專利名稱：生產(chǎn)和純化乙型肝炎疫苗的方法
乙型肝炎病毒(HBV)感染是具有世界范圍重要性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。乙型肝炎病毒造成不可治愈的、有時(shí)是致命的肝病，單是在美國(guó)每年估計(jì)就要有兩萬(wàn)名新患者。在遠(yuǎn)東、非洲和東歐，約10%的人口是慢性HBV攜帶者，其結(jié)果是慢性活動(dòng)型肝炎和肝硬變成為主要死因。另外，有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，HBV攜帶者極易患肝癌，HBV是已知與人類癌癥有關(guān)的少數(shù)病毒之一。
因此，迫切需要生產(chǎn)出安全的和經(jīng)濟(jì)上可行的疫苗，以預(yù)防HBV感染。已經(jīng)采用了幾種方法生產(chǎn)這類疫苗(參見(jiàn)Tiollais等，Nature 1985年317卷489-495頁(yè);Patzer等，Vaccines，1985年85卷261-264頁(yè)，Cold Spring Harbour;Zuckerman，Infection1986年13卷增刊A61-71頁(yè)的綜述。)正如以上綜述中所述，已生產(chǎn)出的所有疫苗的基本組分都是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。該抗原最初是從慢性HBV感染患者的血漿中分離出來(lái)的，用來(lái)作為抗HBV感染的有效疫苗。
HBV感染攜帶者血漿中的HBsAg，以42 nm HBV傳染性病毒粒子(Dane粒子)和非傳染性22 nm粒子兩種形式存在，后者不含HBV-DNA和其它HBV結(jié)構(gòu)蛋白。這些22 nm粒子在人類HBV慢性攜帶者體內(nèi)或在HBV病毒血癥期間過(guò)量產(chǎn)生，它們可由經(jīng)HBV轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系分泌出來(lái)。
這種22 nm HBsAg粒子具有高度的免疫原性，由六種相關(guān)蛋白組成(a)主蛋白P-24和GP-27，前者是分子量為24，000(24K)道爾頓的未糖基化形式，后者是分子量為27，000(27K)道爾頓的糖基化形式的P-24。它們是由HBV基因組的S區(qū)編碼的，有226個(gè)氨基酸;(b)次蛋白GP-33和GP-36，前者是分子量為33，000道爾頓(33K)的單糖基化形式，后者是分子量為36，000道爾頓(36K)的雙糖基化形式。它們是由HBV基因組的前-S2區(qū)和S區(qū)編碼的，有281個(gè)氨基酸(226個(gè)S區(qū)+55個(gè)前-S2區(qū));(c)次蛋白P-39和GP-42，前者是未糖基化形式，后者是P-39的糖基化形式，二者的分子量分別為39，000和42，000道爾頓(39K，42K)。它們由HBV基因組的前-S1、前-S2和S區(qū)編碼，有389至400個(gè)氨基酸(226個(gè)S+55個(gè)前-S2+〔108-119〕個(gè)前-S1)。因此，HBsAg 22 nm粒子的所有蛋白質(zhì)都在HBV基因組DNA的同一不間斷順序中編碼，它們的最終形式取決于基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯)由何處起始，以及它們是否是或者在多大程度上在轉(zhuǎn)譯后糖基化。
22 nm HBsAg粒子可以由P-24/GP-27(S區(qū))組裝，與前-S2和前-S1產(chǎn)物無(wú)關(guān)。近來(lái)已經(jīng)證明，前-S2特異蛋白GP-33和GP-36，以及前-S1特異蛋白GP-39和GP-42，具有和P-24無(wú)關(guān)的抗原決定簇，存在于HBsAg 22 nm粒子中時(shí)會(huì)使免疫原性增強(qiáng)。
另外，在有前-S2和前-S1蛋白存在時(shí)，22 nm HBsAg粒子具有和聚合的人血清清蛋白相結(jié)合的能力，這種能力與HBV病毒粒子在HBV感染期間與靶細(xì)胞結(jié)合的能力直接相關(guān)。因此，含有前-S和S區(qū)蛋白決定簇的HBsAg粒子能夠作為疫苗使用，這種疫苗會(huì)誘發(fā)出應(yīng)答反應(yīng)而中和病毒粒子并阻止這些粒子感染靶細(xì)胞。這種疫苗按照這種方式提供了對(duì)HBV感染的長(zhǎng)期有效預(yù)防作用(例如參見(jiàn)Persing等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985年82卷3440-3444頁(yè);Neurath等，Nature，1985年315卷154-156頁(yè);Neurath等，Cell，1986年46卷429-436頁(yè);Petit等，Mol.Immunol.，1986年23卷511-523頁(yè);Milich等，J.Immunol.，1986年137卷315-322頁(yè)。)HBsAg疫苗的生產(chǎn)方法和用這些方法生產(chǎn)的疫苗1.來(lái)源于血漿的疫苗一般來(lái)說(shuō)，批準(zhǔn)使用并用在免疫接種計(jì)劃中的原始HBsAg疫苗，是由慢性HBV攜帶者的血漿得到的。以下是生產(chǎn)來(lái)源于血漿的疫苗的方法實(shí)例(a)Merk、Sharp和Dohme公司生產(chǎn)的Heptavax B疫苗(見(jiàn)Hilleman等的綜述，J.Infection，1983年第7卷增刊Ⅰ第3-8頁(yè));
(b)巴斯德研究所生產(chǎn)的Hevac B疫苗(見(jiàn)Adamowicz等的綜述，Vaccine，1984年第2卷209-214頁(yè);1982年6月15日頒發(fā)的美國(guó)專利4，335，214)。
以上兩種方法都聲稱得到了來(lái)源于血漿的純度很高的HBsAg 22 nm粒子，其中不含傳染性污染物，因此作為人類疫苗使用是安全的。但是，在這些方法中采用的關(guān)鍵步驟既耗時(shí)又昂貴，因?yàn)樗鼈兩婕熬垡叶?PEG)或硫酸銨分級(jí)分離及后續(xù)的蔗糖和氯化銫梯度超離心。曾有人描述過(guò)生產(chǎn)來(lái)源于血漿的HBsAg疫苗的其它更快速、更廉價(jià)的方法，但這些方法通常都包括聚乙二醇或硫酸銨分級(jí)、用超離心法等密度分離和在各種色譜樹脂上色譜分離等步驟。所有這些方法都昂貴而耗時(shí)，結(jié)果使來(lái)源于人血漿的疫苗成本高昂(綜述見(jiàn)Maupas和Guesry編著的“乙型肝炎疫苗”，Elsevier/North Holland Biomedical出版社，Amsterdam，New York，Oxford，1981)。最后，來(lái)源于血漿的含HBsAg 22 nm粒子的疫苗的主要缺點(diǎn)是它對(duì)健康的潛在危害。雖然這些生產(chǎn)方法使用了某些物質(zhì)使可能的共純化污染物(可能包括艾滋病毒)失活，但是仍然存在這些疫苗可能引起不良副反應(yīng)的潛在危險(xiǎn)(參見(jiàn)Walgate，Nature 1983年304卷297頁(yè))。由于這個(gè)原因，已應(yīng)用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)供疫苗用的22 nm HBsAg粒子，這提供了一種有效而安全的方法，所得到的HBsAg粒子不含來(lái)自人血漿的有潛在危險(xiǎn)的污染物。
2.利用在原核生物(大腸桿菌)體系中重組的方法生產(chǎn)HBsAg疫苗已有人描述了構(gòu)建表達(dá)HBsAg的重組載體和質(zhì)粒的方法以及純化來(lái)自原核生物體系的HBsAg的方法(例如參見(jiàn)1984年1月31日授予Galilbert等的美國(guó)專利4，428，941和武田藥品工業(yè)株式會(huì)社的專利申請(qǐng)1983年1月5日公開的EPO 068719 A2和1986年1月30日公開的WO 86/00640)。由這些轉(zhuǎn)化的細(xì)菌體系生產(chǎn)HBsAg的方法是以先前所述的生產(chǎn)來(lái)源于血漿的HBsAg的方法為基礎(chǔ)的。但是，因?yàn)檫@些原核生物體系不能分泌所產(chǎn)生的HBsAg，所以必須有一個(gè)溶解轉(zhuǎn)化細(xì)胞的附加步驟。這就產(chǎn)生了將潛在有害的細(xì)菌內(nèi)毒素共純化的可能性。另外，原核生物體系既不能將HBsAg產(chǎn)物糖基化，也不能將它們組裝成22 nm粒子。因此，用這種方法制得的疫苗不如來(lái)源于血漿的產(chǎn)品(見(jiàn)Charnay等，Nature，1980年286卷893-895頁(yè))。
因此，已研究出生產(chǎn)重組HBsAg的真核表達(dá)體系;這些體系能產(chǎn)生既糖基化又組裝成22 nm粒子的HBsAg。
3.用酵母細(xì)胞在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)HBsAg疫苗用酵母細(xì)胞在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)的HBsAg疫苗的實(shí)例，包括市售的由Merck、Sharp和Dohme(MSD)生產(chǎn)的Recombivax HB疫苗(見(jiàn)Emini等，J.Infection，1986年13卷增刊A第3-9頁(yè))和SmithKline Beckman公司生產(chǎn)的重組HBsAg疫苗(見(jiàn)1987年1月10日頒發(fā)的美國(guó)專利4，649，192和1986年10月29日公開的歐洲專利申請(qǐng)199698A)。
但是，用這些方法生產(chǎn)的HBsAg粒子只是S區(qū)的產(chǎn)物，沒(méi)有前-S1或前-S2決定簇，因?yàn)檗D(zhuǎn)化質(zhì)粒只含有S區(qū)順序。因此，這些粒子不象來(lái)源于血漿的“天然”粒子那樣具有免疫原性。酵母細(xì)胞也不能分泌HBsAg粒子，而且盡管它們能將HBsAg蛋白糖基化，這種糖基化作用也與哺乳動(dòng)物細(xì)胞不同。雖然在酵母中發(fā)生了22nm粒子的組裝，但是這些粒子不穩(wěn)定。這種生產(chǎn)方法需要對(duì)酵母產(chǎn)生的HBsAg進(jìn)行化學(xué)處理，才能得到與來(lái)源于血漿的產(chǎn)品相類似的最終產(chǎn)品;福爾馬林處理也被認(rèn)為是必需的，以便使產(chǎn)品對(duì)人類使用安全。這些方法和使用洗滌劑和尿素的純化步驟，都會(huì)從結(jié)構(gòu)上改變HBsAg分子，導(dǎo)致抗原性喪失，生產(chǎn)成本提高。
最近，利用酵母體系生產(chǎn)了除S區(qū)決定簇之外還含有前-S2決定簇的HBsAg粒子(例如參見(jiàn)EPO 171908 A3，1986年2月19日公開，日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社;以及EPO 175261 A2，1986年3月26日公開，Chiron公司)。雖然所提出的這些疫苗確實(shí)含有前-S2區(qū)決定簇，但是它們?nèi)匀狈η?S1區(qū)的決定簇。另外，因?yàn)槭褂媒湍阁w系，這些生產(chǎn)方法仍存在上述問(wèn)題。
因此，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法看來(lái)是生產(chǎn)HBsAg粒子疫苗的最優(yōu)越的體系。
4.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系生產(chǎn)的疫苗及其生產(chǎn)方法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系中，HBsAg粒子的糖基化與人類攜帶者的“天然”HBV粒子的糖基化相同。生產(chǎn)出的HBsAg粒子也以“天然”方式組裝，不需要進(jìn)一步的化學(xué)處理。最后，22 nm HBsAg粒子由這些細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中，容易從培養(yǎng)基中純化出這些粒子而不必溶解細(xì)胞。
但是，在哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)中合成重組HBsAg疫苗時(shí)，主要問(wèn)題是組裝成真實(shí)22 nm HBsAg粒子的全譜HBsAg蛋白的合成。看來(lái)含前-S1的蛋白質(zhì)(P-39和GP-42)會(huì)抑制22 nm HBsAg粒子的分泌(例如參見(jiàn)Ou和Rutter，J.Virol，1987年61卷782-786頁(yè);Persing等，J.Virol，1987年61卷1672-1677頁(yè))。
用哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系生產(chǎn)的一些可能的HBsAg疫苗，使用異源致癌病毒表達(dá)載體(例如SV 40、腺病毒)來(lái)指導(dǎo)HBsAg的表達(dá)。這些方法使生產(chǎn)出的HBsAg粒子只表達(dá)出前-S2和S區(qū)，不含前-S1決定簇。使用異源調(diào)控成分來(lái)表達(dá)HBsAg粒子造成了低效率的組裝，從而使收率降低。因?yàn)槭章实秃腿狈η?S1區(qū)，它的免疫原性也差。最后，在這些體系中描述的純化方法既耗時(shí)又昂貴，一般要涉及到用聚乙二醇或硫酸銨分級(jí)，隨后超離心處理，以得到純化的HBsAg(例如參見(jiàn)EPO 0389765 A1，1981年10月28日公開;EPO 145589 A3，1985年6月19日公開;EPO 201416 A1，1986年11月12日公開;EPO 185573 A1，1986年6月25日公開，全都轉(zhuǎn)讓給巴斯德研究所)。
曾有人描述了由重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)HBsAg粒子的其它方法(例如參見(jiàn)EPO 168234 A2，1986年1月15日公開，轉(zhuǎn)讓給Genentech公司)。但是這種體系也采用硫酸銨或聚乙二醇分級(jí)及離心等耗時(shí)而昂貴的步驟來(lái)得到純化的產(chǎn)物。這種體系中的HBsAg粒子最終產(chǎn)物只含S區(qū)蛋白。
近來(lái)又有人描述了一種體系，據(jù)稱它成功地采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系生產(chǎn)了HBsAg粒子，其中含有帶有所有免疫原性決定簇即前-S1、前-S2和S的蛋白質(zhì)。但是，這一體系也使用異源基因表達(dá)調(diào)控順序(一種小鼠金屬硫因啟動(dòng)子)，它需要在重金屬離子和/或類固醇激素存在下培養(yǎng)細(xì)胞)。如果不把這些離子和/或激素從最終產(chǎn)物中除掉，可能有潛在的危害。此外，所述的生產(chǎn)方法也包括聚乙二醇分級(jí)和隨后離心以純化產(chǎn)物的步驟，耗時(shí)而且昂貴。再者，因?yàn)樵诒磉_(dá)體系中使用異源基因調(diào)控順序，前-S1、前-S2和S決定簇的化學(xué)計(jì)量對(duì)于得到具有高度免疫原性的HBsAg產(chǎn)物可能不理想(例如參見(jiàn)EPO 198474 A1，1986年10月22日公開，轉(zhuǎn)讓給Endotronics公司)。
5.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系中生產(chǎn)疫苗的新方法鑒于生產(chǎn)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞疫苗的上述缺點(diǎn)，申請(qǐng)人研究出一種新的廉價(jià)方法，用以生產(chǎn)大量的高度純化的HBsAg粒子，它們具有高度的免疫原性，而且與“天然”產(chǎn)物非常相近。這種粒子為極其有效和廉價(jià)的疫苗提供了基礎(chǔ)。此外，這種新產(chǎn)品含有所有的抗原決定簇，即前-S1、前-S2和S區(qū)決定簇，它們是在采用“天然”HBV基因調(diào)控順序的表達(dá)體系中產(chǎn)生的，形成的粒子在化學(xué)計(jì)量上和來(lái)源于血漿的“天然”粒子相似。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)純化的乙型肝炎表面抗原粒子的新方法，該方法包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生這些粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌乙型肝炎表面抗原粒子，培養(yǎng)基中添加有不含分子量大于約3×105道爾頓的分子的血清;
(b)從所得的含有乙型肝炎表面抗原粒子的培養(yǎng)基中去除全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體;
(c)處理得到的培養(yǎng)基，以濃縮和純化其中存在的乙型肝炎表面抗原粒子;
(d)回收所得的濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子。
在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的方法中，采用以下步驟可以得到純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生所述粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌人乙型肝炎表面抗原粒子，培養(yǎng)基中添加有不含分子量大于約3×105道爾頓的分子的血清;
(b)從所得的含有人乙型肝炎表面抗原粒子的培養(yǎng)基中去除全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體;
(c)對(duì)所得的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，以得到含有濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子的溶液;
(d)對(duì)所得的含濃縮抗原粒子的溶液進(jìn)行處理，以減少溶液中的DNA含量;
(e)如有必要，調(diào)節(jié)如此形成的含有濃縮和純化表面抗原粒子的溶液的pH，以使其pH在約3.0和7.0之間;
(f)純化所得溶液中存在的濃縮表面抗原粒子;
