專利名稱：新的可溶性補(bǔ)體受體i的糖型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可溶性補(bǔ)體受體1型(sCR1)的新的糖型(glycoform)，及其在補(bǔ)體活性相關(guān)疾病和各種炎性以及免疫性疾病的診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明也提供該糖型的生產(chǎn)，檢測(cè)和提純方法。
補(bǔ)體系統(tǒng)構(gòu)成正常血清中約10%球蛋白的補(bǔ)體系統(tǒng)由許多不同蛋白組成，這些蛋白在免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)抗原的應(yīng)答方面是很重要的。當(dāng)補(bǔ)體系統(tǒng)的初級(jí)成份分裂，而分裂的碎片單獨(dú)的或者同其它蛋白一起激活另外的補(bǔ)體蛋白時(shí)，結(jié)果引起連鎖蛋白溶解反應(yīng)，于是便使補(bǔ)體系統(tǒng)激活。補(bǔ)體系統(tǒng)激活導(dǎo)致血管通透性增加，吞噬細(xì)胞趨化性、炎性細(xì)胞激活，外來(lái)顆粒受調(diào)理素影響，直接殺死細(xì)胞以及損傷組織。補(bǔ)體系統(tǒng)激活可由抗原-抗體復(fù)合物(經(jīng)典途徑)啟動(dòng)，或者例如由病原體細(xì)菌細(xì)胞壁上存在的脂多糖引發(fā)(替代途徑)。
膜結(jié)合補(bǔ)體受體1型補(bǔ)體受體1型(CR1)存在于紅細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞、B細(xì)胞、某些T細(xì)胞、脾濾泡樹突細(xì)胞以及腎小球足狀突細(xì)胞的膜上。CR1可與補(bǔ)體成份C3b和C4b結(jié)合，并被稱之為C3b/C4b受體。CR1的結(jié)構(gòu)組織和初級(jí)序列是已知的(Klickstein 等人，1987，J.Exp.Med.165∶1095-1112;Klickstein等人，1988，J.Exp.Med.168∶1699-1717;Hourcade等人，1988，J.Exp.Med.168∶1255-1270)。它由含60-70個(gè)氨基酸的30個(gè)短的一致重復(fù)鏈(SCRs)組成，每個(gè)SCR中，平均65個(gè)氨基酸中的29個(gè)保持不變。推斷出各SCR均通過(guò)二硫鍵形成三維三環(huán)結(jié)構(gòu)，其中第3和第1半胱氨酸以及第4和第2半胱氨酸連于二硫鍵中。CR1進(jìn)一步排列成各由7個(gè)SCRs組成的4個(gè)長(zhǎng)的同源重復(fù)鏈(LHRs)。在引導(dǎo)序列(轉(zhuǎn)譯后除去)后，CR1分子由含C4b結(jié)合區(qū)的N-最末端LHR-A、含C3b結(jié)合區(qū)的兩個(gè)重復(fù)鍵LHR-B和LHR-C以及C最末端的LHRD組成，其后接有2個(gè)其它SCRs，一個(gè)是25殘基的推測(cè)橫跨膜區(qū)和一個(gè)是43殘基的細(xì)胞質(zhì)尾。
CR1系蛋白質(zhì)超科中一員，以該SCR同源性為特征。有C3/C4結(jié)合功能的某些超科成員包括CR2、C4結(jié)合蛋白、H因子、B因子和C2，而缺乏該功能的蛋白質(zhì)包括白細(xì)胞介素-2受體、β2-糖蛋白I、Clr，結(jié)合珠蛋白α鏈以及ⅩⅢb因子。
CR1被認(rèn)為是糖蛋白，其推斷氨基酸序列有用于胞外區(qū)N-連接糖基化作用(氨基酸一致序列NXS或NXT)的25個(gè)潛在位點(diǎn)。據(jù)載這些可利用的位點(diǎn)只有6-8個(gè)連接到低聚糖上(Sim，1985，Biochem.J.232∶883)。CR1的非糖基化形式于衣霉素存在下產(chǎn)生，表現(xiàn)出連接iC3能力降低(Lublin等人，1986，J.Biol.Chem.261∶5736)，看來(lái)糖蛋白N-末端被阻隔了。
目前為止，已鑒定出四種不同CR1等位基因型或異型，其大小上有30-50KDa增量之別。在人群中，這些異型的基因頻率各不相同(Holer 等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶2459-2463)。F(或A)異型由4個(gè)LHR組成，其分子量約為250KDa;較大的S(或B)異型分子量約為290KDa，含有系LHR-B的5′半和LHR-A3′半嵌合體的第5LHR，預(yù)測(cè)它有第3個(gè)C3b連接位點(diǎn)(Wong等人，1989，J.Exp.Med.169∶847)。最小的F′(或C)異型(最大可能是由于LHR-B和一個(gè)C3b結(jié)合位點(diǎn)的缺失引起的)在全身性紅斑狼瘡(SLE)病人中含量增加(Van Dyne等人，1987，Clin.exp.Immunol.68∶570;Dykman 等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶1698)。
