/206/218，27/76/104/123/218/260，27/76/104/123/195/197/218，76/103/104/217，76/103/104/156，76/103/104/166，76/103/104/105，76/101/103/104，76/103/104/128，76/103/104/210，76/103/104/107，76/103/104/204，76/217，76/103/104/156/166和76/103/104/128.
4.如權(quán)利要求3所述的枯草桿菌蛋白酶變異體，其特征在于，取代組合是在相當(dāng)于下列的位置上進行76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/103/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222。
5.如權(quán)利要求4所述的枯草桿菌蛋白酶變異體，其特征在于，取代組合是在相當(dāng)于下列的位置上進行76/99，76/104，76/99/104，76/103/104，76/104/107，76/101/103/104，76/99/103/104和76/101/104。
6.如權(quán)利要求4所述的枯草桿菌蛋白酶變異體，其特征在于，枯草桿菌蛋白酶變異體含有N76D/S99D；N76D/S101R；N76D/S103A；N76D/V104I；N76D/I107V；N76D/N123S；N76D/S99D/S101R；N76D/S99D/S103A；N76D/S99D/V104I；N76D/S101R/S103A；N76D/S101R/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V；N76D/V104I/N123S；N76D/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A；N76D/S99D/S101R/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I；N76D/S101R/S103A/V104I；N76D/S103A/V104I/N123S；N76D/V104I/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S；N76D/S103A/V104I/S128G；N76D/S103A/V104I/T260P；N76D/S103A/V104I/S265N；N76D/S103A/V104I/D197E；N76D/S103A/V104I/S105A；N76D/S103A/V104I/L135I；N76D/S103A/V104I/L126F；N76D/S103A/V104T/L107T；N76D/S103A/V104I/P210I；N76D/S103A/V104I/L126F/S265N和N76D/S103A/V104I/M222A。
7.如權(quán)利要求5所述的枯草桿菌蛋白酶變異體，其特征在于，枯草桿菌蛋白酶變異體含有N76D/S99，N76D/V104I，N76D/S99D/V104I，N76D/S103A/V104I，N76D/V104I/107V，N76D/V104Y/I107V，N76D/S101R/S103A/V104I，N76D/S99D/S101R/S103A/V104I和N76D/S101R/V104I。
8.如權(quán)利要求2所述的枯草桿菌蛋白酶變異體，其特征在于，它衍生自桿菌屬枯草桿菌蛋白酶。
9.如權(quán)利要求8所述的枯草桿菌蛋白酶變異體，其特征在于，它衍生自透鏡狀芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶。
10.編碼權(quán)利要求1所述的羰基水解酶的DNA。
11.編碼權(quán)利要求10所述的DNA的表達載體。
12.用權(quán)利要求11的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
全文摘要
公開了衍生自天然或重組的非人體羰基水解酶的新變異體。一般，這種變異羰基水解酶是通過體外修飾編碼天然或重組羰基水解酶的前體DNA序列，使其僅編碼前體氨基酸序列中多個取代的氨基酸殘基。與前體水解酶相比，變異羰基水解酶具有不同的性質(zhì)如不同的蛋白水解活性，穩(wěn)定性等。被取代的氨基酸殘基對應(yīng)于解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶殘基+76位置的殘基結(jié)合一個或多個選自下組的殘基+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274。
文檔編號C12N15/57GK1133068SQ94193785
公開日1996年10月9日 申請日期1994年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月14日
發(fā)明者T·P·格雷卡, R·R·博特, L·J·威爾遜 申請人:吉恩康國際股份有限公司