(g)回收純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種純化乙型肝炎表面抗原粒子，尤其是具有高度免疫原性的22 nm HBsAg粒子的新方法。這些粒子用來(lái)作為抗原誘發(fā)免疫反應(yīng)，以中和HBV病毒對(duì)靶細(xì)胞的感染。更具體地說(shuō)，這種純化方法的特征在于采用一種新的預(yù)分級(jí)步驟，即利用超濾，從乙型肝炎表面抗原粒子分泌于其中的培養(yǎng)基中去除分子量大于約3×105道爾頓的分子。
本發(fā)明的純化方法涉及各種步驟。在第一步中，使HBsAg粒子生長(zhǎng)并分泌到添加有生長(zhǎng)血清的培養(yǎng)基中。此培養(yǎng)基先經(jīng)過(guò)預(yù)分級(jí)以去除高分子量(即300K以上)的細(xì)胞污染物。補(bǔ)給性培養(yǎng)基的預(yù)分級(jí)是一個(gè)重要步驟，有了這個(gè)步驟，就能以最少數(shù)目的純化步驟達(dá)到高純度。分子量大于約3×105道爾頓的分子包括高分子量的蛋白質(zhì)復(fù)合污染物，這些污染物來(lái)自培養(yǎng)基中使用的胎牛血清，事先將其去除有以下好處(1)細(xì)胞可以在含有高含量胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng);
(2)促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)，因?yàn)楦叻肿恿繌?fù)合物可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用;
(3)簡(jiǎn)化了HBsAg的純化，因?yàn)檫@些高分子量的蛋白質(zhì)復(fù)合物通常是純化過(guò)程中去除的主要污染物。
隨后的純化步驟主要要求高分子量的HBsAg粒子與分子量較低的分子(即，蛋白質(zhì)污染物)相分離。首先，從所形成的含乙型肝炎表面抗原粒子的培養(yǎng)基中去除全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體。然后，處理所得的培養(yǎng)基，以將其中存在的乙型肝炎表面抗原粒子濃縮和純化，然后移出所得的濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子。這些步驟在以后的實(shí)施例中，特別是在實(shí)施例5中，將有更詳細(xì)的敘述。
在本發(fā)明的一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生產(chǎn)出了純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原。在該方法中，在實(shí)施例5提到的純化方法的頭三步(即，培養(yǎng)基的預(yù)分級(jí);從收集到的含HBsAg粒子的培養(yǎng)基中去除全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體;處理所得的培養(yǎng)基以得到含有濃縮人HBsAg粒子的溶液)之后，還包括上述純化方法的一種變型。對(duì)所得的含有濃縮抗原粒子的溶液進(jìn)行處理，以減少溶液中的DNA含量，然后若有必要，調(diào)節(jié)pH，使pH值處在約3.0和7.0之間。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，用酸處理溶液來(lái)調(diào)節(jié)pH，使溶液出現(xiàn)混濁。混濁物中含有蛋白質(zhì)污染物，可以與乙型肝炎表面抗原粒子分開。隨后回收純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子。在實(shí)施例11中更詳細(xì)地?cái)⑹隽诉@些差別，以及這些差別與實(shí)施例5中所用的方法相比所具有的優(yōu)點(diǎn)。
利用本發(fā)明的方法，實(shí)現(xiàn)了在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)能以簡(jiǎn)化的方式將這些細(xì)胞分泌的HBsAg粒子高度純化。此方法不使用聚乙二醇或硫酸銨分級(jí);也無(wú)需用離心法(包括超離心)或親合色譜法分離。此方法快速而有效，以高收率生產(chǎn)高度純化的產(chǎn)物，而且因?yàn)樗钥裳h(huán)使用的組分為基礎(chǔ)，所以很便宜。因此申請(qǐng)人能以很低的成本制得高純度的產(chǎn)物。這就使申請(qǐng)人能為范圍寬得多的潛在用戶提供有效的HBV疫苗，這些用戶以前可能負(fù)擔(dān)不起現(xiàn)有的貴得多的疫苗。
最后，本發(fā)明提供了用哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系生產(chǎn)的HBsAg粒子，它含有天然存在的所有抗原決定簇(前-S1、前-S2和S)，其數(shù)量與“天然”化學(xué)計(jì)量相似。此產(chǎn)品對(duì)于所有的潛在用戶都具有免疫原性，而且由于還具有前-S1決定簇，可以克服對(duì)S區(qū)或前-S2區(qū)決定簇?zé)o反應(yīng)的問(wèn)題。


圖1示意表示了pSPHBV8-1的構(gòu)建。p7.5AL26(11，800堿基對(duì))用PstI消化，分離出3800堿基對(duì)的片段。此片段含有HBV順序，與人Alexander DNA鄰接，通過(guò)用T4DNA連接酶連接而亞克隆在pSP 64的PstI位點(diǎn)。
圖2示意表示了pSPHBVB8的構(gòu)建。pSPHBV8-1用EcoRI和XbaI充分消化，接著分離出500堿基對(duì)的片段，其中含有HBV-AL 26啟動(dòng)子和前-S1編碼順序。在另一個(gè)反應(yīng)中，pSPHBVB8-1用EcoRI和PstI消化，分離出含前-S2和S編碼順序的2400堿基對(duì)片段以及HBV-AL 26增強(qiáng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)。兩個(gè)片段都以三連接法串聯(lián)亞克隆到用XbaI和PstI切割后的pSP 65中。
圖3示意表示了pSPHBVA 13和pSPHBVB 813的構(gòu)建。利用EcoRI消化pSVE 100-dhfr，用Klenow片段填平末端，再用SmaI消化，從pSVE 100-dhfr中分離出與SV 40PE和SV 40多腺苷酸化信號(hào)鄰接的dhfr基因。將1300堿基對(duì)的平末端片段亞克隆到pSPHBV 8-1和pSPHBVB 8的PvuⅡ位點(diǎn)，形成質(zhì)粒pSPHBVA 13和pSPHBVB 813，它攜有HBsAg及dhfr的順序。
圖4說(shuō)明生產(chǎn)和純化HBsAg粒子的優(yōu)選方法A的流程圖。
圖5HBsAg的蔗糖梯度分離-純化的HBsAg粒子。將粒子加到50-5%蔗糖的蔗糖梯度上，在16-21℃下，以27000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速于Beckman SW 27轉(zhuǎn)子中超離心18小時(shí)。以1.8ml為一級(jí)分從底部收集各級(jí)分，分析HBsAg的存在和蔗糖濃度(用折射儀)。
圖6HBsAg的固相放射免疫測(cè)定使用固相放射免疫測(cè)定試劑盒(Travenol)。
(a)將已知標(biāo)準(zhǔn)物(Abbott)與申請(qǐng)人的重組HBsAg(CHO)的校準(zhǔn)曲線相比較。
(b)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的重組HBsAg疫苗-申請(qǐng)人的疫苗(CHO)的校準(zhǔn)曲線與來(lái)源血漿的(HBsAg)疫苗-HeptavaxB和酵母重組疫苗-Recombivax HB的校準(zhǔn)曲線相比較。
圖7利用血清轉(zhuǎn)化測(cè)定HBsAg效力申請(qǐng)人的疫苗(CHO)與來(lái)源于血漿的疫苗-Heptavax B及酵母重組疫苗-Recombivax HB相比較。
用1毫升疫苗在Balb/c小鼠腹膜內(nèi)注射(每個(gè)疫苗濃度用10只小鼠)。注射后30天抽小鼠血，用對(duì)照參考血清(WHO)校正過(guò)的Ausab EIA試劑盒(Abbott)試驗(yàn)血清中抗HBsAg抗體的存在。
圖8說(shuō)明生產(chǎn)和純化HBsAg粒子的特別優(yōu)選方法(優(yōu)選方法B)的流程圖。
圖9說(shuō)明生產(chǎn)和純化HBsAg粒子的優(yōu)選方法C的流程圖。
圖10與酵母重組疫苗-Recombivax HB相比，注射申請(qǐng)人疫苗的無(wú)反應(yīng)小鼠體內(nèi)抗S抗體的檢測(cè)和定量。
本發(fā)明提供生產(chǎn)純化的乙型肝炎表面抗原粒子的新方法，該方法包括(a)在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)產(chǎn)生這些粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌乙型肝炎表面抗原粒子，培養(yǎng)基中添加有不含分子量大于約3×105道爾頓的分子的血清;
(b)從所得的含有乙型肝炎表面抗原粒子的培養(yǎng)基中去除全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體;
(c)對(duì)所得的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，以將其中存在的乙型肝炎表面抗原粒子濃縮和純化;
(d)回收所得的濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子。
用以上方法生產(chǎn)的粒子可以是人乙型肝炎表面抗原粒子。
本發(fā)明還提供一種回收純化HBsAg粒子的方法，該方法包括，進(jìn)一步純化步驟(c)中得到的HBsAg粒子以除去低分子量污染物，其作法是使含有粒子的溶液通過(guò)一個(gè)色譜柱并回收這些粒子。步驟(c)的濃縮在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行，以便能在非間歇式純化系統(tǒng)中將粒子進(jìn)一步純化。
本發(fā)明的一個(gè)要素是，在含有分泌肝炎病毒粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入血清，例如胎牛血清，在將哺乳動(dòng)物細(xì)胞置于培養(yǎng)基中之前，血清中應(yīng)不含高分子量的污染蛋白(即，分子量大于約300，000道爾頓的蛋白)。利用(例如)將血清預(yù)分級(jí)，即利用超濾，從血清中除去這些蛋白。
不除去血清中分子量大于約300K的污染蛋白，會(huì)使后繼的純化步驟中污染蛋白的含量很高，降低收率和純度。
雖然在本發(fā)明中利用超濾進(jìn)行預(yù)分級(jí)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，任何能減少加到培養(yǎng)基中的血清中高分子量污染蛋白的方法都會(huì)得到同樣的效果。
乙型肝炎表面抗原粒子與全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體的分離，也可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行，但優(yōu)選超濾法。濾液中含有由超濾步驟得到的HBsAg粒子，將其收集起來(lái)進(jìn)一步純化。
因?yàn)樵诜蛛x步驟(b)中使用的批料的體積對(duì)于后繼的在色譜柱上純化的優(yōu)選步驟(例如凝膠色譜步驟)來(lái)說(shuō)太大了，所以可以將HBsAg粒子進(jìn)一步濃縮和純化。進(jìn)行純化時(shí)最好是將分離步驟(b)之后得到的濾液進(jìn)行超濾，除去分子量低于約300K的污染分子。保留物中含有所要的HBsAg粒子，可以將其進(jìn)一步純化。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)一步純化是通過(guò)透析進(jìn)行的，透析之后最好進(jìn)行另一次超濾，以進(jìn)一步濃縮。
然后可以用色譜法，最好是用凝膠過(guò)濾柱，進(jìn)一步純化這種濃縮和純化的HBsAg粒子，以進(jìn)一步除去小分子量的污染粒子。凝膠過(guò)濾步驟最好再重復(fù)一次以進(jìn)一步純化。凝膠過(guò)濾色譜最好是在用N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)的烯丙基葡聚糖柱上進(jìn)行。這種凝膠過(guò)濾柱排除分子量大于約1×106道爾頓的分子。在下面的實(shí)施例中，尤其是實(shí)施例5中，將更詳細(xì)地描述此方法。
在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的方法中，通過(guò)以下步驟可以得到純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌人乙型肝炎表面抗原粒子，培養(yǎng)基中添加有不含分子量大于約3×105道爾頓的分子的血清;
(b)從所得含有人乙型肝炎表面抗原粒子的培養(yǎng)基中除去全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體;
(c)對(duì)所得的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，以得到含有濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子的溶液;
(d)對(duì)所得的含濃縮抗原粒子的溶液進(jìn)行處理，以減少溶液中的DNA含量;
(e)如有必要，調(diào)節(jié)如此形成的含有濃縮和純化表面抗原粒子的溶液的pH，使pH值處在約3.0和約7.0之間;
(f)對(duì)存在于所得溶液中的濃縮表面抗原粒子進(jìn)行純化;
(g)回收純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子。
實(shí)施例11中對(duì)這一特別優(yōu)選的實(shí)施例作了進(jìn)一步的描述。根據(jù)這一特別優(yōu)選的方法，從步驟(c)回收的含濃縮抗原襪子的溶液在回收前進(jìn)一步純化。這一特別優(yōu)選方法的步驟a、b和c與實(shí)施例5中所述的方法相同，上面對(duì)實(shí)施例5的方法所作的說(shuō)明也適用于實(shí)施例11的方法中。實(shí)施例13中敘述了另一個(gè)優(yōu)選方法。
在將培養(yǎng)基進(jìn)行處理以得到含有濃縮人乙型肝炎表面抗原粒子的溶液之后，對(duì)所得的溶液進(jìn)行處理以減少溶液中的DNA含量。在一種優(yōu)選方法中(見(jiàn)實(shí)施例11)，這種減少DNA含量的處理包括向溶液中加入DNA酶。在另一個(gè)優(yōu)選方法中(見(jiàn)實(shí)施例13)，減少DNA含量的處理包括對(duì)溶液進(jìn)行陰離子交換色譜處理，最好是在具有二乙氨基乙基官能團(tuán)的交聯(lián)瓊脂糖柱上進(jìn)行。這一陰離子交換色譜步驟也可以在用DNA酶溶液處理后進(jìn)行。
如果有必要，對(duì)如此得到的含濃縮和純化表面抗原粒子的溶液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，使pH達(dá)到約3.0至約7.0之間。在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，用酸處理如此形成的溶液來(lái)調(diào)節(jié)pH，產(chǎn)生混濁。混濁物中含有蛋白質(zhì)污染物，可以與人乙型肝炎表面抗原粒子分離，最好是用離心法分離。這一步驟是對(duì)酸處理過(guò)的抗原粒子的進(jìn)一步純化。
或者是，可以利用離子交換色譜法，最好是用陰離子交換色譜法，從上述抗原粒子溶液中除去DNA和蛋白質(zhì)污染物，從而使HBsAg粒子與洗脫液一起流出，而DNA和蛋白質(zhì)污染物則被柱子結(jié)合或阻留。陰離子交換柱最好是DEAE陰離子交換柱。在本發(fā)明的一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用來(lái)除去DNA和其它污染物的陰離子交換柱是帶有DEAE官能團(tuán)的交聯(lián)瓊脂糖柱。這類柱的一個(gè)實(shí)例是DEAE-Sepharose。該方法在實(shí)施例13中有更詳細(xì)的說(shuō)明。
另一種替代方法是將以上兩個(gè)步驟相結(jié)合，即，用DNA酶處理減少DNA含量之后進(jìn)行酸化，接著在DEAE柱上除去DNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以使用任何純化方法在除去DNA之后作進(jìn)一步的純化，例如利用陽(yáng)離子或陰離子交換色譜法，但優(yōu)選強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜法，例如用帶有磺酸官能團(tuán)的柱。在本發(fā)明的一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于進(jìn)一步純化的陽(yáng)離子交換柱是N-丙烯酰-2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇的共聚物，它具有以下化學(xué)基團(tuán)作為磺酸官能團(tuán)
-CONH-C(CH3)2-CH2-SO3H這類柱的一個(gè)實(shí)例是SP-Trisacryl LS。
這種高度純化和濃縮的抗原粒子也可以先用甲醛處理以使存在的任何活有機(jī)體和病毒滅活，然后進(jìn)一步濃縮，最好用超濾法濃縮。所得的進(jìn)一步濃縮的粒子隨后用色譜法純化，最好用凝膠過(guò)濾色譜法。一種優(yōu)選的凝膠過(guò)濾柱是用N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)的烯丙基葡聚糖柱。
正如在實(shí)施例10中所述，當(dāng)使用本發(fā)明優(yōu)選步驟的替代步驟時(shí)，出現(xiàn)很多問(wèn)題。例如，當(dāng)用離心法來(lái)分離而不用超離心法時(shí)，未去除主要的細(xì)胞污染物，例如細(xì)胞膜和脂類復(fù)合物，這造成總收率降低，并降低了HBsAg粒子的純度。離心法也是昂貴而耗時(shí)的。使用0.22微米膜滅菌體系造成了在實(shí)施例中說(shuō)明的不同問(wèn)題。
