專利名稱：白介素6-白介素2融合蛋白及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有功能蛋白的白介素6(IL-6)-白介素2(IL-2)融合蛋白及其制法和用途，特別涉及具有免疫調(diào)節(jié)抗癌、淋巴瘤等功能的白介素6-白介素2融合蛋白及采用生物高技術(shù)制備方法。
以往研究表明IL-2是由T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，具有廣泛的免疫活性，臨床應(yīng)用可使25-30%的淋巴瘤、腎癌、黑色素瘤病員達(dá)到治愈或有效。結(jié)腸癌及非何杰金氏淋巴病也有較好療效，而且可增強(qiáng)免疫力，提高抗B型肝炎病毒免疫力。IL-6是繼IL-2等細(xì)胞因子后又一具有明顯抗癌活性的生物免疫調(diào)節(jié)劑，屬參與造血、免疫的多功能因子，其特點(diǎn)為抗腫瘤活性高，毒性作用小。新近實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IL-6可誘導(dǎo)的LAK活性也可直接作用于殺傷細(xì)胞，促進(jìn)其功能分化。[Carman RD.etal.Proc，Natl.Acad.Sci.USA，1987;847629][Okada Metal，J.I
nol，1988;1411543]這些都是IL-2、IL-6單因子在某些領(lǐng)域的研究，目前尚未見(jiàn)具有IL-2-IL-6融合蛋白的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供一種白介素6-白介素2融合蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供一種采用生物高技術(shù)來(lái)制備白介素6-白介素2融合蛋白的制備方法。
本發(fā)明的又一目的是提供采用白介素6-白介素2融合蛋白作為高效的抗癌藥物。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下述的方法實(shí)現(xiàn)的。
我們通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)譯起始序列，合成IL-6功能區(qū)上、下游引物，中間接頭一對(duì)寡核苷酸，IL-2下游引物，將天然終止密碼子TAG換成大腸桿菌偏性密碼子TAA，PCR擴(kuò)增獲得IL-6，IL-2功能區(qū)片段，經(jīng)純化后酶切，連接重組至表達(dá)載體PBV220，誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化包涵體，變性復(fù)性獲得具有IL-2、IL-6雙活性融合蛋白。
IL-6-IL-2融合蛋白較IL-6、IL-2單因子或雙因子聯(lián)合有更多生物學(xué)效應(yīng)。


圖1為IL-6-IL-2融合蛋白DNA序列圖，堿基(bp)。
圖2為融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)造圖。其中1是PUC19-IL2.2是PBV220，3是PBV-IL2，4是PUC19-IL6，5是PBV-IL6IL2，6是IL2基因片段，7是ILC基因片段。
下面結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明。
圖1，IL-6-IL-2融合蛋白由IL-6序列(DNA序列1-540bpl中間接頭(DNA序列541-585bp)IL-2序列(586-990bp)接頭15-45bp不等，可由甘、蘇、丙、絲及天門(mén)冬酰胺組成，IL-2，IL-6指與天然因子實(shí)質(zhì)上一致，可與相應(yīng)配基結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)生物信息引起生物活性，并可與相應(yīng)抗體進(jìn)行反應(yīng)。
一、IL-6功能區(qū)基因克隆。
利用Seqnce程序通過(guò)計(jì)算機(jī)分析確定轉(zhuǎn)譯的最佳起始區(qū)域，使其具有最小自由能，最佳堿基排列，避免可能干擾轉(zhuǎn)譯起始的aRNA二級(jí)結(jié)構(gòu);確保兩個(gè)引物之間，引物與模板之間具有最少的配對(duì)以避免擴(kuò)增不必要的序列;在上游和下游引物中分別導(dǎo)入EcoRI和NdeI酶切位點(diǎn)加入起始密碼子ATG。
deI酶切位點(diǎn)是將IL-63’末端CAA ATG突變?yōu)镃AT ATG而致。人工合成寡核苷酸引物左側(cè)(上游)引物5’CCG AAT TC ATG CAACAT TCC AAA CAT3’，右側(cè)(下游)引物5’TAC ATA TCC CGA AGA GCC CTC3’。以IL-6 cdna為模板，PCR擴(kuò)增IL-6基因片段，獲得約540bp產(chǎn)物，將上述片段經(jīng)蛋白酶K消化處理后、酚/氯仿、乙醇沉淀萃取DNA經(jīng)EcoRI酶切后與PUC19載體EcoRI，SmaI雙酶切后重組，轉(zhuǎn)化JN101受體菌，篩選白斑菌落，酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆PUC19-IL6。
二、中間接頭與IL-2功能區(qū)基因克隆。
我們將天然終止密碼子TAG換成大腸桿菌偏性密碼子TAA，中間接頭為內(nèi)側(cè)12bp互補(bǔ)的一對(duì)寡核苷酸，其中3′端寡核苷酸17bp與IL-25’端互補(bǔ)。5’端寡核苷酸5’ATCATATGTCCGGAGGCGGTTCTGGCGGTGGAGGTT3’，3′端寡核苷酸5’AGGTGCACTCGAGCCACCTCCTGAACCTCCACCGC3’。IL-2功能區(qū)下游引物導(dǎo)入BamHI酶切位點(diǎn)引物為5’CCGGATCCTTAATCAGGTCAGTGT3’在最適條件下中間接頭由一對(duì)寡核苷酸自身退火，延伸產(chǎn)生，利用5’端寡核苷酸及IL-2下游引物，以IL-2及中間接頭為雙模板，PCR基因重組獲得約450bpIL-2及接頭共同片段，該片段上游含有NdeI酶切位點(diǎn)，(圖10DNA序列535-540堿基(bp)，經(jīng)純化后BamHI酶切與BamHI/SmaI雙酶切PUC19載體重組，獲得陽(yáng)性克隆PUC19-IL2。
三、融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)造。
圖2顯示PBV220為表達(dá)載體，由溫度誘導(dǎo)抑制子基因CI857ts，PR與PL串聯(lián)啟動(dòng)子，SD序列后面緊跟多克隆位點(diǎn)依次為EcoRI、BamHI。將PUC19-IL2質(zhì)粒純化，EcoRI/BamHI雙酶解消化，回收IL-2片段(在近EcoRI端含有NdeI至EcorI小片段PUC多克隆基因區(qū))，與Bamhl/ecorI雙酶切CIP去磷酸化PBV220載體重組，酶切鑒定獲得PBV-IL2重組質(zhì)粒。繼而純化該質(zhì)粒，EcorI及NdeI雙酶切除去小片段，將保留的載體及IL2片段與EcorI/NdeI雙酶切PUC19-IL6的IL-6功能區(qū)片段重組，由此獲得融合蛋白表達(dá)載體PBV-IL6-IL2。
