專(zhuān)利名稱(chēng)：制備固定化酶共軛體的方法及由此制備的固定化酶共軛體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備固定化酶共軛體的方法及用該方法制備的穩(wěn)定的固定化酶共軛體。
酶一般是水溶性的，因此，若未將其固定在支持物上(游離的酶)就用于反應(yīng)介質(zhì)，則很難將其從中回收以便再使用。由于必須經(jīng)常更換，因此造成與使用所述酶有關(guān)的成本的提高。此外，盡管可在間歇法中有效地使用游離(未固定的)酶，但不適用于連續(xù)的工業(yè)化方法。
為了降低酶更換造成的高成本，已設(shè)計(jì)了各種使用前固定酶的方法。所述固定使得可以很方便地從反應(yīng)介質(zhì)中回收酶，以便連續(xù)地再使用。根據(jù)生物催化反應(yīng)底物的性質(zhì)，可以在各種反應(yīng)器系統(tǒng)，如填充柱和攪拌式反應(yīng)罐中使用這些固定化酶。
用于固定酶的方法包括使用由無(wú)機(jī)或有機(jī)物質(zhì)制成的固體支持物形式的載體。所述物質(zhì)包括如，γ-礬土，二氧化鈦，活性碳顆粒，硅藻土顆粒，玻璃珠，多孔玻璃，浮石，硅膠，金屬氧化物和氧化鋁?？梢杂没衔锘蚧衔锏幕旌衔飳⒚刚掣降剿鲚d體上，特別值得一提的是聚乙烯亞胺和戊二醛。但是，所述方法的缺點(diǎn)是不能將酶緊緊縛于載體上(或與其鍵合或載留在其中)。因此，酶可以與載體分開(kāi)(不結(jié)合)，在反應(yīng)介質(zhì)中成為“游離的”。實(shí)際上，酶和載體間存在的使其結(jié)合在一起的力常常很弱，以致被加工的底物存在時(shí)，很容易從載體中放出酶，從而丟失在反應(yīng)介質(zhì)中。
美國(guó)專(zhuān)利No.4，713，333公開(kāi)了一種方法，其中將酶固定在硅藻土顆粒上。該方法涉及將多孔硅藻土顆粒與聚乙烯亞胺溶液接觸。然后，將含聚乙烯亞胺的硅藻土與戊二醛接觸。最后，向其中加入酶水溶液，由此將酶固定于其上。盡管它是特別有用的，然而從其穩(wěn)定性及半衰期看，仍可改善用這種方法形成的固定化酶共軛物。
因此，可以看出，仍有必要提供酶共軛體形式的將酶固定的方法，以便將酶緊縛(或保持)在由此形成的共軛體內(nèi)，從而使固定化酶不能從共軛體的剩余部分“脫離出來(lái)”并丟失于反應(yīng)介質(zhì)中。進(jìn)一步看出，仍有必要提供使酶緊縛于其上和/或其中的(穩(wěn)定的)固定化酶共軛體，以便在所述共軛體的使用期間，減少酶從反應(yīng)介質(zhì)中丟失，從而實(shí)現(xiàn)其生產(chǎn)率的明顯改善。
本發(fā)明的主要目的是提供一種制備固定化酶共軛體的方法，其中將酶緊縛于(穩(wěn)定的)由此制備的固定化酶共軛體內(nèi)和/或其上。
本發(fā)明的另一主要目的是提供一種制備固定化酶共軛體的方法，以便使由此獲得的固定化酶共軛體不失活，并且使由此制備的固定化酶共軛體比用其它方法得到的同類(lèi)產(chǎn)品具有改善的半衰期。
本發(fā)明的另一主要目的是提供固定化酶共軛體，它具有比用其它方法得到的同類(lèi)產(chǎn)品改善的半衰期，以實(shí)現(xiàn)其生產(chǎn)率的顯著改善。
本發(fā)明的另一主要目的是提供穩(wěn)定的固定化酶共軛體，即使共軛體的酶緊縛于共軛體之內(nèi)(或其上)，以減少酶丟失于反應(yīng)介質(zhì)中。
按本發(fā)明的指導(dǎo)，公開(kāi)了制備固定化酶共軛體的方法。該方法包括將固體支持物，如多孔硅藻土顆粒與含有至少一個(gè)側(cè)鏈胺基的聚胺化合物溶液接觸。用這種方法，可以得到載體。將酶與至少一種胺活性物質(zhì)溶液接觸，從而使酶得到處理。所述胺活性物質(zhì)選自多官能醛，多官能有機(jī)鹵化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能異硫氰酸鹽(酯)，多官能異氰酸鹽(酯)和兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。用這種方法，形成處理過(guò)的含酶和處理過(guò)的加合物相互接觸，以使載體與處理過(guò)的加合物形成穩(wěn)定、有活性的固定化酶共軛體(下文有時(shí)各稱(chēng)為“固定化共軛體”，“酶共軛體”，“處理過(guò)的含酶共軛體”，“處理過(guò)的共軛體”和“共軛體”)。在這方面，載體和處理過(guò)的加合物反應(yīng)是優(yōu)選的，以使處理過(guò)的加合物的胺活性物質(zhì)與多胺載體化合物結(jié)合。
優(yōu)選的是在與處理過(guò)的加合物接觸前，洗滌載體，以從中除去過(guò)量的多胺化合物。
優(yōu)選的，多胺化合物選自聚乙二胺，聚乙烯亞胺(如聚二亞乙基三胺，聚三亞乙基四胺，聚五亞乙基六胺或聚六亞甲基二胺);聚亞甲基環(huán)已胺;聚亞甲基二苯胺;聚四亞乙基五胺，聚亞苯基二胺及兩種或多種這些多胺化合物的混合物。更優(yōu)選的多胺化合物選自分子量為500-100，000道爾頓且水溶性的上述化合物。最優(yōu)選的多胺化合物是聚乙烯亞胺。
優(yōu)選的，胺活性物質(zhì)選自多官能醛，多官能有機(jī)鹵化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能異硫氰酸鹽(酯)，多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。更優(yōu)選的胺活性物質(zhì)選自戊二醛，琥珀醛，對(duì)苯二醛，二重氮基聯(lián)苯胺-2，2′-二磺酸，4′，4-二氟-3，3′-二硝基二苯基砜，二苯基-4，4′-二硫氰酸酯-2，2′-二磺酸，3-甲氧基-二苯基甲烷-4，4′-二異氰酸酯，甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯，甲苯-2，4-二異硫氰酸酯，重氮基聯(lián)苯胺，重氮基聯(lián)苯胺-3，3′-聯(lián)茴香胺，N，N′-六亞甲基二碘乙酰胺，1，6-已二異氰酸酯，氰尿酰氯，1，5-二氟-2，4-二硝基苯及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。最優(yōu)選的胺活性物質(zhì)選自多官能醛。特別優(yōu)選的胺活性物質(zhì)選自戊二醛，琥珀醛，對(duì)苯二醛。用戊二醛已得到最好的結(jié)果。
優(yōu)選的處理過(guò)的含酶加合物與洗滌過(guò)的載體間的比率為每克載體約0.05ml到0.6ml處理過(guò)的加合物。優(yōu)選的胺活性物質(zhì)與酶之間的比率為ml酶約0.10g到約1.50g胺活性物質(zhì)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在包括攪拌的條件下，將酶與胺活性物質(zhì)溶液接觸。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，固定化酶共軛體形成后用水洗滌。
