專利名稱：以穩(wěn)定的形式使用和儲運金屬蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以穩(wěn)定的形式使用和儲運金屬蛋白酶的方法，具體地說，以含酶水溶液形式使用和儲運該種酶的方法。本發(fā)明同時還涉及穩(wěn)定化的酶組合物。
蛋白酶可用于種類食品工業(yè)和洗滌劑領(lǐng)域。在以水溶液或淤漿形式使用蛋白酶的場合，已知的是，由于自發(fā)的自溶或變性作用(pH及溫度等)，酶損失其活性。
最近，已開發(fā)出一種合成二肽甜味劑aspartame的方法，該方法利用由(中性)金屬蛋白酶，例如“嗜熱菌蛋白酶”(由Daiwa化學(xué)公司生產(chǎn))(見諸于K.Oyama，Bioindustry，Vol2，No.9，5-11頁，1985)所催化的縮合反應(yīng)。因此，蛋白酶，尤其是金屬蛋白酶已經(jīng)成為工業(yè)領(lǐng)域中重要的肽合成酶。但是，當(dāng)以水溶液或淤漿形式被使用或存放長時間之后，這些酶不穩(wěn)定。
(金屬)蛋白酶通常以粉末狀在商業(yè)市場上出售。由于當(dāng)酶粉末粘附倒喉或眼的粘膜上時，會引起相應(yīng)部位的炎癥，而粉狀酶又易形成氣溶膠，故而就引起了一個安全問題。另外也可能出現(xiàn)變應(yīng)原效應(yīng)。因此，近來從操作安全性考慮，(金屬)蛋白酶均做成溶態(tài)產(chǎn)品或淤漿使用。然而由于酶自身的穩(wěn)定性，此種液態(tài)酶或酶淤漿在使用和儲運當(dāng)中必須處于低溫下操作，這通常導(dǎo)致成本較高(低溫儲存、活性較低等因素)。
況且，當(dāng)金屬蛋白酶用于N-芐氧羰基-L-天冬氨酸(以下稱做“Z-Asp”)與L-或DL-苯基丙氨酸甲酯(以下稱做“PM”)之間的偶合反應(yīng)(這是生產(chǎn)α-L-天冬酰-L-苯基丙氨酸甲酯(以下稱做“Aspastame”或者“APM”)的一種方法)時，活性酶濃度下降的現(xiàn)象，除酶的穩(wěn)定性問題之外，還由于酶吸附于N-芐氧羰基天冬酰-苯基丙氨酸甲酯(以下稱“Z-APM·PM”，例如“Z-APM·DPM”)加成產(chǎn)物晶體表面所造成。
在金屬蛋白酶，例如由熱蛋白分解素桿菌ROKKO生產(chǎn)出的“嗜熱菌蛋白酶”，以溶液或其淤漿形式儲存或使用的情況下，已知道，若無一定濃度鈣離子存在，該種酶將迅速失活。然而當(dāng)有鈣離子存在時，由于生成碳酸鈣，在導(dǎo)管和罐的各部位可能出現(xiàn)結(jié)垢，這往往在酶的實際使用中具有顯著的有害影響。
本發(fā)明要達(dá)到的目的在于提供一種以穩(wěn)定、不結(jié)垢形式使用和儲運金屬蛋白酶或類似蛋白酶的方法，同時還提供此類穩(wěn)定的蛋白酶組合物。
本發(fā)明欲達(dá)到的進(jìn)一步目標(biāo)是提供一種提高回收率的方法，這是通過抑制酶在反應(yīng)產(chǎn)物晶體(Z-APM·(D)PM)上被吸附來達(dá)到的。
按本發(fā)明，存在或添加一種N-保護(hù)氨基酸(以下稱為“NPAA”)對于防止金屬蛋白酶失活，尤其顯著改進(jìn)酶的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性頗為有效。特別值得指出，已發(fā)現(xiàn)N-芐氧羰基-氨基酸(以下稱為“NZAA”)的效果是顯著的。此外，根據(jù)本發(fā)明，借助NPAA的存在或添加，即使沒有過量鈣離子存在，金屬蛋白酶也可以獲得顯著的穩(wěn)定化。如此說來，本發(fā)明目的的達(dá)到在于，在含蛋白酶的水溶液或淤漿中存在或加入N-保護(hù)氨基酸。