四、大腸桿菌高效表達(dá)融合蛋白。
將上述陽(yáng)性克隆，制備過(guò)夜培養(yǎng)物，再以3%接種量種于含多種微量元素M9CA培養(yǎng)基中，30℃振搖約1小時(shí)00600達(dá)到0.4-0.6轉(zhuǎn)移至42℃誘導(dǎo)4-6小時(shí)，常規(guī)收菌、裂解、SDS-PAGE電泳，用薄層掃描儀測(cè)得表達(dá)蛋白占菌體總蛋白32%，蛋白帶的分子量為36-38KD，與理論計(jì)算分子量相符。融合蛋白氨基酸序列與圖1DNA序列相應(yīng)氨基酸一致。
五、活性測(cè)定。
將誘導(dǎo)細(xì)菌清洗后超聲破碎10000rpm4℃10’離心后，4M脲素洗滌后，多種變性條件，7N鹽酸胍變性(含DTT)25℃1小時(shí)在一定蛋白保護(hù)劑下還原型谷胱苷肽及氧化型谷胱苷肽復(fù)性，分別以IL-6依賴小鼠雜交病細(xì)胞系7TD1及IL-2依賴細(xì)胞株CTLL，測(cè)得IL6、IL-2活性。
六、純化在變性條件下將包涵體經(jīng)分子篩凝膠過(guò)濾后，收集主峰復(fù)性后再經(jīng)反相疏水柱純化，獲得95%左右的純品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、IL6-IL2融合蛋的抗癌抗淋巴瘤效果比單獨(dú)的IL6或IL2好。
2、本制備方法精確可靠，產(chǎn)品純度高。
1ATGGAACATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCA31CACAGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGA61ATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGAC91GGCATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGT121AACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAA151GAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAACCTT181CCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTC211CAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTG241GTGAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTT271GAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGA301TTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCT331GTGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAG361TTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGAT391GCAATAACCACCCCTCACCCAACCACAAAT421GCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAG451AACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCAT481CTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTG511CAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCATATG
權(quán)利要求
1.一種白介素6-白介素2的融合蛋白，其特征在于是由白介素6-中間接頭-白介素2多肽序列組成，分子量為36-38km。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述中間接頭序列的長(zhǎng)度為15-45bPDNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的融合蛋白，其特征在于所述的中間接頭是由天門(mén)冬酰胺、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸所組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于含有圖1DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其特征在于含有圖1DNA序列相應(yīng)的氨基酸序列。
6.一種白介素6-白介素2融合蛋白的制備方法，其特征在于(1)白介素6功能區(qū)基因的克隆(2)中間接頭與白介素2功能區(qū)基因的克隆(3)融合蛋白的表達(dá)載體PBV220進(jìn)行表達(dá)(4)大腸桿菌的高效表達(dá)融合蛋白(5)純化，經(jīng)分子篩凝膠過(guò)濾及高壓液相而獲得純品
7.根據(jù)權(quán)利要求1的融白蛋白，可應(yīng)用于免設(shè)調(diào)節(jié)抗癌、抗淋巴瘤的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗癌性能白介素6活性及白介素2活性的融合蛋白，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)譯起始序列，合成IL6、IL2功能區(qū)上、下游引物及中間接頭一對(duì)寡核苷酸，將天然終止密碼子TAG換成大腸桿菌偏性密碼子TAA，PCR擴(kuò)增獲得IL-6、中間接頭、IL-2基因片段，經(jīng)酶切、連接重組至表達(dá)載體PBV220，誘導(dǎo)高效表達(dá)，分離包涵體，變性、復(fù)性獲得具有IL2、IL6雙活性融合蛋白。它較IL6、IL2單因子或雙因子聯(lián)合在多領(lǐng)域的研究有更多的生物學(xué)效應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/66GK1074243SQ9310011
公開(kāi)日1993年7月14日 申請(qǐng)日期1993年2月6日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月6日
發(fā)明者趙春華, 唐佩弦, 王嘉璽 申請(qǐng)人:北京中化生物技術(shù)研究所