本文公開(kāi)的方法適用于制備任何酶的固定化酶共軛體，所述酶含有能與胺活性物質(zhì)反應(yīng)的氨基。也可以固定兩種或多種酶。這些酶包括胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，已糖激酶，無(wú)花果蛋白酶，菠蘿蛋白酶，乳酸脫氫酶，乳糖酸，葡萄糖異構(gòu)酶，葡糖淀粉酶，胰凝乳蛋白酶，鏈霉蛋白酶，酰基轉(zhuǎn)移酶，蔗糖酶，淀粉酶，支鏈淀粉酶，轉(zhuǎn)葡糖苷酶，葡萄糖氧化酶，胃蛋白酶，蛋白酶，過(guò)氧化氫酶，羥化酶，凝乳酶，轉(zhuǎn)移酶及其混合物。這些酶優(yōu)選地包括葡萄糖異構(gòu)酶，葡糖淀粉酶，蔗糖酶，β-淀粉酶，細(xì)菌α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶，轉(zhuǎn)葡糖苷酶及其混合物。更優(yōu)選地這些酶包括葡糖淀粉酶，細(xì)菌α-淀粉酶，β-淀粉酶及其混合物。用由SOLVAY ENZYMES，Inc.(Elkhart，Indiana)以DIAZYME L-200商標(biāo)銷(xiāo)售的葡糖淀粉酶已經(jīng)得到了滿(mǎn)意的結(jié)果。用由SOLVAY ENZYMES，Inc.(Elkhart，Indiana)以CLARASE L-40，000商標(biāo)銷(xiāo)售的真菌α-淀粉酶已得到了滿(mǎn)意的結(jié)果。最后，用以SPEZYME BBA 1500商標(biāo)銷(xiāo)售的β-淀粉酶也得到了滿(mǎn)意的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)，公開(kāi)了制備固定化葡糖淀粉酶共軛體的方法。該方法包括將固體支持物與聚乙烯亞胺溶液接觸。用該方法，得到載體。將葡糖淀粉酶與戊二醛溶液接觸，由此處理葡糖淀粉酶。用該方法形成處理過(guò)的含葡糖淀粉酶的加合物。最后，將載體和處理過(guò)的含葡糖淀粉酶的加合物相互接觸，使載體和處理過(guò)的含葡糖淀粉酶的加合物反應(yīng)，形成穩(wěn)定、有活性的固定化葡糖淀粉酶共軛物。
優(yōu)選的，固體支持物是多孔的。更優(yōu)選的，固體支持物是多孔硅藻土顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)，公開(kāi)了制備固定化真菌α-淀粉酶共軛體的方法。該方法包括將固體支持物與聚乙烯亞胺溶液接觸。用該方法得到了載體。將真菌α-淀粉酶與戊二醛溶液接觸，由此處理了α-淀粉酶。用該方法形成了處理過(guò)的含α-淀粉酶的加合物。最后，將載體和處理過(guò)的含α-淀粉酶加合物彼此接觸，使載體和處理過(guò)的含α-淀粉酶加合物反應(yīng)，形成穩(wěn)定、有活性的固定化真菌α-淀粉酶共軛體。
進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)，公開(kāi)了制備固定化β-淀粉酶共軛體的方法。該方法包括將固體支持物與聚乙烯亞胺溶液接觸。用該方法，得到了載體。將β-淀粉酶與戊二醛溶液接觸，從而處理了β-淀粉酶。用該方法，形成了處理過(guò)的含β-淀粉酶的加合物。最后，將載體和處理過(guò)的含β-淀粉酶的加合物彼此接觸，使載體與處理過(guò)的β-淀粉酶加合物反應(yīng)，形成穩(wěn)定的、有活性的固定化β-淀粉酶共軛體。
另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了穩(wěn)定的、有活性的固定化酶共軛體，它具有比用其它方法得到的同類(lèi)產(chǎn)品改善的半衰期，由此實(shí)現(xiàn)了其生產(chǎn)率的顯著提高。
根據(jù)本發(fā)明的指導(dǎo)，公開(kāi)了固定化酶共軛體。這些固定化酶共軛體包括載體和處理過(guò)的加合物。該載體包括具有至少一個(gè)側(cè)鏈胺基的多胺化合物。將固體支持物與多胺化合物結(jié)合，形成載體。處理過(guò)的加合物包括至少一種胺活性物質(zhì)。所述胺活性物質(zhì)選自多官能醛，多官能有機(jī)鹵化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能異硫氰酸鹽(酯)，多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。將至少一種酶與(至少一種)胺活性物質(zhì)結(jié)合，由此處理酶并形成處理過(guò)的含酶加合物。最后，將載體與包括處理過(guò)的酶的處理過(guò)的加合物結(jié)合，從而形成穩(wěn)定、有活性的固定化酶共軛體。
優(yōu)選的，固體支持物是多孔的。特別優(yōu)選的固體支持物是多孔硅藻土顆粒。
優(yōu)選的，多胺化合物選自聚乙二胺，聚乙烯亞胺(如，聚二亞乙基三胺，聚三亞乙基四胺，聚五亞乙基六胺或聚六亞乙基二胺)，聚亞甲基二環(huán)已胺，聚亞甲基二苯胺，聚四亞乙基五胺，聚亞苯基二胺及兩種或多種這些多胺化合物的混合物。更優(yōu)選的多胺化合物選自分子量為500-100，000道爾頓及水溶性的化合物。最優(yōu)選的多胺化合物是聚乙烯亞胺。
優(yōu)選的，胺活性物質(zhì)選自多官能醛，多官能有機(jī)鹵化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能異硫氰酸鹽(酯)，多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。更優(yōu)選的胺活性物質(zhì)選自戊二醛，琥珀醛，對(duì)苯二醛，二重氮基聯(lián)苯胺-2，2′-二磺酸，4，4′-二氟-3，3′-二硝基二苯基砜，二苯基-4，4′-二硫氰酸酯-2，2′-二磺酸，3-甲氧二苯基甲烷-4，4′-二異氰酸酯，甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯，甲苯-2，4-二異硫氰酸酯，重氮基聯(lián)苯胺，重氮基聯(lián)苯胺-3，3′-聯(lián)茴香胺，N，N′-六亞甲基二碘乙酰胺，1，6-已二異氰酸酯，氰尿酰氯，1，5-二氟-2，4-二硝基苯及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。優(yōu)選的胺活性物質(zhì)選自多官能醛。更優(yōu)選的，胺活性物質(zhì)選自戊二醛，琥珀醛，對(duì)苯二醛。用戊二醛得到了最好的結(jié)果。
處理過(guò)的含酶加合物與載體間優(yōu)選的比率為每克載體約0.05ml到約0.6ml處理過(guò)的加合物。胺活性物質(zhì)與酶之間優(yōu)選的比率為每ml酶0.10g到約1.50g胺活性物質(zhì)。
本文公開(kāi)的固定化酶共軛體可以包括含能與胺活性物質(zhì)反應(yīng)的氨基的任何酶。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，公開(kāi)了固定化葡糖淀粉酶共軛體。該固定化葡糖淀粉酶共軛體包括載體和處理過(guò)的加合物。載體包括聚乙烯亞胺。將固體支持物與聚乙烯亞胺結(jié)合，由此形成載體。處理過(guò)的加合物包括戊二醛。將葡糖淀粉酶與戊二醛結(jié)合，從而處理了葡糖淀粉酶，并形成了處理過(guò)的加合物。最后，將載體與包括處理過(guò)的葡糖淀粉酶的處理過(guò)的加合物結(jié)合，從而形成穩(wěn)定、有活性的固定化葡糖淀粉酶共軛體。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，公開(kāi)了固定化真菌α-淀粉酶共軛體。所述固定化真菌α-淀粉酶包括載體和處理過(guò)的加合物。載體包括聚乙烯亞胺。將固體支持物與聚乙烯亞胺結(jié)合，形成載體。處理過(guò)的加合物包括戊二醛。將真菌α-淀粉酶與戊二醛結(jié)合，由此處理真菌α-淀粉酶，并形成處理過(guò)的加合物。最后，將載體與處理過(guò)的含α-淀粉酶的加合物結(jié)合，從而形成穩(wěn)定、有活性的固定化真菌α-淀粉酶共軛體。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步教導(dǎo)，公開(kāi)了固定化β-淀粉酶共軛體。所述固定化β-淀粉酶共軛體包括載體和處理過(guò)的加合物。載體包括聚乙烯亞胺。將固體支持物與聚乙烯亞胺結(jié)合，形成載體。處理過(guò)的加合物包括戊二醛。將β-淀粉酶與戊二醛結(jié)合，從而處理β-淀粉酶，并形成處理過(guò)的加合物。最后，將載體與含β-淀粉酶的加合物結(jié)合，形成穩(wěn)定、有活性的固定化β-淀粉酶共軛體。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，公開(kāi)了含有載體和處理過(guò)的加合物的固定化酶共軛體。處理過(guò)的加合物包括至少一種胺活性物質(zhì)，它選自多官能醛，多官能有機(jī)鹵化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能異硫氰酸鹽(酯)，多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。處理過(guò)的加合物還包括至少一種與至少一種胺活性物質(zhì)結(jié)合的酶。用這種方法處理酶，并形成處理過(guò)的含酶加合物。最后，載體與處理過(guò)的含酶加合物結(jié)合，由此形成穩(wěn)定、有活性的固定化酶共軛體。