類似地，當(dāng)使用聚乙二醇濃縮而不用超濾法時(shí)，HBsAg粒子的回收率僅有75%。另外，純度較低，而且該方法更費(fèi)時(shí)。
因此，雖然可以使用諸如實(shí)施例10中所述的方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解的方法等替代方法，但是優(yōu)選的方法是實(shí)施例5中討論的方法。另外，正如上面所討論的，實(shí)施例11中詳細(xì)敘述了本發(fā)明的一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案。
任何能表達(dá)cDNA編碼的乙型肝炎表面抗原的哺乳動(dòng)物細(xì)胞均可使用。優(yōu)選的細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，尤其是CHO-HB200細(xì)胞。
乙型肝炎表面抗原是通過(guò)培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO-HB200)得到的。培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。培養(yǎng)可以在搖瓶或發(fā)酵罐中用微型載體(microcarriers)進(jìn)行。
由上述方法回收純化的乙型肝炎表面抗原粒子。如上所述，這些純化的粒子含有乙型肝炎表面抗原的前-S1、前-S2和S表面抗原多肽，所達(dá)到的純度水平可以高到95%到98-99%(95%到98-99%不含蛋白質(zhì)污染物)。這種純化的乙型肝炎表面抗原粒子含有的前-S1、前-S2和S表面抗原多肽的化學(xué)計(jì)量數(shù)量還與來(lái)源于血漿的粒子相近。
更具體地說(shuō)，純化的乙型肝炎表面抗原粒子可以含有表面抗原多肽，其中S表面抗原多肽構(gòu)成粒子的75-80%，前-S2表面抗原多肽構(gòu)成粒子的10-15%，前-S1表面抗原多肽構(gòu)成粒子的5-10%。在本發(fā)明的一項(xiàng)具體的實(shí)施方案中，S表面抗原多肽構(gòu)成粒子的78%，前-S2表面抗原多肽構(gòu)成粒子的14%，前-S1表面抗原多肽構(gòu)成粒子的8%。
在本發(fā)明的一項(xiàng)更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括純化的乙型肝炎表面抗原粒子，其中的表面抗原多肽的數(shù)量如下S 24KD未糖基化 62.4%S 27KD糖基化 15.6%前-S2 33KD單糖基化 10.8%前-S2 36KD雙糖基化 3.2%前-S1 39KD未糖基化 6.1%前-S1 41KD糖基化 1.9%本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，以上段落中討論的數(shù)量可以隨回收產(chǎn)物的純度而變化。
本發(fā)明還提供了一種乙型肝炎表面抗原疫苗，其中含有用上述方法制得的有效免疫量的乙型肝炎表面抗原粒子和合適的載體。
實(shí)施例以下實(shí)施例用來(lái)幫助理解本發(fā)明，決不是要限制本發(fā)明的范圍，不應(yīng)造成誤解。這些實(shí)施例不包括對(duì)構(gòu)建載體、編碼多肽的基因插入這些載體中或?qū)⑺纬傻馁|(zhì)粒引入宿主中所用的常規(guī)方法的詳細(xì)說(shuō)明。這些實(shí)施例也不包括對(duì)這些宿主載體體系產(chǎn)生的多肽進(jìn)行測(cè)定所用的常規(guī)方法的詳細(xì)說(shuō)明。另外，這些實(shí)施例不包括對(duì)哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)常規(guī)方法或這些組織培養(yǎng)細(xì)胞的重組DNA轉(zhuǎn)化常規(guī)方法的詳細(xì)說(shuō)明。最后，這些實(shí)施例不包括對(duì)超濾和凝膠過(guò)濾以對(duì)由轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的多肽進(jìn)行純化的常規(guī)方法的詳細(xì)說(shuō)明。
這類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，在許多出版物中都有說(shuō)明，例如一般分子生物學(xué)方法Maniatis等，“分子克隆”(Molecular Cloning)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室;Davis等，“分子生物學(xué)中的基本方法”(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier，New York，Amsterdam(1986)。
哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)方法Uslaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.1980年77卷4216-4220頁(yè);Pellicer等，Science，1980年209卷1414-1422頁(yè);Laub等，J.Virol，1983年48卷271-280頁(yè);Petzer等，在Vyas等編著的“病毒性肝炎和肝病”中477-485頁(yè)，Grune和Stratton公司，Orlando，F(xiàn)lorida(1984);Michel等，Bio/Technology，1985年第3卷561-566頁(yè)。
超濾方法Trudel等，Process Biochem.1983年18卷2-9頁(yè)。
凝膠過(guò)濾方法Fisher的“凝膠過(guò)濾色譜法”一書，Elsevier，Amsterdam(1980)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞系申請(qǐng)人使用了稱作CHO200Mrp7.5 AL 26和CHO50Mrp7.5 AL 26的細(xì)胞系，它們是由Weizman Institute/Yeda Research and Development Company建立的，保藏在巴斯德研究所，保藏號(hào)分別為I-574和I-575。在幾份未決歐洲專利申請(qǐng)中說(shuō)明了這些質(zhì)粒的構(gòu)建。在可選擇的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上類似地含有HBsAg基因區(qū)的其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系也可以用來(lái)實(shí)施本發(fā)明。
實(shí)施例1在本發(fā)明中建立和使用的細(xì)胞系和質(zhì)粒申請(qǐng)人使用CHO細(xì)胞系CHOMr200p7.5 AL 26(圖1)來(lái)生產(chǎn)和純化HBsAg粒子。但是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞系被支原體污染，因此在使用前必須進(jìn)行處理。
這一細(xì)胞系是通過(guò)用質(zhì)粒p7.5 AL 26的DNA和含dhfr基因質(zhì)粒的DNA轉(zhuǎn)染而構(gòu)建的。p7.5 AL 26 DNA和含dhfr基因質(zhì)粒的DNA之比是10∶1。
p7.5 AL 26質(zhì)粒是通過(guò)在pBR 322的EcoRI位點(diǎn)插入一個(gè)7.5千堿基對(duì)的EcoRI片段而構(gòu)建的，該片段含有整個(gè)HBV表面抗原整合基因，包括前-S1和前-S2區(qū)以及稱為“TATA”啟動(dòng)子和“SV-40樣”啟動(dòng)子的HBV啟動(dòng)基因。另外，它還含有HBV增強(qiáng)子成分和在3′末端下游的2-3個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)。按照Shaul等的方法(J.Virol，1984年51卷776-787頁(yè))從Alexander細(xì)胞中分離DNA，該DNA在HBV DNA的5′和3′末端含有鄰接的宿主順序(來(lái)自Alexander細(xì)胞)。然后用氨甲蝶呤(200 nM)處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞，選擇出抗性細(xì)胞。
其它細(xì)胞系用同樣的HBV DNA轉(zhuǎn)化，該DNA已經(jīng)過(guò)處理而除去了大部分或全部鄰接的宿主細(xì)胞(Alexander)DNA順序。例如，將p7.5 AL 26的3.8千堿基對(duì)Pst DNA片斷引入到pSP 64中。所形成的質(zhì)粒pSPHBV 8-1含有100堿基對(duì)的位于HBV啟動(dòng)子TATA盒上游的人DNA和600堿基對(duì)的在基因3′末端下游Pj區(qū)之外的人DNA。
A.細(xì)胞系CHO200Mrp7.5 AL 26的處理被支原體污染的細(xì)胞系CHO200Mrp7.5 AL 26用抗生素試劑盒BM-CYCLINE(Boehringer，Mannheim)處理。處理過(guò)程完全按照該試劑盒所提供的程序(Boehringer Mannheim產(chǎn)品目錄799050號(hào)，這里引用作為參考)進(jìn)行。處理后成功地形成了我們稱之為CHO-HB 200的細(xì)胞系，它不含支原體，并且以高水平產(chǎn)生HBsAg粒子。
B.用處理過(guò)的CHOMr2007.5 AL 26 細(xì)胞系-CHO-HB 200生產(chǎn)的HBsAg的產(chǎn)量用此細(xì)胞系制得的免疫活性HBsAg的組成表達(dá)最初通過(guò)測(cè)定匯合培養(yǎng)物的培養(yǎng)基來(lái)確定。使用Travenol固相放射免疫測(cè)定試劑盒來(lái)檢測(cè)HBsAg，確定了匯合CHO-HB 200培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中含有3-5毫克/升免疫活性HBsAg。
C.處理過(guò)的CHOMr2007.5 AL 26克隆-CHO-HB 200的穩(wěn)定性所選擇的克隆CHO-HB 200在至少6個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定地產(chǎn)生HBsAg。
D.新的HBsAg表達(dá)質(zhì)粒的建立對(duì)質(zhì)粒pSPHBV 8-1(圖1)作進(jìn)一步的操作，去除剩下的上游Alexander細(xì)胞DNA順序。操作方法是，使pSPHBV 8-1的500堿基對(duì)XbaI-EcoRI片段和2400堿基對(duì)EcoRI-PstI片段亞克隆到pSP 65中，生成pSPHBVB 8(圖2)。
將SV 40早期啟動(dòng)子和SV 40多聚腺苷酸化位點(diǎn)控制下的dhfr基因亞克隆到pSPHBV 8-1和pSPHBVB8中，分別產(chǎn)生pSPHBV AL 3和pSPHBVB 813(圖3)。這是通過(guò)將已插入的pSVE 100-dhfr的1300堿基對(duì)填平EcoRⅠ-SmaⅠ片段亞克隆到適當(dāng)HBV質(zhì)粒的PvuⅡ位點(diǎn)中而實(shí)現(xiàn)的，上述片段含有帶所有調(diào)控順序的dhfr基因。
這種縮短的構(gòu)建體含有受其天然啟動(dòng)子控制的HBsAg基因以及受SV 40早期啟動(dòng)子控制的dhfr基因。將這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到dhfr CHO細(xì)胞中。
實(shí)施例2組織培養(yǎng)方法申請(qǐng)人在本發(fā)明中使用的下列方法通常是在哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)中使用的標(biāo)準(zhǔn)方法。曾有人描述過(guò)這些方法的許多變型，這些變型也可以用于同一目的(關(guān)于包括本發(fā)明方法在內(nèi)的各種方法的實(shí)例，參見(jiàn)以下文獻(xiàn)Uslaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.1980年77卷4216-4220頁(yè);Pellicer等，Science，1980年209卷1414-1422頁(yè);Laub等，J.Virol.1983年48卷271-280頁(yè);Petzer等在Vyas等編著的“病毒性肝炎和肝病”一書的477-485頁(yè)，Grune和Stratton公司，Orlando，F(xiàn)lorida，1984;Michel等，Bio-Technology，1985年第3卷561-566頁(yè))。
A1.胰酶消化匯合培養(yǎng)物在傳代培養(yǎng)或冷凍貯存之前先進(jìn)行胰酶消化。從培養(yǎng)容器中倒出培養(yǎng)基即Dulbecco改良型伊格耳氏基本培養(yǎng)基(DMEM)，加入胰蛋白酶在磷酸鹽緩沖液中的冷溶液(0.25%稀釋成1∶3)(加入的胰蛋白酶的體積約是原始生長(zhǎng)培養(yǎng)基體積的1/10)?？焖傧礈旄街募?xì)胞，除去多余的胰蛋白酶。在37℃下殘留的胰蛋白酶與細(xì)胞接觸5-10分鐘，然后在培養(yǎng)容器中加入添加有5-10%胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM)以停止胰酶消化。輕輕搖動(dòng)使附著的細(xì)胞從壁上脫下并懸浮在培養(yǎng)基中。將這些細(xì)胞或是傳代培養(yǎng)，或是冷凍長(zhǎng)期貯存。
0.25%胰蛋白酶溶液(儲(chǔ)液)的配制胰蛋白酶溶液中含有80克 NaCl4克 KCl10克 右旋糖35克 NaHCO325克 胰蛋白酶(1∶300 ICN)
將以上所有成分溶于10升水中，調(diào)節(jié)pH至8.5。
然后將以上溶液經(jīng)過(guò)0.22微米濾器過(guò)濾，冷凍(-20℃)，可以貯存數(shù)年。
A2.配制胰蛋白酶工作溶液(1∶3稀釋)用與上述儲(chǔ)液配方相同、但不含胰蛋白酶的溶液，將儲(chǔ)液按1∶3稀釋。
B.細(xì)胞的長(zhǎng)期儲(chǔ)存當(dāng)需要將細(xì)胞長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)，進(jìn)行以下步驟將匯合培養(yǎng)物按第1部分中所述進(jìn)行胰酶消化。將懸浮細(xì)胞在添加有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中洗一次或兩次。洗過(guò)之后，將細(xì)胞再懸浮于含有20%胎牛血清+10%二甲基亞砜的培養(yǎng)基中，使細(xì)胞的最終濃度達(dá)到3-4×106個(gè)細(xì)胞/毫升。將培養(yǎng)瓶在室溫下放置1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到-20℃的冷凍箱中。次日上午將冷凍的培養(yǎng)瓶在-70℃再放置24小時(shí)。最后，將培養(yǎng)瓶放在液氮中長(zhǎng)期貯存。一周之后，取1-3個(gè)培養(yǎng)瓶解凍，估測(cè)細(xì)胞的成活率。
按此方式建立主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)。
C.儲(chǔ)存細(xì)胞的解凍將盛有儲(chǔ)存冷凍細(xì)胞的小瓶從液氮儲(chǔ)罐中迅速取出，放在37℃水浴中。細(xì)胞快速熔化，將其轉(zhuǎn)移到T形瓶(75-150 cm2)中，瓶?jī)?nèi)裝有25-50毫升添加有10%胎牛血清的DMEM。幾小時(shí)后看得出大多數(shù)細(xì)胞附著在底部。在細(xì)胞解凍4小時(shí)后更換培養(yǎng)基。約5-8天后培養(yǎng)物達(dá)到匯合。
實(shí)施例3搖瓶細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)
A.生長(zhǎng)培養(yǎng)基所有CHO細(xì)胞系都在Dulbecco改良型伊格耳氏培養(yǎng)基(DMEM)中進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有10 mM谷氨酰胺(Gibco公司)、20 mM HEPES(Raught公司)、30 mM NaHCO3(Merck公司)、150微克/毫升脯氨酸(Sigma公司)和40微克/毫升慶大霉素(Sigma公司)。在該培養(yǎng)基中添加2-10%胎牛血清(Bocknek公司)以滿足培養(yǎng)需要。該培養(yǎng)基的最佳工作pH是在7.15-7.25之間。
B.接種和培養(yǎng)的維持使用850cm2或490cm2塑料搖瓶(Corning公司)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)HBsAg。匯合培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化，細(xì)胞懸浮在DMEM培養(yǎng)基中用于再培養(yǎng)，該培養(yǎng)基添加有10%胎牛血清。每個(gè)搖瓶用50-100毫升培養(yǎng)基接種，培養(yǎng)基中添加有10%胎牛血清，含有至少5×106個(gè)細(xì)胞。接種量決定了培養(yǎng)物再次達(dá)到匯合所需的時(shí)間長(zhǎng)短(可以在2-10天范圍內(nèi))。在接種幾小時(shí)之后，大多數(shù)細(xì)胞已附著并開始蔓延。24小時(shí)后可以觀察到細(xì)胞分裂。
建議使用添加有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)物達(dá)到匯合;然后在此階段將胎牛血清的含量降到2-5%。降低胎牛血清含量對(duì)于長(zhǎng)期的細(xì)胞維持和生產(chǎn)最為適宜。這樣的培養(yǎng)物可以維持6個(gè)月而不喪失產(chǎn)生HBsAg的能力。
匯合培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目在每搖瓶2×108-109個(gè)細(xì)胞之間變化。