可溶性補(bǔ)體受體1型天然出現(xiàn)的可溶性CR1在正常個(gè)體一和某些患SLE的個(gè)體的血漿中檢測(cè)出來(lái)(Yoon等人，1985，J.Immunol.134∶3332-3338)。其特征是結(jié)構(gòu)和功能上都與紅細(xì)胞(細(xì)胞表面)CR1相似。Hourcade等人(1988，J.Exp.Med.168∶1255-1270)也觀察到預(yù)料產(chǎn)生分泌形式CR1的人CR1轉(zhuǎn)錄單元中的其它聚腺苷酸化位點(diǎn)。由該平切序列編碼的mRNA含CR1的第一8.5SCRs，并且它編碼包括C4b結(jié)合區(qū)的約80KDa蛋白質(zhì)。當(dāng)相應(yīng)于上述平切序列的cDNA轉(zhuǎn)染于COS細(xì)胞并表達(dá)時(shí)，它表現(xiàn)出預(yù)料的C4b結(jié)合活性，但不結(jié)合C3b(Krych 等人，1989，F(xiàn)ASEB J.3∶A368)。Krych等人也在幾種人細(xì)胞系中觀察到相似于預(yù)期的一種mRNA，并假定這種具C4b結(jié)合活性的CR1平切可溶形式可以在人體中合成。
借助重組DNA方法，從正被表達(dá)的DNAs中消除橫跨膜區(qū)，已生成幾種可溶性CR1片斷(Fearon等人，Intl.Patent Publ.Wo89/09220，10/5/89;Fearon等人，Intl.Patent Publ.Wo91/05047，4/18/91)。該可溶性CR1片斷依據(jù)其所含的區(qū)而具有功能活性，可結(jié)合C3b和/或C4b、并表現(xiàn)出因子Ⅰ輔助因子活性。這樣的構(gòu)件于體外抑制補(bǔ)體激活所產(chǎn)生的后果，例如中性白細(xì)胞氧化破裂、補(bǔ)體介導(dǎo)血細(xì)胞溶解，以及C3a和C5a產(chǎn)生。一種可溶性構(gòu)件SCR1/pBSCR1C也表現(xiàn)出體內(nèi)逆轉(zhuǎn)被動(dòng)局部過(guò)敏壞死反應(yīng)活性(Fearon 等人，1989，1991，前述文獻(xiàn);Yeh 等人，1991，J.Immunol.146∶250)，也具抑制心肌缺血后感染及壞死活性(Fearon等人，上述文獻(xiàn);Weisman等人，Science，1990，249∶146-151)，并且能提高移植后的成活率(Pruitt & Bollinger，1991，J.Surg.Res 50∶350;Pruitt等人，1991，Transplantation52;868)。此外，載體sCR1/pBSCRIC可溶性產(chǎn)物與對(duì)甲氧苯甲?；娜搜獫{酶原-鏈激酶-激活因子復(fù)合物(APSAC)的合劑也能產(chǎn)生與單用SCR1/pBSCR1C產(chǎn)物相似的抗溶血活性，這表明補(bǔ)體抑制劑sCR1與血栓溶解劑的組合是可行的(Fearon等人，同上)。
國(guó)際專利申請(qǐng)No.Wo89/09220(1989年10月5日公開)和No。WO91/05047(1991年4月18日公開)全文均引入本文作為參考。
本發(fā)明涉及新的可溶性補(bǔ)體受體1型蛋白(sCR1)的糖型以及它們?cè)谥委熒婕把a(bǔ)體活性的疾病和各種炎性以及免疫性疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明人已揭示，在一定生產(chǎn)條件下，可獲得sCR1的新的糖型，該糖型具有能延遲從血液中消除，而又保留其主要功能活性的所希望特性。此種長(zhǎng)效半衰期使得便于簡(jiǎn)單地團(tuán)塊給藥及有助于發(fā)揮體內(nèi)效能。