另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了用于制備固定化酶共軛體的處理過(guò)的加合物。處理過(guò)的加合物包括至少一種胺活性物質(zhì)，它選自多官能醛，多官能有機(jī)鹵化物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能異硫氰酸鹽(酯)，多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。處理過(guò)的加合物還包括至少一種與至少一種胺活性物質(zhì)結(jié)合的酶。用該方法處理酶，并形成處理過(guò)的含酶加合物。
通過(guò)閱讀與說(shuō)明性實(shí)施例相結(jié)合的本發(fā)明的下列描述，本發(fā)明的這些及其它目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的方法適用于制備有活性且穩(wěn)定的新的固定化酶共軛體，其酶緊縛于其中。
對(duì)于本文公開(kāi)的方法有用的酶包括含有能與胺活性物質(zhì)反應(yīng)的氨基的任何酶。在同一共軛體中也可固定兩種或多種酶。這些酶包括胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，已糖激酶，無(wú)花果蛋白酶，菠蘿蛋白酶，乳酸脫氫酶，乳糖酶，葡萄糖異構(gòu)酶，葡糖淀粉酶，胰凝乳蛋白酶，鏈霉蛋白酶，?；D(zhuǎn)移酶，蔗糖酶，淀粉酶，支鏈淀粉酶，轉(zhuǎn)葡糖苷酶，葡萄糖氧化酶，胃蛋白酶，蛋白酶，過(guò)氧化氫酶，羥化酶，凝乳酶，轉(zhuǎn)移酶及其混合物。這些酶優(yōu)選地包括葡萄糖異構(gòu)酶，葡糖淀粉酶，蔗糖酶，β-淀粉酶，細(xì)菌α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶，轉(zhuǎn)葡糖苷酶及其混合物。這些酶更優(yōu)選地包括葡糖淀粉酶，細(xì)菌α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶，β-淀粉酶及其混合物。用由SOLVAY ENZYMES，Inc.(Elkhart，Indiana)以DIAZYME L-200商標(biāo)銷(xiāo)售的葡糖淀粉酶得到了滿(mǎn)意的結(jié)果。用由SOLVAY ENZYMES，Inc.(Elkhart，Indiana)以CLARASE L-40，000商標(biāo)銷(xiāo)售的真菌α-淀粉酶也已得到滿(mǎn)意的結(jié)果。用以SPEZYME BBA 1500商標(biāo)銷(xiāo)售的β-淀粉酶也獲得了很好的結(jié)果。
本發(fā)明的方法不同于以前公開(kāi)的方法，即在將處理過(guò)的含酶加合物與載體結(jié)合前，包括了使酶與胺活性物質(zhì)溶液(如戊二醛)接觸的步驟，以形成(處理過(guò)的含酶)處理過(guò)的加合物。盡管不能準(zhǔn)確地理解，但應(yīng)相信，用該方法，在與載體反應(yīng)(結(jié)合)前處理酶，以便當(dāng)處理過(guò)的加合物與載體隨后接觸(反應(yīng))時(shí)，處理過(guò)的酶能更緊地結(jié)合和/或更緊密地縛(截留)于由此形成的固定化酶共軛體中[通過(guò)從中除去固定化共軛體后，反應(yīng)介質(zhì)中的酶活性量(數(shù)量)測(cè)量。所述的酶活性量等于在使用共軛體時(shí)，從酶共軛體丟失了反應(yīng)介質(zhì)中的酶活性]。
本文所用的關(guān)于使酶與胺活性物質(zhì)接觸以得到由此形成的加合物和化合物、組合物及組成的術(shù)語(yǔ)“處理過(guò)的”指酶與胺活性物質(zhì)接觸形成加合物的實(shí)際過(guò)程，以及作為所述接觸(或處理)結(jié)果的酶、化合物和/或組合物的結(jié)構(gòu)。因此，如本文所用的“處理過(guò)的”酶是已與胺活性物質(zhì)接觸過(guò)的酶，按本文描述的，和，作為所述接觸的結(jié)果，該酶形成有更強(qiáng)“縛束”力，如(僅為說(shuō)明)涉及酶的強(qiáng)(緊)共價(jià)鍵，和/或涉及和/或截留酶的交鍵的化合物。
用本發(fā)明的方法，能夠提供固定化酶共軛體，它具有改善的長(zhǎng)期穩(wěn)定性及提高的總活性。
本發(fā)明的固定化酶共軛體包括載體和處理過(guò)的含酶加合物。在這些共軛體中，在處理過(guò)的含酶加合物與載體結(jié)合前，通過(guò)與加合物的胺活性物質(zhì)接觸(反應(yīng))處理酶。相信酶的上述處理導(dǎo)致固定化酶共軛體具有(1)數(shù)量增多的鍵，包括涉及共軛體和/或其酶的共價(jià)鍵;和/或(2)在處理過(guò)的酶和固定化酶共軛體剩余部分之間提高的交聯(lián)，由此提供使酶緊縛(或截留)于其中的基體(或改善的基體)。
本文公開(kāi)的優(yōu)選方法包括通過(guò)使固體支持物與具有至少一個(gè)側(cè)鏈胺基的多胺化合物溶液接觸，從處理過(guò)的加合物獨(dú)立地形成載體。對(duì)于上述步驟，其中固體支持物是在美國(guó)專(zhuān)利4，713，333中充分描述過(guò)的多孔硅藻土顆粒，該文獻(xiàn)內(nèi)容引入本文作文參考。
術(shù)語(yǔ)“具有至少一個(gè)側(cè)鏈胺基的多胺化合物”，在本文中指具有至少一個(gè)胺基的多胺化合物，所述胺基能與胺活性物質(zhì)有效地反應(yīng)。適用于本發(fā)明的所述多胺化合物的具體實(shí)例包括聚乙二胺，聚乙烯亞胺(如，聚二亞乙基三胺，聚三亞乙基四胺，聚五亞乙基六胺或聚六亞甲基二胺)，聚亞甲基二環(huán)已胺，聚亞甲基二苯胺，聚四亞乙基五胺，聚亞苯基二胺及兩種或多種這些多胺化合物的混合物。優(yōu)選的是上述提到的水溶性多胺化合物。盡管認(rèn)為多胺化合物的分子量是不重要的，但是優(yōu)選的是分子量為500到100，000道爾頓的上述多胺化合物。最佳為聚乙烯亞胺。
可以將水溶性多胺化合物用于來(lái)自其水溶液的硅藻土顆粒，而非水溶性聚合物可使用來(lái)自有機(jī)溶劑(如甲醇，乙醇，丙醇)中的。
一般對(duì)于載體，每克固體支持物(如，多孔硅藻土顆粒)使用至少約10mg多胺化合物。優(yōu)選的，每克固體支持物使用至少約15mg多胺化合物。
一般，對(duì)于載體，每克固體支持物(如，多孔硅藻土顆粒)使用不超過(guò)約60mg多胺化合物。優(yōu)選的，每克固體支持物使用不超過(guò)約25mg多胺化合物。
多胺化合物與硅藻土之間優(yōu)選的比率為每克固體支持物約10mg到約60mg多胺化合物。最佳比率為，每克固體支持物(如，多孔硅藻土顆粒)約15mg到約25mg多胺化合物。