另外，由于在淤漿存在下攪拌作用引起的金屬蛋白酶的失活，借助NPAA的存在或加入也顯著受到抑制，此乃另一個特點。
而且，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)金屬蛋白酶用于Z-Asp與PM之間的偶合反應(yīng)時，NPAA的存在可使該酶顯著穩(wěn)定化，從而使回收率顯著提高。
具體地說，本發(fā)明可以被有利地用于，在NPAA存在下儲存或運送金屬蛋白酶溶液或淤漿，或者在氨基酸酶催化偶合，特別在aspartame制備過程中利用這種效應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，因少量NPAA的存在，金屬蛋白酶的儲存穩(wěn)定性及其回收率均可顯著地改善。相應(yīng)地，這類酶在儲存當(dāng)中活性降低是極端輕微的，以致于該酶不僅可能長期使用或儲存，而且也可以達(dá)到提高金屬蛋白酶的回收率。這對于處理昂貴的酶在經(jīng)濟上尤其有利。
下面，將詳細(xì)說明本發(fā)明。
打算用本發(fā)明方法處理的金屬蛋白酶并無特定限制，但是對于嗜熱菌蛋白酶類(中性)蛋白酶尤為有效。做為一種金屬蛋白酶舉例說由蛋白水解桿菌或硬脂酸嗜熱桿菌產(chǎn)生的，或者通過其表達(dá)基因在其他宿主內(nèi)產(chǎn)生的(金屬蛋白酶)。用于本發(fā)明的酶溶液或淤漿可以是含許多雜質(zhì)的粗制品或是提純的制品。
在本發(fā)明方法中用作穩(wěn)定添加劑的NPAA可以呈鹽形式，例如NPAA的鈉鹽，或呈NPAA的結(jié)晶形式。如果希望的話，也可以使用含各種NPAA的溶液或淤漿，或者一種包括各種NPAA的混合物?？傊瑢PAA并無特殊限制。NPAA造成的效果絲毫不因其中含有諸如其他氨基酸之類的有機物質(zhì)或無機物質(zhì)而變差。
NPAA中的AA部分可以全部為天然L-氨基酸，但也可以為D-氨基酸;AA中的酸基團(tuán)也可以呈酯基形式，例如芐酯。
做為NPAA的N-保護(hù)基團(tuán)，例如芐氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(BOC)、甲酰基(F)、對-甲氧基芐氧羰基(pMZ)均適用。特別是，芐氧羰基保護(hù)的氨基酸(ZAA類)據(jù)發(fā)現(xiàn)展示出極為出色的穩(wěn)定效應(yīng)。在50℃下存放5小時，在有HZAA存在下，酶的保持率可高達(dá)90%或更高，然而當(dāng)沒有它的情況下，僅為約32%。作為NZAA的例子，可舉出N-芐氧羰基-L-天冬氨酸(也稱為Z-Asp)(其中氨基酸為L-天冬氨酸)、N-芐氧羰基-L-谷氨酸(以下稱之為Z-Glu)(其中氨基酸為L-谷氨酸)、N-芐氧羰基-L-苯基丙氨酸(以下稱為Z-Phe)(其中氨基酸為苯基丙氨酸)以及N-芐氧羰基甘氨酸(以下稱為Z-Gly)(其中氨基酸為甘氨酸)。
在含有過量鈣離子的體系中，當(dāng)沒有NPAA，儲存條件為40℃、5小時情況下，酶的保持率為約44%。然而，在同樣體系中，通過加入NPAA，金屬蛋白酶失活受到顯著的抑制。特別是，當(dāng)系統(tǒng)中加入NZAA時，幾乎不發(fā)生蛋白酶失活。這個結(jié)果顯示由于NPAA的存在，金屬蛋白酶溶液在儲存當(dāng)中極為穩(wěn)定，或可在室溫或更高溫度下長期使用。故而，在處理和儲運昂貴酶時，加入NPAA具有很高的經(jīng)濟價值。根據(jù)本發(fā)明，在儲運中即使沒有過量鈣離子，金屬蛋白酶也是很穩(wěn)定的。所以說，本發(fā)明對于防止因鈣離子引起的麻煩，例如結(jié)垢問題，也是有利的。