典型的CHO細(xì)胞的劇烈代謝作用，和高細(xì)胞密度一起，造成了培養(yǎng)基pH的快速下降。其后果大概一方面會(huì)造成培養(yǎng)基消耗，另一方面會(huì)釋放出不希望有的毒性代謝產(chǎn)物。為了防止對(duì)細(xì)胞的潛在危害，建議逐日更換匯合培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基。
實(shí)施例4在搖瓶體系中生產(chǎn)HBsAg利用CHO-HB 200細(xì)胞的HBsAg組成生產(chǎn)(實(shí)施例1)來(lái)連續(xù)地長(zhǎng)期生產(chǎn)HBsAg。在每日一次更換培養(yǎng)基的情況下，HBsAg在匯合培養(yǎng)物中的生產(chǎn)在至少6個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。生產(chǎn)速度是4-5毫克HBsAg/升/24小時(shí)，在6個(gè)月連續(xù)培養(yǎng)期間內(nèi)不變。
雖然在搖瓶培養(yǎng)體系中可以大量生產(chǎn)HBsAg，但此方法僅適合于有限的工業(yè)生產(chǎn)。主要的限制是所涉及的勞動(dòng)量大和操作效率低。
因此，建議用搖瓶體系來(lái)培養(yǎng)供大規(guī)模生產(chǎn)體系接種用的細(xì)胞，例如用搖床和使用微載體的發(fā)酵罐。
實(shí)施例5生產(chǎn)和純化HBsAg粒子的優(yōu)選方法A如本實(shí)施例的題目所示，在以下實(shí)施例中公開的方法只是一種優(yōu)選方法。一種更優(yōu)選的方法在實(shí)施例11中給出，它是本發(fā)明的特別優(yōu)選的方法。圖4和8分別圖示說(shuō)明了這兩個(gè)方法的流程圖。
A.方法概述使用搖瓶體系生產(chǎn)HBsAg(如實(shí)施例3、4所述)。所用的培養(yǎng)基含有2-10%胎牛血清，最好是2%胎牛血清，已經(jīng)用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)(Pellicon切向流動(dòng)超濾器，Millipore公司)進(jìn)行超濾預(yù)分級(jí)，以除去高分子量污染蛋白(步驟1)。
逐日收集培養(yǎng)基并合并起來(lái)。收集到的含HBsAg粒子的培養(yǎng)基利用帶有0.22微米膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾器(Millipore)澄清，除去細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片(步驟2)。最后，澄清的粗制培養(yǎng)基用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾器(Millipore)濃縮和透析(用磷酸鹽緩沖液)(步驟3)。在Sephacryl S-400柱(2.6cm×190cm，Pharmacia)上進(jìn)行兩次連續(xù)的凝膠過(guò)濾色譜，將濃縮物進(jìn)一步純化。每次色譜之后，用帶有截止分子量為300，000的膜的Minitan切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)(Millipore)將含有HBsAg粒子的峰級(jí)分濃縮。此純化步驟總結(jié)在圖4。使用這種新方法來(lái)純化HBsAg粒子的結(jié)果在實(shí)施例6中說(shuō)明，該實(shí)施例敘述了100毫克批量的高度純化的HBsAg粒子的生產(chǎn)。
在Pellicon和Minitan切向流動(dòng)超濾步驟中使用的方法如制造商(Millipore公司)提供的手冊(cè)所述。凝膠過(guò)濾方法使用床體積為1升的Sephacryl S-400柱，該方法如制造商(Pharmacia Fine Chemicals)所述。在整個(gè)純化過(guò)程中，申請(qǐng)人只使用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為超濾、透析和凝膠過(guò)濾色譜(加樣和洗脫)的緩沖液。申請(qǐng)人使用無(wú)鈣(Ca++)和鎂(Mg++)的PBS緩沖液。
B.PBS緩沖液，無(wú)Ca++和Mg++無(wú)Ca++、Mg++的PBS緩沖液(×1)按下列方式配制8克 NaCl0.2克 KCl1.15克 Na2HPO40.2克 KH2PO4
將以上組分溶于1升水(重蒸水，無(wú)熱原)中。溶液的pH調(diào)節(jié)到7.25。
C.生產(chǎn)和純化HBsAg的新方法的詳細(xì)說(shuō)明步驟1細(xì)胞培養(yǎng)基的預(yù)分級(jí)產(chǎn)生并且向培養(yǎng)基中分泌HBsAg粒子的CHO-HB 200細(xì)胞(實(shí)施例1所述)在搖瓶培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)(實(shí)施例3和4所述)。申請(qǐng)人一般使用20個(gè)這樣的搖瓶培養(yǎng)細(xì)胞。
培養(yǎng)基以下列方式添加胎牛血清將添加有10%胎牛血清的培養(yǎng)基用于對(duì)搖瓶接種。為了逐日更換細(xì)胞培養(yǎng)基(用新鮮培養(yǎng)基替換用過(guò)一天的培養(yǎng)基)，使用添加有2-5%、最好是2%胎牛血清的培養(yǎng)基。在以上兩種情形，添加有胎牛血清的培養(yǎng)基先用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)預(yù)分級(jí)。入口與出口的表壓一般在0磅/平方英寸的范圍內(nèi)。只把濾液(添加有胎牛血清的培養(yǎng)基中分子量低于300，000的組分)加到細(xì)胞中。
為了對(duì)搖瓶接種，在每只搖瓶中倒入100毫升預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)基，其中添加有10%胎牛血清，含有至少5×106個(gè)CHO-HB 200細(xì)胞。細(xì)胞在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，直到達(dá)到匯合(在2-10天之間)。
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)，每個(gè)搖瓶中有2×108-1×109個(gè)細(xì)胞，這時(shí)開始純化這些細(xì)胞產(chǎn)生的HBsAg粒子。從細(xì)胞培養(yǎng)物中取出添加有10%胎牛血清的接種培養(yǎng)基并棄去，用預(yù)分級(jí)過(guò)的添加有2%胎牛血清的培養(yǎng)基代替。細(xì)胞在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至少6個(gè)月，逐日更換培養(yǎng)基。匯合細(xì)胞每天每升(10個(gè)搖瓶)產(chǎn)生4-5毫克HBsAg粒子。逐日從搖瓶中取出培養(yǎng)基(每天20×100毫升＝2升)，其中含有分泌出的HBsAg粒子。將收集的這些培養(yǎng)基合并，在4℃下貯存。當(dāng)逐日收集和合并的匯合培養(yǎng)基累積達(dá)到25升時(shí)(80-100毫克HBsAg，培養(yǎng)13天)，按步驟2所述開始對(duì)合并培養(yǎng)基中的HBsAg粒子分批純化。
上述的對(duì)添加有胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)分級(jí)的獨(dú)特步驟使申請(qǐng)人能用最少數(shù)目的純化步驟將HBsAg粒子純化到高純度。其原因可總結(jié)如下。
在含有分泌出的HBsAg粒子的培養(yǎng)基中，主要污染物是來(lái)源于胎牛血清的蛋白質(zhì)。胎牛血清是達(dá)到最佳培養(yǎng)條件所必需的，因此不能從培養(yǎng)基中排除。分泌出的HBsAg粒子具有高分子量，因此在純化期間污染HBsAg級(jí)分的蛋白質(zhì)應(yīng)是高分子量的蛋白質(zhì)。利用上述用截止分子量為300，000的膜進(jìn)行預(yù)分級(jí)的步驟，申請(qǐng)人除去了培養(yǎng)基中大部分高分子量蛋白質(zhì)污染物。事實(shí)上，申請(qǐng)人加到培養(yǎng)物中的只是添加了胎牛血清的培養(yǎng)基中分子量低于300，000的組分。這樣就從細(xì)胞培養(yǎng)物中排除了高分子量的蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如抗體復(fù)合物和多聚清蛋白聚集體。實(shí)際上，將在預(yù)分級(jí)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)和HBsAg生產(chǎn)特性與在相應(yīng)的未經(jīng)預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，申請(qǐng)人觀察到前一培養(yǎng)基在兩方面都優(yōu)越。因此，預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)基具有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)情況更好;在HBsAg純化中污染物含量減少。
最后，后繼的純化步驟主要要求將高分子量的HBsAg粒子與低分子量的蛋白質(zhì)污染物分離。這些污染物包括作為主要級(jí)分的來(lái)源于胎牛血清的清蛋白，它的分子量約為97，000道爾頓。
步驟2所收集的含HBsAg粒子培養(yǎng)基的澄清這實(shí)際上是HBsAg純化過(guò)程的第一步，借此將收集到的培養(yǎng)基(含HBsAg)中存在的分散全細(xì)胞和細(xì)胞碎片從培養(yǎng)基中除去。這通常稱作粗制培養(yǎng)基的澄清。申請(qǐng)人使用帶有0.22微米濾膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)來(lái)澄清含HBsAg的培養(yǎng)基。通常在此系統(tǒng)中每次過(guò)濾25升批料(80-100毫克HBsAg粒子)。入口和出口的表壓讀數(shù)保持為0磅/平方英寸。在此系統(tǒng)中可以處理更大的批量或是更多的批數(shù)，因?yàn)樗啃r(shí)能濾過(guò)數(shù)百升培養(yǎng)基。在每批過(guò)濾之后，用5-10升PBS洗滌該系統(tǒng)。因此這是一個(gè)很快的過(guò)程，可在工業(yè)上應(yīng)用。
只有全細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片(＞220納米)聚集體(例如細(xì)胞膜和膜復(fù)合物、大的細(xì)胞器)被0.22微米濾膜(220納米)阻留。只收集這一澄清超濾步驟的濾液(含有22納米HBsAg粒子)。按步驟3-5進(jìn)一步純化。濾液的體積與起始體積相同，即每批25升。采用這種超濾澄清步驟，HBsAg粒子或總的培養(yǎng)基蛋白質(zhì)均不受損失(100%回收)。
步驟3濃縮和純化澄清培養(yǎng)基中的HBsAg粒子澄清的粗制培養(yǎng)基(步驟2)的體積與它在澄清之前的體積相同，即，每批25升。為了專一純化這一培養(yǎng)基中的HBsAg粒子，先需要一個(gè)濃縮步驟。象申請(qǐng)人所用體積那樣大的批料體積不能直接用于在最后純化步驟(步驟4、5)中使用的純化用凝膠過(guò)濾柱。因此需要一個(gè)濃縮步驟，而且希望濃縮步驟還能從培養(yǎng)基的其余組分中專一純化出HBsAg粒子。這樣一個(gè)步驟是通過(guò)在帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)中將澄清的粗制培養(yǎng)基濃縮而實(shí)現(xiàn)的。利用此系統(tǒng)也使申請(qǐng)人能夠在封閉的超濾系統(tǒng)內(nèi)將被截止分子量為300，000的膜阻留的HBsAg粒子透析。
申請(qǐng)人向截止分子量為300，000的Pellicon過(guò)濾系統(tǒng)(如上)中加入25升澄清的粗制培養(yǎng)基，棄去濾液(包括分子量低于300，000的清蛋白在內(nèi)的分子)。將濾膜上的保留物(包括分子量大于300，000的HBsAg粒子在內(nèi)的分子)對(duì)10升PBS(10×1升)透析。透析后保留物的體積為660毫升，濃縮了近40倍。
然后收集600毫升濃縮物(或保留物)，在帶有截止分子量為300，000的膜的Minitan切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)中進(jìn)一步濃縮。Minitan系統(tǒng)比Pellicon系統(tǒng)更適合于小體積(最高1升)。棄去Minitan超濾的濾液，只收集保留物。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)加入660毫升Pellicon系統(tǒng)濃縮物(或保留物)時(shí)，從Minitan系統(tǒng)回收到約150毫升保留物(或濃縮物)。這意味著又濃縮了約4.5倍。因此，串聯(lián)使用Pellicon和Minitan系統(tǒng)的整個(gè)濃縮過(guò)程，使澄清的粗制培養(yǎng)基濃縮了約180倍。在每批試驗(yàn)之后，用5-10升PBS洗滌Pellicon和Minitan系統(tǒng)。
上述系統(tǒng)不僅濃縮了澄清的培養(yǎng)基，而且也專一地從培養(yǎng)基組分中純化出HBsAg粒子。在上述系統(tǒng)中用截止分子量為300，000的膜濃縮之后，只回收到全部澄清培養(yǎng)基蛋白質(zhì)的2.5%。但是，回收到培養(yǎng)基中全部HBsAg粒子的95%。這表明了從HBsAg粒子中除去來(lái)源于培養(yǎng)基的污染物的專一性純化作用(約35倍)。雖然回收了原始HBsAg粒子的95%，但它們只構(gòu)成回收到的2.5%原有總蛋白質(zhì)的一部分。也就是說(shuō)，在總計(jì)636毫克蛋白質(zhì)中有95毫克HBsAg(約15%)。因此用凝膠過(guò)濾法將以上的150毫升濃縮物(Minitan保留物)進(jìn)一步純化，以完成最終的HBsAg粒子純化步驟(步驟4、5)。
步驟4用凝膠過(guò)濾法從濃縮和澄清的培養(yǎng)基中純化HBsAg粒子為進(jìn)一步純化HBsAg粒子，申請(qǐng)人利用它們的化學(xué)-物理性質(zhì)，即它們處于在1-2×106道爾頓范圍內(nèi)的有效分子量。因此，使用Sephacryl S-400(Pharmacia)凝膠過(guò)濾柱，它排除分子量大于1×106道爾頓的分子。Sephacryl S-400是用N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)的烯丙基葡聚糖凝膠過(guò)濾柱。因此，象HBsAg粒子這樣的大分子被排阻，迅速洗脫出來(lái)。諸如清蛋白和其它蛋白質(zhì)等較小的污染分子進(jìn)入柱樹脂中，洗脫緩慢，結(jié)果使HBsAg粒子和低分子量污染物有效地分離。申請(qǐng)人使用的Sephacryl S-400柱的大小為2.6厘米×190厘米，有效柱床體積為1升。對(duì)于更大體積的濃縮物或濃縮物中更大量的蛋白質(zhì)，可以使用容量更大的Sephacryl S-400柱。
申請(qǐng)人采用的濃縮培養(yǎng)基每批體積一般約為150毫升(步驟3)，在總計(jì)約640毫克蛋白質(zhì)中含有約95毫克HBsAg粒子。作為濃縮期間透析步驟(步驟3)的結(jié)果，濃縮物是含有HBsAg粒子和污染蛋白的PBS溶液(即，在150毫升PBS中有95毫克HBsAg)。對(duì)于每批濃縮物，申請(qǐng)人只使用1個(gè)Sephacryl S-400柱，但是也可以用更多的柱子以提高純化速度。申請(qǐng)人在每次凝膠過(guò)濾時(shí)加入1/3濃縮物(大約32毫克HBsAg在50毫升PBS中)濾過(guò)柱子。這約占柱床體積的5%(體積)。將流速調(diào)節(jié)到每小時(shí)約10厘米以實(shí)現(xiàn)最佳分離，這造成約為25-30厘米水柱的低操作壓。
使用最多達(dá)1個(gè)床體積(1升)的PBS從柱中洗脫HBsAg粒子。在洗脫之后和重新使用同一柱之前，用2-3個(gè)床體積(2-3升)的PBS洗柱。
HBsAg粒子因?yàn)轶w積大而不進(jìn)入柱床樹脂，于是很快從柱中洗脫出來(lái)。緊接在外水體積之后分部回收HBsAg粒子峰。洗脫出的級(jí)分通常是每級(jí)分10毫升。HBsAg粒子總是分14-15個(gè)級(jí)分(140-150毫升)洗脫出。
從Sephacryl S-400柱中回收HBsAg粒子的速度很快，純化程度相當(dāng)高。由混在50毫升PBS中的約32毫克HBsAg回收到在140毫升流出液中的30毫克HBsAg，回收率為92%。在一個(gè)柱上通過(guò)后，HBsAg粒子純化了4-5倍，洗脫出的HBsAg峰級(jí)分中總蛋白質(zhì)中的特異組分HBsAg占60-70%(由上柱前濃縮物中總計(jì)僅15%增加到此值)。為了將HBsAg粒子進(jìn)一步純化得到純度高于95%，按步驟5中所述通過(guò)同樣的Sephacryl S-400柱進(jìn)行第二次凝膠過(guò)濾。
步驟5對(duì)第一次凝膠過(guò)濾柱的洗脫峰中的HBsAg作第二次凝膠過(guò)濾純化使用在第一次凝膠過(guò)濾操作(步驟4)中使用的同樣的Sephacryl S-400柱進(jìn)行第二次凝膠過(guò)濾操作。在第一次凝膠過(guò)濾操作后，用3-5個(gè)床體積(3-5升)的PBS洗柱，除去所有結(jié)合的分子。每批典型的濃縮和澄清的培養(yǎng)基需要通過(guò)第一個(gè)柱3-4次，每次用1/3體積的濃縮物。為進(jìn)行第二次凝膠過(guò)濾操作，將兩份第一次凝膠過(guò)濾操作的峰級(jí)分合并(每份140-150毫升)。接著，一般是先將280-300毫升合并的HBsAg粒子洗脫峰濃縮，然后加到Sephacryl S-400柱上進(jìn)行第二次凝膠過(guò)濾操作。(第三份第一次凝膠過(guò)濾HBsAg洗脫峰與下一批的洗脫峰合并，供第二次凝膠過(guò)濾操作用。因此，對(duì)于每?jī)膳琀BsAg粒子的濃縮培養(yǎng)基，第一次凝膠過(guò)濾需要6次操作，第二次凝膠過(guò)濾需要3次操作)。
為了在加入到第二個(gè)凝膠過(guò)濾柱之前將合并的洗脫峰濃縮，使用帶有截止分子量為300，000的膜的Minitan切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)(如步驟3中所述)。這將使體積從280-300毫升減少到約60毫升(濃縮5倍)。這60毫升中含有約57-60毫克HBsAg粒子，將其加到Sephacryl S-400柱中進(jìn)行第二次凝膠過(guò)濾操作。