所用的多胺化合物溶液的濃度為多胺化合物比溶劑(如，水)約1%(重量/體積)到約0.01%(重量/體積)。以約10ml硅藻土顆粒比約50ml多胺化合物溶液的比率，將多胺化合物溶液加到硅藻土顆粒中。
本文可使用任何固體支持物，它適用于與多胺化合物反應(yīng)并支持處理過(guò)的加合物中的處理過(guò)的酶。優(yōu)選的固體支持物是多孔的。以該觀點(diǎn)看，特別優(yōu)選的所用的固體支持物是多孔硅藻土顆粒。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何硅藻土顆粒。特別適合的硅藻土顆粒粒度為大于約72目，粒度大于約52目的顆粒是優(yōu)選的，最佳的粒度為大于約40目。特別適合的硅藻土顆粒粒度也可以是小于約10目的，優(yōu)選的粒度小于約14目。用粒度小于約16目的硅藻土顆粒已得到了特別好的結(jié)果。(按美國(guó)篩測(cè)量上述篩目。)硅藻土顆粒孔的半徑優(yōu)選為約35埃到約1000埃。硅藻土顆粒的表面積優(yōu)選為約20m2/g到約60m2/g。
然后優(yōu)選地用任何適宜的化合物洗滌上述形成的載體以有效地除去載體的游離多胺化合物。優(yōu)選的是用水完成上述洗滌。在美國(guó)專(zhuān)利4，713，333中詳細(xì)描述了所述洗滌，該文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考。
從形成的載體，獨(dú)立地形成處理過(guò)的加合物。通過(guò)使酶與胺活性物質(zhì)溶液接觸，形成處理過(guò)的加合物，以便用胺活性物質(zhì)處理酶，形成處理過(guò)的含酶加合物。
術(shù)語(yǔ)“胺活性物質(zhì)”在本文指能與胺基有效反應(yīng)的任何化合物。胺活性物質(zhì)選自多官能醛，多官能有機(jī)鹵化合物，多官能酐，多官能偶氮化合物，多官能異硫氰酸鹽(酯)，多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。
用術(shù)語(yǔ)“多官能”指含有胺活性物質(zhì)的各種化合物，本文指與酶接觸時(shí)，任何具有或能夠具有至少兩個(gè)可以與不同胺基反應(yīng)的化學(xué)功能團(tuán)的化合物，功能團(tuán)之一能與來(lái)自載體多胺化合物的胺基反應(yīng)，另一功能團(tuán)能與來(lái)自處理過(guò)的加合物中酶的胺基反應(yīng)。
通常，胺活性物質(zhì)選自戊二醛，琥珀酐，對(duì)苯二醛，二重氮基聯(lián)苯胺-2，2′-二磺酸，4，4′-二氟-3，3′-二硝基二苯基砜，二苯基-4，4′-二硫氰酸酯-2，2′-二磺酸，3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二異氰酸酯，甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯，甲苯-2，4-二異硫氰酸酯，重氮基聯(lián)苯胺，重氮基聯(lián)苯胺-3，3′-二聯(lián)茴香胺，N，N′-六亞甲基二碘乙酰胺，1，6-已二異氰酸酯，氰尿酰氯，1，5-二氟-2，4-二硝基苯及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物。優(yōu)選的，胺活性物質(zhì)選自多官能醛。更優(yōu)選的，胺活性物質(zhì)選自戊二醛，琥珀醛，對(duì)苯二醛。用戊二醛得到了最佳結(jié)果。
可將水溶性胺活性物質(zhì)用于來(lái)自其水溶液中的酶?？蓪⒎撬苄园坊钚晕镔|(zhì)用于來(lái)自有機(jī)溶劑(如，甲醇，乙醇，丙醇)中的酶。水溶性胺活性物質(zhì)是優(yōu)選的。
通常，使用酶水溶液。優(yōu)選的，所述水溶液是緩沖水溶液。根據(jù)所涉及的酶及溶液組分的不同，所用的酶準(zhǔn)確的有效濃度和準(zhǔn)確的最佳濃度及溶液組成(如，水緩沖液)不同。但是，在本公開(kāi)的指導(dǎo)下，經(jīng)簡(jiǎn)單常規(guī)試驗(yàn)后，所述濃度對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員是顯而易見(jiàn)的。在此應(yīng)注意在任何情況下，優(yōu)選所述溶液在每ml酶溶液(或每克固體酶)中含有70至100ml的緩沖水溶液。
通常，在胺活性物質(zhì)的溶液(水)中，胺活性物質(zhì)的濃度至少為約0.05%(重量/體積)，優(yōu)選的是至少約0.1%(重量/體積)。進(jìn)一步說(shuō)，通常胺活性物質(zhì)的溶液(水)中胺活性物質(zhì)的濃度不超過(guò)約0.4%，優(yōu)選的是不超過(guò)約0.2%(重量/體積)。
處理過(guò)的加合物在每ml酶溶液中(在加入水緩沖液前)含有至少約0.10g胺活性物質(zhì)。優(yōu)選的，處理過(guò)的加合物在每ml酶溶液中(加入水緩沖液前)含有至少約0.15g胺活性物質(zhì)。最優(yōu)選的是，每ml酶溶液(加入水緩沖液前)使用至少約0.2g胺活性物質(zhì)。
處理過(guò)的加合物在每ml酶溶液中(加入水緩沖液前)含有的胺活性物質(zhì)不超過(guò)約1.50g。優(yōu)選的，處理過(guò)的加合物在每ml酶溶液中(加入水緩沖液前)含有不超過(guò)約1.0g的胺活性物質(zhì)。最佳是在每ml酶溶液中(加入水緩沖液前)使用不超過(guò)約0.3g的胺活性物質(zhì)。
然而，在此應(yīng)注意，胺活性物質(zhì)與酶之間的比率取決于所用酶的活性。
例如，若戊二醛是胺活性物質(zhì)，且葡糖淀粉酶(含200DU/ml)是酶時(shí)，優(yōu)選每ml葡糖淀粉酶至少約0.15g戊二醛，最佳為每ml葡糖淀粉酶至少約0.2g戊二醛，且優(yōu)選的是每ml葡糖淀粉酶使用不超過(guò)約1.00g的戊二醛，最佳為每ml葡糖淀粉酶使用不超過(guò)0.3g的戊二醛。
一個(gè)Diazyme Unit(Du)是指用可溶液性淀粉作為底物，在pH4.2和60℃的檢測(cè)條件下，1小時(shí)內(nèi)催化生產(chǎn)一克葡萄糖的活性。
作為另一實(shí)例，若戊二醛是胺活性物質(zhì)且真菌α-淀粉酶(含40，000SKBU/g)是酶時(shí)，優(yōu)選的是每mlα-淀粉酶用至少約0.15g的戊二醛，最佳是每mlα-淀粉酶用至少約0.2g戊二醛，并且每mlα-淀粉酶使用不超過(guò)約1.00g的戊二醛是優(yōu)選的，每mlα-淀粉酶使用不超過(guò)0.3g的戊二醛是最佳的。
一個(gè)α-淀粉酶(SKBU)單位指在檢測(cè)條件下，每小時(shí)糊精化1.0g極限糊精底物的活性。
相似地，作為最后的實(shí)例，若戊二醛作為胺活性物質(zhì)且β-淀粉酶(每ml含1500單位淀粉糖化活性)作為酶，則優(yōu)選的是每mlβ-淀粉酶使用至少約0.15g戊二醛，最佳為每mlβ-淀粉酶使用至少約0.2g戊二醛，并且每mlβ-淀粉酶使用不超過(guò)約1.00g戊二醛是優(yōu)選的，每mlβ-淀粉酶使用不超過(guò)0.3g戊二醛最佳。
用Food Chemical Codex，Vol.Ⅲ(1981)第484頁(yè)中公開(kāi)的方法確定淀粉糖化活性，并將其表達(dá)為糖化力的程度(DP°)。
一般酶與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))的溫度為至少約10℃，優(yōu)選的溫度為至少約18℃，最佳溫度為至少約20℃。作為上限，一般溫度不超過(guò)約30℃，不超過(guò)約28℃是優(yōu)選的，不超過(guò)約25℃最佳。