這里可以提到，JP-A-6226989述及通過加入一定量可逆抑制劑，例如抑糜蛋白酶或Z-Phe，可使用于洗滌劑的堿蛋白酶穩(wěn)定化。然而本發(fā)明卻觀察到，將NPAA加入到其他蛋白酶，例如番木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草溶菌素中(所有這些均不是金屬蛋白酶)(根據(jù)當(dāng)前的技術(shù)，它們可以用于酶催化APM合成)，并不導(dǎo)致任何顯著的酶穩(wěn)定化作用。
況且，當(dāng)金屬蛋白酶用于Z-Asp與PM之間的偶合反應(yīng)時，酶回收率的降低，通過在酶水溶液或淤漿中NPAA的存在，可以獲得非常明顯的改善。
根據(jù)本發(fā)明為了酶的儲存和運送，金屬蛋白酶水溶液或淤漿中含有的NPAA克分子濃度，應(yīng)為上述酶濃度的30倍以上，較好為該酶的50倍以上。
另一方面，當(dāng)金屬蛋白酶用于Z-Asp和PM之間的偶合反應(yīng)，而Z-Asp又當(dāng)作NPAA使用時，在偶合反應(yīng)后酶的水溶液或淤漿中應(yīng)存在的Z-Asp克分子濃度應(yīng)為上述酶濃度的500倍以上，且較好為上述酶的1000倍以上。一般，這意味著Z-Asp濃度應(yīng)高于15毫克分子/升，較好高于30毫克分子/升。
在Z-Asp與PM之間的偶合反應(yīng)中，當(dāng)偶合反應(yīng)后存在于酶的水溶液或淤漿中Z-Asp濃度為50毫克分子/升(克分子濃度1724倍于酶濃度)時，酶的回收率約為90%。
另一方面，偶合反應(yīng)后酶的水溶液或淤漿中存在的Z-Asp濃度為10毫克分子/升(克分子濃度為345倍于酶濃度)時，酶的回收率僅約為50%。
如上面所述，當(dāng)酶用于Z-Asp與PM之間的偶合反應(yīng)時，在該酶的水溶液或淤漿中NPAA的存在使金屬蛋白酶顯著地穩(wěn)定化，而且酶的水溶液或淤漿中NPAA的存在也使該種酶的回收率顯著地提高。
通過在偶合反應(yīng)過程中和/或反應(yīng)的最終階段向偶合反應(yīng)體系加入N-保護(hù)氨基酸，如果N-保護(hù)氨基酸，例如Z-Asp，的克分子濃度被維持在該種酶濃度的500倍以上時，在生產(chǎn)糖精aspartame的偶合反應(yīng)中一種金屬蛋白酶使用因而被大大改進(jìn)。
接下來，通過下列實例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，然而列舉實例的目的絕不是限定本發(fā)明的范圍。
實例1在1升含CaCl22H2O(6.8毫克分子/升)的水中，懸浮5克粉狀Thermoase(粗制嗜熱菌蛋白酶，Daiwa化學(xué)公司的商品名稱;純度約20%)(Thermoase濃度為0.029毫克分子/升)，接著在達(dá)到預(yù)定濃度之前(2.62毫克分子/升或24.7毫克分子/升，換言之具有分別為90及850倍于酶的克分子濃度)向其中加入Z-Asp，借助于加入1N NaOH水溶液將生成的溶液的pH調(diào)整到5.0。為測定酶保持率(即活性酶濃度)，將酶溶液傾入一個體積為2升的可分離的燒瓶中并控制溫度在70℃，攪拌速240轉(zhuǎn)/分。按一定的時間間隔取樣并用HPLC(高壓液相色譜)測定每個試樣中剩余酶數(shù)量。所得結(jié)果載于表1。
表1酶保護(hù)百分率(%)時間 Z-Asp(2.62 Z-Asp(24.7(小時) 不加入 毫克分子/升) 毫克分子/升)0 100 100 1001 68 91 912 53 86 873 47 83 874 39 80 835 35 74 787 31 73 74正如從表1中看到的，由于加入Z-Asp，酶被顯著地穩(wěn)定化了。