從第二次凝膠過(guò)濾操作洗脫出(用PBS)的HBsAg粒子峰含有在140毫升PBS中的約48.5毫克HBsAg粒子。這表明HBsAg的回收率為85%。另外，這個(gè)第二次凝膠過(guò)濾峰含有95%以上(約98-99%)純的HBsAg特異蛋白。
因此，總的說(shuō)來(lái)，使用2個(gè)接續(xù)的凝膠過(guò)濾柱從濃縮和澄清的粗制培養(yǎng)基中純化HBsAg粒子，申請(qǐng)人達(dá)到了高收率(78%)和很高的純度(大于95%)。
在整個(gè)純化過(guò)程中，各個(gè)階段的HBsAg粒子回收率、收率和純度都用實(shí)施例7、8和9中所述的分析方法測(cè)定。
純化流程圖概述在圖4中，典型的HBsAg粒子批料的生產(chǎn)和純化表述在實(shí)施例6中。
在本文所述的純化方法中，可以將步驟1-5擴(kuò)大規(guī)模進(jìn)行用于疫苗的HBsAg粒子的工業(yè)化生產(chǎn)。這由以下步驟完成(1)在更大數(shù)目的搖瓶或帶有微載體接合體的發(fā)酵罐中培養(yǎng)培養(yǎng)物;
(2)用與工業(yè)規(guī)模體積相適應(yīng)的Pellicon和Minitan系統(tǒng)(Millipore公司)或與其相當(dāng)?shù)南到y(tǒng)進(jìn)行超濾;
(3)用更大床體積的Sephacryl S-400柱或串聯(lián)在一起的大量所述柱(步驟4、5)進(jìn)行凝膠過(guò)濾純化。
最后，申請(qǐng)人的生產(chǎn)和純化方法的一些新特征可以總結(jié)如下培養(yǎng)基的預(yù)分級(jí)除去了令人討厭的高分子量蛋白質(zhì)污染物，這使申請(qǐng)人能以大大簡(jiǎn)化的方式純化HBsAg粒子。純化前的濃縮步驟是高度有效的，并且完成了很大程度的預(yù)純化。這些純化步驟在一個(gè)可重復(fù)使用的系統(tǒng)中很快完成。
包括澄清、濃縮和純化步驟(步驟2-5)的所有部件可以機(jī)械地(用管道)連在一起，形成一個(gè)密閉系統(tǒng)。因?yàn)樗胁考伎梢詼缇?，所以申?qǐng)人的純化方法是在一個(gè)封閉系統(tǒng)內(nèi)自始至終于無(wú)菌條件下進(jìn)行。
因此，申請(qǐng)人能以很高的效率和很低的成本生產(chǎn)大量高度純化的由重組DNA生成的HBsAg粒子。
實(shí)施例6生產(chǎn)和純化100毫克HBsAg-第一批下述生產(chǎn)和純化HBsAg粒子的方法，在實(shí)施例5中有更詳細(xì)的說(shuō)明。
使用20只搖瓶來(lái)生產(chǎn)HBsAg。使用的培養(yǎng)基含有添加了胎牛血清的培養(yǎng)基的濾液，該培養(yǎng)基已用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon超濾系統(tǒng)預(yù)分級(jí)。
表1總結(jié)了由第一批料得到的結(jié)果。
＊HBsAg在粗制培養(yǎng)基中的濃度為4.0毫克/升。粗制培養(yǎng)基是指逐日收集和合并的細(xì)胞培養(yǎng)基，直到累積了25升，此時(shí)進(jìn)行純化。用帶0.22微米膜的Pellicon超濾系統(tǒng)澄清該培養(yǎng)基-澄清的粗制培養(yǎng)基。
＊＊澄清的粗制培養(yǎng)基在帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)上濃縮并對(duì)10升PBS(10×1升)透析。濾膜上的保留物(660毫升)用Minitan系統(tǒng)(截止分子量為300，000的膜)進(jìn)一步濃縮成148毫升最終濃縮物。注意HBsAg粒子的專一性純化是通過(guò)濃縮步驟完成的。
＊＊＊第二批100毫克按同樣方式濃縮，得到的結(jié)果相似。
將濃縮物在Sephacryl S-400柱(2.6×190厘米)上用凝膠過(guò)濾法進(jìn)一步純化。在柱上加入32.5毫克HBsAg(1/3體積的濃縮物)。在140毫升流出液中回收到30.0毫克HBsAg(回收率為92%)。將兩個(gè)柱的流出液合并，用Minitan系統(tǒng)(截止分子量為300，000的膜)濃縮到58毫升，在同樣的Sephacryl S-400柱上進(jìn)行第二次同樣的凝膠過(guò)濾操作。由加在第二個(gè)柱上的57毫克HBsAg回收到48.5毫克(回收率為85%)。HBsAg粒子在第一個(gè)柱上純化了3-4倍(從總蛋白質(zhì)的15%增加到約60%)，在第二個(gè)柱上又純化了1.5倍(從總蛋白質(zhì)的約60%增加到高于95%)。
用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，15%凝膠)對(duì)純化過(guò)的HBsAg粒子進(jìn)行分析。按實(shí)施例7中所述，用家兔抗體，采用銀染色和Western印跡法使HBsAg特異蛋白質(zhì)條帶顯色。
實(shí)施例7純化的HBsAg粒子的分析A.用SDS-PAGE(15%凝膠)和凝膠銀染色法，對(duì)純化過(guò)程中每一步驟(見(jiàn)實(shí)施例5和6)之后的HBsAg粒子的純度進(jìn)行分析。凝膠顯示出在第二個(gè)凝膠過(guò)濾步驟之后(實(shí)施例5和6)得到的HBsAg粒子的純度約為98-99%。
用SDS-PAGE和銀染色法對(duì)以下樣品進(jìn)行比較澄清的粗制培養(yǎng)基;粗制澄清培養(yǎng)基的濃縮物;第一次Sephacryl S-400凝膠過(guò)濾的濃縮流出液;第二次Sephacryl S-400凝膠過(guò)濾的濃縮流出液;經(jīng)過(guò)蔗糖梯度分離的培養(yǎng)基濃縮物的峰級(jí)分(見(jiàn)實(shí)施例11)。每個(gè)樣品在凝膠上的加樣量為用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的相同數(shù)量的蛋白質(zhì)。在粗制培養(yǎng)基中，主要條帶對(duì)應(yīng)于污染物蛋白質(zhì)(清蛋白)，HBsAg特異蛋白質(zhì)條帶只是次要條帶。在濃縮的粗制培養(yǎng)基中，HBsAg特異蛋白質(zhì)條帶加強(qiáng)(總量的15%)，污染物條帶明顯減弱。在第一個(gè)Sephacryl S-400柱之后，HBsAg特異條帶占蛋白質(zhì)條帶的約60%，在此階段污染物條帶是次要條帶。在第二個(gè)Sephacryl S-400柱之后，所有的HBsAg特異條帶均清晰可見(jiàn)24K、27K、33K、36K、39K和42K。它們占全部蛋白質(zhì)條帶的95%以上。主要的HBsAg特異條帶是24K、27K、33K和36K，39K和42K是次要但是很顯著的條帶。經(jīng)過(guò)蔗糖梯度分離的樣品與第一個(gè)Sephacryl S-400柱的流出液有很相似的圖譜，說(shuō)明蔗糖梯度分離只使HBsAg達(dá)到60%的純度。
B.用Western印跡法對(duì)純化過(guò)程中每一步之后(實(shí)施例5和6)的純化HBsAg粒子作進(jìn)一步的分析，使用針對(duì)來(lái)源于血漿的HBsAg粒子而制備的家兔抗體。印跡顯示了具有以下分子量的對(duì)HBsAg粒子特異的六種主要蛋白質(zhì)條帶的存在24K、27K、33K、36K、39K和42K。
使用HBsAg粒子特異性抗體的Western印跡法能對(duì)HBsAg粒子條帶進(jìn)行特異性鑒定。每個(gè)樣品都用相同數(shù)量的蛋白質(zhì)。所用的抗體也具有抗清蛋白特異性。這可以用來(lái)測(cè)定主要蛋白質(zhì)污染物清蛋白在整個(gè)純化過(guò)程中的特異性減少。
粗制的培養(yǎng)基樣品只清楚地顯示清蛋白條帶，HBsAg粒子特異性條帶低于此方法的檢測(cè)水平。對(duì)于蛋白質(zhì)條帶的抗體特異性檢測(cè)，每個(gè)條帶的蛋白質(zhì)含量及其在測(cè)定條件下的抗原性決定了檢測(cè)水平。申請(qǐng)人斷定，粗制培養(yǎng)基含有很少量的HBsAg粒子特異性條帶(如同在A中用銀染色法所觀察到的，該方法的檢測(cè)水平約為50納克/條帶)，而且這些條帶在我們的測(cè)定條件下不具有高抗原性。濃縮培養(yǎng)基樣品的清蛋白含量減少，HBsAg特異性條帶24K和33K是主要條帶，27K和36K是次要條帶。在第一個(gè)Sephacryl S-400柱流出液中，清蛋白只是次要條帶，HBsAg特異性條帶24K和33K是主要條帶，27K、26K、39K和42K是次要條帶。蔗糖梯度分離樣品的圖譜與第一個(gè)Sephacryl S-400柱流出液很相似。第二個(gè)Sephacryl S-400柱流出液幾乎完全沒(méi)有可見(jiàn)的清蛋白條帶，HBsAg特異性條帶24K、27K、33K是主要條帶，36K、39K和42K是次要但明顯的條帶。因此，在這一樣品中條帶幾乎完全是HBsAg粒子特異性的，表明其純度很高。所以這證實(shí)了在上述A部分中用凝膠銀染色法觀察到的結(jié)果。
對(duì)Western印跡條帶強(qiáng)度的進(jìn)一步鑒定(尤其是對(duì)和第一及第二Sephacryl S-400柱流出液相應(yīng)的樣品)，表明了用申請(qǐng)人的方法生產(chǎn)和純化的HBsAg粒子的化學(xué)計(jì)量即，24K、27K和33K是主要條帶，36K、39K和42K是次要條帶。
這些發(fā)現(xiàn)與Heermann等人的數(shù)據(jù)(J.Virol.1984年52卷396-402頁(yè))完全一致，他們描述了在來(lái)源于血漿的HBV粒子和只含有HBsAg的大絲狀體中有以下蛋白質(zhì)(他們提到的較小的20 nm HBsAg粒子不含39K和42K)。
24K-未糖基化 (S)27K-糖基化 (S)33K-單糖基化 (前-S2)36K-雙糖基化 (前-S2)39K-未糖基化 (前-S1)42K-糖基化 (前-S1)應(yīng)當(dāng)指出，在申請(qǐng)人對(duì)銀染色凝膠和用家兔抗體得到的Western印跡進(jìn)行的比較中，觀察到HBsAg粒子的前-S2區(qū)33K蛋白的免疫原性增加。在銀染色凝膠上，與24K和27K主要條帶相比，33K條帶是次要條帶。在Western免疫印跡上，與24K和27K主要條帶相比，33K條帶是主要條帶。這與前-S2區(qū)決定簇免疫原性增加的發(fā)現(xiàn)是一致的，上述發(fā)現(xiàn)曾在“發(fā)明背景”部分討論過(guò)，例如見(jiàn)Milich等，J.Immunol.1986年137卷315-322頁(yè)。
C.利用Western印跡法，用抗前-S1區(qū)的特異性單克隆抗體進(jìn)一步證實(shí)了前-S1蛋白(39K、42K)的存在。印跡顯示出比糖基化形式42K的量至少高兩部的未糖基化前-S1 39K。(這表明單克隆抗體等同地與糖基化和未糖基化的蛋白反應(yīng)。)D.進(jìn)一步鑒定純化過(guò)的HBsAg中來(lái)源于胎牛血清和CHO細(xì)胞的污染物的存在。利用Western印跡法，用兩種分別抗胎牛血清和CHO細(xì)胞蛋白的家兔抗體，有可能證實(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照相比，純化過(guò)的HBsAg中的污染物含量在兩種情形下均低于檢測(cè)水平。這里所說(shuō)的檢測(cè)水平是指每個(gè)條帶的蛋白質(zhì)數(shù)量和它在測(cè)定條件下的抗原性。
實(shí)施例8A.用申請(qǐng)人的新生產(chǎn)和純化方法(在實(shí)施例5和6中說(shuō)明)生產(chǎn)的HBsAg粒子的固相放射免疫測(cè)定使用用于檢測(cè)HBsAg的固相放射免疫測(cè)定試劑盒(Travenol)進(jìn)行HBsAg粒子免疫原性測(cè)定。申請(qǐng)人測(cè)定的HBsAg粒子是濃縮的第二次凝膠過(guò)濾流出液中的粒子(實(shí)施例5步驟5，或圖4步驟5)。該試劑盒用已知標(biāo)準(zhǔn)物(Abbott)校正。將申請(qǐng)人的由重組DNA生產(chǎn)的HBsAg(CHO)的校準(zhǔn)曲線與Abbott校準(zhǔn)曲線相比較。與Abbott標(biāo)準(zhǔn)物相比，申請(qǐng)人的HBsAg(CHO)與Travenol試劑盒的黑猩猩抗體的親合性似乎更高(圖6A)。
B.用申請(qǐng)人的新的生產(chǎn)和純化方法(實(shí)施例5)在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的重組HBsAg疫苗的校準(zhǔn)曲線申請(qǐng)人利用在下面實(shí)施例9中說(shuō)明的方法，將高度純化的HBsAg粒子(實(shí)施例5步驟5中得到的濃縮HBsAg粒子)與明礬佐劑相結(jié)合，制得HBsAg疫苗。
將申請(qǐng)人的HBsAg疫苗與來(lái)源于血漿的HBsAg疫苗-Heptavax B和酵母重組疫苗-Recombivax HB的校準(zhǔn)曲線相比較。結(jié)果再次表明，與市售的疫苗(Heptavax、Recombivax)相比，申請(qǐng)人的疫苗(CHO)對(duì)Travenol試劑盒的黑猩猩抗體的親合性最高?？磥?lái)重組酵母疫苗Recombivax HB在測(cè)定中不反應(yīng)，這大概是由于對(duì)Travenol RIA試劑盒的抗體的親合性很低。
實(shí)施例9在小動(dòng)物(小鼠)體內(nèi)的血清轉(zhuǎn)化A.利用小鼠體內(nèi)的血清轉(zhuǎn)化測(cè)定HBsAg的效力將CHO-HB 200細(xì)胞產(chǎn)生的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(實(shí)施例3和4)高度純化(約98%，實(shí)施例5和6)。用檢測(cè)HBsAg的固相放射免疫測(cè)定試劑盒(Travenol)和蛋白質(zhì)測(cè)定法(實(shí)施例7和8)測(cè)定HBsAg濃度。HBsAg用明礬佐劑復(fù)合，構(gòu)成重組HBsAg疫苗。明礬佐劑是用過(guò)量的1M磷酸氫二鈉(Na2HPO4，約1毫升)滴定1.5毫升10%明礬(硫酸鋁鉀·18H2O)溶液而制得的。將所形成的懸浮液用水稀釋10倍，離心。將明礬沉降物再懸浮于10毫升PBS中，形成約2.5毫克/毫升的Al(OH)3溶液。在1毫升該溶液中加入50微克申請(qǐng)人的重組CHO HBsAg，用PBS將體積調(diào)節(jié)到5毫升。
將申請(qǐng)人的重組疫苗(CHO)與來(lái)源于血漿的疫苗-Heptavax(Merck，Sharp和Dohme)和酵母重組疫苗-Recombivax HB(Merck，Sharp和Dohme)相比較。
用1毫升疫苗樣品對(duì)Balb/c小鼠作腹膜內(nèi)注射，每份疫苗樣品含有以下數(shù)量的HBsAg0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.4微克(每組10只小鼠)。注射30天后抽小鼠血，用Ausab EIA試劑盒(Abbott)試驗(yàn)血清中抗HBsAg抗體的存在，并且與參考血清(WHO)對(duì)照進(jìn)行校準(zhǔn)，參考血清得自荷蘭中央血庫(kù)。
結(jié)果總結(jié)在圖7?？梢酝茢?，申請(qǐng)人的重組(CHO)疫苗比市售的兩種疫苗的效力至少高10倍。
利用申請(qǐng)人的重組(CHO)疫苗制品以更大規(guī)模重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，該疫苗是用詳述在實(shí)施例11中的特別優(yōu)選的方法制備的。得到的結(jié)果與上述結(jié)果相似。
B.鑒定在血清轉(zhuǎn)化測(cè)定(如上面A部分所述)中誘發(fā)的抗體的質(zhì)量在小鼠血清轉(zhuǎn)化測(cè)定中誘發(fā)出三類抗體(a)抗Heptavax B(血漿)的抗體(b)抗Recombivax HB(酵母)的抗體(c)抗申請(qǐng)人疫苗(CHO)的抗體。
以相同的效價(jià)分析這三類抗體的質(zhì)量和特異性。申請(qǐng)人的高度純化的HBsAg(CHO)粒子(實(shí)施例5步驟5)在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳分級(jí)，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。利用Western印跡法，使濾膜與三類抗體接觸。
抗Heptavax B(血漿)和Recombivax HB(酵母)的小鼠抗體只識(shí)別HBsAg粒子中存在的S蛋白(24K)，而抗申請(qǐng)人疫苗(CHO)的小鼠抗體識(shí)別S和前-S2(24K、33K)兩種蛋白。
這些發(fā)現(xiàn)再次證實(shí)，與商品疫苗相比，這種疫苗誘發(fā)出更高效價(jià)的抗體。另外，申請(qǐng)人疫苗誘發(fā)出的抗體的質(zhì)量和特異性不同，因?yàn)樗鼈兂薙(24K)蛋白質(zhì)之外還識(shí)別前-S2(33K)蛋白質(zhì)，后者被認(rèn)為對(duì)病毒的傳染力有重要作用。
C.用無(wú)反應(yīng)小鼠作的實(shí)驗(yàn)用同類系B10S品系小鼠(得自Harlan Olac公司，Bicester，英國(guó))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，已知這些小鼠對(duì)S蛋白無(wú)反應(yīng)，即，對(duì)不含前-S蛋白的任何HBsAg疫苗都無(wú)反應(yīng)(Milich等，Science，1985年228卷1195-1198頁(yè))。將這些小鼠分成兩組，每組26只。一組小鼠用1微克來(lái)源于酵母的Recombivax HB疫苗(在發(fā)明背景中說(shuō)明)腹膜內(nèi)注射，該疫苗沒(méi)有前-S1或前-S2決定簇;另一組小鼠用1微克按實(shí)施例11所述生產(chǎn)的申請(qǐng)人的HBsAg疫苗腹膜內(nèi)注射(這約為小鼠正常劑量的50倍)。在初次免疫三十天之后，將每組小鼠的一半抽血，如下所述測(cè)定血清中的抗體效價(jià)。剩下的小鼠再次免疫(加強(qiáng)免疫)，第二次免疫兩周之后抽血，如下所述測(cè)定血清中的抗體效價(jià)。