酶與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))至少約2小時(shí)，接觸時(shí)間至少約3小時(shí)是優(yōu)選的，至少4小時(shí)最佳。酶與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))不超過(guò)約24小時(shí)，接觸時(shí)間不超過(guò)約6小時(shí)是優(yōu)選的，最佳為不超過(guò)約4小時(shí)。
在由酶活性pH范圍決定的pH將酶與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))，在該pH酶活性可以耐受而不明顯失去酶活性。
若葡糖淀粉酶是酶時(shí)，與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))的pH為至少約3.5，至少約4.5的pH是優(yōu)選的，并且pH不大于約6.0，優(yōu)選pH不大于約5.0。
若用真菌α-淀粉酶作為酶時(shí)，與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))的pH至少為約4.5，至少約5.0的pH是優(yōu)選的，并且pH不大于約7.0，優(yōu)選pH不大于約5.5。
若用β-淀粉酶作為酶時(shí)，與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))的pH至少為約4.5，至少約5.0的pH是優(yōu)選的，并且pH不大于約7.0，優(yōu)選pH不大于約5.5。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，于攪拌條件下，使酶與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))以形成處理過(guò)的含酶加合物。在混合以通過(guò)溶液提供勻質(zhì)混合物的條件下，使酶與胺活性物質(zhì)接觸(并隨即反應(yīng))。優(yōu)選足夠緩慢地?cái)嚢?，以便沒(méi)有氣泡形成。
用上述方法及在上述條件下，完成載體與處理過(guò)的含酶加合物的接觸，以使載體和處理過(guò)的加合物相互反應(yīng)，形成固定化酶共軛體。
通常，對(duì)于本發(fā)明的固定化酶共軛體，每克載體包括至少約0.05ml處理過(guò)的含酶加合物。優(yōu)選的是，每克載體含至少0.07ml處理過(guò)的含酶加合物。進(jìn)一步說(shuō)，對(duì)于本發(fā)明的固定化酶共軛體，每克載體含有不超過(guò)約0.6ml處理過(guò)的含酶加合物，優(yōu)選的是每克載體含有不超過(guò)約0.5ml處理過(guò)的含酶加合物。
若將由處理過(guò)的葡糖淀粉酶與戊二醛形成的處理過(guò)的加合物與由聚乙烯亞胺和硅藻土顆粒形成的載體接觸，優(yōu)選的比率為每克載體約0.11ml到約0.13ml處理過(guò)的加合物。若將由處理過(guò)的真菌α-淀粉酶與戊二醛形成的處理過(guò)的加合物與由聚乙烯亞胺和硅藻土顆粒形成的載體接觸，優(yōu)選的比率為每克載體約0.14ml到約0.16ml處理過(guò)的加合物。若將由處理過(guò)的β-淀粉酶和戊二醛形成的處理過(guò)的加合物與由聚乙烯亞胺和硅藻土顆粒形成的載體接觸，優(yōu)選的比率為每克載體約0.15ml到約0.17ml處理過(guò)的加合物。
通過(guò)攪拌或再循環(huán)使載體和處理過(guò)的含酶加合物接觸。應(yīng)足夠緩慢地?cái)嚢琛?br> 載體與處理過(guò)的含酶加合物接觸的溫度為至少約5℃，優(yōu)選的溫度為至少約15℃，特別優(yōu)選的溫度為至少20℃。載體與處理過(guò)的含酶加合物接觸的溫度不超過(guò)約30℃，優(yōu)選的溫度是不超過(guò)約28℃，特別優(yōu)選的溫度為不超過(guò)約25℃。
載體與處理過(guò)的含酶加合物接觸至少約2小時(shí)，至少約4小時(shí)是優(yōu)選的。載體與處理過(guò)的含酶加合物接觸不超過(guò)約24小時(shí)，不超過(guò)約6是優(yōu)選的，最優(yōu)選不超過(guò)約4小時(shí)。
載體與處理過(guò)的含酶加合物接觸的pH至少為約4.0，優(yōu)選的pH為至少約4.5。載體與處理過(guò)的含酶加合物接觸的pH不大于約7.0，pH不大于約6.0是優(yōu)選的。
用適宜的溶液洗滌如此得到的固定化酶共軛體以除去游離的加合物和游離的載體是特別優(yōu)選的。優(yōu)選該溶液是水。在與上述載體和處理過(guò)的含酶加合物接觸的步驟相同的條件下實(shí)現(xiàn)該洗滌步驟。
可以冷凍貯存固定化酶共軛體幾個(gè)月以上，而不會(huì)明顯喪失酶活性。優(yōu)選的，在貯存共軛體前，將含0.3%(重量/體積)苯甲酸鈉、0.15%(重量/體積)山梨酸鉀和5%(重量/體積)玉米糖漿的0.02M乙酸鹽組合物(pH4.2)加至固定化酶共軛體中。
本發(fā)明未預(yù)料到的一個(gè)觀察結(jié)果是，用上述方法得到的固定化酶共軛體實(shí)際上比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333得到的那些固定化酶共軛體更穩(wěn)定(通過(guò)測(cè)量在其使用期間丟失于反應(yīng)介質(zhì)中的共軛體的酶活性百分?jǐn)?shù)而確定的)。另外，在相同使用條件下，它們比用美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化酶共軛體有更好的熱穩(wěn)定性，按本發(fā)明制備的固定化酶共軛體的半衰期比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化酶共軛體的半衰期更長(zhǎng)。這說(shuō)明顯著提高了酶的生產(chǎn)率。
本發(fā)明另一令人滿(mǎn)意的方面是可以很容易地回收本文公開(kāi)的固定化酶共軛體，并在使用涉及酸堿洗滌的簡(jiǎn)單方法再生后通過(guò)固定化作用制備該共軛體并再使用。具體說(shuō)，在水、0.5N NaOH、水、0.5N HCl以及然后是水，混合用過(guò)的固定化酶共軛體。本發(fā)明的該方面是非常有意義的，因?yàn)樗鼫p少了與其相關(guān)的一次性使用問(wèn)題，并通過(guò)提高酶的生產(chǎn)率提供了可能的經(jīng)濟(jì)節(jié)約。
通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例是為了說(shuō)明優(yōu)選的具體方案，而不意味著由此限定本發(fā)明。
實(shí)施例1制備固定化葡糖淀粉酶共軛體。
將700ml 16到40日(美國(guó)篩)的多孔硅藻土顆粒(美國(guó)專(zhuān)利4，713，333中描述的，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)轉(zhuǎn)移至直徑5cm、高100cm的玻璃柱反應(yīng)器中。
將一層4cm的12目小石子(aquarium gravel)鋪在柱的端板以便在操作過(guò)程中溶液上流時(shí)，幫助分散液體。
以一定的速度將水向上泵，以膨脹或流體化約20%的硅藻土顆粒，從而除細(xì)砂。一般在1小時(shí)內(nèi)，水流出物中沒(méi)有了細(xì)砂。將水引至硅藻土顆粒層的頂部。
然后，將3500ml 0.1%(重量/體積)聚乙烯亞胺水溶液(PEI-600，分子量40，000-60，000道爾頓，pH9.8)向上泵，并使流出物在該層內(nèi)再循環(huán)2小時(shí)。然后從柱中將聚乙烯亞胺水溶液排至硅藻土顆粒層的頂部。
室溫下，用水上流洗滌硅藻土顆粒2小時(shí)以除去游離的聚乙烯亞胺。用這種方法，得到了硅藻土顆粒-聚乙烯亞胺載體。