實施例2向每升含有0.029毫克分子粉末狀Thermoase(粗制嗜熱菌蛋白酶，Daiwa化學(xué)公司的商品名稱;純度約20%)及10毫克分子CaCl2的100毫升水中逐漸加入一定量NPAA直至達(dá)到預(yù)定的濃度(10毫克分子/升)，并逐漸加入0.1N NaOH水溶液使pH調(diào)節(jié)到6.0。把如此制備的酶溶液置于控溫在70℃的水浴中。然后按一定的時間間隔對酶溶液取樣，并用HPLC測定每個試樣中剩余酶數(shù)量。所得結(jié)果載于下表2。
表2N-保護(hù) 酶保持百分率(%)氨基酸 0小時 2小時 5小時(NPAA)未添加 100 54 32Z-Asp 100 89 75Z-Asp-OBzl(*) 100 101 92Z-Glu 100 101 88Z-Phe 100 95 85Z-Gly 100 88 68BOC-Asp 100 82 50BOC-Glu 100 89 59BOC-Phe 100 88 53BOC-Gly 100 76 40BOC-Cys-SBzl(*) 100 86 55pMZ-Asp 100 78 42pMZ-Glu 100 78 40F-Asp-OBzl(*) 100 71 48(＊)Bzl芐基酯正如從上面表2看到的，酶由于加入NPAA，尤其是NZAA(Z-Asp、Z-Asp-OBzl、Z-Glu、Z-Phe以及Z-Gly)，而顯著穩(wěn)定化。
實例3在1升含有CaCl2-2H2O(CaCl2濃度＝0.6毫克分子/升)的水中或者含有Z-Asp(Z-Asp濃度＝30毫克分子/升)的水中，溶解5克粉末狀Thermoase，Thermoase濃度各為0.029毫克分子/升，將所生成的溶液pH值，用1N NaOH水溶液調(diào)節(jié)到6.0。將酶溶液傾入可分離的燒瓶(體積2升)中，并控制溫度在40℃，攪拌速200轉(zhuǎn)/分。
按一定時間間隔對它取樣并用HPLC測定每個試樣中剩余酶數(shù)量。所得結(jié)果載于表3。
表3酶保持百分率(%)時間水 CaCl2Z-Asp(小時) 水溶液0 100 100 1000.5 84 100 1061 73 104 1052 63 102 1013 57 104 1044 52 101 1045 - 97 1046 47 98 101表3的實驗顯示，加入Z-Asp與使用0.6毫克分子/升CaCl2水溶液的效果相同。沒有此種過量Ca2+，結(jié)垢將減少。
如同從上表3看到的，由于加入Z-Asp(作為一種NZAA)，即使在沒有過量的鈣離子情況下，酶也被顯著地穩(wěn)定化。
實例4向100毫升每升含有0.029毫克分子粉狀Thermoase(不含過量Ca)水溶液中，加入一定數(shù)量NPAA直至達(dá)到預(yù)定濃度(10毫克分子/升)，與實例2相同將體系的pH調(diào)節(jié)到6.0。將之置于控制在溫度為40℃的水浴中。
按一定時間間隔對酶溶液取樣，并用HPLC測定剩余酶數(shù)量。所得結(jié)果示于下表4。
表4N-保護(hù) 酶保持百分率(%)氨基酸 0小時 2小時 5小時(NPAA)未添加 100 54 44Z-Asp 100 97 95Z-Asp-OBzl(*) 100 94 98Z-Glu 100 101 104Z-Phe 100 98 103Z-Gly 100 88 89BOC-Asp 100 63 50BOC-Glu 100 89 70BOC-Phe 100 92 83BOC-Gly 100 89 74BOC-Cys-SBzl(*) 100 93 79pMZ-Asp 100 77 60pMZ-Glu 100 89 70F-Asp-OBzl(*) 100 74 38
(＊)Bzl芐基酯如從上表4所示，由于加入NPAA，尤其是NZAA(Z-Asp、Z-Asp-OBzl、Z-Glu、Z-Phe以及Z-Gly)，酶被顯著地穩(wěn)定化。