本發(fā)明使用各種提純方法來(lái)溶解和富集特種sCR1糖型。因此本發(fā)明提供含一種或多種復(fù)合低聚糖結(jié)構(gòu)的可溶性補(bǔ)體受體1(sCR1)糖蛋白分子，該低聚糖結(jié)構(gòu)的一種或多種其末端帶有平均一個(gè)或多個(gè)唾液酸殘基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，描述分子里含一種或多種復(fù)合低聚糖結(jié)構(gòu)的sCR1糖蛋白的制備，其中低聚糖結(jié)構(gòu)至少有40%平均含至少1個(gè)末端唾液酸殘基。優(yōu)選該分子含一種或多種復(fù)合低聚糖結(jié)構(gòu)，其中至少有70%平均含至少1個(gè)末端唾液酸殘基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，一種sCR1制劑含有sCR1糖蛋白分子，其中占優(yōu)勢(shì)的糖型，經(jīng)色譜聚焦(chromatofocusing)法測(cè)定其等電點(diǎn)PI小于或等于5.1，而經(jīng)神經(jīng)氨酸苷酶處理后PI提高。
在另一實(shí)施方案中，一種sCR1制劑含有一種sCR1糖蛋白，其中唾液酸與甘露糖摩爾之比大于或等于0.25。
優(yōu)選的本發(fā)明sCR1制劑，具有至少25%的去糖基化sCR1的功能補(bǔ)體抑制活性。
優(yōu)選的本發(fā)明的分子或制劑的實(shí)施方案中，該sCR1糖蛋白的蛋白骨架含LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、sCR29以及sCR30區(qū)，直達(dá)(和包括)橫跨膜區(qū)的第1丙氨酸殘基。
本發(fā)明也針對(duì)含有治療有效量的上述一種sCR1糖蛋白分子和一種藥物學(xué)上可接受載體或賦形劑的藥用組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥用組合物還含有治療有效量的溶血栓劑。
優(yōu)選溶血栓選自如下藥劑組成的一類(a)血漿酶原激活劑或其突變蛋白;
(b)對(duì)甲氧苯甲?；獫{酶原-鏈激酶激活劑復(fù)合物(APSAC);
(c)單鏈尿激酶;
(d)雙鏈尿激酶;
(e)鏈激酶;
(f)纖維蛋白溶解活性雜交蛋白，該蛋白包括第1雙鏈蛋白酶的一個(gè)鏈連于第2雙鏈蛋白酶的一個(gè)鏈上，所說(shuō)第1和第2蛋白酶的至少一個(gè)有纖維蛋白溶解活性，因此，所說(shuō)雜的交蛋白有作為纖維蛋白溶解活性之基礎(chǔ)的催化位點(diǎn)，它可以由能被除去的阻斷基團(tuán)加以阻斷。
(g)在體內(nèi)可逆性阻隔的纖維蛋白溶解酶，其中作為所說(shuō)酶的纖維蛋白溶解活性之基礎(chǔ)的催化位點(diǎn)由通過(guò)水解能除去的基團(tuán)加以阻隔，其水解過(guò)程按在等滲水溶液中，PH7.4，37℃下以假一級(jí)水解速度常數(shù)在10-6sec-1至10-3sec-1的范圍內(nèi)的水解速度進(jìn)行。
本發(fā)明也提供治療由炎癥或不適當(dāng)補(bǔ)體激活引起的疾病或失調(diào)的方法，包括給需要治療的患者施用上述治療有效量的sCR1藥物組合物。
本發(fā)明也提供治療血栓形成病態(tài)的方法，包括給需要此類治療的患者施用有效量的sCR1藥物組合物，或者優(yōu)選施用上述包括溶血栓劑的藥物組合物。
上述方法中，“患者”優(yōu)選人。
本發(fā)明進(jìn)一步針對(duì)上述sCR1糖蛋白或sCR1制劑的制備方法，包括(a)在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，表達(dá)編碼該sCR1蛋白骨架的DNA分子，該培養(yǎng)條件是細(xì)胞生長(zhǎng)不受限于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，且該宿主細(xì)胞能使低聚糖鏈唾液酸化(Sialylation)。
(b)從培養(yǎng)物中分離sCR1糖蛋白。
在優(yōu)選方案中，該方法進(jìn)一步包括下述步驟(c)從步驟(b)所得物質(zhì)中分離出含唾液酸分子。
上述方法中，優(yōu)選培養(yǎng)條件包括一個(gè)流體化床生物反應(yīng)器，空心纖維生物反應(yīng)器，滾動(dòng)瓶培養(yǎng)或攪拌罐生物反應(yīng)器體系，后兩體系帶有或不帶有細(xì)胞微載體。
上述細(xì)胞培養(yǎng)的sCR1糖蛋白產(chǎn)物可通過(guò)親和、體積排斥、離子交換或疏水相互作用色譜法來(lái)提純。為富集含唾液酸分子，優(yōu)選采用可收集更多酸級(jí)分的離子交換軟凝膠色譜或利用陽(yáng)離子或者陰離子樹脂的HPPLC方法。含唾液酸分子也可通過(guò)色譜聚焦(chromatofocusing)或外源凝集素親和色譜來(lái)分離。
優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系能表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶者，其表達(dá)水平要能足以保證表達(dá)的sCR1糖蛋白中低聚糖的基本唾液酸化。適宜的宿主細(xì)胞包括CHO系，優(yōu)選DUX B11細(xì)胞系。