將以DIAZYME L-200(SOLVAY ENZYMES，Inc.，Elkhart，Indiana)商標(biāo)銷(xiāo)售的35ml葡糖淀粉酶加至3500ml pH5.0的0.02M乙酸鹽緩沖液中。葡糖淀粉酶DIAZYME L-200含200DU/ml的葡糖淀粉酶活性。
邊緩慢混合，邊將17.5g 50%(重量/重量)戊二醛(在水中)緩慢加至葡糖淀粉酶水溶液中，在20-25℃，邊緩慢攪拌邊使戊二醛與葡糖淀粉酶水溶液反應(yīng)4小時(shí)。結(jié)果是形成了含有處理過(guò)的葡糖淀粉酶的處理過(guò)的葡糖淀粉酶-戊二醛加合物。
然后，使處理過(guò)的葡糖淀粉酶-戊二醛加合物循環(huán)通過(guò)上述制備的硅藻土顆粒-聚乙烯亞胺載體。在緩慢攪拌下，于約20-25℃使所述循環(huán)保持4小時(shí)，然后用水洗滌掉載體中過(guò)量的處理過(guò)的加合物。結(jié)果是結(jié)成了穩(wěn)定、有活性的固定化葡糖淀粉酶共軛體。
然后從柱中除去洗滌過(guò)的共軛體，并貯存于pH4.2含0.3%(重量/體積)苯甲酸鈉、0.15%(重量/體積)山梨酸鉀和5%(重量/體積)玉米糖漿固體的0.02M乙酸鹽中以備將來(lái)使用。
然后，可將上述形成的固定化葡糖淀粉酶共軛體貯存于經(jīng)數(shù)月仍不會(huì)明顯喪失活性的冷藏條件下。
用50ml pH4.2的在0.02M乙酸鹽中的33%(W/V)玉米淀粉作為底物，在55℃檢測(cè)固定化酶共軛體。為了完成檢測(cè)，將底物和酶置于250ml燒瓶中并于55℃水浴振蕩培養(yǎng)。在反應(yīng)時(shí)間達(dá)到15和75分鐘時(shí)，取出0.2ml反應(yīng)混合物并加入0.5ml 0.2N H2SO4以終止反應(yīng)。加入5.3ml蒸餾水稀釋這些樣品，然后用0.45μ的濾器過(guò)濾。用碳水化合物高壓液相色譜(HPLC)分析產(chǎn)物。一單位活性表示在檢測(cè)條件下，1分鐘內(nèi)生產(chǎn)1微摩爾葡萄糖的酶量，并表示為U/g(每克共軛體的活性單位數(shù))。
發(fā)現(xiàn)該制劑的酶活性為881單位/g(以干重計(jì))。發(fā)現(xiàn)總活性的84.6%是以固定化酶表現(xiàn)的，15.4%是非固定的。固定化酶的密度為0.43g/ml。
實(shí)施例2在提取介質(zhì)中固定化葡糖淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性該實(shí)施例證明了共軛體的穩(wěn)定性(酶是怎樣很好地縛于共軛體中)。本方法的原理是在提取介質(zhì)中培養(yǎng)固定化酶共軛體。所述培養(yǎng)后，除去共軛體，檢測(cè)提取物介質(zhì)以確定從共軛體中脫離的(未結(jié)合的)并丟失于提取介質(zhì)中的酶量(通過(guò)測(cè)量其酶活性來(lái)確定)。
將按實(shí)施例1制備的5ml固定化酶共軛體樣品放入15ml錐形塑料管中，并用水洗滌數(shù)次。然后倒出液體，隨后加入5mlpH5.0含5%(重量/體積)NaCl的0.02N乙酸鹽緩沖液。
混合數(shù)分鐘后，在30℃水浴中將試管培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)WHATMAN N°1濾紙重力過(guò)濾酶漿。
然后，將0.1ml濾物加至1.0ml底物(20%(w/v)pH5.0的在0.02N乙酸鹽中的玉米淀粉)中，在60℃水浴中放置60分鐘。60分鐘后，將試管在沸水浴中放10分鐘，終止反應(yīng)。
然后用流動(dòng)相0.01N H2SO4將樣品(稱(chēng)為樣品A)稀釋10倍，用HPLC分析碳水化合物圖。
為了比較，按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333的實(shí)施例1制備固定化葡糖淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品B)，并按上段中描述的方法檢測(cè)。
樣品A和B的檢測(cè)結(jié)果列于表1中。
表1樣品 起始活性 提取后活性 丟失的活性U/ml (U/ml) %A 379 369 2.6B 332 293 12.0結(jié)果清楚地說(shuō)明，在共軛體基質(zhì)中按本發(fā)明方法生產(chǎn)的固定化葡糖淀粉酶共軛體的處理過(guò)的葡糖淀粉酶明顯比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化葡糖淀粉酶共軛體的更穩(wěn)定(緊縛的)，由上，減少了從共軛體中酶的丟失和進(jìn)入反應(yīng)介質(zhì)中，正如本發(fā)明共軛體所經(jīng)歷的。
實(shí)施例3在玻璃柱中固定化葡糖淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性將50ml按實(shí)施例1所述制備的固定化葡糖淀粉酶共軛體放入直徑1.5cm、高50cm的帶套玻璃柱中。
用循環(huán)水浴將該柱保持于55℃。然后，于55℃以50ml/小時(shí)的流速經(jīng)24小時(shí)，使由在pH5.0的0.02N乙酸鹽緩沖液中的10%(W/W)干固體(DS)43DE漿和5%(W/V)NaCl組成的提取介質(zhì)通過(guò)該柱。
提取結(jié)束時(shí)，檢測(cè)由此得到的固定化葡糖淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品C)以評(píng)估其穩(wěn)定性。
為了對(duì)比，用與上段描述的相同的方法檢測(cè)按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333的實(shí)施例1制備的固定化葡糖淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品D)。
樣品C和D的檢測(cè)結(jié)果列于表2表2樣品 起始活性(U/g) 提取后活性(U/g) 丟失的活性%C 881 653 26D 771 396 49結(jié)果清楚地表明，在共軛體基質(zhì)中按本發(fā)明方法制備的固定化葡糖淀粉酶共軛體的處理過(guò)的葡糖淀粉酶明顯比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化葡糖淀粉酶共軛體的更穩(wěn)定(緊縛的)，由此減少了酶從共軛體中的丟失以及進(jìn)入反應(yīng)介質(zhì)中，正如本發(fā)明共軛體所經(jīng)歷的。
實(shí)施例4制備固定化α-淀粉酶共軛體取44ml由SOLVAY-ENZYMES，Inc.(Elkhart，Indiana)以CLARASE L-40，000商標(biāo)銷(xiāo)售的真菌α-淀粉酶，并按實(shí)施例1的固定化方法制成固定化真菌α-淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品E)。
以CLARASE L-40，000商標(biāo)銷(xiāo)售的真菌α-淀粉酶具有40，000SKBU/g的酶活性。1個(gè)(SKBU)α-淀粉酶單位是指在檢測(cè)條件下，每小時(shí)糊精化1.0g極限糊精底物的活性。
發(fā)現(xiàn)固定化酶共軛體的活性為638U/g。
實(shí)施例5在提取介質(zhì)中固定化α-淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性。
按實(shí)施例4，制備5ml固定化酶共軛體樣品，按實(shí)施例1中描述的酶活性檢測(cè)方法(只是底物的pH6.0)，完成下列檢測(cè)。