實例5將5克粉狀Thermoase(純度＝約20%)懸浮在盛于2升容積可分離的燒瓶內(nèi)并含0.1% CaCl2·2H2O的750克水中，然后向其中加入250克Celite(由Johns Manvill公司生產(chǎn)，品級標(biāo)準(zhǔn)Super-Cel)，從而生成一均勻淤漿。將其控制在40℃溫度，Thermoase濃度為0.029毫克分子/升。
向其中加入Z-Asp直至達(dá)到預(yù)定的濃度(30毫克分子/升)，然后用1N NaOH水溶液將其調(diào)整到pH＝7.3用帶馬達(dá)的攪拌器，轉(zhuǎn)速240轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢栉锪?，再按一定時間間隔取樣。用HPLC測定每個試樣內(nèi)的酶保持百分率，所得結(jié)果載于下面表5。
表5酶保持百分率(%)時間 不加 Z-AspZ-Asp (30毫克分子/升)0 100 1001 85 953 70 885 60 857 55 79
從上面表5看出，在淤漿中受到影響并失活的酶，通過加入Z-Asp而顯著地穩(wěn)定化。
實例6把5克粉狀蛋白酶TD(Amano藥品公司產(chǎn)品;由硬脂酸嗜熱桿菌生成的金屬蛋白酶;純度＝約20%)懸浮在1升含有0.1%CaCl2·2H2O的水中，蛋白酶TD濃度為0.029毫克分子/升。向其中加入Z-Asp直至達(dá)到預(yù)定的濃度(10毫克分子/升)，然后用1N NaOH水溶液把pH調(diào)整到5.0。把生成的溶液置于容積為2升的、可分離的燒瓶內(nèi)，控制溫度為70℃，攪拌器轉(zhuǎn)速240轉(zhuǎn)/分。按預(yù)定時間間隔取樣，用HPLC測定每個試樣中剩余酶數(shù)量。所得結(jié)果示于下表6。
表6酶保持百分率(%)時間 不加 Z-Asp(小時) Z-Asp (30毫克分子/升)0 100 1001 84.5 97.42 71.9 95.53 62.9 93.64 53.4 91.65 45.5 92.17 36.0 86.6
如上表6所示，由于加入Z-Asp酶得到顯著的穩(wěn)定化。
實例7把943克Z-Asp水溶液(Z-Asp數(shù)量為1.0克分子)與1258克DL-PM水溶液(PM量為2.0克分子)相混合，加熱至40℃，通過用25% NaOH溶液調(diào)整該溶液pH而制備成水溶液，并把此溶液用作酶解物溶液。
分別將1.28克CaCl2·2H2O和127克NaCl溶解于1242克純化水中，再將45克Thermoase溶解在該水溶液中，而這水溶液被用做為酶的水溶液。
把酶解物溶液和酶溶液在一只5升可分離的燒瓶內(nèi)混合，燒瓶置于維持在40℃的水浴中，將該混合溶液的pH調(diào)整到6.0，于是Z-Asp與PM之間的偶合反應(yīng)便開始了。
與前面例子一樣，Thermoase的濃度為0.029毫克分子/升。
在偶合反應(yīng)開始后的3.5小時期間，混合溶液的攪拌是在130轉(zhuǎn)/分的速度下進(jìn)行，而從3.5小時直至7小時期間，攪拌是在30轉(zhuǎn)/分的速度下進(jìn)行。
基于Z-Asp的起始量的Z-APM·(D)PM的收率，在7小時以后為80.5%，而偶合反應(yīng)后殘留Z-Asp濃度為55.9毫克分子/升。
偶合反應(yīng)結(jié)束后回收得到的Thermoase為41.4克，回收率為約92%。
對照實例1把943克Z-Asp水溶液(Z-Asp量為1.0克分子)與1572克DL-PM水溶液(PM量為2.5克分子)相混合，加熱至40℃，用25% NaOH溶液調(diào)整該溶液的pH從而制備水溶液，將該溶液用作酶解物溶液。