縮寫和定義APSAC＝甲氧苯甲酰化的血漿酶原-鏈激酶激活劑復(fù)合物PI＝等電點(diǎn)HPLC＝高效液相色譜IH50%＝產(chǎn)生50%溶血抑制作用的濃度SRBC＝羊紅血細(xì)胞EIA＝酶免疫檢測(cè)W/V＝重量體積之比V/V＝體積與體積之比KDa＝千道爾頓ELISA＝酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)gu＝葡萄糖單元SDS-PAGE＝十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳glycoforms＝糖蛋白品種，例如本發(fā)明的可溶性CR1糖蛋白，以其碳水化合物成分，色譜表現(xiàn)和/或電荷為特征TP10HD＝一種特定可溶性CR1構(gòu)件，它含有LHR-A、LHR-B、LHR-C、LHR-D、SCR29、SCR30區(qū)直至(和包括)橫跨膜區(qū)的第一個(gè)丙氨酸殘基;TP10HD相當(dāng)于質(zhì)粒pBSCR1中的CR1編碼序列Fearon等人，Int′l Patent Publication No.WO 89/09220 1989年10月5日)
TP10HD-CC＝如本文所述由流體化床灌注生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生，并經(jīng)聯(lián)合色譜提純的.TP10HDTP10HD-CCW＝由制備型HPLC陽(yáng)離子交換色譜分離的TP10HD-CC弱陽(yáng)離子型TP10HD-CCS＝由制備型HPLC陽(yáng)離子色譜分離的TP10HD-CC的強(qiáng)陽(yáng)離子型TP10H-CX＝由空心纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的，經(jīng)HPLC陽(yáng)離子交換色譜提純的TP10HD(Fearon等人，同上)TP10HD-CXD＝以n-聚糖酶促除糖基化的TP10HD-CX附圖簡(jiǎn)介

圖1是于280nm處的一系列吸收?qǐng)D，表示以不同方法提純的TP10HD制劑的HPLC分析結(jié)果。修改的Hydropore-SCXHPLC純化法用于證明TP10HD糖型的存在。
其中A圖由親和色譜提純的TP10HD物質(zhì)，含有多種糖型，主要的糖型均為強(qiáng)陽(yáng)離子型(即于約125mM NaCl洗脫)。
B圖由聯(lián)合色譜提純的TP10HD物質(zhì)，含多種糖型，弱陽(yáng)離子糖型對(duì)強(qiáng)陽(yáng)離子糖型濃度之比在70∶30至80∶20之間。
C圖由HPLC陽(yáng)離子交換色譜提純的TP10HD，僅含強(qiáng)陽(yáng)離子糖型。
圖2表示以50-250mM NaCl梯度液從S-瓊脂糖柱上洗脫T10HD剖面圖。表示出相應(yīng)于庫(kù)1和庫(kù)2的峰值，流速為2ml/分鐘，繪圖速度為0.25cm/min，在280nm滿刻度敏感度為0.2吸收單位。
圖3表示從圖2的S-瓊脂糖柱上洗脫的物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠圖形。泳道1高分子量標(biāo)準(zhǔn)物;泳道5和8S-瓊脂糖庫(kù)1(各2.4μg);泳道6和9S-瓊脂糖庫(kù)2(分別5.0和6.7μg)。
圖4表示來(lái)自TP10HD-CCW(右邊一組)和來(lái)自TP10HD-CCS(左邊一組)的低聚糖鏈的四個(gè)放射電泳圖。其中下面兩圖表示經(jīng)唾液酸苷酶處理后的情況。
圖5表示來(lái)自TP10HD-CCS(A)和TP10HD-CCW(B)的低聚糖鏈的兩個(gè)色譜顯示尺寸及相對(duì)比例。
圖6表示TP10HD-CC(上)和TP10HD-CX(下)的色聚焦柱記錄圖。
本發(fā)明涉及可溶性補(bǔ)體受體1型蛋白(sCR1)的新糖型及其在診斷和治療補(bǔ)體活性相關(guān)疾病和各種炎性以及免疫性疾病中的應(yīng)用。
可溶性補(bǔ)體受體1(sCR1)在本文中定義為含所有30個(gè)胞外SCR區(qū)的可溶形式的人CR1。
sCR1及其制備方法曾公開于國(guó)際專利
發(fā)明者小·H·C·馬什, C·-J·G·葉, A·M·弗里曼, R·A·G·史密夫, J·里夫特, M·L·戈塞林 申請(qǐng)人:T細(xì)胞科學(xué)有限公司, 史密絲克萊恩比徹姆有限公司