按實(shí)施例2中所述，通過(guò)在30℃，將酶培養(yǎng)過(guò)夜，評(píng)估固定化真菌α-淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性。NaCl乙酸鹽緩沖液的pH為6.0，與實(shí)施例1固定化葡糖淀粉酶5.0的pH形成對(duì)照，并且溶解的真菌α-淀粉酶活性的檢測(cè)溫度是50℃而不是60℃。
為了對(duì)比，按與上段所述相同的方法，檢測(cè)按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333中實(shí)施例1所用方法制備的固定化真菌α-淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品F)。
樣品E和F的檢測(cè)結(jié)果列于表3。
表3樣品 起始活性(U/ml) 提取后活性(U/ml) 丟失的活性%E 274 266.5 3.0F 366 156.0 57.0結(jié)果清楚地說(shuō)明，在共軛體基質(zhì)中，按本發(fā)明方法制備的固定化α-淀粉酶共軛體的處理過(guò)的α-淀粉酶明顯比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化真菌α-淀粉酶共軛體的更穩(wěn)定(緊縛的)，由此減少了酶從共軛體中的丟失以及進(jìn)入反應(yīng)介質(zhì)中，正如本發(fā)明共軛體所經(jīng)歷的。
實(shí)施例6玻璃柱中固定化α-淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性得到50ml按實(shí)施例4中所述制備的固定化α-淀粉酶共軛體(稱(chēng)為樣品E)。
為了對(duì)比，按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333實(shí)施例1制備固定化α-淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品F)。
除了在5.0%(w/v)NaCl的0.02M乙酸鹽中，10%DS(干固體)漿的pH是6.0而不是5.0，柱溫度是50℃而不是55℃外，按實(shí)施例3中描述的柱方法檢測(cè)兩種固定化真菌α-淀粉酶共軛體樣品(樣品E和F)的穩(wěn)定性。
使用柱方法檢測(cè)的樣品E和F的結(jié)果列于表4。
表4樣品 起始活性(U/g) 提取后活性(U/g) 丟失的活性%E 638 608 4.7F 851 518 39.0這些結(jié)果清楚地說(shuō)明，在共軛體基質(zhì)中，按本發(fā)明制備的固定化真菌α-淀粉酶共軛體的處理過(guò)的真菌α-淀粉酶比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化真菌α-淀粉酶共軛體的更穩(wěn)定(緊縛的)，由此降低了酶從共軛體中的丟失以及進(jìn)入反應(yīng)介質(zhì)中，正如本發(fā)明共軛體所經(jīng)歷的。
實(shí)施例7固定化α-淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性(半衰期)另一種觀察穩(wěn)定性的方法是將固定化酶共軛體放在柱中，然后監(jiān)測(cè)底物通過(guò)酶共軛體層的活性。
將15ml按實(shí)施例4中的描述得到的固定化真菌α-淀粉酶共軛體(稱(chēng)為樣品G)置于直徑1.5cm、高50cm的玻璃套柱中。將該柱保持于60°并以每小時(shí)約45ml的恒定流速，使喂入的漿液滲透通過(guò)柱床。喂入的漿液由pH調(diào)至6.0的40%DS(干固體)的43DE漿組成并加入下列防腐劑0.3%(w/v)苯甲酸鈉、0.15%(w/v)山梨酸鉀、125ppm羥苯甲酸甲酯和250ppm SO2。
每天取樣，用HPLC分析得到碳水化合物圖。通過(guò)計(jì)算每ml固定化酶共軛體每分鐘形成的麥芽糖μmol數(shù)，用二糖部分計(jì)算活性。
為了對(duì)比，按與上段所述相同的方法檢測(cè)由美國(guó)專(zhuān)利4，713，333實(shí)施例1中所用的方法制備的固定化真菌α-淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品H)。
樣品G和H的檢測(cè)結(jié)果列于表5。
表5樣品 起始活性U/ml 半衰期(天數(shù))G 1700 29H 1500 18這些結(jié)果清楚地說(shuō)明，按本發(fā)明制備的固定化真菌α-淀粉酶共軛體的處理過(guò)的真菌α-淀粉酶比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化真菌α-淀粉酶共軛體更穩(wěn)定，它具有明顯提高的半衰期。
實(shí)施例8制備固定化β-淀粉酶共軛體制備48mlβ-淀粉酶(每ml含1500單位糖化活性)，并按實(shí)施例1的固定化方法制成固定化β-淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品I)。
用Food Chemical Codex Vol.Ⅲ，(1981)，P.484上公開(kāi)的有關(guān)糖化活性的方法，確定活性并將其表達(dá)為糖化力的程度(DP°)。
發(fā)現(xiàn)該制品的酶活性是860單位/g(以干重計(jì))。
實(shí)施例9在提取介質(zhì)中固定化β-淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性按實(shí)施例子8制備5ml固定化酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品I)，并按實(shí)施例1中描述的檢測(cè)酶活性的檢測(cè)方法(除底物pH是5.5外)檢測(cè)。
按實(shí)施例2中的描述，通過(guò)在30℃將酶培養(yǎng)過(guò)夜，評(píng)估固定化β-淀粉酶共軛體的穩(wěn)定性。NaCl乙酸鹽緩沖液的pH是5.5，而不是實(shí)施例2固定化葡糖淀粉酶的pH5.0，檢測(cè)溶解的β-淀粉酶活性的溫度是55℃而不是60℃。
為了對(duì)比，按與上段所述相同的方法檢測(cè)按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333實(shí)施例1中所用方法制備的固定化β-淀粉酶共軛體樣品(稱(chēng)為樣品J)。
樣品I和J的檢測(cè)結(jié)果列于表6。
表6樣品 起始活性(U/ml) 提取后活性(U/ml) 丟失的活性%I 370 369 <0.5J 201 188 6.5這些結(jié)果清楚地說(shuō)明在共軛體基質(zhì)中，按本發(fā)明方法制備的固定化β-淀粉酶共軛體的處理過(guò)的β-淀粉酶比按美國(guó)專(zhuān)利4，713，333制備的固定化β-淀粉酶的更穩(wěn)定(緊縛的)，由此減少了酶從共軛體中的丟失以及進(jìn)入反應(yīng)介質(zhì)中，正如本發(fā)明共軛體所經(jīng)歷的。
顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行大量的修改及改變。因此應(yīng)理解在后附的權(quán)利要求范圍內(nèi)，也可按其它方式實(shí)施本發(fā)明，而不僅限于本文具體描述的。
權(quán)利要求