分別把1.28克CaCl2·2H2O和127克NaCl溶解在1242克純化水中，再把45克Thermoase溶解于該水溶液中，該水溶液被用作為酶水溶液。
在該對照實例中，與實例7相比，較高的PM量在偶合反應(yīng)后生成較低量的殘留Z-Asp?？梢钥闯?，這導(dǎo)致Thermoase回收率顯著地降低。
將酶解物溶液與酶水溶液在一只5升可分離的燒瓶中混合。燒瓶置于維持在40℃的水浴中，混合溶液的pH被調(diào)至6.0，于是開始Z-Asp與PM之間的偶合反應(yīng)便開始了。
在偶合反應(yīng)開始后的3.5小時期間，混合溶液的攪拌是在130轉(zhuǎn)/分的攪拌速度下進(jìn)行，而從3.5小時至7小時這段期間，攪拌速度為30轉(zhuǎn)/分。
基于Z-Asp起始量的Z-APM·(D)PM收率，在7小時后為95.2%，偶合反應(yīng)后殘留Z-Asp濃度是10.5毫克分子/升。
偶合反應(yīng)后回收得到的Thermoase為19.5克，回收率是44%。
權(quán)利要求
1.以穩(wěn)定形式使用和儲運金屬蛋白酶的方法，其特征在于，在含該蛋白酶的水溶液或淤漿中，存在有或外加入N-保護(hù)氨基酸。
2.按照權(quán)利要求1的使用和儲運酶的方法，其特征在于，N-保護(hù)氨基酸為N-芐氧羰基氨基酸。
3.按照權(quán)利要求1或2中任何一項的使用和儲運酶的方法，其特征在于，該蛋白酶為嗜熱菌蛋白酶類(中性)金屬蛋白酶。
4.按照權(quán)利要求1-3中任何一項的使用和儲運酶的方法，其特征在于，所說N-保護(hù)氨基酸的克分子濃度為上述酶濃度的30倍以上。
5.按照權(quán)利要求1-3中任何一項的酶使用方法，其特征在于，所說N-保護(hù)氨基酸的克分子濃度為上述酶濃度的500倍以上。
6.權(quán)利要求5的酶使用方法，其特征在于，該酶是在N-保護(hù)的氨基酸和氨基酸酯之間的偶合反應(yīng)中使用的。
7.按照權(quán)利要求6的酶的使用方法，其特征在于，通過在偶合反應(yīng)期間和/或在其最終階段向偶合反應(yīng)體系內(nèi)加入N-保護(hù)的氨基酸來使N-保護(hù)的氨基酸的克分子濃度維持在上述酶濃度的500倍以上。
8.按照權(quán)利要求6或7中任何一項的酶使用方法，其特征在于，該酶是在N-芐氧羰基天冬氨酸和苯基丙氨酸甲酯之間的偶合反應(yīng)中使用的。
9.含有N-保護(hù)氨基酸的穩(wěn)定化的含水金屬蛋白酶組合物。
全文摘要
以穩(wěn)定形式使用和儲運金屬蛋白酶的方法，其中在含蛋白酶的水溶液或淤漿中存在或加入N-保護(hù)氨基酸；以及因N-保護(hù)氨基酸的存在而穩(wěn)定化的金屬蛋白酶組合物。效果金屬蛋白酶的失活受到抑制，酶的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性得特別明顯的改進(jìn)。當(dāng)上述酶被用于N-保護(hù)氨基酸與氨基酸酯之間的偶合反應(yīng)時，金屬蛋白酶的回收率因NPAA的存在而獲改善。在糖精的生產(chǎn)中用N-芐氧羰基天冬氨酸做為N-芐基氧羰基氨基酸，并苯基丙氨酸甲酯作為氨基酸酯時，這種效果最為顯著。
文檔編號C12N9/54GK1105389SQ9411573
公開日1995年7月19日 申請日期1994年8月26日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月27日
發(fā)明者原田恒夫, 國澤幸男, 小山清孝, J·C·M·施米斯, 高菅修哉, W·J·J·范登特里爾 申請人:荷蘭加甜劑公司