用測(cè)定HBsAg抗體的市售試劑盒Ausab RIA(Abbott)分析血清;這種測(cè)定能檢測(cè)和定量測(cè)定抗S抗體。示于圖10的結(jié)果表明，在初次免疫之后，兩組小鼠中的抗體效價(jià)只略有提高。但是，在第二次免疫之后，申請(qǐng)人的疫苗誘發(fā)的抗體效價(jià)幾乎比Recombivax高10倍;這在統(tǒng)計(jì)上有顯著性差異(p＜0.001)。這些結(jié)果表明，申請(qǐng)人的疫苗克服了現(xiàn)有疫苗存在的無(wú)反應(yīng)問(wèn)題。
D.進(jìn)一步鑒定在血清轉(zhuǎn)化測(cè)定中誘發(fā)的抗體的質(zhì)量在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，在用來(lái)源于酵母的Recombivax HB和申請(qǐng)人的HBsAg疫苗作第二次免疫之后收集上述無(wú)反應(yīng)小鼠的血清，用固相酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)測(cè)定抗前-S1抗體的存在。在這種測(cè)定中，將相應(yīng)于HBsAg前-S1區(qū)的合成二十一肽涂在96孔聚苯乙烯微量滴定板上(Nunc公司，Covalink板，產(chǎn)品編號(hào)478042)，每孔0.5微克。然后用不同的血清，包括作為陰性對(duì)照的正常小鼠血清，按1∶5稀釋后鋪到各小孔上，每種血清作兩個(gè)平行試驗(yàn)。接著用作為第二抗體的生物素化抗小鼠親合性純化IgG和ExtrAridin過(guò)氧化物酶(Bio-Makor染色試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)7801-1)連續(xù)保溫。示于下面表Ⅲ中的結(jié)果表明，在用申請(qǐng)人的HBsAg疫苗免疫的無(wú)反應(yīng)小鼠的血清中有抗前-S1抗體存在，相比之下，在用來(lái)源于酵母的Recombivax接種的小鼠血清中不存在這種抗體。
表Ⅲ無(wú)反應(yīng)小鼠體內(nèi)抗前-S1抗體的固相ELISA結(jié)果光密度(405納米)血清來(lái)源 實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)2接種申請(qǐng)人疫苗后 0.797;0.811 0.608;0.575接種Recombivax后 0.422;0.399 0.363;0.352正常小鼠血清 0.397;0.399 0.389;0.386這些結(jié)果表明，申請(qǐng)人疫苗誘發(fā)產(chǎn)生抗前-S1抗體，而來(lái)源于酵母的疫苗不誘發(fā)產(chǎn)生這種抗體。在實(shí)施例12的最后將討論這些發(fā)現(xiàn)的新穎性和意義。
實(shí)施例10純化由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物分泌的HBsAg粒子的替代方法如圖4所說(shuō)明的，“HBsAg粒子的純化示意圖”由5個(gè)關(guān)鍵步驟組成。每一步都可以采用不同于實(shí)施例5中詳述方法的替代方法。
另外，可以將這些替代方法進(jìn)行各種組合用于生產(chǎn)純化的HBsAg粒子。
這些替代方法與申請(qǐng)人的優(yōu)選純化方法(在實(shí)施例5和圖4中說(shuō)明)的對(duì)比總結(jié)在本實(shí)施例末尾的表Ⅱ中。
下面是對(duì)純化示意圖中每一步驟的可能替代方法的詳細(xì)說(shuō)明。
A.步驟1(培養(yǎng)基的預(yù)分級(jí))的替代方法產(chǎn)生HBsAg粒子的CHO細(xì)胞(在實(shí)施例3和4中說(shuō)明)可以換一種方式在以下培養(yǎng)基中培養(yǎng)1)實(shí)施例3(a)中所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中含有2-10%胎牛血清，最好是含2%胎牛血清，該生長(zhǎng)介質(zhì)不經(jīng)預(yù)分級(jí)(實(shí)施例5中所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基預(yù)分級(jí))。
但是，這種替代方法造成了進(jìn)一步純化的問(wèn)題。
當(dāng)培養(yǎng)基未經(jīng)預(yù)分級(jí)時(shí)，在后繼的純化步驟中污染蛋白的含量很高，最終收率減少，最終產(chǎn)物的純度降低。在以下步驟中敘述的替代性純化步驟包括使用聚乙二醇分級(jí);親合色譜(Affigel Blue，Blue-Sepharose，Phenyl-Sepharose);離子交換色譜(Heparin-Sepharose，DEAE-Sephacel);凝膠過(guò)濾(Sephacryl S-400)。這些步驟都與不把培養(yǎng)基預(yù)分級(jí)的第一步結(jié)合使用。只是凝膠過(guò)濾(Sephacryl S-400)替代方法是對(duì)預(yù)分級(jí)培養(yǎng)基產(chǎn)生的HBsAg粒子進(jìn)行的(實(shí)施例5，優(yōu)選方法A)。
2)實(shí)施例3和5所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中含有2-10%、最好是2%的胎牛血清，它用Pellicon超濾系統(tǒng)預(yù)分級(jí)(實(shí)施例5)，但所述預(yù)分級(jí)中使用截止分子量為10000或100000的膜代替截止分子量為300，000的膜。
但是這一替代方法造成了細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)的問(wèn)題。
當(dāng)在培養(yǎng)基的Pellicon超濾預(yù)分級(jí)中使用截止分子量為10，000或100，000的膜時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制，造成HBsAg的收率較低。
因此，申請(qǐng)人的步驟1的優(yōu)選方法是圖4和實(shí)施例5中所述的方法。
B.步驟2(含HBsAg粒子培養(yǎng)基的澄清)的替代方法產(chǎn)生分泌到培養(yǎng)基中的HBsAg粒子的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基可以用可能的替代步驟澄清1)用Sorvall離心機(jī)(RC-3B型，擺桶型轉(zhuǎn)子)在1升的料管中將收集的培養(yǎng)基在4000轉(zhuǎn)/分下離心15-20分鐘。然后將上清液(澄清除去細(xì)胞和部分細(xì)胞碎片)按圖4說(shuō)明的純化方法的步驟3-5進(jìn)行后繼的加工處理。
但是，用這些替代方法產(chǎn)生了以下問(wèn)題。
將收集的培養(yǎng)基離心只除去了培養(yǎng)基中的全細(xì)胞，其它的主要污染物(例如細(xì)胞膜和類脂復(fù)合物)仍留在上清液中。這干擾了后續(xù)的凝膠過(guò)濾純化步驟(步驟4、5)，導(dǎo)致HBsAg粒子的總收率減小和HBsAg粒子純度下降。另外，離心步驟是耗時(shí)過(guò)程，對(duì)于大體積不能有效地使用(每個(gè)離心機(jī)每小時(shí)只能處理12升左右)。
2)用通常供滅菌用的0.22微米過(guò)濾系統(tǒng)(Millipore)過(guò)濾。(這與用0.22微米膜的Pellicon系統(tǒng)進(jìn)行切向流動(dòng)超濾不同-實(shí)施例5)。
但是，用這種替代方法產(chǎn)生以下問(wèn)題。
用0.22微米膜滅菌系統(tǒng)(與帶有截止孔徑為0.22微米的膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)不同)過(guò)濾，能有效地澄清培養(yǎng)基，除去全細(xì)胞、細(xì)胞膜和類脂復(fù)合物，但是有下列缺點(diǎn)該系統(tǒng)不能處理大體積，因?yàn)檫@種0.22微米滅菌型膜很快就會(huì)堵塞，需要頻繁更換。這會(huì)使產(chǎn)物收率受損失，而且也耗時(shí)。
因此，申請(qǐng)人的優(yōu)選系統(tǒng)是在圖4和實(shí)施例5的步驟2中敘述的系統(tǒng)。在該步驟中申請(qǐng)人使用帶有截止孔徑為0.22微米的膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)。這是一種工業(yè)規(guī)模的系統(tǒng)，能夠處理大體積的培養(yǎng)基，而且培養(yǎng)基的處理很迅速(每小時(shí)數(shù)百升)。該系統(tǒng)較不易堵塞，HBsAg粒子的回收率為100%。
C.步驟3(澄清培養(yǎng)基的濃縮步驟)的替代方法1)使用10%聚乙二醇(PEG 6000，Sigma公司)進(jìn)行聚乙二醇分級(jí)，以便使包括HBsAg粒子在內(nèi)的高分子量蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀。將溶在PBS中的濃縮形式的PEG(25-30%)加到澄清的培養(yǎng)基中(步驟2)，使PEG的最終濃度為10%W/V?？梢杂秒x心法(在Sorvall RC-38離心機(jī)中，固定角度轉(zhuǎn)子，50毫升離心管，在6000-7000轉(zhuǎn)/分下20分鐘)或用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon切向流動(dòng)超濾系統(tǒng)過(guò)濾收集PEG沉淀物(如圖4步驟3和實(shí)施例5所述)。將溶液充分混合并且在4℃下放置至少30分鐘。注意這一PEG分級(jí)步驟只是對(duì)未經(jīng)步驟1預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的HBsAg粒子進(jìn)行的。
用這種替代濃縮方法得到以下結(jié)果。
澄清的培養(yǎng)基用10%PEG分級(jí)的作法，僅使用小體積的澄清培養(yǎng)基時(shí)(最多1升)才有效。另外，更重要的是，PEG分級(jí)只回收到75%的HBsAg粒子。10%PEG分級(jí)造成了總蛋白質(zhì)損失約80%(包括全部HBsAg粒子的25%)，而HBsAg粒子的純度在用10%PEG分級(jí)后僅為0.5-1%。最后，在PEG分級(jí)后，必須將含有HBsAg的沉淀物重新懸浮在PBS中并透析，以除去PEG。此步驟之后必須接著另一個(gè)濃縮步驟，然后才能進(jìn)行最后的純化步驟(步驟4、5)。因此，PEG分級(jí)是耗時(shí)的，造成了HBsAg粒子的明顯損失，它至多是一個(gè)需要后繼濃縮步驟的預(yù)濃縮步驟，而且總的來(lái)說(shuō)，可以認(rèn)為是一種昂貴的步驟。注意在下面的某些步驟中PEG濃縮與其它替代方法結(jié)合進(jìn)行(即，與離子交換色譜、親合色譜及凝膠過(guò)濾一起進(jìn)行)。
2)使用截止分子量為10，000、100，000或300，000的膜進(jìn)行切向流動(dòng)超濾(Millipore公司制造的Minitan和Pellicon系統(tǒng))。這些使用Minitan或Pellicon系統(tǒng)的方法能在超濾過(guò)程中對(duì)保留物(未透過(guò)膜的物質(zhì))進(jìn)行透析。此系統(tǒng)的典型應(yīng)用如下a)帶有截止分子量為10，000的膜的Minitan系統(tǒng)6.4升澄清培養(yǎng)基(步驟2)超濾，用2升磷酸鹽緩沖液(PBS，4×500毫升)透析。這樣得到260毫升最終濃縮物(濃縮約25倍)。
b)帶有截止分子量為100，000的膜的Pellicon系統(tǒng)34升澄清培養(yǎng)基(步驟2)超濾，用8升PBS(8×1升PBS)透析。這樣得到660毫升最終濃縮物(濃縮約50倍)。
c)帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)34升澄清培養(yǎng)基(步驟2)超濾，用10升PBS(10×1升PBS)透析。這樣得到500毫升最終濃縮物(濃縮約70倍)。
用替代的濃縮方法得到以下結(jié)果a)帶有截止分子量為10，000的膜的Minitan系統(tǒng)超濾和透析很慢。因此該系統(tǒng)不能用于HBsAg粒子的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。雖然HBsAg粒子的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。雖然HBsAg粒子的回收率很高(高于96%)，但是總蛋白質(zhì)回收率也很高(高于95%)。因此，此系統(tǒng)在將起始物濃縮而不損失產(chǎn)物方面很有效，但是不能純化起始物中的HBsAg粒子，HBsAg粒子與總蛋白質(zhì)之比保持不變(HBsAg粒子的純度只有約0.4%)。
當(dāng)澄清培養(yǎng)基的體積增加時(shí)，留在膜上的蛋白質(zhì)的數(shù)量增加到使流速顯著減小的程度。
b)用帶有截止分子量為100，000的膜的Pellicon系統(tǒng)超濾和透析比上述(a)中用帶有截止分子量為10，000的膜的Minitan系統(tǒng)更有效?？梢蕴幚磔^大的體積，而且流速較快。阻留在膜上的蛋白質(zhì)較少，因此當(dāng)處理含有大量蛋白質(zhì)的大體積培養(yǎng)基時(shí)，流速不受嚴(yán)重限制。
但是，雖然對(duì)培養(yǎng)基的濃縮很有效，但該系統(tǒng)不能專一地純化HBsAg粒子HBsAg粒子的回收率為100%，而總蛋白質(zhì)回收率在95%以上。因此，HBsAg粒子與總蛋白質(zhì)的比例保持與起始物中相同(HBsAg粒子的純度僅為約0.4%)。
c)用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)超濾和透析是優(yōu)選的方法，比上述兩種方法(a、b)都更有效。該系統(tǒng)同時(shí)實(shí)現(xiàn)了HBsAg粒子的濃縮和專一性純化HBsAg粒子回收98%，而原始總蛋白質(zhì)僅回收10%。這使HBsAg與總蛋白質(zhì)之比增加了9倍(HBsAg粒子的純度為3-4%)。
d)為了在這一濃縮步驟實(shí)現(xiàn)HBsAg的進(jìn)一步純化，在用上述的帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)超濾和透析之后，申請(qǐng)人增加了另一個(gè)任選的替代步驟。這一附加步驟是用10%PEG進(jìn)行PEG分級(jí)(此法如本節(jié)的第一部分所述，但區(qū)別是在超濾之后使用PEG而不是用它代替過(guò)濾)。
但是這造成了HBsAg粒子的回收率減少28%(由98%降至70%)，雖然總蛋白質(zhì)由10%減少到了2.5%的理想水平。(HBsAg粒子的純度約為7-10%)。在超濾之后進(jìn)行PEG分級(jí)這一替代步驟不打算用于前面a和b中敘述的替代系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈兊目偟鞍踪|(zhì)含量在超濾后很高(超過(guò)98%)。
總的看來(lái)，濃縮步驟是純化過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵步驟。為了使最后的凝膠過(guò)濾純化(實(shí)施例5，圖4)能夠進(jìn)行，必須先將澄清培養(yǎng)基濃縮。注意上述的所有替代濃縮方法都是用于在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)未經(jīng)預(yù)分級(jí)的澄清粗制培養(yǎng)基。使用所述系統(tǒng)對(duì)所述培養(yǎng)基預(yù)分級(jí)的方法(圖4和實(shí)施例5，步驟1)是作為一個(gè)獨(dú)特的步驟而建立的，用來(lái)克服在濃縮步驟(步驟3)和最后的純化步驟(步驟4、5)中遇到的問(wèn)題。所述預(yù)分級(jí)除去了分子量約為300，000的培養(yǎng)基污染物(在細(xì)胞培養(yǎng)之前)。
申請(qǐng)人的優(yōu)選濃縮方法(實(shí)施例5、圖4)使用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)，當(dāng)將此方法用于原來(lái)預(yù)分級(jí)過(guò)的澄清粗制培養(yǎng)基時(shí)，得到以下結(jié)果由25升培養(yǎng)基得到148毫升濃縮物(在超濾濃縮期間用PBS透析時(shí)使用10升PBS)。這就濃縮了170倍，HBsAg的回收率約為96%，而總蛋白質(zhì)回收率只有2.5%，達(dá)到了理想的水平。(在這一階段HBsAg粒子的純度約為15%-也見(jiàn)表Ⅰ。)這比上述的所有替代步驟(1、2a、2b、2c、2d)都優(yōu)越得多。因此，申請(qǐng)人的優(yōu)選方法在一個(gè)步驟中同時(shí)實(shí)現(xiàn)將HBsAg濃縮和純化到高水平，而HBsAg粒子沒(méi)有重大損失。
D.步驟4和5(凝膠過(guò)濾純化)的替代方法1)使用疏水柱的親合色譜使用三種親合柱Blue-Sepharose(Pharmacia)、Affigel Blue(Biorad)、Phenyl-Sepharose(Pharmacia)。(按照Pharmacia和Biorad公司提供的說(shuō)明書使用這些柱。)Affigel Blue和Blue-Sepharose柱用于以下純化方法(與申請(qǐng)人優(yōu)選方法的各種替代步驟相結(jié)合)。
HBsAg粒子由培養(yǎng)基未經(jīng)預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)物生成，培養(yǎng)物用10%PEG濃縮(見(jiàn)前面的C1，濃縮步驟的替代方法)。將PEG沉淀物溶于最小體積的PBS中(每毫升PBS 250微克蛋白質(zhì))，加在Affigel Blue或Blue-Sepharose柱上。申請(qǐng)人使用35毫升的裝填柱，每柱加5毫升HBsAg/PBS溶液(每柱1.25毫克HBsAg粒子)。用2倍體積(70毫升)的PBS洗柱，先用硫氰化鈉(NaSCN)緩沖液、接著用40%的PEG/PBS溶液洗脫。洗脫時(shí)先用1體積(35毫升)0.1M NaSCN緩沖液洗第一次，接著用0.25M NaSCN(35毫升)洗第二次。這樣有效地除去了諸如清蛋白等蛋白質(zhì)，但未從柱中除去HBsAg。HBsAg粒子用含1M NaCl 的40%PEG/PBS溶液從柱中洗脫。用這種方法只回收到10-20%的HBsAg粒子，Affigel Blue與Blue-Sepharose柱之間沒(méi)有明顯差別。HBsAg的純度低(5%-7%),因?yàn)樗c清蛋白一起洗脫。Phenyl-Sepharose柱(2.7毫升床體積的微型柱)用于以下純化方法HBsAg粒子得自培養(yǎng)基未經(jīng)預(yù)分級(jí)的細(xì)胞培養(yǎng)物，在帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)上進(jìn)行濃縮并對(duì)PBS透析。然后用10%PEG/PBS進(jìn)一步濃縮，將PEG沉淀物溶于最小體積的PBS中(最終體積1.8毫升，約0.5毫克HBsAg粒子)。然后將它加到柱上，用19毫升PBS(7倍體積)洗。用13.5毫升水(5倍體積)洗脫。只洗脫出22%的HBsAg，它的純度低(7%)，因?yàn)榍宓鞍缀虷BsAg級(jí)分一起洗脫。