1.一種制備固定化酶共軛體的方法，包括下列步驟(a)將多孔硅藻土顆粒與含有至少一個(gè)側(cè)鏈胺基的多胺化合物溶液接觸，形成載體；(b)將酶與至少一種胺活性物質(zhì)溶液接觸，所述胺活性物質(zhì)選自多官能醛、多官能有機(jī)鹵化物、多官能酐、多官能偶氮化合物、多官異硫氰酸鹽(酯)、多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物，由此形成處理過(guò)的含酶加合物；和(c)將載體和處理過(guò)的加合物接觸，以使載體和處理過(guò)的加合物反應(yīng)形成固定化酶共軛體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中胺活性物質(zhì)是戊二醛。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中多胺化合物是聚乙烯亞胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酶含有能與胺活性物質(zhì)反應(yīng)的氨基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中胺活性物質(zhì)與酶的比率為每ml酶約0.10g到約1.50g胺活性物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)在包括攪拌的條件下完成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟(c)后還包括用水洗滌固定化酶共軛體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，處理過(guò)的加合物與載體之間的比率為每克載體約0.05ml到約0.6ml處理過(guò)的加合物。
9.制備固定化葡糖淀粉酶共軛體的方法，包括下列步驟(a)將固體支持物與聚乙烯亞胺接觸，從而形成載體;(b)將葡糖淀粉酶與戊二醛溶液接觸，由此形成處理過(guò)的含酶加合物;和(c)將載體和處理過(guò)的加合物接觸，使載體和處理過(guò)的加合物反應(yīng)，形成固定化葡糖淀粉酶共軛體。
10.制備固定化真菌α-淀粉酶共軛體的方法，包括下列步驟(a)將固體支持物與聚乙烯亞胺溶液接觸，由此形成載體。(b)將真菌α-淀粉酶與戊二醛溶液接觸，由此形成處理過(guò)的含酶加合物;和(c)將載體和處理過(guò)的加合物接觸，以使載體和處理過(guò)的加合物反應(yīng)，形成固定化真菌α-淀粉酶共軛體。
11.制備固定化β-淀粉酶共軛體的方法，包括下列步驟(a)將固體支持物與聚乙烯亞胺溶液接觸，由此形成載體;(b)將β-淀粉酶與戊二醛溶液接觸，由此形成處理過(guò)的含酶加合物;和(c)將載體和處理過(guò)的加合物反應(yīng)，以使載體和處理過(guò)的加合物反應(yīng)，形成固定化β-淀粉酶共軛體。
12.一種固定化酶共軛體，含有載體和處理過(guò)的加合物，載體包括具有至少一個(gè)側(cè)鏈胺基的多胺化合物及與多胺化合物結(jié)合的固體支持物，由此形成載體，處理過(guò)的加合物包括至少一種選自下列的胺活性物質(zhì)多官能醛、多官能有機(jī)鹵化物、多官能酐、多官能偶氮化合物、多官能異硫氰酸鹽(酯)、多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物，處理過(guò)的加合物還包括至少一種與至少一種胺活性物質(zhì)接觸的酶，從而處理了酶并形成處理過(guò)的含酶加合物，并且載體與處理過(guò)的含酶加合物結(jié)合，從而形成穩(wěn)定、有活性的固定化酶共軛體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的固定化酶共軛體，其中胺活性物質(zhì)是戊二醛。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的固定化酶共軛體，其中多胺化合物是聚乙烯亞胺。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的固定化酶共軛體，其中所述酶含有能與胺活性物質(zhì)反應(yīng)的氨基。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的固定化酶共軛體，其中胺活性物質(zhì)與酶之間的比率為每ml酶約0.10g到約1.50g胺活性物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的固定化酶共軛體，其中處理過(guò)的含酶加合物與載體之間的比率為每克載體約0.05ml到約0.6ml處理過(guò)的加合物。
18.一種固定化葡糖淀粉酶共軛體，含有載體和處理過(guò)的加合物，所述載體包括聚乙烯亞胺和與聚乙烯亞胺結(jié)合的固體支持物，由此形成載體，處理過(guò)的加合物包括戊二醛和與戊二醛接觸的葡糖粉酶，由此處理了葡糖淀粉酶并形成處理過(guò)的含葡糖淀粉酶的加合物，并且載體與處理過(guò)的含葡糖淀粉酶加合物結(jié)合，由此形成穩(wěn)定、有活性的固定化葡糖淀粉酶共軛體。
19.一種固定化真菌α-淀粉酶共軛體，含有載體和處理過(guò)的加合物，載體包括聚乙烯亞胺和與聚乙烯亞胺結(jié)合的固體支持物，由此形成載體，處理過(guò)的加合物包括戊二醛及與戊二醛接觸的真菌α-淀粉酶，從而處理了真菌α-淀粉酶并形成處理過(guò)的含真菌α-淀粉酶的加合物，并且載體與處理過(guò)的含真菌α-淀粉酶的加合物結(jié)合，形成穩(wěn)定、有活性的固定化真菌α-淀粉酶共軛體。
20.一種固定化β-淀粉酶共軛體，含有載體和處理過(guò)的加合物，載體包括聚乙烯亞胺及與聚乙烯亞胺結(jié)合的固體支持物，由此形成載體，處理過(guò)的加合物包括戊二醛及與戊二醛接觸的β-淀粉酶，從而處理了β-淀粉酶并形成處理過(guò)的含β-定粉酶的加合物，并且載體與處理過(guò)的含β-淀粉酶的加合物結(jié)合，形成穩(wěn)定、有活性的固定化β-淀粉酶共軛體。
21.一種固定化酶共軛體，含有固體載體和處理過(guò)的加合物，處理過(guò)的加合物包括至少一種選自下列的胺活性物質(zhì)多官能醛、多官能有機(jī)鹵化物、多官能酐、多官能偶氮化合物、多官能異硫氰酸鹽(酯)、多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物，處理過(guò)的加合物還包括至少一種與至少一種胺活性物質(zhì)接觸的酶，由此處理了所述酶并形成處理過(guò)的含酶加合物，并且載體與處理過(guò)的含酶加合物結(jié)合，形成穩(wěn)定、有活性的固定化酶共軛體。
22.一種用于制備固定化酶共軛體的處理過(guò)的液體加合物，其中處理過(guò)的加合物包括至少一種選自下列的胺活性物質(zhì)多官能醛、多官能有機(jī)鹵化物、多官能酐、多官能偶氮化合物、多官能異硫氰酸鹽(酯)、多官能異氰酸鹽(酯)及兩種或多種這些胺活性物質(zhì)的混合物，并且其中處理過(guò)的加合物還包括至少一種與至少一種胺活性物質(zhì)接觸的酶，由此處理了酶并形成處理過(guò)的含酶加合物。
全文摘要
一種制備固定化酶共軛體的方法，其中用多宮能胺活性物質(zhì)處理酶，以在固定于固體支持物前形成處理過(guò)的含酶加合物，所述固體支持物已與多胺化合物溶液接觸過(guò)。對(duì)于使用葡糖淀粉酶、真菌α-淀粉酶和β-淀粉酶，該方法是特別優(yōu)選的。用該方法形成的固定化酶共軛體包括處理過(guò)的含酶加合物。本文公開(kāi)的固定化酶共軛體比其它方法得到并提供的更穩(wěn)定，而且固定于其中的酶被束縛得更緊。
文檔編號(hào)C12N11/14GK1107514SQ9411686
公開(kāi)日1995年8月30日 申請(qǐng)日期1994年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月1日
發(fā)明者O·J·蘭特羅, J·W·布魯瓦, S·M·沙巴 申請(qǐng)人:索爾維酶有限公司