因此這些方法不如申請(qǐng)人的優(yōu)選方法(實(shí)施例5、圖4)。
2)離子交換色譜使用兩種離子交換柱Heparin-Sepharose 3毫升床體積柱(Pharmacia)和DEAE-Sephacel 2.5毫升床體積柱(Pharmacia)(根據(jù)制造商Pharmacia公司提供的說(shuō)明書使用這些柱)。
對(duì)于這兩種柱，所加入的HBsAg粒子樣品均按以下方式制備HBsAg粒子得自培養(yǎng)基未經(jīng)預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)物。將收集的培養(yǎng)基在帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)上濃縮和透析，再用10%PEG/PBS進(jìn)一步濃縮。將PEG濃縮物(HBsAg樣品)溶于稀PBS(0.3×PBS)中，按以下方式加到柱上將6毫升HBsAg樣品(約1.5毫克)加到Heparin-Sepharose柱上。11毫升(約2.75毫克)加到DEAE-Sephacel柱上。HBsAg粒子從柱中洗脫如下用4體積(12毫升)的0.3×PBS洗Heparin-Sepharose柱，用0.3×PBS和2×PBS之間的PBS梯度溶液(30毫升，10倍體積)洗脫。由該柱只回收到10%-20%HBsAg，其純度低(5-7%)。DEAE-Sephacel柱用PBS階式梯度溶液洗脫;用0.2×PBS、0.3×PBS、0.5×PBS、0.75×PBS、1×PBS、1.5×PBS、2×PBS各1體積(2.5毫升)洗柱。這使HBsAg粒子釋放出來(lái)，回收率為70%，但是分布在許多級(jí)分中(拖尾)。另外，因?yàn)樵谒蠬BsAg級(jí)分中都有污染物存在，所以純度低(約5-10%)。
因此，用這些方法不能有效地純化HBsAg粒子。
注意，后來(lái)試驗(yàn)了另外幾個(gè)離子交換柱(見(jiàn)實(shí)施例11)。使用SP-Trisacryl得到了出乎意料的好結(jié)果，將該柱并入優(yōu)選方法B中(實(shí)施例11)。
3)凝膠過(guò)濾色譜a)使用Sepharose CL-6B(Pharmacia，500毫升床體積柱，按制造商說(shuō)明書使用)作為優(yōu)選的Sephacryl S-400凝膠過(guò)濾的替代方法。
按以下方式將使用Sepharose CL-6B柱的凝膠過(guò)濾與Sephacryl S-400柱(本方法中為500毫升床體積類型)直接比較HBsAg粒子由培養(yǎng)基未經(jīng)預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)物得到。收集到的含HBsAg培養(yǎng)基先在Pellicon系統(tǒng)(帶有截止分子量為300，000的膜)或Amicon XM300系統(tǒng)(帶有截止分子量為300，000的膜，Amicon公司)上濃縮，然后用10%PEG分級(jí)(與事先不在帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)上濃縮就用PEG分級(jí)相比，這樣作減少了HBsAg粒子的損失)。Pellicon或Amicon XM300得到的結(jié)果相同。將PEG沉淀物(含HBsAg粒子的樣品)溶解在1×PBS中，最好溶解在高鹽Tris-NaCl緩沖液中(50mM Tris-Trizma Base，Sigma公司;3M NaCl，分析純，Merck公司)。將8.1毫升HBsAg樣品(約2毫克)加到Sepharose或Sephacryl柱上。在兩種情況下，加到PBS緩沖液中的樣品的分離和純化都比加到Tris-NaCl緩沖液中的樣品好(2倍)。這些柱在純化HBsAg粒子方面的差別可以總結(jié)如下用1體積(500毫升)PBS洗柱使HBsAg粒子洗脫出(兩個(gè)柱均為500毫升床體積)。以10毫升為一個(gè)樣品收集洗脫出的各級(jí)分，對(duì)每份樣品試驗(yàn)HBsAg特異性(Travenol試劑盒，在實(shí)施例8和9中有說(shuō)明，蛋白質(zhì)測(cè)定在實(shí)施例7中說(shuō)明)。Sephacryl S-400柱的HBsAg粒子回收率(收率)高于90%，而Sepharose CL-6B柱僅為75%。當(dāng)樣品加到PBS中時(shí)，Sephacryl柱得到的粒子純度為45%(加到Tris-NaCl緩沖液中時(shí)為20%);而當(dāng)樣品加到PBS中時(shí)用Sepharose柱得到的粒子純度只有20-30%(樣品加到Tris-NaCl緩沖液中時(shí)純度為10-15%)。
為了用Sephacryl或Sepharose柱達(dá)到更高的HBsAg粒子純度，進(jìn)行第二次凝膠過(guò)濾。將第一次凝膠過(guò)濾洗脫出的峰級(jí)分用10%PEG/PBS濃縮，將PEG沉淀物重新溶解在PBS中。象上面對(duì)第一個(gè)柱所述的那樣將樣品加到第二個(gè)柱上，但是這次只用PBS作為加樣緩沖液。象對(duì)第一個(gè)柱子那樣洗脫和分析HBsAg粒子。觀察到以下結(jié)果當(dāng)?shù)谝粋€(gè)柱是Sephacryl S-400，第二個(gè)柱是Sephacryl S-400時(shí)，回收到約95%HBsAg粒子，純度為60-70%。
當(dāng)?shù)谝粋€(gè)柱是Sephacryl S-400，第二個(gè)柱是Sepharose CL-6B時(shí)，只回收到約60-70%的HBsAg粒子，純度只有約50%。
當(dāng)?shù)谝粋€(gè)柱是Sepharose CL-6B，第二個(gè)柱也是Sepharose CL-6B時(shí)，只回收到70%HBsAg粒子，峰很寬(拖尾峰)，純度低到約30%。
應(yīng)該再次指出，上述的這些純化方法是對(duì)在培養(yǎng)基未經(jīng)預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)物中產(chǎn)生的HBsAg粒子進(jìn)行的。預(yù)分級(jí)步驟使申請(qǐng)人能將HBsAg粒子純化得到高得多的水平，在任何階段都不需要PEG分級(jí)/濃縮，只采用在實(shí)施例5和圖4中所述的步驟。如本實(shí)施例的C1部分所述(步驟3的替代方法)，PEG分級(jí)/濃縮要求以離心和/或結(jié)合透析的超濾作為一個(gè)必要步驟。因此這既費(fèi)時(shí)又增加生產(chǎn)成本。
最后，如上所述，欲用凝膠過(guò)濾法純化的HBsAg樣品在制備時(shí)采用一個(gè)濃縮步驟，這利用帶有截止分子量為300，000的膜的Pellicon系統(tǒng)或Amicon XM 300系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。二者得到同樣的結(jié)果，但是所用的Amicon系統(tǒng)只能處理50毫升樣品，并且要求50磅/平方英寸的操作壓力。Pellicon系統(tǒng)能處理大得多的體積，并且在0磅/平方英寸的壓力下操作。這對(duì)于工業(yè)應(yīng)用和低成本生產(chǎn)是理想的。
因此，優(yōu)選的方法是用Sephacryl S-400進(jìn)行兩次連續(xù)的柱色譜操作，以此來(lái)制備從培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)物中得到的HBsAg。這使得在第二次操作后的最終HBsAg粒子純度高于95%(實(shí)施例5和圖4)。這一步驟也更為經(jīng)濟(jì)合算，因?yàn)閮纱芜B續(xù)操作使用同一個(gè)柱。
4)作為對(duì)第二個(gè)凝膠過(guò)濾步驟(圖4和實(shí)施例5中的步驟5)的另一替代方法，將從第一個(gè)Sephacryl S-400柱洗脫出的HBsAg粒子(步驟4)如下加到蔗糖梯度上HBsAg粒子得自培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)預(yù)分級(jí)的培養(yǎng)物。按實(shí)施例5中直到步驟4末尾所述(即，步驟1-4)處理含HBsAg的培養(yǎng)基。
將純化過(guò)的HBsAg粒子(在第一個(gè)Sephacryl S-400柱上凝膠過(guò)濾之后)加到Beckman SW 27超離心管中的50%至5%蔗糖梯度(用PBS配制)上。將蔗糖梯度在27000轉(zhuǎn)/分下于16-21℃超離心18小時(shí)。離心之后由管底以1.8毫升為一個(gè)級(jí)分進(jìn)行收集，測(cè)定它們的蔗糖濃度(用折射儀)和HBsAg特異性(用實(shí)施例7的方法)。HBsAg粒子特異峰以尖銳峰位于級(jí)分6-7中。HBsAg在蔗糖梯度中的這一條帶圖形表明用申請(qǐng)人方法生產(chǎn)的HBsAg粒子高度均一(示于圖5)。
進(jìn)一步鑒定(詳述于實(shí)施例7)蔗糖梯度分離后HBsAg的純度表明，用這種方法制備的HBsAg粒子的純度(60-70%)沒(méi)有改進(jìn)(如實(shí)施例7中所述用SDS-PAGE和Western印跡分析)。另外，收率也比用凝膠過(guò)濾法達(dá)到的低-回收率只有約70%。再者，蔗糖法很費(fèi)時(shí)，要使用貴重的儀器。
5)為得到高純度的HBsAg粒子，作為對(duì)第二個(gè)凝膠過(guò)濾步驟(圖4和實(shí)施例5中的步驟5)的另一個(gè)可能替代方法，將從第一個(gè)Sephacryl S-400柱洗脫出的HBsAg粒子加到CsCl梯度上，用超離心法分離(CsCl梯度超離心法詳述在Hilleman等，J.Infection，1983年第7卷增刊I 3-8頁(yè);Adamowicz等，Vaccine，1984年第2卷209-214頁(yè))。
用CsCl梯度分離法(等密度梯度分離)所得的結(jié)果是回收到高純度的HBsAg粒子(高于90%)，但是回收率低(約40-50%)?；厥章式档褪怯捎趶腃sCl梯度回收的HBsAg粒子必須透析，HBsAg粒子粘附在進(jìn)行透析用的透析袋上。另外，CsCl梯度超離心很昂貴和費(fèi)時(shí)，因此在工業(yè)上不適用。因此，優(yōu)選的方法是實(shí)施例5和圖4中敘述的方法。
表Ⅱ?qū)Ρ攘松暾?qǐng)人的純化HBsAg粒子的優(yōu)選新方法和在HBsAg粒子純化中使用的替代方法。所包括的是申請(qǐng)人在建立自己體系的過(guò)程中曾用過(guò)的可能替代方法。在實(shí)施例5和圖4中提供了優(yōu)選方法A的細(xì)節(jié)。替代方法的細(xì)節(jié)在上述實(shí)施例10中說(shuō)明。在實(shí)施例11和圖8中提供了一種特別優(yōu)選的方法(優(yōu)選方法B)的細(xì)節(jié)。
實(shí)施例11生產(chǎn)和純化HBsAg粒子的優(yōu)選方法B(特別優(yōu)選的方法)A.HBsAg生產(chǎn)和純化方法的詳細(xì)描述圖8畫出了這一方法的流程圖。
注意，在所有步驟中均使用無(wú)熱原的水和容器。
步驟1至3這些步驟與優(yōu)選方法A(實(shí)施例5)中所述的步驟1至3相同。
步驟4對(duì)濃縮和澄清的培養(yǎng)基中的HBsAg粒子進(jìn)行DNA酶處理用一小瓶11，700單位不含蛋白酶的DNA酶(美國(guó)Biochemical公司)處理步驟3由Minitan系統(tǒng)回收的150毫升保留物(或濃縮物)。在室溫下保溫2小時(shí)。通過(guò)這一處理，DNA含量由20納克/微克HBsAg減少到2皮克/微克HBsAg。
在DNA酶處理結(jié)束時(shí)，用pH＝4.5的20 mM NaAc按1∶5將蛋白質(zhì)溶液稀釋。如有必要，將pH調(diào)節(jié)到4.5。稀釋操作在硅烷化瓶中進(jìn)行，以防止HBsAg吸附。在稀釋和酸化后出現(xiàn)混濁，在Sorvall離心機(jī)上于12，000轉(zhuǎn)/分下離心30分鐘除去混濁物。上清液(約850毫升)含有HBsAg。
注意，進(jìn)行稀釋和酸化是為了使溶液適合步驟5中的Trisacryl柱，加到該柱上的必須是低鹽、低pH溶液。出人意料的是，在這些條件下生成的混濁物含有清蛋白和其它污染物，但是不含HBsAg。因此，離心除去這些混濁物實(shí)現(xiàn)了純化而不損失HBsAg。
步驟5在DNA酶處理后HBsAg粒子的離子交換純化在這一步驟中，將前一步驟的離心上清液加到陽(yáng)離子交換柱SP-Trisacryl LS(法國(guó)IBF公司)上。試驗(yàn)了很多離子交換樹脂來(lái)純化HBsAg(見(jiàn)下面的C部分)。出乎意料的是，SP-Trisacryl LS陽(yáng)離子交換柱是唯一的具有高容量、能以高收率和高純化度生產(chǎn)HBsAg的柱;SP-Trisacryl LS是N-丙烯酰-2-氨基-2-羥甲基-1，3丙二醇的共聚物，帶有以下化學(xué)基團(tuán)作為磺酸官能團(tuán)
所用的柱是5厘米×21.5厘米柱(Pharmacia)，裝填有430毫升SP-Trisacryl LS，最大線性流速為3.6(720毫升/小時(shí))。
在上述流速下用5倍床體積的20 mM NaAc(pH＝4.5)使柱平衡。加樣之后，用3倍床體積的50 mM NaCl在20 mM NaAc中的溶液(pH＝4.5)洗柱。
將加樣和洗柱步驟的流出液(其中含DNA和DNA降解產(chǎn)物)棄去。開始洗脫HBsAg時(shí)，緩沖液改為140-200 mM NaCl在20 mM NaAc中的溶液(pH＝4.5)。洗脫步驟的線性流速為6.3(1260毫升/小時(shí))。通過(guò)監(jiān)測(cè)流出液在280納米處的光吸收連續(xù)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。出現(xiàn)兩個(gè)峰，第一個(gè)含有純的HBsAg，第二個(gè)含有一些清蛋白污染物，其數(shù)量取決于所用的NaCl濃度。通過(guò)這一步驟，約80%的HBsAg從柱中被置換到1個(gè)床體積的流出液中。收集含有很純HBsAg的第一個(gè)峰用于下一步驟。
步驟5ASP-Trisacryl柱的HBsAg流出液與1∶4000稀釋的37%甲醛(美國(guó)藥典級(jí))一起在30℃保溫48小時(shí)。這一處理使蛋白質(zhì)溶液中可能存在的病毒滅活，只作為預(yù)防措施進(jìn)行。
步驟6濃縮和純化將前一步驟的含HBsAg的溶液在使用截止分子量為100，000的膜的Minitan或Pellicon超濾系統(tǒng)上濃縮。滲流速度為1升/小時(shí)。HBsAg不透過(guò)膜，收集在保留物中。將保留物溶液濃縮到原體積的約50%。
濃縮的保留物溶液現(xiàn)在象優(yōu)選方法A中步驟4一樣處理。將溶液加到兩個(gè)相連的5厘米×100厘米Sephacryl-400超細(xì)凝膠過(guò)濾柱上，柱中裝填有總體積為4升的樹脂，流速為140毫升/小時(shí)(也可以用一個(gè)更大的柱子)。
用至少2個(gè)床體積的PBS緩沖液以上述流速使柱平衡(實(shí)施例5)。
在外水體積之后洗脫出HBsAg，它具有高純度(98%以上)。甲醛被阻留在柱上，在大約1個(gè)床體積后洗脫出。申請(qǐng)人認(rèn)為可以省略這一Sephacryl-400色譜步驟而純度不會(huì)有明顯損失，在這種情況下利用在Minitan或Pellicon超濾系統(tǒng)上透濾將甲醛除去。
由Sephacryl-400柱流出的含HBsAg的流出液可以通過(guò)一個(gè)Gelman ACRO 50A(0.2微米)濾器濾入玻璃瓶中滅菌。
B.上述優(yōu)選方法B比優(yōu)選方法A(實(shí)施例5)優(yōu)越之處這種新方法生產(chǎn)出了比先前的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品更純的高度有效的產(chǎn)品。其純度(就蛋白質(zhì)而言)超過(guò)98%，DNA污染物低于每毫克HBsAg 0.3皮克。因此產(chǎn)物是臨床級(jí)的。這一新的特別優(yōu)選的方法仍很簡(jiǎn)單，只涉及5-6個(gè)步驟，快速而非常有效。這樣生產(chǎn)的產(chǎn)品是成本很低的高純度產(chǎn)品。
C.步驟5中使用的SP-Trisacryl LS柱比其它離子交換柱優(yōu)越之處試驗(yàn)了很多柱，比較了它們將步驟1到3的最初純化之后的HBsAg粒子進(jìn)一步純化的能力。SP-Trisacryl被證實(shí)是唯一對(duì)HBsAg既有足夠高的容量，又能實(shí)現(xiàn)高收率和高純度的離子交換樹脂。
為了說(shuō)明SP-Trisacryl柱在純化HBsAg粒子方面出乎意料的成功應(yīng)用，下面對(duì)所試驗(yàn)的所有柱的使用情況作出說(shuō)明。這些結(jié)果清楚地表明，SP-Trisacryl柱比所試驗(yàn)的所有其它柱都出乎意料地優(yōu)越。
在步驟3之后用來(lái)純化HBsAg粒子的試驗(yàn)柱(a)S-Sepharose問(wèn)題(1)回收率低-對(duì)粒子親合性高。
(2)DNA與粒子結(jié)合，一起洗脫。
(b)硫酸葡聚糖問(wèn)題(1)容量很低。
(2)回收率隨不同的緩沖條件而變。
(c)HA Ultragel問(wèn)題(1)容量很低。
(2)回收率差。
(d)HTP Biogel問(wèn)題回收率僅50%-HBsAg對(duì)HTP-Biogel的親合性高。
(e)DEAE Sepharose問(wèn)題容量低-未測(cè)定回收率。
(f)SP-Trisacryl優(yōu)點(diǎn)高容量和高回收率(收率)。
實(shí)施例12人體內(nèi)的血清轉(zhuǎn)化將申請(qǐng)人的重組HBsAg疫苗(按實(shí)施例11所述生產(chǎn))注射給成年志愿者，用測(cè)定抗HBsAg抗體的商品試劑盒Ausab EIA或Ausab RIA(Abbott)，證實(shí)誘發(fā)出了針對(duì)疫苗的高效價(jià)抗體。
另外，鑒定出一名無(wú)反應(yīng)者，即，一名對(duì)先前的來(lái)源于酵母的重組HBsAg疫苗無(wú)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。注射了申請(qǐng)人的重組HBsAg疫苗后，誘發(fā)了抗HBsAg抗體的產(chǎn)生。這表明申請(qǐng)人的重組HBsAg疫苗比現(xiàn)有的疫苗產(chǎn)生更高比例的免疫對(duì)象。
進(jìn)一步鑒定在人體內(nèi)誘發(fā)的抗體的質(zhì)量從用申請(qǐng)人的HBsAg疫苗免疫的個(gè)體收集人血清，與用Recombivax疫苗免疫的個(gè)體及乙型肝炎感染患者的人血清相比較。用固相ELISA(如實(shí)施例9D部分中所述)分析血清中抗前-S1抗體的存在，以生物素化的經(jīng)親合純化的抗人IgG(Sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)B-9015)作為第二抗體。結(jié)果示于下面的表Ⅳ中。
表 Ⅳ固相ELISA分析人血清中抗前-S1抗體的結(jié)果光密度(405納米)血清來(lái)源 實(shí)驗(yàn)1 實(shí)驗(yàn)2注射申請(qǐng)人的疫苗后 0.556;0.572 0.840;0.843患者 0.530;0.538 未測(cè)注射Recombivax疫苗后 0.365;0.377 未測(cè)正常人血清 0.362;0.367 0.389;0.386
表Ⅳ表明，用申請(qǐng)人的疫苗免疫的個(gè)體血液內(nèi)有抗前-S1抗體，而且這些抗體的含量與乙型肝炎感染患者血液中的相似。但是，用來(lái)源于酵母的Recombivax免疫的個(gè)體血液不含抗前-S1抗體。
申請(qǐng)人相信這是第一次表明一種重組HBsAg疫苗誘發(fā)產(chǎn)生了抗前-S1抗體，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)申請(qǐng)人的疫苗比現(xiàn)有的疫苗更有效，因?yàn)樗捎谶€具有前-S1決定簇，能克服對(duì)S區(qū)或前-S2區(qū)決定簇?zé)o反應(yīng)的問(wèn)題(例如見(jiàn)Zuckerman，J.Infection 1986年第13卷增刊A第61-67頁(yè))。
實(shí)施例13生產(chǎn)和純化HBsAg的優(yōu)選方法CA.HBsAg生產(chǎn)和純化方法(優(yōu)選方法C)的詳細(xì)說(shuō)明圖9畫出了說(shuō)明此方法的流程圖。
步驟1到3這些步驟與優(yōu)選方法A(實(shí)施例5)和優(yōu)選方法B(實(shí)施例11)中所述的步驟1到3相同。
步驟4在DEAE陰離子交換柱上純化HBsAg粒子將步驟3從Minitan或Pellicon系統(tǒng)回收的保留物或濃縮物(100-400毫升)加到裝有400-900毫升DEAE快速流動(dòng)樹脂的離子交換柱上，樹脂懸浮并平衡在1×PBS(pH7.35±0.05)中。
收集過(guò)柱體積，然后用1×PBS洗柱(0.5倍加樣體積)，收集流出液，加到過(guò)柱體積中(總體積＝1.5倍加樣體積)。
在DEAE柱之后，用10 mM NaAc(pH＝4.5)將蛋白質(zhì)溶液按1∶3稀釋，并酸化到pH＝4.5(在稀釋之后無(wú)可見(jiàn)的混濁，與優(yōu)選方法B步驟4結(jié)束時(shí)的類似方法不同;這是因?yàn)閹缀跛械那宓鞍锥家驯籇EAE柱除去。因此，離心除去混濁物的步驟現(xiàn)在可以省略。)注意，在DEAE色譜步驟之前，一個(gè)任選的附加步驟是，用DNA酶處理步驟3的濃縮物(如優(yōu)選方法B步驟4中所述)。
步驟5HBsAg粒子的離子交換純化在此步驟中，將前一步驟中稀釋和酸化的過(guò)柱溶液如優(yōu)選方法B(實(shí)施例11)步驟5中所述加到陽(yáng)離子交換柱SP-Trisacryl LS上。
步驟5A甲醛處理如優(yōu)選方法B(實(shí)施例11)的步驟5A中所述，用甲醛處理從SP-Trisacryl柱洗脫出的HBsAg。
步驟6除去甲醛和滅菌用透析法從最后一步的經(jīng)過(guò)甲醛處理的HBsAg溶液中除去甲醛。透析在Minitan(或Pellicon)超濾系統(tǒng)上用截止分子量為30，000或100，000的膜進(jìn)行。對(duì)1×PBS進(jìn)行透析，在開始透析前將保留物濃縮到約50毫升。在濃縮和透析3-4個(gè)循環(huán)后透析完全，此時(shí)保留物濃縮到約50毫升。用1×PBS洗滌超濾系統(tǒng)，將洗滌液加到保留物中，使保留物的最終總體積為100毫升。將這個(gè)HBsAg溶液通過(guò)0.2微米濾器滅菌，在4℃貯存。
B.上述優(yōu)選方法C比優(yōu)選方法B(實(shí)施例11)優(yōu)越之處這種新方法得到的產(chǎn)物與先前方法(優(yōu)選方法B)的純度大致相同。產(chǎn)物收率也與優(yōu)選方法B達(dá)到的收率相近。另外，對(duì)用方法C制得的HBsAg粒子所作的分析表明，它們與用方法B制得的相同。這一新方法的優(yōu)點(diǎn)在于方法更為簡(jiǎn)單，因此以很低的成本生產(chǎn)出純度很高的產(chǎn)物。此方法更為簡(jiǎn)單是因?yàn)?a)用DEAE柱代替優(yōu)選方法B中的DNA酶步驟也省去了繁瑣的離心步驟;因?yàn)槭∪チ薉NA酶的成本，此方法的總成本也降低了。
(b)省去了甲醛步驟之前的濃縮步驟;該步驟不是必要的，因?yàn)楹罄m(xù)的凝膠過(guò)濾步驟被省掉了。
(c)省去了耗時(shí)的Sephacryl柱的平衡、操作和再生等步驟。
(d)省去了Sephacryl柱色譜(凝膠過(guò)濾)之后的濃縮步驟。
C.DEAE Sepharose柱的優(yōu)點(diǎn)據(jù)信這一離子交換步驟是HBsAg粒子純化中的新步驟。此步驟的新穎之處在于HBsAg粒子既不與柱結(jié)合也不被柱阻留，而是直接通過(guò)。因?yàn)槲廴疚锱c柱結(jié)合或被柱阻留，所以實(shí)現(xiàn)了純化。DNA與柱結(jié)合(因此可以省去方法B中的DNA酶步驟)，主要的蛋白質(zhì)污染物清蛋白被柱阻留，在HBsAg之后洗脫出。類似地，其它陰離子污染物，例如蛋白質(zhì)、帶電類脂、多糖和膜碎片，也與HBsAg粒子分開。另外，細(xì)胞培養(yǎng)基中的pH指示劑(染料)也與柱結(jié)合，從而與HBsAg粒子分離開。在這個(gè)易于實(shí)施的純化步驟之后，HBsAg粒子的純度大于90%。
注意，這里所用的DEAE柱具有大容量，因?yàn)樗x擇的條件(pH、離子強(qiáng)度)使粒子直接過(guò)柱。(這與在實(shí)施例11部分C(e)中提到的試圖使用DEAE柱不同，在實(shí)施例11中申請(qǐng)人試圖通過(guò)使HBsAg粒子與DEAE柱相結(jié)合實(shí)現(xiàn)純化)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)純化的乙型肝炎表面抗原粒子的方法，該方法包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生所述粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌乙型肝炎表面抗原粒子，培養(yǎng)基中添加有不含分子量大于約3×105道爾頓的分子的血清；(b)從所得的含乙型肝炎表面抗原粒子的培養(yǎng)基中除去全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體；(c)對(duì)所得的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，以將其中存在的乙型肝炎表面抗原粒子濃縮和純化；(d)回收所得的濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中乙型肝炎表面抗原粒子是人表面抗原粒子。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)的血清是胎牛血清。
4.權(quán)利要求1的方法，其中全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體用超濾法除去。
5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)中對(duì)乙型肝炎表面抗原粒子的濃縮和純化處理包括超濾。
6.權(quán)利要求1的方法，其中濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子的回收方法包括色譜法。
7.權(quán)利要求6的方法，其中色譜法包括凝膠過(guò)濾色譜法。
8.權(quán)利要求7的方法，其中凝膠過(guò)濾色譜法包括用N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)的烯丙基葡聚糖柱色譜。
9.權(quán)利要求7的方法，其中凝膠過(guò)濾色譜法包括在排除分子量大于約1×106道爾頓的分子的凝膠柱上進(jìn)行色譜。
10.權(quán)利要求7的方法，其中用超濾法將所得的濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子進(jìn)一步濃縮。
11.權(quán)利要求10的方法，其中用凝膠過(guò)濾色譜法將所得的濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子進(jìn)一步純化。
12.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)中對(duì)乙型肝炎表面抗原粒子的濃縮和純化處理包括透析。
13.權(quán)利要求12的方法，其中用超濾法將所得的濃縮和純化的乙型肝炎表面抗原粒子進(jìn)一步濃縮。
14.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中CHO細(xì)胞是CHO-HB 200細(xì)胞。
16.一種生產(chǎn)純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子的方法，該方法包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生所述粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌人乙型肝炎表面抗原粒子，培養(yǎng)基中添加有不含分子量大于約3×105道爾頓的分子的血清;(b)從所得的含有人乙型肝炎表面抗原粒子的培養(yǎng)基中除去全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體;(c)對(duì)所得的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，以得到含有濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子的溶液;(d)對(duì)所得的含有濃縮抗原粒子的溶液進(jìn)行處理，以減少溶液中的DNA含量;(e)如有必要，調(diào)節(jié)如此得到的含濃縮和純化表面抗原粒子的溶液的pH，使其pH處在約3.0和約7.0之間;(f)純化在所得的溶液中存在的濃縮表面抗原粒子;(g)回收純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子。
17.權(quán)利要求16的方法，其中步驟(d)中減少DNA含量的處理包括向溶液中加入DNA酶。
18.權(quán)利要求17的方法，該方法還包括對(duì)所得的溶液進(jìn)行陰離子交換色譜。
19.權(quán)利要求16的方法，其中步驟(d)中減少DNA含量的處理包括對(duì)溶液進(jìn)行陰離子交換色譜。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中陰離子交換色譜包括交聯(lián)瓊脂糖柱色譜，瓊脂糖上存在有二乙氨基乙基官能團(tuán)。
21.權(quán)利要求16的方法，其中步驟(a)的血清是胎牛血清。
22.權(quán)利要求16的方法，其中用超濾法除去全細(xì)胞、細(xì)胞碎片和顆粒聚集體。
23.權(quán)利要求16的方法，其中步驟(c)中對(duì)人乙型肝炎表面抗原粒子的濃縮處理包括超濾法。
24.權(quán)利要求16的方法，其中純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子的回收方法包括色譜法。
25.權(quán)利要求24的方法，其中色譜法包括凝膠過(guò)濾色譜法。
26.權(quán)利要求25的方法，其中凝膠過(guò)濾色譜法包括用N，N′－亞甲基雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)的烯丙基葡聚糖柱色譜。
27.權(quán)利要求25的方法，其中凝膠過(guò)濾色譜法包括在排除分子量大于約1×106道爾頓的分子的柱上進(jìn)行色譜。
28.權(quán)利要求23的方法，其中用超濾法將所得的濃縮人乙型肝炎表面抗原粒子進(jìn)一步濃縮。
29.權(quán)利要求28的方法，其中用凝膠過(guò)濾色譜法純化所得的濃縮人乙型肝炎表面抗原粒子。
30.權(quán)利要求16的方法，其中步驟(c)中對(duì)人乙型肝炎表面抗原粒子的濃縮處理包括透析。
31.權(quán)利要求30的方法，其中用超濾法將所得的濃縮人乙型肝炎表面抗原粒子進(jìn)一步濃縮。
32.權(quán)利要求16的方法，其中對(duì)所得溶液pH的調(diào)節(jié)包括將溶液離心。
33.權(quán)利要求16的方法，其中用陽(yáng)離子交換色譜法將純化和濃縮的人乙型肝炎表面抗原粒子進(jìn)一步純化。
34.權(quán)利要求33的方法，其中陽(yáng)離子交換色譜法包括強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜。
35.權(quán)利要求34的方法，其中強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜包括在存在有磺酸官能團(tuán)的柱上進(jìn)行色譜。
36.權(quán)利要求34的方法，其中強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜包括在N-丙烯酰-2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇共聚物柱上進(jìn)行色譜，該共聚物上帶有-CONH-C(CH3)2-CH2-SO3H官能團(tuán)。
37.權(quán)利要求33的方法，其中用甲醛對(duì)所得的進(jìn)一步純化和濃縮的抗原粒子進(jìn)行處理，以將存在的任何活有機(jī)體和病毒滅活。
38.權(quán)利要求33的方法，其中用超濾法將所得的進(jìn)一步純化和濃縮的抗原粒子進(jìn)一步濃縮。
39.權(quán)利要求38的方法，其中用色譜法將所得的進(jìn)一步濃縮的粒子純化。
40.權(quán)利要求39的方法，其中色譜法包括凝膠過(guò)濾色譜。
41.權(quán)利要求40的方法，其中凝膠過(guò)濾色譜包括用N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)的烯丙基葡聚糖柱色譜。
42.權(quán)利要求16的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。
43.權(quán)利要求42的方法，其中CHO細(xì)胞是CHO-HB 200細(xì)胞。
44.用權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的純化的乙型肝炎表面抗原粒子。
45.權(quán)利要求44的純化的乙型肝炎表面抗原粒子，粒子中含有前-S1、前-S2和S表面抗原多肽。
46.純化的非血漿來(lái)源的人乙型肝炎表面抗原粒子，粒子中含有前-S1、前-S2和S表面抗原多肽，除蛋白質(zhì)污染物之外的部分占95%以上。
47.權(quán)利要求46的純化的人乙型肝炎表面抗原粒子，其中除蛋白質(zhì)污染物之外的部分占98%以上。
48.權(quán)利要求46的純化的人乙型肝炎表面抗原粒子，其中含有以下數(shù)量的表面抗原多肽S表面抗原多肽 75-80%前-S2表面抗原多肽 10-15%前-S1表面抗原多肽 5-10%。
49.權(quán)利要求48的純化的人乙型肝炎表面抗原粒子，其中存在以下數(shù)量的表面抗原多肽S表面抗原多肽 78%前-S2表面抗原多肽 14%前-S1表面抗原多肽 8%。
50.權(quán)利要求49的純化的人乙型肝炎表面抗原粒子，其中存在以下數(shù)量的表面抗原多肽S 24 KD未糖基化 62.4%S 27 KD糖基化 15.6%前-S2 33 KD單糖基化 10.8%前-S2 36 KD雙糖基化 3.2%前-S1 39 KD未糖基化 6.1%前-S1 41 KD糖基化 1.9%
51.用權(quán)利要求16的方法生產(chǎn)的純化的人乙型肝炎表面抗原粒子。
52.權(quán)利要求51的純化的人乙型肝炎表面抗原粒子，其中含有前-S1、前-S2和S表面抗原多肽。
53.權(quán)利要求44、45、46、47、51或52中任一項(xiàng)的純化的人乙型肝炎表面抗原粒子，其中含有化學(xué)計(jì)量與來(lái)源于血漿的粒子相近的前-S1、前-S2和S表面抗原多肽。
54.一種乙型肝炎表面抗原疫苗，該疫苗含有有效免疫量的權(quán)利要求44、45、46、47、48、51或52中任一項(xiàng)的乙型肝炎表面抗原粒子，以及一種合適的載體。
全文摘要
提供了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)純化的乙型肝炎表面抗原粒子的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生這種粒子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加有不含高分子量污染蛋白的血清；回收純化的乙型肝炎表面抗原粒子。用預(yù)分級(jí)法除去分子量大于約3×10
文檔編號(hào)C12P21/00GK1087122SQ9211300
公開日1994年5月25日 申請(qǐng)日期1992年11月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月14日
發(fā)明者Z·伊文一陳 申請(qǐng)人:生物技術(shù)通用公司